Summary
이 연구에서는 선물이 인플루엔자 바이러스 감염 후 murine tracheal 점 막에서 2 광자 intravital 이미징 및 세포 상호 작용 분석을 수행 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 호흡기 감염 시 면역 세포 역학을 공부 하는 연구자와 관련이 있을 것입니다.
Abstract
셀 또는 셀-병원 체 상호 작용에서 생체 내에서 의 분석 감염에 면역 반응의 역학을 이해 하는 중요 한 도구입니다. 2 광자 intravital 현미경 검사 법 (2 P-IVM) 이미지 수집 중에 생성 된 photobleaching를 최소화 하면서 생체, 깊은 조직에 세포 상호 작용의 관측을 허용 한다. 날짜 하려면, 다른 모델 2 P-IVM 림프 및 비 림프 기관에 대 한 설명 되었습니다. 그러나, 호흡 기관의 이미지는 동물의 호흡 주기와 관련 된 운동으로 인해 도전 남아 있습니다.
여기, 우리 2 P IVM를 사용 하 여 인플루엔자 바이러스에 감염 된 쥐의 면역 세포 상호 기도에 vivo에서 시각화 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 목적에 우리 외과 노출 및 호 중구 및 점 막 상피에서 수지상 세포 (DC)의 동적 이미지의 취득 다음, 기도의 삽 관 법을 포함 하는 사용자 지정 이미지 플랫폼을 개발 했다. 또한, 우리 인플루엔자 intranasal 감염 및 흐름 cytometric 분석 면역 세포의 기도에 수행 하기 위해 필요한 단계 자세한. 마지막으로, 우리 분석 neutrophil DC 운동 뿐만 아니라 그들의 상호 작용 영화의 과정. 이 프로토콜은 기도에서 세포 세포 상호 작용의 평가에 필요한 안정적이 고 밝은 4 D 이미지의 생성에 대 한 있습니다.
Introduction
두 광자 intravital 현미경 검사 법 (2 P-IVM) 실시간 이미징 세포 세포 상호 작용의 그들의 자연 환경1에서 발생에 대 한 효과적인 기술입니다. 이 방법의 주요 장점 중 하나는 다른 전통적인 이미징 기술을2에 비해 더 큰 견본 깊이 (1 m m 500 µ m)에서 세포질 과정의 학문을 허용 한다. 같은 시간에 두 광자 레이저에 의해 생성 된 두 개의 낮은 에너지 광자를 사용 하 여 일반적으로 이미지 수집 과정2와 관련 된 조직 사진 손상 최소화 합니다. 지난 10 년 동안 2 P IVM 여러 분야3,,45에서 세포 세포 상호 작용의 다른 유형을 공부에 적용 되었습니다. 이 연구는 특히 면역 세포, 그들의 높은 역동성과 다른 세포와 환경에 의해 발생 하는 신호에 따라 눈에 띄는 연락처의 형성에 의해 특징 조사에 관련 된 되었습니다. 2 P-IVM 또한 병원 체 및 호스트6간의 상호 작용을 공부에 적용 되었습니다. 실제로, 그것은 이전 표시 되었습니다 일부 병원 체 종류와 면역 세포, 방해, 결과적으로 면역 반응7사이의 연락처의 기간을 변경할 수 있습니다.
기도 점 막 첫 번째 사이트는 공 수 병원 체에 대하여 면역 반응을 생성8입니다. 따라서, vivo에서 이 조직에서 호스트 병원 체 상호 작용의 분석은 감염 시 호스트 방어 메커니즘의 개시를 이해 하는 것 중요 합니다. 그러나, 기도의 2 P IVM 이미지 수집의 과정을 타협 하는 동물의 호흡 사이클을 제작한 유물 때문에 주로 도전 이다. 최근, 다른 외과 모델 이미징 murine 기관9,10,,1112 및 폐13,14,15, 설명 되었습니다. 16. Tracheal 2 P-IVM 모델 폐 포 2 P IVM 모델은 더 적당 한 감염의 늦은 단계를 공부 하는 동안 위의 기도에 면역 반응의 초기 단계를 시각화 하는 우수한 설치를 나타냅니다. 개발된 폐 모델 제시는 레이저의 광 침투를 제한 하 고 intrapulmonary 기도의 점 막 층을 vivo에서 17 이미징에 대 한 액세스할 수 있도록 공기 채워진 폐 포의 존재와 관련 된 제한 . 반대로, 연속 상피에 의해 형성 된 기관지의 구조는 이미지 수집을 촉진 한다.
여기, 우리가 현재 인플루엔자 감염, 동물, 수술 준비와 기도의 2 P IVM 수행 하는 데 필요한 단계에 대 한 자세한 설명을 포함 하는 프로토콜. 또한, 우리는 호 중구 및 모 수석 세포 (DC), 인플루엔자 바이러스18,19에 대 한 방어 메커니즘의 중재자로 중요 한 역할을 재생 하는 두 개의 면역 세포 유형의 시각화에 대 한 특정 실험 설정 설명 . 마지막으로, 우리는 neutrophil DC 상호 작용을 분석 하는 절차를 설명 합니다. 이 연락처 DC 활성화 변조 표시 되었습니다 및, 그 후, 병원 균20에 대 한 면역 반응에 영향을 미칠.
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Protocol
모든 동물 절차 관련 된 마우스 스위스 연방 수의 관리 지침 및 동물 프로토콜 수행 된 현지 수 의사 당국에 의해 승인 되었다.
1. 인플루엔자 감염 CD11c YFP 마우스의
- Biosafety
참고: (PR8) A/Puerto 토 리코/8/34 H1N1 인플루엔자의 마우스 적응 변형 수정 된 난 자에서 성장, 정화 되었고 앞에서 설명한21로 적정. 모든 감염된 한 동물 또는 생물 학적 샘플 단계 실시 biosafety biosafety 수준 (BSL)에 따라 캐비닛 아래 2 조건.- 감염 절차 전후 70% 에탄올 솔루션 biosafety 내각을 청소.
- 적절 한 누가 biosafety 지침 (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf)에 따라이 절차 동안 생산 하는 모든 폐기물을 폐기. 멸 쓰레기통에 고체 폐기물 및 비닐 봉지 가득 70% 에탄올 솔루션 또는 의료 살 균에에서 오염 된 액체를 삭제 합니다.
- 인플루엔자 intranasal 감염
참고: B6. Cg-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c YFP)22 C57BL/6J 배경에이 연구에 사용 되었다. 마우스는 특정 병원 체-무료 시설에서 연구를 위한 학회에 의학에서 유지 되었다.- 감 금 소 당 최대 5 나이 및 성별-일치 (6 8 주 오래 된에) CD11c YFP 마우스를 놓습니다. 최소한 이틀 전에 감염 절차 주택 조건에 쥐 새 환경 순응에 대 한 기다립니다.
- PR8 주식에 서 리 없애다 30 µ L. 계속 바이러스 희석에서 감기 1 x Dulbecco의 인산 염 버퍼 수정 염화 칼슘과 염화 마그네슘 (PBS) 200 플 라크 형성 단위 (PFU)의 최종 농도를 사용 하 여 해당 희석을 준비 하 고 에 모든 절차 동안 얼음.
참고: 그것의 사용 이전에 인플루엔자 바이러스의 모든 배치의 적정 정확한 감염 복용량 되도록 것이 좋습니다. - Intraperitoneally 케 타 민 (100mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 복용량을 주사 (i.p.) 26 G 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여.
- 마우스는 완전히 마 취 (righting와 페달 철수 반사의 완전 한 손실) 될 때까지 기다립니다. 아니 완전히 마 취 쥐 제비 것 또는 변화 감염 복용량에 선도 바이러스 inoculum을 추방 이후 깊은 마 취는 최적의 감염, 필요 합니다.
- 부정사 위치에 마 취 마우스를 놓습니다. 바이러스 inoculum의 15 µ L를 수집 합니다. 마우스 왼쪽된 콧구멍에 가까운 피 펫 팁 놓고 바이러스 inoculum 드롭 하 여 분배 합니다. 방울을 흡입 해야 합니다로 할 하지 플라스틱 그들 직접 캐비티 내부에 코.
- 2-5 분을 기다려 하 고 오른쪽 콧구멍에서 바이러스 inoculum의 나머지 15 µ L을 포함 하는 피 펫 팁을 배치.
참고: 질 식 하지 않으려면, 약 20 s 간격에 작은 크기의 방울을 분배. - 마우스 올바르게 호흡을 확인 하 고 옆 decubitus에 감 금 소에 배치. 마우스 호흡 마 취 회복 (유도 후 약 60 분)를 모니터링 합니다.
참고: 그것은 동시에 1 이상의 마우스를 감염 수 있습니다. 이 경우 시퀀스에 있는 모든 쥐의 왼쪽된 콧구멍에서 바이러스 inoculum을 관리 하 고 2-5 분을 기다리는 다음 오른쪽 콧구멍에서 바이러스 관리. 개인 사이 가변성을 방지 하려면 동시에 더 이상 3 쥐를 감염. - 동물의 건강 상태와 체중 감량을 매일 모니터링 합니다.
- 기관 지침에 의해 결정 하는 인간적 끝점에 따라 마우스를 안락사 안락사 방법은 동물 실험 기관에 의해 승인을 받아야 하며, 현지 윤리 규정을 존중해 야 합니다. 2 광자 실험 후 케 타 민/xylazine 뒤에 자 궁 경부 전위의 과다 복용의 행정에 의해 마우스를 안락사. 모든 다른 실험에서 CO2 흡입 안락사에 대 한 방법으로 사용 합니다.
참고: 감염 된 기관, 50% 조직 문화 감염 복용량 (TCID50) 분석 결과 또는 실시간 중 합 효소 연쇄 반응의 바이러스 titers 측정 하 (RT-PCR) 분석 결과 앞에서 설명한23으로 수행할 수 있습니다.
- Cytometry에 의해 기관지에서 호 중구 채용의 평가
참고: 프로토콜의이 부분은 선택 사항입니다. 그것은 인플루엔자 감염 다음 tracheal 점 막에서 호 중구 모집을 평가 하는 것을 목표로.- CO2 흡입에 의해 3 일 후 감염 (탐정)에 감염 되 고 감염 되지 않은 컨트롤 마우스를 안락사.
참고: tracheal 손상을 방지 하기 위해 동물을 안락사를 자 궁 경부 전위를 사용 하 여 피하십시오. 또한, 안락사 쥐의 관류는 혈액 호 중구에서 오염을 방지 하는 것이 좋습니다. - 70% 에탄올 솔루션 마우스 목 스프레이 하 고 가슴에서 턱을 수술가 위를 사용 하 여 피부 절 개를 수행 합니다.
- 집게를 사용 하 여 침 샘 하 고 기도 노출 합니다.
- 집게와가 위를 사용 하 여 기관지 주위 근육 해 부.
참고:이 단계가 수행 되어야 합니다 신중 하 게 기도 절차 동안 쉽게 손상 될 수 있기 때문. - 집게와 함께 기도 누른 조심 스럽게 절 개 식도 분리.
- 집게와 기도의 intrathoracic 부분을 잡고, 기관지 나무의 시작 부분에 절 개를 확인 합니다. 다음 후 두에서 기관지를 분리 하 고 왼쪽의 모든 근육을 조심 스럽게 제거.
- 포함 된 RPMI 1640 + 얼음에 HEPES 매체 (RPMI) 1.5 mL 튜브에 장기를 놓습니다.
- 콜라 (I 및 II)의 0.26 단위/mL과 0.2 mg/mL DNase의 포함 된 기관 소화 효소 혼합물 준비 RPMI에 나.
- 해 부 기도 효소 혼합물의 1 mL를 포함 하는 6-잘 접시에 놓습니다.
- 기관 집게와가 위의 도움으로 작은 조각으로 잘라. 이 단계 동안 얼음에 플레이트를 유지.
- 45 분 동안 37 ° C에서 품 어. 이 시간 동안 접시 마다 15 분 흔들.
- PBS에서 FACS 세척 버퍼 (2 mM EDTA와 2% 열 비활성화 필터 살 균 태아 둔감 한 혈 청 (FBS))의 1 mL을 추가 하 여 효소 소화를 중지 합니다.
- 1 mL 피 펫을 조직의 부분적으로 소화 되지 않은 조각 끊을 수 있도록 솔루션 resuspend
- 40 µ m 스 트레이너를 통해 콘텐츠를 전달 하 여 솔루션을 다른 영역 전송. 그런 다음, 부드럽게 2 mL 주사기 플런저를 사용 하 여 여과기 위에 갇혀 오르간의 나머지 조각 분쇄.
참고: 흐름 cytometric 분석 하는 동안 셀의 최적 수를 얻기 위해 중요 한 단계는 스 트 레 통해 기관지의 부분적으로 소화 되지 않은 조각 스매싱. - 워시 우물 및 FACS 세척 여과기 버퍼 전송 5 mL 튜브에 서 스 펜 션은 얼음에 보관.
- 166 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 관을 원심 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 세척 버퍼의 100 µ L에 셀.
- Cytometry에 대 한 항 체 표면 얼룩과 진행 합니다. 간단히, CD16/32, 뒤에 표면 얼룩에 대 한 항 체를 사용 하 여 격리 된 세포의 Fc 수용 체를 차단 합니다. 중 성구를 제대로 식별 하려면 흐름 cytometry 패널 다음 항 체를 포함 해야 합니다: 죽은 세포를 제외 하는 생존 능력 뿐만 아니라 αLy6G, αCD11b, αCD45, 염료.
- 교류 cytometer에 샘플의 전체 콘텐츠를 실행 하 고 데이터를 분석.
- 면역 세포의 최적 수를 얻으려면 단일 셀 서 스 펜 션 높이 3000 이벤트/s 보다 빠른 속도로 실행 합니다. 이 이벤트는 중 제외 수를 줄일 것입니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 그것은 기관 당 셀 1에 2 백만 얻기 위해 가능 해야 합니다.
- CO2 흡입에 의해 3 일 후 감염 (탐정)에 감염 되 고 감염 되지 않은 컨트롤 마우스를 안락사.
2. 절연 및 호 중구의 주입
참고:이 절차에서는, B6.129 (ICR)-Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J 쥐 (CK6-ECFP) 사용된24했다. 이 동물 인간의 β-말라 발기인에 따라 모든 셀 형식에 CFP를 표현 한다. 또는 그것은 또한 세포를 격리 하 여 단계 2.6에에서 설명 된 프로토콜에 따라 얼룩 C57BL/6J 마우스를 사용 하 여. 정화와 호 중구의 조작 잠재적으로 그들의 철새 및 기능 속성을 변경, 그들의 활성화 상태를 증가할 수 있습니다.
- CO2 흡입 하 여 동물을 안락사.
- 화관과 tibias 제거 하 고 부드럽게 그들을 청소 집게를 사용 하 여.
- 뼈 epiphyses 고 얼음에 보관 50 mL 튜브에 살 균 차가운 PBS 가득 1 mL 주사기를 사용 하 여 골을 플러시.
- 18 G 바늘 셀 resuspend 고 40 μ m 스 트레이너와 세포 현 탁 액을 필터링 합니다. 110 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 PBS를 가진 한 번 세척 하 고 차가운 PBS의 2 mL에 셀 resuspend.
-
100% 희석 Percoll 9:1 10 x PBS에서 72%, 64%, 52 %1 x PBS를 사용 하 여 percoll의 그라데이션 솔루션을 준비 하 고. 조심 스럽게 2 mL 각 15ml 튜브에서 3 그라디언트 레이어, 하나 집중 가장에서 시작.
- 가속 및 브레이크 없이 실 온 (RT)에서 30 분 동안 1100 x g 에서 그라디언트 및 원심 분리기 골 수 세포 현 탁 액의 신중 하 게 2 개 mL를 추가 합니다.
- 조심 스럽게 64%와 72% 사이의 인터페이스에서 밴드를 제거 하 고 차가운 PBS와 4 ° C에서 5 분 동안 200 x g 에 한 번 씻어. PBS의 100 μ의 볼륨에 셀 resuspend 하 고 얼음에 그들을 유지. 호 중구의 순도 90% 보다 높을 것으로 예상 된다.
- 필요에 따라 레이블 호 중구 세포 확산 키트 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여. 1 mL의 볼륨에서 10 μ M의 최종 농도에 세포 현 탁 액을 염료를 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어 세척 (166 x g, 5 분).
- 세포 농도 hemocytometer를 사용 하 여 추정 하 고 정 맥 5 x 106 셀 26 G 바늘 1 mL 주사기, 이미징 하기 전에 12 h를 사용 하 여 이전 감염된 CD11c YFP+ 마우스에서 100 μ의 최대 볼륨을 주입.
3. 영상에 마우스를 준비
-
마 취
- 1.2.3 단계에 따라 주 3 탐정에서 감염된 CD11c YFP+ 마우스 anesthetize
- 쥐 취 깊이 일단 마 취는 다시 먹이 지에 대 한 카 테 터를 준비 합니다.
- 집게를 사용 하 여 주사기에서 30g 바늘을 제거 합니다.
- PE 10 의료 실리콘 튜브 20 cm 조각에 바늘을 삽입 합니다.
- 튜브의 다른 쪽에 케 타 민/xylazine 혼합물으로 채워진 30 G 바늘 주사기를 삽입 합니다.
- 튜브 내부 공기를 제거 합니다.
- 20g 카 테 터 (그림 1A나) 자동된 환기를 유지 하는 산소 insufflating 기계에서 튜브에 연결을 준비 합니다. 100% 산소 가스 공급을 사용 하 여 0.2 mL의 해 양으로 130 분당 (b.p.m.)의 호흡 비율에 그것을 설정 합니다.
-
수술에 대 한 마우스를 준비
- 열띤된 접시 또는 수술의 모든 시간에 대 한 37 ° C에서 설정 온수 외과 벤치 특정 사용자 지정 된 외과 보드 (그림 1Aⅱ-3)에 마우스를 유지.
- 전기 면도기와 depilatory 크림을 사용 하 여 마우스의 목에서 머리를 면도 (그림 1B나).
- 위치 플라스틱 마우스 위에 마우스를 놓습니다 (그림 1Aii-a), 유지은 위치 외부 동물 머리 (그림 1Bii) 기관 삽 관 법을 용이 하 게 하는 각도 만들려고.
- 외과 테이프와 앞 발, 발, 꼬리를 해결 하 고 농축 비타민 A 젤 마우스 눈을 축 축 하 게 마우스 목 (그림 1Bii) 소독.
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수술
- 제대로 압력가 항목, 즉,가 위, microsurgical가 위와 집게를 준비 합니다.
- 목, 약 1 ㎝ 길이, 상단의 가슴 및 mandible (그림 1Biii)의 낮은 지점을 통과 하는 선 사이의 중간 영역에서의 긴 중간 축에 작은 절 개를 수행 합니다.
- 피부 패치 및 침 샘 옆으로 이동 하 고 근육에 의해 덮여 기도 시각화. 그런 다음, 집게 (그림 1Biii)를 사용 하 여 신중 하 게 tracheal 근육 해 부.
- 카 테 터와 마우스를 넣어야 하 고 인공 환기 (그림 1Biv)를 시작 합니다.
참고: 테 tracheal 점 및 내부 철 바늘 보호 외부 플라스틱 부품의 구성 됩니다. 바늘의 존재는 확장 하 고 기도 안정화 하 고 그것의 박람회를 규제 하는 이상적인 솔루션을 나타냅니다. 카 테 터를 통해 인공 환기는 마우스의 적절 한 호흡을 보장할 것 이다. - 즉시 인공 환기 호흡 모니터를 시작 합니다.
- 카 테 터 높이 방향을 외과 보드 (그림 1Aii b) 특정 막대에 연결 된 외과 후크 (그림 1Bv)를 사용 하 여 수정 합니다. 턱의 같은 높이에서 기관지를 노출 합니다.
- 석유 젤리와 기도 둘러싸 자 고 보장 기관 (그림 1Bvi)에 적절 일 분을 미리가 열된 PBS의 몇 방울으로 그것을 커버.
- 준비 위에 coverslip을 탑재 합니다. 이 단계에 대 한 XYZ 번역기 (그림 1Aii-c)을 나사로 죄 어 질 것 이다 금속 홀더 (그림 1Bvii)에 coverslip 접착제. 수술 준비 위에 coverslip를 XYZ 번역기를 조정 합니다.
- Intraperitoneally는 마 취의 관리에 대 한 카 테 터를 놓습니다 (그림 1B8 조).
- 케 타 민/xylazine 혼합 매 30 분의 초기 복용량의 50%를 주사.
참고: 안전 하 고 유효한 다른25는 초기 케 타 민/xylazine 혼합물의 25 %50 %에서 다시 먹이 지. 그러나,이 프로토콜은 터미널 전체 절차 동안 동물의 엄격한 동원 정지는 필요 때문에, 마 취의 깊은 수술 평면을 유지 하기 위해 더 높은 복용량을 사용 합니다.
4. 생체 내에서 시간 경과 영상
참고: 이미지 수집 2 Ti:Sa 레이저, 외피 온도-제어 약 실, 및 25 X, 직 립 2 광자 현미경으로 수행한 나 1.1 집중 목적 물 /. 이미지 수집에 사용 되는 photomultipliers (PMT) 하이브리드 감지기 또는 높은 감도 GaAsP 했다.
- 챔버 내부에 현미경 인큐베이션 (사전 37-38 ° C에 온수) 마 취 마우스와 함께 외과 보드를 놓고는 coverslip에 물 한 방울을 추가 합니다.
- 센터 및 찾기 tracheal 조직에 초점입니다.
-
520 x 520 픽셀, 440 x 440 μ m2 의 시야 800 hz, 스캐닝 주파수를 설정 하 고 줄 평균 1.
- 조정 Ti:Sa 레이저 830 nm 콜라겐, 150의 소스에서 나타내는 힘에서 둘째로 고조파 생성 (SHG)를 자극 mW. 920에서 두 번째 Ti:Sa 레이저 조정 94 nm 소스, CFP와 YFP 자극에 mW.
- 3D 및 동시 여기 timelapse 획득 모드
참고: photobleaching 및 phototoxicity을 최소화 하기 위해 가능한 한 낮은 레이저 파워를 계속.
- 비 descanned 모드, 560에서 마스터 dichroic 거울에에서 두 개의 채널을 사용 하 여 레코드 형광 nm. 이 프로토콜에 사용 되는 설정, 두 번째 dichroic 거울 분할 495에서 신호 분리 nm 채널 1 (방출 필터 475/50) 채널 2 (배출 필터 525/50)에서 (그림 2A). 이 구성 CFP 방출 두 채널 1과 2에에서 수집과 YFP 채널 2에만 수집 하는 동안 SHG 첫 번째 채널에 콜라겐에서 빛을 수집 합니다.
- 3 μ m (복 크기 0.86 ㎛ x 3 μ m)의 단계 크기는 Z 축 범위 50 μ m를 정의 합니다. 기록 이미지 매일 30 30 분의 총 시간에 대 한 s.
- 원하는 경우, 여러 영역을 취득 합니다. 더 많은 인수를 실행 하기 전에 생체 신호를 확인 하 고 reinject (단계 3.3.10 참조) 필요한 경우 카 테 터를 통해 마 취.
- 이미징 프로세스의 끝에, 케 타 민/xylazine 과다 자 궁 경관 탈 구 다음을 통해 마우스를 안락사.
5. 이미지 Neutrophil DC 운동 성 및 상호 작용의 처리 및 정량 분석
참고:이 프로토콜에 전문된 이미징 소프트웨어 현미경 데이터를 분석 하는 데 사용 되었다.
- 4 D 이미지 수집 완료 후 충분 한 계산 리소스를 가진 워크스테이션에 (데이터 및 메타 데이터) 파일을 전송 (최소 시스템 요구 사항을 제안: 32 기가바이트 RAM, 빠른 solid-시-드라이브, 최근 CPU, GPU에 따라 전용 한 대규모 병렬 아키텍처)입니다.
- 이미징 소프트웨어에 파일을 엽니다.
- 비디오를 재생 하 고 관심사의 세포 명확 하 게 표시 하 고 이미징 아티팩트 결 석 하다.
참고: 이 샘플 움직임 밝기 변화 모두는 충분히 국한 하는 것을 확인. 사실, 자동 분석26에 대 한 도전을 나타냅니다. 인접 한 프레임 간의 샘플 운동의 과도 한 경우에, 예를 들어 SHG 채널을 참조 하 여 고정 드리프트 보정 방법 적용. 그러면 더 나은 측정 하는 세포의 움직임 보다는 샘플의 움직임. 또한, 밝은 배경이 나 파편의 존재는 선택 매개 변수로 서 볼륨을 사용 하 여 복원된 표면 가지 치기. - CFP와 콜라겐 (SHG) 신호를 분리 하기 위하여 CFP+ 세포에 대 한 공동 지역화 채널 특정을 생성 합니다. 이 위해, 제어 다각형을 (그림 2B나) 녹색 채널와 파랑 채널에 긍정적인 강도 갖는 복만을 선택 하는 나타냅니다.
참고:이 절차는 현미경의 필터 집합 및 셀의 얼룩 달라질 수 있습니다. 그것은 녹색 및 파랑 채널에 충분 한 강도 가진 복만을 선택 하 여 얻을 수 있습니다. 사용 가능한 도구 중 강도 임계 처리에 따라 colocalization 채널을 자동으로 계산을 "coloc" 기능을 사용할 수 있습니다. 또한, 기계 학습 기반 방법 전문가27의 감독으로이 단계에 대 한 사용할 수 있습니다. - 검색 및 c f P+ 세포, 자동 표면 재구성을 사용 하 여 및 적절 한 공동 지역화 채널을 통해 (표면 도구)을 추적 추적.
참고: 최종 추적 오류 수동 변호사 및 트랙 (즉, 150 s) 정의 된 임계값 보다 짧은 기간을 제외 해야 합니다. - CFP와 YFP 신호를 분리 하기 위하여 CD11c YFP+ 세포에 대 한 공동 지역화 채널 특정을 생성 합니다. 이 위해, 녹색 채널에 긍정적인 강도 하지만 파랑 채널에 낮은 강도 갖는 복만을 선택 하는 제어 다각형을 (그림 2Bii)을 나타냅니다.
참고: 신호를 채널 1, 채널 2, CFP에 대 한 공동 지역화 채널, YFP에 대 한 공동 지역화 채널 모든 채널의 조합을 보여주는 대표적인 현미경 그림 2Biii에서 찾을 수 있습니다. - CD11c YFP+ 세포의 표면 재구성 하 고 시간 (표면 도구)에 그들의 위치를 추적 합니다.
참고: 최종 추적 오류 수동 수정이이 단계에 대 한 필요 하지 않습니다. 실제로, DC의 복잡 한 역학 spatio 시간적으로 사용할 수 있는 세그먼트화 소프트웨어와 함께 얻을 수 없는 도전적인 작업입니다 2 P IVM 데이터에서 그들의 정확한 표면 재구성. 이 작업을 도전 하는 이유, 사이 얇은 돌출 및 밝기 변화 허용 하지 않습니다 필터 되거나 정적 임계 처리와 같은 특정 이미지 처리 기술의 사용에 대 한. 또한, DC의 네트워크, 그것 어렵다 2 P IVM 데이터에 그들의 외관에만 기반으로 하는 단일 세포를 분리. 이러한 이유 보다는 소프트웨어 매개 변수를 조정 하 여 정확한 세분화를 시도, DC의 비 정확한 표면 재구성을 제안 한다. 그런 다음 5.8에 설명 된 대로 강력한 통계를 사용 하 여 가능한 오류를 처리. -
측정 셀 마이그레이션.
- C f P+ 와 CD11c YFP+ 세포에 대 한 고전적인 마이그레이션 조치를 내보냅니다. 이 사이 "트랙 속도 평균" 셀의 방향을 나타냅니다 "추적 직진도" 셀의 평균 이동 속도 나타냅니다. 이러한 조치는 이미징 소프트웨어에서 스프레드시트 파일로 내보낼 수 있습니다.
- 내보낸된 스프레드시트 파일에서 "수정 된 트랙 직진도" (수정된 감 금 비율 라고도 함) 계산 CFP+ 와 CD11c YFP+ 세포는로 정의 됩니다 "트랙 직진도"의 제곱근을 곱한 비디오 기간의 제곱근으로 나눈 "추적 기간". 이 측정은 "" 짧은의 직진도 추적 추적28, 예를 들어 추적 오류에서 발생 하는 보다 더 강력한입니다.
참고: 동일한 길이의 동영상만이 측정으로 비교할 수 있습니다.
-
세포 상호 작용을 측정 합니다.
- 그들의 거리 (가까운 복) 임계값 (즉, 2 μ m) 보다 더 적은 또는 동등한 경우 CFP+ 세포와 CD11c YFP+ 세포 사이 접촉을 정의 합니다.
참고:이 임계값 충분히 엄격한 셀 가까운 위치에 있는 경우에 연락처를 검색 해야 합니다. 그러나, 우리는 이상적으로 N 번 복 반경 보다 큰 0 보다 큰이 임계값을 계속 격려 (N > 2), 테두리 부드럽게 만들 수 있는 세포의 재구성 실제 셀 크기 보다 작은 있기 때문에. - 수와 CFP+ 와 CD11c YFP+ 세포 사이 접촉의 기간을 계산 합니다. 이미징 소프트웨어에이에 "키스 하 고 실행" 플러그를 실행 하 여 예를 들어 할 수 있습니다. 이러한 조치는 통계 탭에서 스프레드시트 파일로 내보낼 수 있습니다.
- 그들의 거리 (가까운 복) 임계값 (즉, 2 μ m) 보다 더 적은 또는 동등한 경우 CFP+ 세포와 CD11c YFP+ 세포 사이 접촉을 정의 합니다.
- 통계 소프트웨어의 이전 계산된 측정값을 가져올, 플롯을 생성 하 고 통계 시험을 수행.
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Representative Results
이 작품에서 우리 상세한 프로토콜 vivo에서 공부 하는 운동 성 및 호 중구 및 DC 간의 상호 작용 동안 설명 murine 기도 (그림 3A)에 인플루엔자 감염. 이 목적에 우리 고립 CFP+ 호 중구 (92% 순도; 그림 3B) CK6 ECFP에서 마우스와 우리 adoptively 전송 그들 독감 감염 CD11c YFP 마우스에. 그 후, 우리는 2 P-IVM 하루 3 탐정에서 기도의 수행 이 시간 지점에서 흐름 cytometric 분석 (그림 3C)와 같이 감염된 지역에서 호 중구의 명확한 모집을 관찰 합니다. 2 P-IVM 프로토콜 설치류 (그림 1A)에 대 한 특정 외과 보드 및 산소 공급의 사용을 요구 한다. 기도에 삽입 된 정 맥을 통해 산소 공급 호흡 기관, 박람회를 촉진 하 고 호흡 (그림 1B)와 관련 된 기관 운동 제어 동물 도움. 이 실험 설정에 따라 우리는 (3D 그림영화 1) 30 분의 기간 동안 안정적인 4 D 이미지에서 vivo에서 감염 된 기도에 인수.
전문된 이미징 소프트웨어 허용 셀의 마이그레이션을 측정 하 고 계량 neutrophils spatio 시간적 역학 DC를 통해 인수 4 D 이미지의 분석. 세포 운동 성 관련 된 DC의 움직임과 채용된 호 중구, 후자 (그림 4A) 보다 훨씬 빠른 속도 보여주는 사이 큰 차이가 관찰 합니다. 이 결과 이전 높은 운동 세포 chemoattractant 소스29으로 마이그레이션 할 수로 설명 하는 호 중구의 동적 특성을 확인 합니다. 방향에 대하여 우리는 차례로 감소 기간 및 측정된 방향 동작 (그림 4B)의 증가 분산 트랙을 생산 셀 추적, 자주 오류를 굴복 하는 DC의 그 복잡 한 형태학 결론을 내렸다. 이러한 이유로, 우리는 트랙 기간을 고려 하 여 방향성을 측정할 수 있는 강력한 통계 계산. 이 메트릭을 사용 하 여, 호 중구 대 DC (그림 4C)의 방향에 상당한 차이 관찰 합니다.
또한, 중 성구 및 DC 사이의 거리의 계산 허용 감지 하 고 시간이 지남에 그들의 연락처를 분석 하. 이 실험 모델에서 일부 호 중구 (그림 4D) 군데 기간 동안 어떤 연락처를 형성 하지 않았다 DC와 다중-간단한 연락처를 형성 하는 관찰 합니다. 또한, 시간이 지남에 호 중구 및 DC 사이의 거리의 평균 추세의 연구 허용 공부 공부 셀 (그림 4E)의 전반적인 위치에 특성을 허용 하는 특정 셀에 추세의 조사 동안에 각 단일 셀 (그림 4 층영화 2)의 동작입니다.
그림 1: 장비 및 2 P-IVM murine 기도의 단계. (인공 지능) 자동된 환기 담당 휴대용 동물 마 취 시스템 마우스에 산소를 공급 하는 펌프에 연결 된다. 앞면 모습 (좋아) 및 사이드 뷰 (Aiii) 맞춤 수술 보드 tracheal 모델에 대 한 사용의. 보드의 플라스틱 마우스 위치와 금속 단계 구성 (좋아 한), 이동식 클램프 (좋아-b)를 들고 위한 그리고 벌금 가변 XYZ 번역기 (좋아-c). Tracheal 외과 모델의 순차적 단계 (B): (Bi) 제 모 수술 영역 (Bii)의 기도, (Biv의 외과 박람회 (Biii), 외과 보드에서 마 취 마우스의 위치 ) 인공 환기, (Bv)는 카 테 터의 고정, 노출된 기도에 PBS (Bvi) 추가와 카 테 터를 삽 관 법 coverslip와 카 테 터의 (Bviii) 배치 (Bvii) 장착 와 마 취. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 2 P IVM 동안 형광 신호 검출. (A)의 현미경 탐지 도식 표현 필터 설정과 해당 채널. 560 nm 분리 블루/그린 레드/멀리 빨간 배출량에서 dichroic 거울. 추가 dichroic 거울 495 nm 추가 방출 스펙트럼의 다른 오는 아구를 인식 하는 데 사용 됩니다. 채널 1 채널 2를 사용 하 여 높은 감도 GaAsP PMT (방출 필터 525/50) 동안 하이브리드 검출기 (방출 필터 475/50)를 사용합니다. (B) 대표적인 분산형 도트 2 P 신호 CFP (Bi)와 YFP (Bii) fluorophores에서 나오는 신호 식별에 대 한 colocalization 채널의 생성에 대 한 제어 전략을 보여주는 플롯 합니다. (Biii) 채널 (Ch 1, 진한 파란색) 1, 채널 2 (채널 2, 녹색), CFP (밝은 파란색)에 대 한 공동 지역화 채널, YFP (노란색)에 대 한 공동 지역화 채널 모든 채널의 조합에서 특정 신호를 보여주는 대표적인 현미경 (채널 1 + 벼 2 + c f P + YFP)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 인플루엔자 감염 기관지에서 호 중구 및 DC Intravital 4 D 영상. (A) 프로토콜의 개요 개요. (B) 대표적인 흐름 cytometric scatterplot murine 골 Percoll 그라데이션 메서드를 사용 하 여에서 고립 세포 현 탁 액에서 총 CD45 + 세포에 관하여 호 중구의 비율을 보여주는. (C) 대표적인 흐름 cytometric scatterplots 하루 3 파이 (D) (왼쪽된 패널) 해부학 이미지는 murine의 인플루엔자 바이러스에 감염 된 쥐에 비해 감염된 마우스에서 tracheas에 호 중구의 주파수에 있는 증가 보여주는 기도 이미지 수집에 대 한 선택 영역을 보여주는입니다. (오른쪽 패널) 대표적인 3D 투영의 탐정 SHG 신호 표시 됩니다 다크 블루 3 일에 그들의 궤도 함께 neutrophils (밝은 파란색) 및 DC (노란색)의 표면 재건을 보여주는 2 P IVM 현미경 사진. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: neutrophil 및 인플루엔자 감염 된 기관 DC 마이그레이션 및 상호 작용 역학의 특성화. 추적 속도 보여주는 대표 작 (A)를 의미, 직진도 (B), 트랙과 트랙 직진도 (C), (2009 년)28, 호 중구 및 기도 함께 하루 3 탐정에 있는 DC의 Beltman와 동료에 의해 정의 된 대로 수정 인플루엔자 바이러스입니다. 수정 된 트랙 직진도 측정 오류를 추적 하는 견고성을 전시 한다. (D) 2 차원 히스토그램 neutrophil DC 및 평균 접촉 기간으로 연락처의 그들의 수에 따라 주파수를 보여주는. (E)는 영화의 기간 동안 가장 가까운 DC에 호 중구의 평균 거리입니다. (F) (왼쪽) 대표 시간에 가장 가까운 DC에 호 중구의 거리의 분석. 점선된 빨간색 선은 고려는 neutrophil DC와 연락처를 설립 하는 거리 임계값을 나타냅니다. (오른쪽 i-iii) 현미경 neutrophil (밝은 파랑)의 마이그레이션 DC (노란색)으로 나타내는 다른 시간 지점에서 인수. 셀 트랙 시간을 대표 하는 빨강 파랑에서 색을 변경 하는 여러 줄으로 표시 됩니다. SHG 신호 fibrillary 콜라겐에서 진한 파란색으로 표시 됩니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 모든 인물 제시 데이터는 적어도 3 개의 독립적인 실험의 대표. 결과 웰 치의 테스트에서 ± sd. 통계 의미 부여 됩니다. ns p > 0.05; p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: 호 중구 및 DC 인플루엔자 감염 시 기관에 역학. 30 분 경과 3D 이미지 neutrophils (밝은 파란색) 및 DC (노란색) 뿐만 아니라 콜라겐 네트워크 (진한 파란색)의 기도 관하여 그들의 각각 궤도 사이 상호 작용 역동성을 보여주는. 대표 neutrophil DC 상호 작용 흰색 화살표로 표시 됩니다. 셀 트랙 시간을 대표 하는 빨강 파랑에서 색을 변경 하는 여러 줄으로 표시 됩니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 2: 대표적인 단기 neutrophil DC 상호 작용 기도에 인플루엔자 감염 시. 30 분 경과 3D 이미지 neutrophil (밝은 파랑)와 DC 간의 상호 작용을 대표 (노란색)를 보여주는 고 그들의 각각 트랙. 셀 트랙 시간을 대표 하는 빨강 파랑에서 색을 변경 하는 여러 줄으로 표시 됩니다. SHG 신호 콜라겐에서 진한 파란색으로 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
이 작품 마우스 기도에 인플루엔자 감염 시 adoptively 전송 된 호 중구 및 DC와 그들의 상호 작용의 마이그레이션을 보여주는 4 D 이미지의 생성에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 설명된 2 P-IVM 모델 기도에 감염 시 면역 세포 역학 연구와 관련이 있을 것입니다.
최근, 기도에 셀 역학의 시각화를 기반으로 여러 모델 개발된9,10,11,12,,1314,15 되었습니다. ,16. 그러나, vivo에서 화상 진 찰 폐의은이 장기와 호흡 사이클30동안 움직임을 최소화 하기 위해 기술적인 어려움의 해 부 위치를 고려 하 고 여전히 도전적 이다. 이러한 문제를 해결 하려면 일부 저자 수술 가슴13,14에 삽입 하는 맞춤식 원형 흡입 챔버의 사용을 제안 했다. 그러나,이 절차는 침략 적 개입이 특히 염증 반응의 조사에 초점을 맞춘 그 연구에서에서 결과 손상 시킬 수 있는 필요 합니다. 또한, 폐 수술 모델 제시 포17에서 공기에 의해 발생 하는 빛 굴절으로 인해 깊은 조직 이미징에 대 한 제한. 반대로, 다른 tracheal 모델 기도 상피 세포 역학 연구를 최근 고용 되었습니다 했다. 이미징이이 오르간의 노출과 tracheal 상피에 높은 접근성 뿐 아니라 기관, 무력화 하는 데 필요한 비교적 간단한 수술 등 폐에 비해 명확한 이점을 제공 합니다. 제안 된 tracheal 모델은 또한8인플루엔자 감염 과정에서 바이러스 성 복제의 첫 번째 사이트 중 기도 이므로 기도 병원 균, 인플루엔자 바이러스에 대 한 응답의 개시를 조사 관련이 있다.
흥미롭게도, 한 연구는 대안 삽 관 법-무료 기도 이미징 방법 최근 되었습니다12출판. 이 메서드와 감소 염증으로 특징은 상피 세포의 mucociliarity 기능 유지 해야 하는 연구에 명확한 이점을 보여 줍니다. 그러나,이 방법은 충분 한 안정성을 보장 하지 않습니다 하며 밝은 신호 몇 µ m의 범위에 셀 연락처를 반대로, 공부 하는 데 필요한 현재 프로토콜에서 제공 하는 메서드 인수는 오르간의 더 나은 동원 정지 덕분에 삽 관 법, 고 기관과 coverslip12사이의 짧은 거리 결과로 강한 형광 신호 탐지를 허용 한다.
2 P-IVM 이미지 수집 vivo에서 동안 조직 동원 정지 달성 최적의 데이터를 생성 하는 가장 중요 한 단계입니다. 제시 방법의 안정성에 기여 하는 몇 가지 중요 한 조치 포함: 적절 한 마우스 마 취; 올바른 마우스 삽 관 법; 그리고는 coverslip로 기관에 쉽게 접근할 수 있도록 기도의 수술 박람회. 또한, 셀 (이상적으로 30 시야 당)의 오른쪽 숫자 이미지 획득된 결과 강화 것입니다. 셀의 최적의 수의 모집 대부분 바이러스 inoculum의 적절 한 관리에 의해 영향을 아주 많이 바이러스 성 감염 복용량에 따라 달라 집니다.
프로토콜의 다른 중요 한 단계는 기도의 수술 박람회입니다. 수술 동안 기관에의 한 피해를 최소화 하기 위해 다른 조치를 채택 수 있습니다. 예를 들어 기도 해야 하지 수 직접만 진 수술 도구. 대신, 그것은 단지 주변 조직 (피부, 침 샘, 그리고 근육)을 조작 하 여 노출 되어야 합니다. 엄격 하 게 필요한 경우 기도 unsharpened 항목을 사용 하 여 처리 합니다. 또한, 노력 혈관 손상을 피하기 위하여 행해져야 한다. 마지막으로, 장기 탈수를 방지 하기 위해, 그것은 또한 즉시 수술 후 PBS로 커버 하는 것이 중요입니다.
Tracheal 점 막의 면역 세포 상호 작용의 시각화에 대 한 앞에서 설명한 방법을 통해이 방법의 독특한 장점을에 불구 하 고이 모델을 사용 하는 몇 가지 제한이 제공합니다. 위에서 설명한 대로 tracheal 수술과 관련 된 염증의 존재 면역 반응을 공부를 할 때 단점을 나타낼 수 있습니다. 이 제한을 극복 하기 위해 관리 절차의 개시 전에 항 염증 성 약물 수는. 이 모델의 또 다른 한계는 강한 autofluorescence 신호는 항공에 주로 상주 세포와 점액 층에 의해 생성 된의 존재에 관련 되어 있습니다. 이 일반적인 형광 분석을 방해할 수 있는 유물을 만듭니다. 또한, 트랙 직진도 매개 변수의 잘못 된 계산 때 비교 셀 추적의 다른 기간 및 짧은 기간26의 트랙을 소개 하는 추적 오류 생성 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 우리는 트랙 직진도 해결 하기 위해 벌금 계수 적용. 이러한 수정 결과28미스 추적의 영향을 최소화 하기 위한 것입니다.
2 P-IVM 실험의 중요 한 측면 수술 및 이미징 받은 다시 사용 마우스 가능성입니다. vivo에서 여기에 설명 된 프로토콜을 이미징 필요 하지 않습니다 따라서 복구 가능성을 떠나는 동물 안락사 또는 기관 수집 및 재사용 마우스 다른 프로시저에 대 한 수술 후. 기도 이미징 포인트 극적으로 총 동물 실험, 동물 감소 원리 지원에 필요한의 수를 줄일 수 있는 다른 시간에 수행 예를 들어 단일 마우스를 사용. 또한, 그것은 또한 간 개별 가변성을 줄일 수 있습니다. 그러나, 동물 복구 하 고 다시 사용 하 여 복구 시간 동안 적절 한 진통 약물과 동물에 항생제의 관리를 포함 하는 동물 복지 표준을 준수 해야 합니다. 이 모든 절차는 동물 실험 프로토콜에 포함 하 고 현지 수 의사 당국에 의해 승인 해야 합니다.
설명된 프로토콜은 다른 면역 세포 유형의 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다. 예를 들어 절연 및 주입 (형광 또는 스테인드) 특정 병원 체 T 세포의 T 세포 활성화 역학31 tracheal DC 등 다른 세포와의 상호 작용 공부를 사용할 수 있습니다. 비슷한 방식으로, 혈액 이나 림프 혈관의 시각화 감염 과정 tracheal 조직으로 선 동적인 세포의 모집을 공부 하는 흥미로운 접근을 대표할 수 있었다. 또한, 기도의 2 P IVM 적용할 수 있습니다 또한 다른 공 수 병원 체에 대 한 면역 반응의 역학을 공부 하. 따라서, 유전자 변형 형광 공 수 병원 균, 구 균32, 같은 사용 하 여 면역 체계와 그들의 상호 작용을 공부 하 새로운 기회를 만들 것입니다. 이 절차는 감염 시 면역 세포의 역학을 측정에 초점을 맞추고, 하지만 그것은 또한 암, 천식, 등 또는 상처 치유 분야에 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 스위스 국립 재단 (SNF) 보조금 (176124, 145038, 및 148183), 유럽 위원회 마리 퀴리 재통합 부여 (612742), 및 D.U.P. 부여에 대 한 SystemsX.ch에 의해 지원 되었다 (2013/124).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3x 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20 °C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20 °C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20 °C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20 °C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
References
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