Summary
I denne undersøgelse præsenterer vi en protokol for at udføre to-foton intravital imaging og celle interaktionsanalyser i murine trakeal slimhinde efter infektion med influenza-virus. Denne protokol vil være relevant for forskere studerer immun celle dynamics under luftvejsinfektioner.
Abstract
Analyse af celle-celle eller celle-patogen interaktion i vivo er et vigtigt redskab til at forstå dynamikken i den immun reaktion på infektion. To-foton intravital mikroskopi (2P-IVM) giver mulighed for observation af celle interaktioner i dybe væv i levende dyr, og minimere photobleaching genereret under image erhvervelse. Til dato har været beskrevet forskellige modeller for 2P-IVM af lymfoide og ikke-lymfoide organer. Billeddannelse af åndedrætsorganerne er imidlertid fortsat en udfordring på grund af den bevægelse i forbindelse med vejrtrækning cyklus af dyret.
Her, beskriver vi en protokol for at visualisere i vivo immun celle interaktioner i luftrøret af mus smittet med influenzavirus ved hjælp af 2 P-IVM. Til dette formål udviklede vi en brugerdefineret imaging platform, som omfattede kirurgiske eksponering og intubation af luftrøret, efterfulgt af erhvervelse af dynamiske billeder af neutrofile og dendritiske celler (DC) i slimhinden epitel. Derudover detaljerede vi de nødvendige skridt for at udføre influenza intranasal infektion og flow cytometric analyse af immunceller i luftrøret. Endelig, vi analyseret neutrofile og DC motilitet samt deres interaktioner i løbet af en film. Denne protokol giver mulighed for generation af stabile og lyse 4D billeder nødvendigt for vurdering af celle-celle interaktioner i luftrøret.
Introduction
To-foton intravital mikroskopi (2P-IVM) er en effektiv teknik til realtid imaging af celle-til-celle interaktioner som de forekommer i deres naturlige miljø1. En af de vigtigste fordele ved denne metode er, at det giver studiet af cellulære processer på en større modellen dybde (500 µm til 1 mm) sammenlignet med andre traditionelle billeddiagnostiske teknikker2. På samme tid minimerer brugen af to lav-energi fotoner genereret af to-foton laser væv foto-skader typisk tilknyttet image erhvervelse processen2. I det sidste tiår, er 2P-IVM blevet anvendt for at studere forskellige typer af celle-celle interaktioner i flere discipliner3,4,5. Disse undersøgelser har været særligt relevant at undersøge immunceller, som er karakteriseret ved høj dynamik og dannelsen af fremtrædende kontakter efter de signaler, der er genereret af andre celler og miljøet. 2P-IVM er også blevet anvendt til at studere samspillet mellem patogen og vært6. Ja, det har tidligere vist sig at nogle patogener kan ændre type og varighed af kontakter mellem immunceller, hæmmer, som et resultat, immunrespons7.
Luftvejene slimhinde er det første sted, hvor immunrespons mod luftbårne patogener er genereret8. Derfor, i vivo analyse af pathogen-værtssammenspil i dette væv er afgørende at forstå indledning af forsvarsmekanismer vært under infektion. 2P-IVM af luftvejene er imidlertid udfordrende hovedsagelig på grund af artefakter fremstillet af vejrtrækning cyklus af dyr, der bringer processen med billede erhvervelse. For nylig, forskellige kirurgiske modeller er blevet beskrevet for billedbehandling murine luftrøret9,10,11,12 og lungerne13,14,15, 16. Luftrør 2P-IVM modeller repræsenterer en fremragende set-up til at visualisere den indledende fase af immunreaktion i de øvre luftveje, mens lunge-alveolerne 2P-IVM modeller er mere velegnede til at studere den sene fase af infektioner. De udviklede lunge modeller præsentere en begrænsning forbundet med tilstedeværelsen af luftfyldte alveolerne, som begrænser den optiske penetration af laser og gøre den slimhinde lag i de intrapulmonary luftveje utilgængelige for i vivo billeddannelse17 . Omvendt letter strukturen i luftrøret, dannet af en kontinuerlig epitel, billede erhvervelse.
Vi præsenterer her, en protokol, der indeholder en detaljeret beskrivelse af de trin, der kræves for at udføre influenza-infektion, kirurgisk forberedelse af dyrene, og 2P-IVM af luftrøret. Derudover beskriver vi en specifik eksperimentel set-up for visualisering af neutrofile og dendritiske celler (DC), to immun celletyper, der spiller en vigtig rolle som formidlere af forsvarsmekanisme mod influenza virus18,19 . Endelig, vi beskriver en metode til at analysere neutrofile-DC interaktioner. Disse kontakter har vist sig at modulere DC aktivering og efterfølgende, at påvirke immunrespons mod patogener20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr procedurer der involverer mus blev udført i overensstemmelse med de schweiziske føderale Veterinærkontoret retningslinjer og animalske protokoller blev godkendt af de lokale dyrlæge myndigheder.
1. influenza-infektion af CD11c-YFP mus
- Biosikkerhed
Bemærk: Mus tilpasset stamme af influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) blev dyrket i befrugtede æg, renset og titreres som tidligere beskrevet21. Alle de trin, der involverer inficerede dyr eller biologiske prøver blev udført under en biosikkerhed kabinet ifølge biosikkerhed niveau (BSL) 2 betingelser.- Ren biosikkerhed kabinettet med en 70% ethanol løsning, før og efter proceduren for infektion.
- Kassér alle affaldsmaterialer produceres under denne procedure efter korrekt der biosikkerhed retningslinjer (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Kassér fast affald i autoklaverbart placeringer og forurenede væsker i plastikposer fyldt med 70% ethanol opløsning eller medicinsk desinfektionsmiddel.
- Influenza intranasal infektion
BEMÆRK: B6. CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/Jørgensen (CD11c-YFP)22 på en C57BL/6J baggrund blev anvendt i denne undersøgelse. Mus blev opretholdt i det specifikt patogenfrie facilitet på Institut for forskning i biomedicin.- Placere et maksimum på 5 alder - og køn-matchede (seks til otte uger gamle) CD11c-YFP mus pr. bur. Vent i mindst to dage for mus akklimatisering til boligforhold før proceduren infektion.
- Afrimning PR8 lager og forberede de tilsvarende fortynding ved hjælp af koldt 1 x Dulbeccos fosfat buffer saltvand ændret uden calciumchlorid og magnesiumchlorid (PBS) for at opnå en endelig koncentration på 200 plak-dannende enheder (PFU) i 30 µL. holde virus fortynding på isen under hele proceduren.
Bemærk: titrering af hver batch af influenzavirus forud for sin anvendelse er anbefales for at sikre en præcis infektion dosis. - Indsprøjtes en dosis ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) intraperitoneal (i.p.) ved hjælp af en 26 G kanyle 1 mL sprøjte.
- Vent, indtil musen er fuldt bedøvede (fuldstændig tab af både oprettende og pedal tilbagetrækning refleks). Dyb anæstesi er nødvendigt for en optimal infektion, da ikke-fuldt bedøvede mus vil sluge eller udvise virus inokulum, fører til variationer i infektion dosis.
- Opstille den bedøvede mus i en liggende stilling. Indsamle 15 µL af virus inokulum. Placere pipette spidsen tæt på musen venstre næsebor og give afkald på den virale inokulum dråbevis. Som dråber skal indåndes, ikke afpipetteres dem direkte inde i næsen hulrummet.
- Vente 2 – 5 min. og placere pipette spidsen indeholdende de resterende 15 µL af virus inokulum i den højre næsebor.
Bemærk: For at undgå kvælning, dispensere små dråber i ca. 20 s intervaller. - Kontroller, at musen korrekt vejrtrækning og placere den i et bur i laterale decubitus. Overvåge mus vejrtrækning og anæstesi recovery (ca. 60 min. efter induktion).
Bemærk: Det er muligt at inficere mere end 1 mus på samme tid. I dette tilfælde, administrere viral inokulum i den venstre næsebor af alle mus i en sekvens, vente på 2 – 5 min og derefter administrere virus i den højre næsebor. For at undgå variation mellem individer, inficere ikke mere end 3 mus på samme tid. - Overvåge dyresundhedsmæssige status og vægt tab dagligt.
- Aflive mus ifølge Human slutpunktet bestemmes af retningslinjerne for myndighed. Metoden eutanasi skal være godkendt af myndighederne i dyreforsøg og skal respektere lokale etiske regler. Efter to-foton eksperimenter, aflive mus ved administration af en overdosis af ketamin/xylazin efterfulgt af cervikal dislokation. I alle andre eksperimenter kan bruge CO2 indånding som en metode for aktiv dødshjælp.
Bemærk: For at måle de virale titers inficerede luftrøret, 50% vævskultur smitsom dosis (TCID50) assay eller realtid polymerase kædereaktion (RT-PCR) assay kan udføres som tidligere beskrevet23.
- Evaluering af neutrofile rekruttering i luftrøret ved flowcytometri
Bemærk: Denne del af protokollen er valgfri. Det har til formål at evaluere neutrofile rekruttering i trakeal slimhinde efter influenza-infektion.- Aflive inficeret og ikke-inficerede kontrol mus på dag 3 efter infektionen (PI) af CO2 indånding.
Bemærk: For at forhindre luftrør skade, undgå at bruge cervikal dislokation for at aflive dyr. Derudover er perfusion af aflivede mus tilrådeligt at undgå forurening fra blodet neutrofile. - Spray mus hals med 70% ethanol løsning og udføre en hud indsnit ved hjælp af kirurgiske saks fra brystet til hagen.
- Adskille spytkirtlerne med pincet og udsætte luftrøret.
- Dissekere musklerne omkring luftrøret ved hjælp af saks og pincet.
Bemærk: Dette trin skal udføres omhyggeligt da luftrøret kunne let beskadiget under proceduren. - Hold luftrøret med pincet og omhyggeligt frigør spiserøret ved dissektion.
- Holde den intrathoracic del af luftrøret med pincet, gøre et snit i begyndelsen af den bronchiale træ. Derefter løsne luftrøret fra strubehovedet og forsigtigt fjerne enhver muskulatur tilbage.
- Placer orglet i 1,5 mL rør indeholdende RPMI 1640 + HEPES medium (RPMI) på is.
- Forberede luftrøret fordøjelse, der indeholder 0,26 enheder/mL collagenase (I og II) og 0,2 mg/mL af DNase enzym blandingen I RPMI.
- Sted dissekeret luftrøret i en 6-godt plade indeholdende 1 mL af enzymet blanding.
- Skær orglet i små stykker ved hjælp af saks og pincet. Holde pladen på isen under dette trin.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 45 min. I løbet af denne tid, ryste plade hver 15 min.
- Stop enzym fordøjelsen ved tilsætning af 1 mL af FACS vask buffer (2 mM EDTA og 2% varme-inaktiverede filter-steriliseret føtal bovint serum (FBS)) i PBS.
- Resuspend løsning med 1 mL pipette til at bidrage til at fjerne tilknytningen af de delvist nedbrudte stykker af væv.
- Opløsningen overføres til en anden brønd ved at passere indholdet gennem en 40 µm si. Derefter forsigtigt smadre de resterende stykker af orglet fanget på toppen af sien bruger en 2 mL sprøjte stemplet.
Bemærk: Smadre delvist nedbrudte stykker af luftrøret over sien er et afgørende skridt til at opnå en optimal antal celler under analysen af cytometric. - Vask godt og si med FACS vask buffer og overføre suspension i en 5 mL tube opbevares på is.
- Centrifugeres rør på 166 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten og resuspend celler i 100 µL af FACS vask buffer.
- Fortsætte med antistoffarvning overflade til flowcytometri. Kort, blokere Fc receptorer af isolerede celler ved hjælp af en antistof mod CD16/32, efterfulgt af overflade farvning. Til korrekt for at identificere neutrofiler, panelet flow flowcytometri bør indeholde følgende antistoffer: αLy6G, αCD11b, αCD45, samt en levedygtighed farvestof for at udelukke døde celler.
- Køre hele indholdet af prøverne på en flow forskellige og analysere dataene.
- For at få en optimal antallet af immunceller, køre enkelt cellesuspension ved en hastighed ikke højere end 3.000 begivenheder/s. Dette vil reducere antallet af begivenheder udelukket under erhvervelse. Ved hjælp af denne protokol, skal det være muligt at få 1 til 2 millioner af celler pr. luftrøret.
- Aflive inficeret og ikke-inficerede kontrol mus på dag 3 efter infektionen (PI) af CO2 indånding.
2. isolering og injektion af neutrofiler
Bemærk: I denne procedure, B6.129 (ICR)-Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J mus (CK6-ECFP) blev brugt24. Disse dyr udtrykke den fælles fiskeripolitik i alle celletyper menneskelige β-actin promotor. Alternativt er det også muligt at bruge C57BL/6J mus at isolere cellerne og bejdse dem i henhold til protokollen, beskrevet taktfast 2.6. Rensning og manipulation af neutrofiler kan øge deres aktivisering status, potentielt ændre deres vandrende og funktionelle egenskaber.
- Aflive dyret af CO2 indånding.
- Fjerne både lårben og skinneben og forsigtigt rengøre dem ved hjælp af pincet.
- Skåret ben epifyser og skylle knoglemarven ved hjælp af en 1 mL sprøjte fyldt med steril kolde PBS, i en 50 mL tube opbevares på is.
- Resuspend cellerne med en 18 G nåle og filtrere cellesuspension med en 40 μm si. Vask en gang med PBS på 110 x g i 5 min. ved 4 ° C og resuspend celler i 2 mL koldt PBS.
-
Fortyndes 100% Percoll 9:1 i 10 x PBS og forberede gradient løsninger af percoll 72%, 64% og 52% bruger 1 x PBS. Lag omhyggeligt 2 mL af hver af de tre forløb i en 15 mL tube, startende fra mest koncentreret en.
- Tilføje omhyggeligt 2 mL cellesuspension knoglemarv på det forløb og de centrifuge på 1.100 x g i 30 min. ved stuetemperatur (RT) uden acceleration og bremse.
- Forsigtigt fjerne bandet på grænsefladen mellem 64% og 72% og vaske det én gang på 200 x g i 5 min. ved 4 ° C med kolde PBS. Resuspend celler i et volumen på 100 μL af PBS og holde dem på is. Renheden af neutrofile forventes at være højere end 90%.
- Du kan eventuelt etiket neutrofiler med en celle spredning kit bruger producentens protokol. Tilføj farvestof til cellesuspension til en slutkoncentration på 10 μM i et volumen på 1 mL, der inkuberes ved 37 ° C i 30 min og vask (166 x g, 5 min).
- Anslå celle koncentration ved hjælp af en hemocytometer og indsprøjtes intravenøst 5 x 106 celler i en maksimal volumen på 100 μL i de tidligere inficerede CD11c-YFP+ mus ved hjælp af en 26 G kanyle 1 mL sprøjte, 12 h før billeddannelse.
3. forberedelse af mus til billedbehandling
-
Anæstesi
- Bedøver inficerede CD11c-YFP+ mus på dag 3 p.i. Ifølge trin 1.2.3.
- Når musene er dybt bedøvede, forberede et kateter for anæstesi re dosering.
- Fjerne en 30 G nål fra en sprøjte med pincet.
- Indsætte nålen til en 20 cm stykke af PE-10 medicinsk silikone slanger.
- Indsæt en 30 G kanyle sprøjte fyldt med ketamin/xylazin blanding på anden siden af røret.
- Fjerne luft inde i røret.
- Forberede en 20 G kateter tilsluttet et rør fra en ilt insufflating maskine at opretholde automatiseret ventilation (figur 1Ajeg). Sæt den på en ånde forholdet mellem 130 slag i minuttet (b.p.m.) med en tidalvolumen af 0,2 mL ved hjælp af en 100% ilt gasforsyning.
-
Forberede kirurgi musen
- Hold musen på en særlig skræddersyet kirurgisk bord (figur 1Aii-iii) over en opvarmet plade eller en opvarmet kirurgisk bænk indstillet på 37 ° C for alle tid af kirurgi.
- Barbering håret fra nakke af musen ved hjælp af en elektrisk barbermaskine og en depilatory creme (figur 1Bjeg).
- Placer musen over plast musen positionelle (figur 1Aii-en), at holde dyr hovedet uden for de positionelle (figur 1Bii) til at oprette en vinkel, der letter intubation af luftrøret.
- Lave forbens, poterne og halen med kirurgisk tape, fugte mus øjne med en vitamin A beriget gel og desinficere mus hals (figur 1Bii).
-
Kirurgi
- Forberede sig ordentligt autoklaveres elementer, nemlig saks, microsurgical saks og pincet.
- Udføre en lille snit på den lange mediale akse af halsen, ca 1 cm lange, i det midterste område mellem den øvre bryst og en linje gennem det laveste punkt af underkæben (figur 1Biii).
- Bevæge sig sideværts hud lapper og spytkirtlerne og visualisere luftrøret, er omfattet af musklerne. Derefter, dissekere trakeal musklerne ved hjælp af pincet (figur 1Biii).
- Intubate mus med et kateter og starte kunstig ventilation (figur 1Biv).
Bemærk: Kateteret er sammensat af en ekstern plast del, som beskytter den trakeal slimhinde, og en indre jern nålen. Tilstedeværelsen af nålen repræsenterer den ideelle løsning til at udvide og stabilisere luftrøret og til at regulere sin redegørelse. Kunstig ventilation gennem kateteret vil sikre korrekt vejrtrækning med musen. - Straks starte kunstig ventilation til dataskærm mus vejrtrækning.
- Fix kateter højde og orientering ved hjælp af en kirurgisk krog (figur 1Bv) forbundet til den særlige stang på den kirurgiske board (figur 1Aii-b). Udsætte luftrør i den samme højde på hagen.
- Omringe luftrøret med vaseline og dække det med et par dråber af forvarmet PBS sikrer korrekt hydrering til orgel (figur 1Bvi).
- Montere coverslip på toppen af præparatet. For dette trin, lim en coverslip på en metal indehaveren (figur 1Bvii), som vil være skruet til XYZ oversætter (figur 1Aii-c). Justere XYZ oversætter for at placere coverslip oven på den kirurgiske forberedelse.
- Placer kateter forvaltning af anæstesi intraperitoneal (figur 1Bviii).
- Injicere 50% af den oprindelige dosis ketamin/xylazin blanding hvert 30 min.
Bemærk: Re dosering fra 50% til 25% af den oprindelige ketamin/xylazin blanding er en sikker og lovlig alternative25. Men da denne protokol er terminal og en streng immobilisering af dyret er påkrævet under hele proceduren, bruge højere doser til at opretholde et dybt kirurgisk fly af anæstesi.
4. in Vivo Time-lapse Imaging
Bemærk: Image erhvervelse blev udført med en opretstående to-foton mikroskop, udstyret med to Ti:Sa lasere, temperatur-kontrolleret inkubation kammer og en 25 X / NA 1.1 vand fordybelse mål. Fotomultiplikatorer (PMT) bruges til billede erhvervelse var enten hybrid detektorer eller høj følsomhed GaAsP.
- Placer den kirurgisk bord med bedøvede musen inde i mikroskopet inkubation kammer (forvarmet på 37-38 ° C) og tilføje en dråbe vand på coverslip.
- Center og finde fokus på det trakeale væv.
-
Indstil den scanning frekvens til 800 Hz, med 520 x 520 pixels, en 440 x 440 μm2 synsfelt og line gennemsnitlige 1.
- Tune Ti:Sa laser til 830 nm at ophidse andet harmonisk generation (SHG) fra kollagen, med en vejledende magt ved kilden på 150 mW. Tune den anden Ti:Sa laser på 920 nm med 94 mW ved kilden, at ophidse både FFP og YFP.
- Set-up 3D og timelapse erhvervelse mode med samtidige magnetisering
Bemærk: Hold laser beføjelser så lavt som muligt for at minimere photobleaching og fototoksicitet.
- Optage fluorescens ved hjælp af to kanaler i ikke-descanned tilstand, med en master dichroic spejl på 560 nm. I det set-up, der anvendes i denne protokol, et andet dichroic spejl delt signal på 495 nm at adskille kanal 1 (emission filter 475/50) fra kanal 2 (emission filter 525/50) (figur 2A). Denne konfiguration indsamler SHG lys fra kollagen i den første kanal, mens fælles fiskeripolitik emission er indsamlet i begge kanaler 1 og 2 og YFP indsamles kun i kanal 2.
- Definere en række 50 μm langs Z-aksen med et skridt nummer 3 μm (voxel størrelse 0,86 μm x 3 μm). Post billeder hver 30 s til en samlet varighed på 30 min.
- Hvis det ønskes, erhverve flere regioner. Før du kører flere opkøb, kontrollere vitale tegn og handler anæstesi gennem kateteret hvis nødvendigt (Se trin 3.3.10).
- For enden af billedprocessen euthanize musen gennem ketamin/xylazin overdosis efterfulgt af cervikal dislokation.
5. billede forarbejdning og kvantitativ analyse af neutrofile-DC motilitet og interaktion
Bemærk: I denne protokol, en specialiseret imaging software blev brugt til dataanalyse mikroskopi.
- Efter 4D billede erhvervelse er afsluttet, overføre filer (data og metadata) på en arbejdsstation med tilstrækkelig beregningsmæssige ressourcer (foreslog minimum systemkrav: 32 GB RAM, hurtig solid-out-of-State-drev, seneste CPU, dedikeret GPU baseret på en massiv parallel arkitektur).
- Åbne filerne i den billedbehandlingsprogrammer.
- Afspil videoen og sikre at cellerne i interesse er klart synlige og at billeddannelse artefakter er fraværende.
Bemærk: herpå, kontrollere, at både bevægelsen af prøven og lysstyrke variation er tilstrækkelig begrænset. Ja, disse udgør udfordringer for automatisk analyse26. Hvis bevægelse af prøven mellem tilstødende rammer er overdreven, anvende en drift korrektion metode, ved hjælp af for eksempel SHG kanal som fast reference. Dette giver mulighed for at bedre foranstaltning bevægelse af celler i stedet for bevægelse af prøven. Derudover lys baggrund eller vragrester, beskære de rekonstruerede overflader ved hjælp af volumen som udvalg parameter. - Generere en co lokalisering kanal bestemt for den fælles fiskeripolitik+ celler, for at adskille signalet mellem den fælles fiskeripolitik og kollagen (SHG). Med henblik herpå, betegne en gating polygon (figur 2Bjeg), vælger kun de voxels at have en positiv intensitet, både i den grønne kanal og i den blå kanal.
Bemærk: Denne procedure kan variere alt efter filtersæt mikroskop og farvning af celler. Det kan opnås ved at vælge kun voxels med tilstrækkelig intensitet i både grønne og blå kanaler. Blandt de tilgængelige værktøjer, kan funktionen "coloc" anvendes til automatisk beregne den colocalization kanal baseret på intensitet tærskel. Derudover kan anvendes metoder baseret på maskinen læring for dette trin med tilsyn af en ekspert27. - Registrere og spore fælles fiskeripolitik+ celler, ved hjælp af automatiske overflade genopbygning og tracking (overflade værktøj) over den passende Co lokalisering kanal.
Bemærk: Manuel datasikring af eventuel tracking fejl og udelukkelse af spor med en varighed kortere end en angivet tærskel (dvs. 150 s) kan være påkrævet. - Generere en co lokalisering kanal bestemt til CD11c-YFP+ celler, for at adskille den fælles fiskeripolitik og YFP signaler. Med henblik herpå, betegne en gating polygon (figur 2Bii), vælger kun de voxels at have en positiv intensitet i den grønne kanal, men en lav intensitet i den blå kanal.
Bemærk: repræsentative micrographs viser signaler fra kanal 1, kanal 2, co lokalisering kanal for den fælles fiskeripolitik, co lokalisering kanal for YFP, og kombinationen af alle kanaler kan findes i figur 2Biii. - Rekonstruere overfladen af CD11c-YFP+ celler og spore deres position over tid (overflade værktøj).
Bemærk: Manuel korrektion af eventuelle tracking fejl er ikke nødvendig for dette trin. Ja, på grund af den komplekse spatio-temporale dynamikken i DC, rekonstruere deres præcise overflade fra 2 P-IVM data er en udfordrende opgave, der ikke kan opnås med tilgængelige segmentering software. Blandt grundene til, at gør denne opgave udfordrende, tillader tynde fremspring og lysstyrke variationer ikke for brugen af visse billedbehandling teknikker, såsom gulvafslibning filtre eller statisk tærskel. Desuden i et netværk af DC er det vanskeligt at adskille enkelt celler baseret kun på deres udseende i 2P-IVM data. For disse grunde, i stedet for at forsøge en præcis segmentering af tuning software parametre, foreslår vi at rekonstruere ikke-præcise overflader af DC. Derefter håndtere de mulige fejl ved hjælp af robust målinger som beskrevet i 5.8. -
Måle celle migration.
- Eksportere klassisk migration foranstaltninger for både fælles fiskeripolitik+ og CD11c-YFP+ celler. Blandt disse angiver "spor hastighed betyder" den gennemsnitlige vandrende lufthastighed i cellerne, mens "spore rethed" angiver retningen af cellerne. Disse foranstaltninger kan eksporteres som en regnearksfil fra den billedbehandlingsprogrammer.
- I de eksporterede regnearksfiler, beregne "korrigerede spor rethed" (også kaldet korrigeret indespærring ratio) for både fælles fiskeripolitik+ og CD11c-YFP+ celler, der defineres som "track rethed" ganget med kvadratroden af "spor varighed" divideret med kvadratroden af video varighed. Denne foranstaltning er mere robust end "spore rethed" i nærværelse af korte spor28, stammer for eksempel fra tracking fejl.
Bemærk: kun videoer af samme længde kan sammenlignes med denne foranstaltning.
-
Måle celle interaktion.
- Definere en kontakt mellem en fælles fiskeripolitik+ celle og en CD11c-YFP+ celle, hvis deres afstand (nærmest voxels) er mindre end eller lig end en tærskel (dvs. 2 μm).
Bemærk: Denne tærskel skal være tilstrækkeligt strenge til at opdage en kontaktperson, når celler er i umiddelbar nærhed. Vi opfordrer dog til at holde denne tærskel større end 0, ideelt N gange større end voxel radius (N > 2), fordi kant udjævning kan gøre genopbygningen af celler mindre end den faktiske Cellestørrelse. - Tælle antallet og varigheden af kontakter mellem den fælles fiskeripolitik+ og CD11c-YFP+ celler. I den billedbehandlingsprogrammer kan dette gøres for eksempel ved at udføre en "kys og Kør" plug i. Disse foranstaltninger kan eksporteres som en regnearksfil under fanen statistik.
- Definere en kontakt mellem en fælles fiskeripolitik+ celle og en CD11c-YFP+ celle, hvis deres afstand (nærmest voxels) er mindre end eller lig end en tærskel (dvs. 2 μm).
- Importere de tidligere beregnede foranstaltninger i en statistisk software, generere observationsområderne og udføre statistiske test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette arbejde beskrev vi en detaljeret protokol til at studere i vivo motilitet og interaktioner mellem neutrofile og DC under influenza-infektion i murine luftrøret (figur 3A). Til dette formål isoleret vi fælles fiskeripolitik+ neutrofile (92% renhed; Figur 3B) fra CK6-ECFP overført mus og vi adoptively dem til en CD11c-YFP musen smittet med influenza. Efter at udførte vi 2P-IVM af luftrøret på dag 3 p.i. På dette tidspunkt observeret vi en klar rekruttering af neutrofiler i det inficerede område, som det fremgår af analysen af handelsstrømmen cytometric (figur 3 c). 2P-IVM-protokollen kræver brug af en særlig kirurgisk bord og en ilt leverandør for gnavere (figur 1A). Levere ilt gennem en kanyle indsættes i luftrøret hjalp dyret vejrtrækning, lettet redegørelsen af luftrøret og kontrollerede den orgel bevægelse i forbindelse med vejrtrækning (figur 1B). Efter denne eksperimentelle set-up erhvervet vi stabil 4D billeder i vivo i inficerede luftrøret i en periode på 30 min (figur 3Dfilm 1).
Analysen af de erhvervede 4D billeder gennem specialiseret imaging software lov til at måle migration af celler og kvantificere spatio-temporale dynamikken i neutrofile og DC. Med hensyn til celle motilitet observeret vi betydelige forskelle mellem bevægelse i DC og de rekrutterede neutrofiler, som viste en betydeligt hurtigere hastighed end den sidstnævnte (figur 4A). Dette resultat bekræfter den dynamiske karakter af neutrofiler, tidligere beskrevet som meget motile celler i stand til at gå over til en chemoattractant kilde29. Med hensyn til retningslinier konkluderede vi at komplekse morfologi af DC givet hyppige fejl i celle tracking, som til gengæld produceret spor med nedsat varighed og øget afvigelse af de målte retningsbestemt adfærd (figur 4B). Af denne grund beregnet vi en robust metrikværdi, der er i stand til at måle direktionalitet ved at overveje spor varighed. Brug denne måleparameter, observeret vi en signifikant forskel i retningen af neutrofiler vs DC (figur 4 c).
Derudover, beregning af afstanden mellem neutrofile og DC lov til at registrere og analysere deres kontakter med tiden. I denne eksperimentelle model observeret vi nogle neutrofiler, der dannes flere korte kontakter med DC og andre der ikke danne nogen kontakt afbildet periode (figur 4D). Desuden undersøgelse af den gennemsnitlige tendens af afstanden mellem neutrofile og DC med tiden tillod os at studere den samlede positionering af de undersøgte celler (figur 4E), mens undersøgelsen af udviklingen i specifikke celler tillod at karakterisere det funktionsmåde for hver enkelt celle (figur 4FMovie 2).
Figur 1: udstyr og skridt for 2P-IVM af murine luftrøret. (Ai) Bærbare animalske anæstesi system for automatiseret ventilationen er forbundet med en pumpe, der leverer ilt til musen. Front view (Aii) og sidekig (Aiii) af skræddersyede kirurgisk bestyrelsen anvendes for trakeal model. Bestyrelsen er sammensat af en metal scenen med en plastik mus positionelle (Aii-en), en stang til at holde en bevægelig klemme (Aii-b), og en bøde afstemmelige XYZ oversætter (Aii-c). (B) sekventielle trin af luftrør kirurgisk model: (Bi) hårfjerning af det kirurgiske område, (Bii) positionering af bedøvede musen i kirurgisk bord, (Biii) kirurgisk redegørelsen af luftrøret, (Biv ) intubation med et kateter med kunstig ventilation, (Bv) fiksering af kateteret, (Bvi) tilføjelse af PBS til udsatte luftrøret (Bvii) montering af coverslip og (Bviii) placering af et kateter med anæstesi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: fluorescerende signal påvisning under 2P-IVM. (A) skematisk gengivelse af mikroskop påvisning filtrere set-up og tilsvarende kanaler. Dichroic spejl på 560 nm adskiller blå/grøn fra rød/langt rød emissioner. Yderligere dichroic spejl på 495 nm bruges til yderligere genkende de forskellige grupperinger af emission spektrum. Kanal 1 beskæftiger en hybrid detektor (emission filter 475/50), mens kanal 2 bruger høj følsomhed GaAsP PMT (emission filter 525/50). (B) repræsentative scatter dot parceller af 2 P signaler viser den gating strategi for generation af colocalization kanalerne til identifikation af signal, der kommer fra fælles fiskeripolitik (Bi) og YFP (Bii) fluorophores. (Biii) Repræsentative micrographs viser de specifikke signaler fra kanal 1 (Ch 1, mørkeblå), kanal 2 (Ch 2, grøn), co lokalisering kanal for den fælles fiskeripolitik (lyseblå), co lokalisering kanal for YFP (gul) og kombinationen af alle kanaler (Ch 1 + Ch 2 + fælles fiskeripolitik + YFP). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Intravital 4D billeddannelse af neutrofile og DC i en influenza inficerede luftrøret. (A) skematisk oversigt over protokollen. (B) repræsentative flow cytometric scatterplot viser procentdelen af neutrofiler med hensyn til de samlede CD45 + celler i en cellesuspension isoleret fra murine knoglemarven ved hjælp af metoden Percoll gradient. (C) repræsentative flow cytometric scatterplots viser en stigning i hyppigheden af neutrofiler i tracheas fra ikke-inficerede mus i forhold til mus smittet med influenzavirus på dag 3 p.i. (D) (venstre panel) anatomiske billede af en murine luftrør viser området valgt for image erhvervelse. (Højre panel) Repræsentative 3D projektion af en 2P-IVM Mikrograf viser overflade genopbygningen af neutrofiler (lyseblå) og DC (gul) sammen med deres spor på dag 3 p.i. SHG signal er vist i mørk blå. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: karakterisering af neutrofile og DC migration og interaktion dynamikker i influenza inficerede luftrøret. Repræsentative parceller viser spor hastighed betyder (A), spore rethed (B), og korrigeret spor rethed (C), som defineret af Beltman og kolleger (2009)28, neutrofiler og DC i luftrøret på dag 3 p.i. med influenzavirus. Korrigeret spor rethed måling udstiller robusthed til sporing af fejl. (D) 2D histogrammet viser hyppigheden af neutrofile ifølge deres antal af kontakter med DC og den gennemsnitlige kontakt varighed. (E) gennemsnitlige afstand af neutrofiler til den nærmeste DC i løbet af filmen. (F) (venstre) analyse af afstand af en repræsentant neutrofile til den nærmeste DC i tid. Den prikkede røde streg angiver afstanden tærskel for at overveje, at en neutrofile etableret en kontakt med en DC. (Ret i-iii) Micrographs erhvervet på forskellige tidspunkter der repræsenterer overgangen af en neutrofile (lyseblå) mod en DC (gul). Celle spor er vist som en flerfarvede linje, der skifter farve fra blå til rød repræsenterer tid. SHG signal fra fibrillære kollagen er vist i mørkeblå. Skalalinjen = 50 µm. I alle tal er de præsenterede data repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Resultaterne er gengivet som betyder ± SD. statistik af Welch's test. NS p > 0.05; p < 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: neutrofile og DC dynamics i luftrøret under influenza-infektion,. 30 min time-lapse 3D billede viser interaktion dynamik mellem neutrofile (lyseblå) samt DC (gul) og deres respektive spor med hensyn til kollagen netværk (mørkeblå) af luftrøret. Repræsentative neutrofile-DC interaktioner er angivet med hvide pile. Celle spor er vist som en flerfarvede linje, der skifter farve fra blå til rød repræsenterer tid. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Movie 2: repræsentative kortsigtede neutrofile-DC interaktion i luftrøret under influenza-infektion,. 30 min time-lapse 3D billedet viser et repræsentativt interaktion mellem en neutrofile (lyseblå) og en DC (gul) og deres respektive spor. Celle spor er vist som en flerfarvede linje, der skifter farve fra blå til rød repræsenterer tid. SHG signal fra kollagen er vist i mørkeblå. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde præsenterer en detaljeret protokol for generation af 4D billeder viser migration af adoptively overførte neutrofile og deres interaktioner med DC under et influenza-infektion i mus luftrøret. Den beskrevne 2P-IVM model vil være relevante at studere immun celle dynamics under en infektion i luftvejene.
For nylig, flere modeller baseret på visualisering af celle dynamics i luftvejene har været udviklede9,10,11,12,13,14,15 ,16. Men, i vivo billeddannelse af lungerne er stadig udfordrende, overvejer dette organ og de tekniske vanskeligheder at minimere bevægelse i løbet af vejrtrækning cyklus30anatomisk stilling. For at overvinde disse problemer, har nogle forfattere foreslået brugen af et specialbygget cirkulært suge kammer, som skal være kirurgisk indsat i thorax13,14. Denne procedure kræver imidlertid en invasive indgreb, der kunne kompromittere resultater, især i de undersøgelser, der har fokuseret på undersøgelser af det inflammatoriske respons. Derudover præsentere lunge kirurgisk modeller en begrænsning for dybe væv imaging på grund af den lette brydning stammer fra luften i alveolerne17. Omvendt, forskellige trakeal modeller har været for nylig ansat til at studere cellen dynamics i luftvejene epitel. Billeddannelse af dette organ præsenterer klare fordele i forhold til lunge, såsom den relativt simple kirurgi kræves for at afsløre og immobilisere orgel, samt den højere tilgængelighed til trakeal epitel. Den foreslåede trakeale model er også relevant at undersøge indledningen af svaret mod luftvejs patogener, såsom influenza-virus, da luftrøret er en af de første steder i viral replikation i løbet af en influenza-infektion8.
Interessant, udgivet en undersøgelse, der viser en alternativ intubation-fri metode til imaging luftrøret har været for nylig12. Denne metode er karakteriseret ved en nedsat inflammation og viser klare fordele i studier, hvor funktionen mucociliarity af epitelceller skal bevares. Men denne metode kan ikke garantere tilstrækkelig stabilitet og erhvervelse af lysere signaler nødvendigt at studere celle-celle kontakter i en vifte af nogle få µm. derimod metoden præsenteret i den nuværende protokol giver bedre immobilisering af orglet Takket være intubation, og giver mulighed for påvisning af stærkere fluorescens signaler som følge af den kortere afstand mellem orgel og coverslip12.
Varetagelse af væv immobilisering under i vivo 2 P-IVM billede erhvervelse er den mest afgørende skridt at skabe optimale data. Nogle afgørende foranstaltninger, der bidrager til stabiliteten i den præsenterede metode omfatter: en passende mus anæstesi; en korrekt mus intubation; og en kirurgisk redegørelsen af luftrøret, der giver nem adgang til orglet af coverslip. Derudover vil imaging det rigtige antal celler (ideelt 30 celler pr. synsfelt) styrke de opnåede resultater. Rekruttering af det optimale antal celler vil i vid udstrækning afhænge af virusinfektion dosis, som er meget påvirket af en korrekt forvaltning af den virale inokulum.
En anden kritisk trin i protokollen er kirurgisk redegørelsen af luftrøret. Kan træffes forskellige foranstaltninger for at minimere skader på orglet under kirurgi. For eksempel, bør luftrøret ikke direkte berøres med kirurgiske værktøjer. I stedet bør det blive udsat ved at manipulere med kun de omkringliggende væv (hud, spytkirtler og muskler). Hvis det er strengt nødvendigt, skal luftrøret håndteres ved hjælp af unsharpened elementer. Derudover skal gøres bestræbelser for at undgå beskadigelse af blodkar. Endelig, for at forhindre orgel dehydrering, det er også vigtigt at dække det med PBS straks efter operationen.
Trods de unikke fordele ved denne metode over de tidligere beskrevne metoder for visualisering af immun celle interaktioner i trakeal slimhinde præsenterer bruger denne model nogle begrænsninger. Som beskrevet ovenfor, kan tilstedeværelsen af inflammation i forbindelse med luftrør operationen udgør en ulempe, når man studerer immunrespons. For at overvinde denne begrænsning, er det muligt at administrere anti-inflammatoriske lægemidler forud for indledningen af proceduren. En anden begrænsning af denne model er relateret til tilstedeværelse af en stærk autofluorescence signal i luftvejene, som er primært genereret af de hjemmehørende celler og mukuslagets. Denne ikke-specifikke fluorescens skaber artefakter, der kan hæmme analysen. Vildledende beregning af spor rethed parameter kan desuden oprettes, når sammenligne celle spor af forskellig varighed, og når tracking fejl indføre spor af kort varighed26. For at løse dette problem, anvendte vi en straf koefficient for at rette spor rethed. Sådan korrektion er beregnet til at minimere effekten af miss-tracking resultater28.
Et afgørende aspekt af 2P-IVM forsøg er muligheden for at genbruge mus, der har gennemgået kirurgi og billedbehandling. Den i vivo billeddannelse protokollen beskrevet her kræver ikke animalsk eutanasi eller orgel samling, hvilket giver mulighed for at genoprette og genbruge mus efter operation for andre procedurer. Ved hjælp af et enkelt museklik, for eksempel, til at udføre luftrøret imaging på andet tidspunkt punkter kan dramatisk reducere antallet af samlede dyr behov i et eksperiment, støtte princippet animalske reduktion . Desuden kunne det også reducere mellem individuelle variation. Men dyr nyttiggørelse og genbrug skal følge dyrevelfærdsnormer, der omfatter forvaltning af ordentlig smertestillende medicin og antibiotika til dyrene under restitutionstid. Alle disse procedurer skal være inkluderet i dyreforsøg protokol og godkendt af de lokale dyrlæge myndigheder.
Den beskrevne protokol kan tilpasses nemt til studiet af andre immun celletyper. For eksempel, kan isolation og injektion af (fluorescerende eller bejdset) patogen-specifikke T-celler bruges til at studere T-celle aktivering dynamics31 samt deres interaktion med andre celler såsom trakeal DC. På en lignende måde, kunne visualisering af blod eller lymfe-fartøjer repræsentere en interessant tilgang til at studere rekruttering af inflammatoriske celler i det trakeale væv i løbet af infektionen. 2P-IVM af luftrøret kunne desuden også anvendes til at studere dynamikken i immunrespons til andre luftbårne patogener. Derfor vil brugen af transgene fluorescerende luftbårne patogener, såsom Streptococcus pneumoniae32, skabe nye muligheder for at studere deres interaktioner med immunsystemet. Selv om denne fremgangsmåde fokuserer på at måle dynamikken i immunceller under infektion, kan det også anvendes til forskellige felter, herunder kræft, astma, eller sårheling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af de schweiziske nationale Foundation (SNF) tilskud (176124, 145038 og 148183), den europæiske Kommissionen Marie Curie-reintegrationsstipendium (612742) og SystemsX.ch for et tilskud til D.U.P. (2013/124).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3x 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20 °C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20 °C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20 °C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20 °C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
References
- Helmchen, F., Denk, W.
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
- Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694 (2017).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
- Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R.
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
- Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
- Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
- Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
- Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
- Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
- Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
- Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
- Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
- Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
- Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881 (2016).
- Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).
