Summary
Dit protocol beschrijft de verwijdering en de zuivering van de longslagader endotheliale cellen (PAECs), die aan de ballontips van Swan-Ganz katheters, voldoen terwijl ze worden ingeklemd in de longslagader tijdens het rechterdeel van het hart catheterisatie en blijven aanhangend aan de leeggelopen ballon na verwijdering van het lichaam van de patiënt.
Abstract
Een verscheidenheid van pathologieën leiden tot pulmonale hypertensie (PH), die is gedefinieerd als een gemiddelde longslagader druk meer dan 25 mmHg onbeweeglijk. Om verder te diagnosticeren en beheren van PH, ondergaan patiënten herhaalde rechterdeel van het hart catheterizations (RHC) waarin een Swan-Ganz-katheter is gevorderd in een tak van de longslagader en een ballon is opgeblazen om de wig op het puntje van de katheter. Dit artikel illustreert een protocol waarbij longslagader endotheliale cellen (PAECs) kunnen worden geoogst uit de ballontips van Swan-Ganz katheters na RHC en gezuiverd met een anti-CD146 affiniteit kolom techniek voor het zuiveren van vermeende PAECs. Deze cellen kunnen worden gebruikt om een in situ momentopname van de biologische toestand van de pulmonaire therapieën endotheel ter aanvulling van hemodynamische metingen verkregen tijdens RHC. Geoogst en gezuiverde PAECs kunnen worden gebruikt voor beide celkweek of voor latere analytische testen zoals stroom cytometery.
Introduction
Rechterdeel van het hart catheterisatie nodig huidige Amerikaanse en Europese richtsnoeren voor de diagnose van pulmonale hypertensie1. Artsen en wetenschappers proberen te begrijpen van deze ziekte verlangen biologische monsters van de pulmonaire therapieën als aanvulling op de hemodynamische gegevens die wordt verzameld tijdens RHC. Helaas, het risico van de pulmonaire vasculaire biopsie is zeer hoog, en daarom biologische monsters van de pulmonaire therapieën zijn zelden als ooit levende patiënten ondergaan RHC verkregen. Terwijl veel inzicht heeft opgedaan van pulmonaire vaatweefsel verkregen van dode foetussen of transplanteren longen, deze voorbeelden zijn niet in staat om na te denken van de biologie van het ziekteproces PH, zoals het in een levende patiënt ontvouwt zich. In 2013, we eerst gemeld dat longslagader endotheliale cellen (PAECs) zijn kale van de takken van de longslagader door fysiek contact met het topje van de ballon van de Swan-Ganz-katheter tijdens RHC, en in kleine aantallen van de katheter tips kunnen worden hersteld na de procedure2.
Dit artikel illustreert onze techniek voor de verwijdering en de zuivering van de longslagader endotheliale cellen (PAECs) van de ballontips van Swan-Ganz katheters na rechterdeel van het hart catheterisatie. Voorheen, de methodologie voor het uitvoeren van deze oogst techniek heeft zijn onvoldoende gedetailleerd beschreven in de literatuur voor uniforme resultaten tussen laboratoria voor het uitvoeren van de techniek. Dit artikel is bedoeld om het overwinnen van deze tekortkoming, het aanbieden van gevisualiseerde demonstratie van de techniek, uit bed collectie van katheter tips tot het definitieve product van gezuiverde CD146 + endotheliale cellen. Deze techniek moet steun ter bevordering van onderzoek in de pathobiology van verschillende etiologie van PH en eventueel leiden tot de ontwikkeling van nieuwe diagnostische tests ter aanvulling van hemodynamische gegevens verzameld tijdens RHC.
Het belang van deze techniek op het gebied van de pulmonaire vasculaire geneeskunde en onderzoek is dat het biedt toegang tot een momentopname van de biologie van de pulmonaire endotheel in situ, en in tegenstelling tot eerdere studies op transplanteren of dode foetussen longen, vormt geen een eindpunt voor de certificaathouder longkanker. Onlangs, hebben wij aangetoond dat een anti-apoptotic biomarker in deze cellen nut in nauwkeuriger fenotypering wellicht gerelateerde soorten pulmonale hypertensie3. De opbrengst van cellen verkregen is relatief klein, ~ 5, 000-25.000 PAECs per monster, en deze cellen zijn moeilijk (maar niet onmogelijk) aan cultuur. Wij zijn van mening dat slimme clinici en onderzoekers synergieën tussen deze metgezel technieken vindt om verder pulmonaire vasculaire onderzoek, diagnostiek en onderzoeksaanpak.
Protocol
Alle studies die in dit artikel beschreven werden goedgekeurd door de institutionele Review Board van de Allegheny gezondheidsnetwerk. Alle patiënten geboden geïnformeerde toestemming vóór de toediening van kalmerende agenten en -werden geïdentificeerd door een nummer van de studie wordt toegewezen.
1. bed collectie
Opmerking: Alles in dit protocol moet worden gedaan op het ijs, met behulp van vooraf gekoeld oplossingen. Het is belangrijk voor het opwekken van koude stase in de cellen te behouden hun in situ biologische fenotype. Dit protocol omvat de verwerking van bloed en cellen verkregen van de mens en dus universele voorzorgsmaatregelen in acht moeten worden genomen.
- Na intrekking van de katheter uit de schede, onderdompelen onmiddellijk de katheter in een 50 mL centrifugebuis met 40 mL gekoeld steriele zoutoplossing. Swirl de katheter meermaals bloed verwijderen en de regel Doorsturen indien nodig te verwijderen van bloed in de lijn blijven.
- De distale 5 cm van het puntje cath afgesneden en laat ze te vallen in de centrifugebuis van 50 mL met gekoeld zoutoplossing. Onmiddellijk de cath tip verwijderen met pincet en overbrengen naar een 15 mL centrifugebuis met 15 mL endothelial cel (EG) groeimedium.
- Zegel van de buis, plaats het op ijs en transfer naar het lab voor verwerking of verzending te bereiden. Het is van cruciaal belang dat de ballon ondergedompeld in medium blijft, dus zorg ervoor dat er minimale headspace is in de tube van 15 mL volledig vullen met EG groeimedium.
- Proces het monster onmiddellijk door over te gaan tot stap 2.1 of zegel en schip het monster op nat ijs 's nachts voor verwerking op een laboratorium bedreven in dit protocol. Als cellen uiteindelijk worden gebruikt voor de cultuur van de cel gaat, is het raden dat de tip cath onmiddellijk verwerkt op hetzelfde terrein waarop de gegevens zijn verzameld.
2. cel oogst
Opmerking: Alles in dit protocol moet worden gedaan op het ijs, met behulp van vooraf gekoeld oplossingen. De cellen zijn in koude stase, en het is belangrijk te voorkomen dat hen ontwaken totdat ze klaar om te worden vastgesteld of gekweekt. Dit hele protocol moet worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap, met behulp van steriele instrumenten, als de uiteindelijke bedoeling is de cultuur van de geoogste PAECs. Als de cultuur niet is gepland (bijvoorbeeld stroom cytometry analyse), het is niet nodig acht steriele voorzorgsmaatregelen te nemen.
- Voeg 5 mL cell detachement oplossing voor een tube van 15 mL centrifuge; plaats op het ijs.
- 1 mL van EG media tekenen dat blijft in de buis bed collectie in de 1 mL spuit.
- Snel stappen 2.3 via 2.5. Greep het gesneden einde van het puntje van de katheter met hemostats.
- Steek de naald van de spuit 1 mL zorgvuldig in het "witte" gat tegenover de begeleidingskabel ('black hole'). Neem grote zorg om te voorkomen dat schade met de naald.
- Breng de tip van cath in de 15 mL centrifugebuis met de mobiele-detachement oplossing.
- Opblazen van de ballon, voorzichtig om niet te barsten opblazen van de ballon met ongeveer 200 µL van media werkt goed.
- Toestaan dat de katheter zitten in cel detachement oplossing op ijs voor 5 min met de ballon opgeblazen. Als de ballon op eigen tijdens de incubatie 5 min inzakt, is dit aanvaardbaar.
- Giet de inhoud van de tube van 15 mL centrifuge in de schotel van 100 mm. Plaats de ballon in de mobiele-detachement oplossing "plas".
- Schraap de opgeblazen ballon met een cel schraper. De cel schraper kan worden getrokken rond de ballon in een cirkelvormige beweging of een poetsen beweging. Focus op de "expertisecentra" van de ballon, waar het samenkomt met de katheter. Zorg ervoor dat de cel schraper contact op met het gehele oppervlak van de ballon ten minste tweemaal. Spoel de cel schraper periodiek in de mobiele-detachement oplossing "plas".
- De ballon leeglopen en schraap het met een poetsen motie. Spoel de cel schraper in de mobiele-detachement oplossing "plas".
- Gooi de cath tip, de naald en de cel schraper in de juiste afval container.
- Giet de cel detachement oplossing met de oogst van de cel in een centrifugebuis 50 mL. Schud de collectie buis en giet de resterende media uit de collectie buis in het verzamelde monster ook.
- Centrifugeer het monster bij 650 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Het is belangrijk op te merken dat dikwijls een pellet krijgt niet te zien. Het kan het nuttig zijn om te markeren van de locatie waar een pellet zou worden gezien, als zichtbaar zijn, om te voorkomen dat aspirating van de pellet in het geval het is te klein om gezien te worden.
Opmerking: Een pellet is normaal gesproken alleen gezien wanneer het monster is besmet met bloed. Bloed besmetting is irrelevant aan de uiteindelijke oogst product omdat het bloed niet binden de kralen CD146 en wast door de kolom. Uitgebreid testen heeft aangetoond dat het specifieke merk van 1,5 mL microcentrifuge tubes waarnaar wordt verwezen in de Tabel van materialen cel verlies ten opzichte van andere buizen gebruikt tijdens protocolverbetering minimaliseert. - Zorgvuldig gecombineerd media en Vermijd verstoord of aspirating van de pellet.
3. cel zuivering
Opmerking: Alles in dit protocol moet worden gedaan op het ijs, met behulp van vooraf gekoeld oplossingen. De cellen zijn in koude stase, en het is belangrijk te voorkomen dat hen ontwaken totdat ze klaar om te worden vastgesteld of gekweekt.
- Resuspendeer de pellet in 1 mL van gekoeld rode bloedcellen lysis van de oplossing, en het overbrengen naar een 1,5 mL microfuge buis; zachtjes rock gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Centrifugeer gedurende 5 min bij 500 x g - en 4 ° C. De RBC lysis oplossing gecombineerd.
- Resuspendeer de pellet in 60 μL van PBS, 20 μL van FcR blocker en 20 μL van anti-menselijke CD146 microbeads. Incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Voeg 1 mL gekoeld PBS. Centrifugeer gedurende 5 min bij 500 x g - en 4 ° C. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL gekoeld PBS.
- Plaats een magnetische LS-kolom op een magnetische rek (Zie Tabel van materialen voor specifieke commerciële identiteiten van deze items) bij kamertemperatuur. Prime kolom door toevoeging van 1 mL PBS en laat het gehele volume doorheen kan stromen. Gooi de doorstroming.
- Leg het monster in de magnetische kolom. Gooi de doorstroming.
- Was de kolom met 3 mL gekoeld PBS driemaal. Gooi de doorstroom van elk wassen.
- Voeg 3 mL gekoeld PBS tot een centrifugebuis 15 mL. Verwijder de magnetische kolom uit magneet, giet de 3 mL PBS uit centrifugebuis 15 mL in de kolom en snel de plaats van de kolom in de centrifugebuis te vangen de doorstroming. Duik onmiddellijk met de zuiger voorzien van kolom. Het monster is nu gezuiverd, klaar voor fixatie/kleuring, of cultuur.
Representative Results
Dit protocol resulteert in de zuivering van cellen, van Swan-Ganz catheter tips na het rechterdeel van het hart catheterisatie, die binden aan een kolom van de selectie van CD146 en hebben vooruit/kant scatter-profielen die niet te onderscheiden van gekweekte primaire mens pulmonale zijn slagader endotheliale cellen (Figuur 1). Gezien het feit dat de ballon van de katheter in contact komen met alleen de introducer schede (een cel-vrij materiaal), de longslagader vaatwand is, en het bloed, gegevens die hierin aantonen dat deze cellen niet zijn afgeleid van het bloed (Figuur 2) , en daarom wordt ervan uitgegaan dat ze inderdaad zijn afgeleid van de vaatwand van de longslagader. De lezer moet er rekening mee dat de magnetische kralen van de anti-CD146 die worden gebruikt voor het zuiveren van de cellen blijven aanhanger aan het celoppervlak na de procedure, en dus het is suboptimaal proberen te analyseren van de cel oogsten voor CD146 als een marker van endotheliale cellen. CD31 of andere endothelial markeringen zou vermoedelijk beschikbaar voor het labelen en kunnen worden beschouwd als alternatieven.
Belangrijkste elementen van dit protocol zijn vastgesteld die van invloed kunnen zijn op de resultaten. Ten eerste is het belangrijk te spoelen van het uiteinde van de katheter op het bed om het bloed te verwijderen. Figuur 3 toont kant scatter (SSC) / Forward scatter (FSC) profielen van doorstroming uit de kolom van de anti-CD146 voor een voorbeeld dat werd goed gespoeld en een die niet was. De kolom verschijnt bloed-afgeleide cellen uitsluiten van de oogsten (Figuur 2), maar de spoeldouche stap zorgt voor minimale mogelijke besmetting endotheliale cellen blijven circuleren (die zijn normaal aanwezig in < 50 cellen/mL bloed4). Wij hebben geconstateerd dat eluaat uit de kolom volledig duidelijk, zelfs in het geval van zeer bloedige katheter tip monsters is CD146. Dit suggereert dat de kolom is het kundig voor het verwerken van aanzienlijke hoeveelheden bloed zonder verstopping of het behoud van niet-CD146 + bloodborne cellen.
Ten tweede is het belangrijk om het opblazen van de ballontip ten minste eenmaal in de cel detachement oplossing/cel schraper stap. Gezien het feit dat de vermeende PAECs op de ballontip aanhangend ondanks de zoute spoelen stapt, lijkt het waarschijnlijk blijven kunnen ze worden gedeeltelijk gevangen door plooien in de ballon van vinyl als het gedefleerd in voorbereiding voor verwijdering uit de patiënt aan de hand is. Vermoedelijk, bevrijdt de inflatie stap de PAECs, waardoor ze worden zachtjes weg geschraapt. Het is niet onmiddellijk duidelijk een misschien deze hypothese te testen, maar lagere rendementen van cellen zijn waargenomen wanneer de ballon is niet opgeblazen (gegevens niet worden weergegeven).
Tenslotte is het belangrijk op te merken dat de opbrengsten van PAECs die zijn afgeleid van deze methode kunnen aanzienlijk kunnen variëren. Vermoedelijk, patiënt-, ziekte staat - en arts-specifieke factoren bijdragen aan deze variabiliteit, zoals het protocol bevat geen stappen die zou leiden tot een groot verlies van het uitgangsmateriaal worden verwacht. Tabel 1 toont vertegenwoordiger die cd146 + opbrengsten uit een verscheidenheid van PAEC oogsten met behulp van tips van de katheter verkregen uit een verscheidenheid van patiënten met andere ziekte staten van pulmonale hypertensie en een breed scala operatoren van de arts.
Figuur 1 : WS/FSC profielen van een typische katheter ballon tip oogst van een patiënt met pulmonale hypertensie (A) en een vergelijkbaar aantal cellen uit een commercieel verworven primaire menselijke PAEC cultuur (B). Beide monsters werden gezuiverd met de anti-CD146-kolom, vaste en permeablized zoals beschreven in het protocol vóór de FACS analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : WS/FSC profielen van een typische katheter ballon tip oogst van een pulmonale hypertensie patiënt (A) en seriële 1:10 verdunning van densiteitgradiënt verloop-gezuiverd menselijke buffy coat (B, C, D). (A) werd gezuiverd met de anti-CD146 kolom overwegende dat (B-D) niet waren. Alle celsteekproeven waren vastgesteld en permeablized zoals beschreven in het protocol vóór de FACS analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : WS/FSC profielen van een katheter ballon tip oogst van een patiënt met pulmonale hypertensie in welke bloed was zichtbaar op het puntje van de katheter vóór verwerking. Vóór stap 3.1 van het protocol, het monster werd gesplitst en lysis-buffermengsel werd toegevoegd aan één aliquot en onthouden anderzijds. (A) en (C) de WS/FSC-profielen van de steekproef lysed beide cellen behouden door de kolom (A) en de doorstroming van de kolom weergeven. (B) en (D) Toon de SSC/FSC-profielen van het unlysed monster, zowel de cellen behouden door de kolom (B) en de doorstroming van de kolom (D). We concluderen dat lysis sommige verwijdert maar niet alle van de leukocyten maar dat leukocyten blijven niet behouden door de kolom en zijn dus uitgesloten van de laatste oogst, ongeacht de lysis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Monster | Datum | Opbrengst van de cel | Diagnose |
| 433 | 4/17/2018 | 7364 | PH-pneumologie |
| 279 | 4/17/2018 | 7130 | PH-sclerodermie |
| 432 | 4/13/2018 | 3976 | PH-Multifactoriële |
| 431 | 4/13/2018 | 3634 | HFrEF |
| 390 | 4/13/2018 | 5666 | PAK |
| 423 | 3/23/2018 | 9024 | HFrEF |
| 272 | 3/23/2018 | 7098 | HFrEF |
| 408 | 2/27/2018 | 4784 | HFrEF |
| 403 | 2/14/2018 | 10376 | PH-ASD + mitralisklep ziekte |
| 396 | 1/26/2018 | 4890 | HFpEF-IPCPH |
| 397 | 1/26/2018 | 7672 | Normale hemodynamiek |
| 318 | 1/4/2018 | 7002 | HFrEF-LVAD aanwezig |
Tabel 1: CD146 + opbrengsten uit allerlei PAEC oogsten. Vertegenwoordiger CD146 + opbrengsten uit een verscheidenheid van PAEC oogsten met behulp van tips van de katheter verkregen uit een verscheidenheid van patiënten met andere ziekte staten van pulmonale hypertensie en een breed scala operatoren van de arts.
Discussion
De techniek die in dit artikel beschreven wordt best gewaardeerd in het kader van eerdere experimentele paradigma's voor de studie van de pulmonaire vasculaire endotheel. Eerdere pogingen om PAECs van de mens zijn beperkt tot transplanteren/dode foetussen longen5 en een korte poging om te ontwikkelen een katheter longslagader biopsie6staat. Zoals opgemerkt in een recente review7, is de huidige techniek Long weefsel oogst onderscheiden door haar vermogen om PAECs van een levend mens, en om dit te doen op meerdere tijdstippen in de progressie van de ziekte en/of therapie. Echter moet worden opgemerkt dat een metgezel techniek heeft onlangs gemeld waarbij geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSCs) kunnen transdifferentiated in PAECs4,5. Deze techniek produceert overvloedige culturen van patiënt-specifieke PAECs en studie van de effecten van patiënt-specifieke genetische achtergrond op PAEC biologie staat. Ondanks deze voordelen biedt deze IPSC afkomstige PAECs geen inlichtingen over de interactie tussen lokale communicatie en patiënt-specifieke genetische achtergrond. Onze eigen groep heeft de opvatting dat de "cath tip" en de IPSC technieken waarschijnlijk synergie zijn bij het bevorderen van het veld8gepresenteerd.
In deze huidige en historische context, moeten de beperkingen van deze techniek worden opgemerkt. Ten eerste is het belangrijk op te merken dat de opbrengsten van PAECs die zijn afgeleid van deze methode kunnen aanzienlijk kunnen variëren. Vermoedelijk, patiënt-, ziekte staat - en arts-specifieke factoren bijdragen aan deze variabiliteit, zoals het protocol bevat geen stappen die zou leiden tot een groot verlies van het uitgangsmateriaal worden verwacht. Tabel 1 toont vertegenwoordiger die cd146 + opbrengsten uit een verscheidenheid van PAEC oogsten met behulp van tips van de katheter verkregen uit een verscheidenheid van patiënten met andere ziekte staten van pulmonale hypertensie en een breed scala operatoren van de arts. Ten tweede, de opbrengsten van de cel zijn algemene lage, en hun levensvatbaarheid voor cultuur heeft bewezen te zijn lager maar in onze handen. Terwijl eerder zijn we gegroeid culturen van PAECs met behulp van deze methode1, we nemen die resultaten vertegenwoordigen redding van een subset van voorlopercellen na die-off van de meeste van de steekproef en is alleen met tussenpozen succesvol in onze handen. Het is bijvoorbeeld niet ongebruikelijk om te vinden slechts een paar dozijn aanhanger PAECs in cultuur de ochtend na een oogst heeft zijn verguld. Deze micro-culturen overleven vaak niet tot uitbreiding. Verdere inspanningen vereist om dit protocol op een manier die zal blijven inspannen voor de levensvatbaarheid van de PAECs en hun omstandigheden in cultuur te bereiken van het gewenste doel van propagatie van patiënt-specifieke PAEC oogsten te optimaliseren. Tot slot uitsluiten de CD146 positieve selectie die hebben we aangepast niet verontreiniging met andere CD146 + cellen, zoals de circulerende endotheliale cellen4, pericytes, zachte spiercellen en zeldzame CD146 + T-cellen-9,10. Echter deze cellen worden geacht te zijn zeer gering in aantal in monsters die op deze manier, en CD146 is aanzienlijk meer specifiek voor dit protocol dan andere cel markers van endotheliale cellen zoals CD31 (die ook aanwezig zijn op een scala aan door bloed overgedragen cellen met inbegrip van bloedplaatjes11). Eventuele toekomstige verbeteringen ter verbetering van de specificiteit moeten worden afgewogen tegen hun potentieel negatief effect op de opbrengst.
Disclosures
MJP en RLB zijn uitvinders inzake octrooien beweren gedeelten van de beschreven methoden.
Acknowledgments
De auteurs zou willen bedanken voor de artsen en ondersteunend personeel van de geavanceerde Heart Failure and pulmonale hypertensie service van Allegheny General Hospital voor de levering van honderden katheter monsters meerjarenaanpak die hebben vergemakkelijkt de optimalisatie van deze methodologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
| 16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
| Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
| Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
| Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
| Forceps | any | ||
| Hemostat | any | ||
| LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
| Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
| Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
| Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
| Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| PBS | Fisher | BP2438-4 | |
| Scissors | any | ||
| Syringes | BD | 309597 |
References
- Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Respiratory Journal. 46 (4), 903-975 (2015).
- Pollett, J. B., Benza, R. L., Murali, S., Shields, K. J., Passineau, M. J. Harvest of pulmonary artery endothelial cells from patients undergoing right heart catheterization. Journal of Heart Lung Transplantation. 32 (7), 746-749 (2013).
- Benza, R. L., et al. In situ expression of Bcl-2 in pulmonary artery endothelial cells associates with pulmonary arterial hypertension relative to heart failure with preserved ejection fraction. Pulmonary Circulation. 6 (4), 551-556 (2016).
- Bull, T. M., et al. Circulating endothelial cells in pulmonary hypertension. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 698-703 (2003).
- Kaneko, F. T., et al. Biochemical reaction products of nitric oxide as quantitative markers of primary pulmonary hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 158 (3), 917-923 (1998).
- Rothman, A., et al. Transvenous procurement of pulmonary artery smooth muscle and endothelial cells using a novel endoarterial biopsy catheter in a canine model. Journal of the American College of Cardiology. 27 (1), 218-224 (1996).
- Savale, L., Guignabert, C., Weatherald, J., Humbert, M. Precision medicine and personalising therapy in pulmonary hypertension: seeing the light from the dawn of a new era. European Respiratory Reviews. 27 (148), (2018).
- Kanwar, M., Raina, A., Passineau, M., Benza, R. Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension: Evolving Therapeutic Strategies. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 38 (5), 606-618 (2017).
- Elshal, M. F., Khan, S. S., Takahashi, Y., Solomon, M. A., McCoy, J. P. Jr CD146 (Mel-CAM), an adhesion marker of endothelial cells, is a novel marker of lymphocyte subset activation in normal peripheral blood. Blood. 106 (8), 2923-2924 (2005).
- Elshal, M. F., et al. A unique population of effector memory lymphocytes identified by CD146 having a distinct immunophenotypic and genomic profile. BMC Immunolology. 8, 29 (2007).
- Newman, P. J., et al. PECAM-1 (CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily. Science. 247 (4947), 1219-1222 (1990).
