Summary
Dans cette étude, nous présentons un protocole pour effectuer deux photons intravitale d’imagerie et de la cellule analyse des interactions dans la muqueuse trachéale murine après infection par le virus de la grippe. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui étudient la dynamique de cellules immunitaires lors d’infections respiratoires.
Abstract
L’analyse de cellule-cellule ou cellule-pathogen interactions in vivo est un outil important pour comprendre la dynamique de la réponse immunitaire à l’infection. Microscopie intravitale biphotonique (2p-IVM) permet l’observation des interactions entre les cellules dans les tissus profonds dans les animaux vivants, tout en minimisant le photoblanchiment généré lors de l’acquisition de l’image. A ce jour, différents modèles pour 2p-IVM des organes lymphoïdes et non lymphoïdes ont été décrits. Toutefois, l’imagerie des organes respiratoires reste un défi en raison de la circulation liée au cycle de respiration de l’animal.
Nous décrivons ici un protocole afin de visualiser in vivo des cellules immunitaires des interactions dans la trachée chez des souris infectées avec le virus de la grippe à l’aide de 2p-IVM. À cette fin, nous avons développé une plate-forme d’imagerie personnalisée, qui comprenait l’exposition chirurgicale et l’intubation de la trachée, suivie de l’acquisition des images dynamiques des neutrophiles et les cellules dendritiques (DC) dans l’épithélium muqueux. En outre, nous avons détaillé les étapes nécessaires à l’exercice de la grippe par voie nasale infection et flux analyse cytométrique des cellules immunitaires dans la trachée. Enfin, nous avons analysé les neutrophiles et la motilité DC ainsi que leurs interactions au cours d’un film. Ce protocole permet la génération d’images 4D stable et lumineux nécessaire pour l’évaluation des interactions cellule-cellule dans la trachée.
Introduction
La microscopie intravitale biphotonique (2p-IVM) est une technique efficace pour d’imagerie en temps réel des interactions cellule-cellule lorsqu’ils se produisent dans leur environnement naturel1. L’un des principaux avantages de cette méthode est qu’elle permet l’étude des processus cellulaires à une plus grande profondeur de l’échantillon (500 µm à 1 mm) par rapport aux autres de techniques d’imagerie traditionnelle2. Dans le même temps, l’utilisation de deux photons de faible énergie générée par le laser à deux photons minimise la photo-lésions tissulaires généralement associées à l’image acquisition processus2. Au cours de la dernière décennie, 2p-IVM a été appliquée à l’étude des différents types d’interactions cellule-cellule dans plusieurs disciplines3,4,5. Ces études ont été particulièrement pertinents pour étudier les cellules immunitaires, qui sont caractérisent par leur dynamisme élevé et la formation d’importants contacts après les signaux générés par les autres cellules et l’environnement. 2P-IVM a été appliquée également pour étudier les interactions entre les pathogènes et hôte6. En effet, il a été précédemment démontré que certains agents pathogènes peuvent modifier le type et la durée des contacts entre les cellules immunitaires, qui entravent, en conséquence, la réponse immunitaire7.
La muqueuse des voies aériennes est le premier site où la réponse immunitaire contre les pathogènes aéroportés est généré8. En vivo analyse des interactions hôte-pathogène dans ce tissu est donc essentielle de comprendre l’initiation des mécanismes de défense de l’hôte au cours de l’infection. Cependant, 2p-IVM des voies respiratoires est difficile, principalement en raison des artefacts produits par le cycle de respiration de l’animal, ce qui compromet le processus d’acquisition d’images. Récemment, différents modèles chirurgicaux ont été décrites pour imagerie trachée murine9,10,11,12 et poumons13,14,15, 16. Trachéale 2p-IVM modèles représentent un excellent montage pour visualiser la phase initiale de la réaction immunitaire dans les voies aériennes supérieures, tandis que les alvéoles pulmonaires 2p-IVM modèles ne conviennent plus étudier la phase tardive des infections. Les modèles développés pulmonaires présentent une limitation associée à la présence d’alvéoles remplies d’air, qui restreignent la pénétration optique du laser et de rendre la muqueuse des voies respiratoires intrapulmonaires inaccessible pour in vivo de l’imagerie17 . À l’inverse, la structure de la trachée, formée par un épithélium continu, facilite l’acquisition d’images.
Nous présentons ici un protocole qui comprend une description détaillée des étapes requises pour effectuer une infection grippale, préparation chirurgicale des animaux et 2p-IVM de la trachée. En outre, les auteurs décrivent un montage expérimental spécifique pour la visualisation des neutrophiles et les cellules dendritiques (DC), deux types de cellules immunitaires qui jouent un rôle important comme médiateurs du mécanisme de défense contre l’influenza virus18,19 . Enfin, nous décrivons une procédure pour analyser les interactions de neutrophile-DC. Ces contacts auraient dû être divulgués pour moduler l’activation DC et, subséquemment, d’influer sur les réponses immunitaires contre les agents pathogènes20.
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Protocol
Toutes les procédures animales portant sur des souris ont été effectuées conformément aux directives de l’Office vétérinaire fédéral suisse et protocoles animales ont été approuvées par les autorités de vétérinaire local.
1. influenza Infection des souris CD11c-YFP
- Prévention des risques biotechnologiques
Remarque : La souche de souris adaptée de la grippe H1N1 Rico/8/34 A/Puerto (PR8) a été cultivée dans des oeufs fécondés, purifiée et titrée comme décrit précédemment21. Toutes les opérations impliquant des animaux infectés ou des échantillons biologiques ont été effectuées sous une armoire selon niveau biosafety (BSL) de biosécurité 2 conditions.- Nettoyez l’enceinte de sécurité biologique avec une solution d’éthanol 70 % avant et après l’intervention de l’infection.
- Jeter tous les déchets produits au cours de cette procédure à la suite appropriée qui biosafety guidelines (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Jeter des déchets solides dans les bacs autoclavable et liquides contaminés dans des sacs en plastique remplis de solution d’éthanol à 70 % ou désinfectant médical.
- Infection grippale intranasale
REMARQUE : B6. CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-YFP)22 sur un fond de C57BL/6J ont été utilisées dans cette étude. Souris ont été maintenus dans l’établissement exempt d’agents pathogènes spécifique à l’Institut de recherche en biomédecine.- Placez un maximum de 5 souris de CD11c-YFP et sexe-appariés selon l’âge (de six à huit semaines) par cage. Attendez au moins deux jours pour l’acclimatation de souris aux conditions de logement avant l’intervention de l’infection.
- PR8 stock de dégivrage et de préparer la dilution correspondante à l’aide de froid 1 x saline de tampon phosphate de Dulbecco modifiée sans chlorure de calcium et de chlorure de magnésium (PBS) pour obtenir une concentration finale de 200 unités formant des plaques (PFU) dans 30 µL. Keep dilution virus sur la glace durant toute la procédure.
Remarque : titrage de chaque lot de virus de la grippe avant son utilisation est recommandée pour assurer une dose précise de l’infection. - Injecter une dose de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) par voie intrapéritonéale (i.p.) à l’aide d’une seringue de 1 mL aiguille 26 G.
- Attendez que la souris est totalement anesthésiée (perte complète du réflexe de retrait de redressement et de pédale). Une anesthésie profonde est nécessaire pour une infection optimale, puisque les souris non-complètement anesthésiés vont avaler ou expulser l’inoculum de virus, conduisant à des variations de la dose de l’infection.
- Placez votre souris anesthésiée en position couchée. Prélever 15 µL d’inoculum de virus. Placer l’embout de la pipette à proximité de la narine gauche de la souris et faites couler l’inoculum viral goutte à goutte. Comme les gouttes doivent être inhalés, ne pas leur Pipeter directement à l’intérieur de la cavité du nez.
- Attendez 2 à 5 min et placer l’embout de la pipette contenant le restant 15 µL d’inoculum de virus dans la narine droite.
Remarque : Pour éviter l’étouffement, distribuer gouttes de petite taille environ 20 incréments de s. - Vérifiez que la souris est respirer correctement et le placer dans une cage en latéral décubitus. Surveiller le souris respiratoire et anesthésie rétablissement (environ 60 min après l’induction).
Remarque : Il est possible d’infecter plus de 1 souris en même temps. Dans ce cas, administrer un inoculum viral dans la narine gauche de toutes les souris dans une séquence, attendre 2 à 5 min et ensuite administrer le virus dans la narine droite. Pour éviter la variabilité entre les individus, infecter ne dépassant pas 3 souris en même temps. - Contrôler au quotidien santé animale statut et perte de poids.
- Euthanasier souris selon le point de terminaison sans cruauté, déterminé par les directives de l’autorité. La méthode d’euthanasie doit être approuvée par les autorités de l’expérimentation animale et doit respecter des normes éthiques locales. Après des expériences de deux photons, euthanasier souris par l’administration d’une surdose de kétamine/xylazine suivie par dislocation cervicale. Dans toutes les autres expériences, utiliser CO2 par inhalation comme une méthode d’euthanasie.
Remarque : Pour mesurer les titres viraux du trachée infectée, test de dose infectieuse (DICT50) 50 % vitroplants ou PCR temps réel test (RT-PCR) peut être effectuée comme précédemment décrit23.
- Évaluation du recrutement de neutrophil dans la trachée par cytométrie en flux
Remarque : Cette partie du protocole est facultative. Il vise à évaluer le recrutement de neutrophil dans la muqueuse trachéale suite à une infection grippale.- Euthanasier infectés et des souris témoins à post-infection jour 3 (p.i.) par inhalation de CO2 .
NOTE : Afin d’éviter des dommages à la trachée, évitez d’utiliser la dislocation cervicale pour euthanasier les animaux. En outre, une perfusion de souris euthanasiés est conseillée pour éviter la contamination par les neutrophiles sanguins. - Vaporisez le cou de la souris avec la solution d’éthanol à 70 % et effectuer une incision de la peau à l’aide de ciseaux chirurgicaux de la poitrine au menton.
- Séparez les glandes salivaires à l’aide de pinces et exposer la trachée.
- Disséquer les muscles autour de la trachée, à l’aide de pinces et ciseaux.
Remarque : Cette étape doit être exécutée avec soin puisque la trachée peut être facilement endommagée durant la procédure. - Tenez la trachée avec une pince et détachez soigneusement le œsophage par dissection.
- Tenant la partie intrathoracique de la trachée avec une pince, faites une incision au début de l’arbre bronchique. Puis détacher la trachée, du larynx et retirez délicatement tout à gauche de la musculature.
- Placer l’orgue dans un tube de 1,5 mL contenant RPMI 1640 + milieu HEPES (RPMI) sur la glace.
- Préparer le mélange d’enzymes pour la digestion de trachée, contenant 0,26 unités/mL de collagénase (I et II) et de 0,2 mg/mL de DNase I dans RPMI.
- Placer la trachée disséquée dans une plaque de 6 puits contenant 1 mL de mélange d’enzymes.
- Couper l’orgue en petits morceaux à l’aide de pinces et ciseaux. Maintenir la plaque sur la glace pendant cette étape.
- Incuber à 37 ° C pendant 45 min. Pendant ce temps, secouer la plaque toutes les 15 min.
- Arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant 1 mL de tampon de lavage de FACS (2 mM EDTA et 2 % inactivés par la chaleur stérilisée par filtration bovin sérum fœtal (SVF)) dans du PBS.
- Remettre en suspension dans la solution avec une pipette de 1 mL pour aider à dissocier les morceaux partiellement digérées du tissu.
- Transvaser la solution dans un autre puits en passant le contenu par un filtre à 40 µm. Puis, doucement casser les pièces restantes de l’orgue, pris au piège sur le dessus de la crépine à l’aide d’un piston de seringue de 2 mL.
NOTE : Smashing morceaux partiellement digérées de trachée sur la crépine est une étape essentielle pour obtenir un nombre optimal de cellules au cours de l’analyse en cytométrie en flux. - Laver le puits et la crépine avec FACS lavage tampon et le transfert, la suspension dans un tube de 5 mL gardée sur glace.
- Centrifuger les tubes à 166 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 µL de tampon de lavage de FACS.
- Procéder à la coloration surface anticorps pour la cytométrie en flux. En bref, bloquer les récepteurs Fc des cellules isolées à l’aide d’un anticorps contre CD16/32, suivie par la coloration de surface. D’identifier correctement les neutrophiles, le panneau de cytométrie de flux doit contenir les anticorps suivants : αLy6G, αCD11b, αCD45, ainsi qu’une viabilité teindre pour exclure les cellules mortes.
- Exécuter le contenu entier des échantillons sur un cytomètre en flux et analyser les données.
- Pour obtenir un nombre optimal de cellules immunitaires, exécutez la suspension monocellulaire à une vitesse ne dépassant pas 3 000 événements/s. Ceci réduira le nombre d’événements exclus lors de l’acquisition. Utilisant ce protocole, il devrait être possible d’obtenir 1 à 2 millions de cellules par la trachée.
- Euthanasier infectés et des souris témoins à post-infection jour 3 (p.i.) par inhalation de CO2 .
2. isolement et Injection des neutrophiles
Remarque : dans cette procédure, B6.129 (ICR)-souris Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J (CK6-ECFP) ont été utilisés24. Ces animaux exprime des PCP dans tous les types de cellules par un promoteur de la β-actine humaine. Alternativement, il est également possible d’utiliser des souris C57BL/6J pour isoler des cellules et leur tache selon le protocole décrit à l’étape 2.6. La purification et la manipulation des neutrophiles peuvent augmenter leur statut d’activation, susceptibles de modifier leurs propriétés fonctionnelles et migrateurs.
- Euthanasier l’animal par l’inhalation de CO2 .
- Enlever les deux fémurs et tibias et nettoyez-les délicatement à l’aide de pinces.
- Couper les épiphyses des os, puis rincez la moelle osseuse à l’aide d’une seringue de 1 mL remplie de PBS froide stérile, dans un tube de 50 mL gardé sur glace.
- Remettre en suspension les cellules avec une aiguille 18 G et filtrage de la suspension cellulaire avec un tamis de 40 μm. Laver une fois avec du PBS à 110 x g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension des cellules dans 2 mL de PBS froid.
-
Diluer 100 % Percoll 9:1 à 10 x PBS et préparer des solutions gradients de percoll 72 %, 64 % et 52 % à l’aide de la solution 1 PBS x. Soigneusement la couche 2 mL de chacune des trois gradients dans un tube de 15 mL, à partir de la plupart un concentré.
- Ajouter avec précaution 2 mL de la suspension de cellules de moelle osseuse sur le dessus les dégradés et centrifuger à 1 100 x g pendant 30 min à température ambiante (RT) sans accélération et freinage.
- Soigneusement retirer la bande à l’interface entre 64 % et 72 % et le laver une fois à 200 x g pendant 5 min à 4 ° C avec du PBS froid. Remettre en suspension des cellules dans un volume de 100 μl de PBS et conservez-les sur la glace. La pureté des neutrophiles devrait être supérieur à 90 %.
- Éventuellement, les polynucléaires neutrophiles étiquette avec un kit de prolifération cellulaire utilisant le protocole par le fabricant. Ajouter le colorant à la suspension de cellules à une concentration finale de 10 μm dans un volume de 1 mL, incuber à 37 ° C pendant 30 min et laver (166 x g, 5 min).
- Estimer la concentration cellulaire utilisant un hémocytomètre et injecter par voie intraveineuse de 5 x 106 cellules dans un volume maximum de 100 μL chez les souris CD11c-YFP+ précédemment infectés à l’aide d’une seringue de 1 mL d’aiguille 26 G, 12 h avant l’imagerie.
3. préparation de la souris pour l’imagerie
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Anesthésie
- Anesthésier les souris infectées de CD11c-YFP+ à jour 3 p.i. selon l’étape 1.2.3.
- Une fois que les souris sont profondément anesthésiés, préparer un cathéter pour le re-dosage de l’anesthésie.
- Retirer une aiguille 30 G d’une seringue avec une pincette.
- Insérer l’aiguille à un morceau de 20 cm de PE-10 tubes de silicone médical.
- Insérer une seringue à aiguille 30 G remplie du mélange de kétamine/xylazine de l’autre côté du tube.
- Evacuez l’air à l’intérieur du tube.
- Préparer un cathéter de 20 G, relié à un tube d’une machine insufflation d’oxygène pour maintenir une ventilation automatisée (Figure 1 aj’ai). Posez-le sur un ratio de souffle de 130 battements par minute (b.p.m.) avec un volume de marée de 0,2 mL à l’aide d’une alimentation en gaz 100 % d’oxygène.
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Préparer la souris pour la chirurgie
- Maintenez la souris sur une planche de chirurgicale personnalisée spécifique (Figure 1 aii et iii) sur une plaque chauffante ou un banc chirurgical chauffé fixé à 37 ° C pendant tout le temps de la chirurgie.
- Raser les poils du cou de la souris à l’aide d’un rasoir électrique et une crème dépilatoire (Figure 1 bi).
- Placez la souris au-dessus de la souris en plastique positionnel (Figure 1 aii-a), gardant la tête d’animal à l’extérieur de la position (Figure 1 bii) pour créer un angle qui facilite l’intubation de la trachée.
- Fixer les pattes avant, les pattes et la queue avec ruban chirurgical, humidifier les yeux de la souris avec un gel de la vitamine A enrichi et désinfecter le cou de la souris (Figure 1 bii).
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Chirurgie
- Préparer les éléments correctement stérilisés à l’autoclave, à savoir, ciseaux, ciseaux microchirurgicale et pinces.
- Effectuer une petite incision sur l’axe de temps médian du cou, environ 1 cm de long, dans la zone centrale entre le haut de la poitrine et la ligne passant par le point inférieur de la mandibule (Figure 1 biii).
- Se déplacer latéralement les correctifs de la peau et les glandes salivaires et visualiser la trachée, recouverte par les muscles. Puis, disséquer les muscles trachées soigneusement à l’aide de la pince (Figure 1 biii).
- Intuber la souris avec un cathéter et commencez la ventilation artificielle (Figure 1 biv).
Remarque : Le cathéter est composé d’une partie externe en plastique, qui protège la muqueuse trachéale et une aiguille en fer intérieure. La présence de l’aiguille représente la solution idéale pour étendre et stabiliser la trachée et de réguler son exposition. Ventilation artificielle par le cathéter garantira la respiration de la souris. - Commencer immédiatement la ventilation artificielle pour souris moniteur respiratoire.
- Fixer le cathéter hauteur et l’orientation à l’aide d’un crochet chirurgical (Figure 1 bv) relié à la tige spécifique sur le plateau chirurgical (Figure 1 aii-b). Exposer la trachée à la même hauteur du menton.
- Encercler la trachée de vaseline et couvrez-la avec quelques gouttes de PBS préchauffé pour garantir une bonne hydratation à l’orgue (Figure 1 bvi).
- Monter la lamelle sur le dessus de la préparation. Pour cette étape, coller un lamelle couvre-objet sur un support métallique (Figure 1 bvii), qui sera vissé au traducteur de XYZ (Figure 1 aii-c). Ajuster le traducteur XYZ pour placer la lamelle sur le dessus de la préparation chirurgicale.
- Placer le cathéter pour l’administration de l’anesthésie par voie intrapéritonéale (Figure 1 bviii).
- Injecter de 50 % de la dose initiale de kétamine/xylazine mélange toutes les 30 minutes.
NOTE : Ré-dosage de 50 % à 25 % du mélange initial kétamine/xylazine est une alternative sûre et valide25. Toutefois, étant donné que ce protocole est en phase terminal et une immobilisation stricte de l’animal est requise pendant toute la procédure, utiliser des doses plus élevées pour maintenir un avion chirurgical profondes de l’anesthésie.
4. l’imagerie in Vivo Time-lapse
NOTE : Acquisition d’images a été réalisée avec un microscope biphotonique vertical, équipé de deux lasers Ti:Sa, chambre d’incubation à température contrôlée et un 25 X / NA 1.1 objectif à immersion d’eau. Le Photomultiplier (PMT) utilisé pour l’acquisition d’images était des détecteurs hybride ou haute sensibilité GaAsP.
- Placez la planche chirurgicale avec la souris anesthésiée à l’intérieur de la chambre d’incubation de microscope (préchauffée à 37-38 ° C) et ajouter une goutte d’eau sur la lamelle couvre-objet.
- Centre et trouver se concentrent sur le tissu trachéal.
-
Définissez la fréquence de balayage à 800 Hz, avec 520 x 520 pixels, un champ de vision de 440 x 440 μm2 et ligne 1 moyenne.
- Tune Ti:Sa laser à 830 nm pour exciter la génération de seconde harmonique (SHG) de collagène, avec une puissance indicative à la source de 150 mW. Régler le deuxième laser Ti:Sa à 920 nm avec 94 mW à la source, pour exciter les PCP et YFP.
- Mise en place la 3D et le mode d’acquisition de timelapse avec excitation simultanée
NOTE : Gardez les puissances laser aussi bas que possible afin de minimiser le photoblanchiment et phototoxicité.
- Record fluorescence en utilisant deux canaux en mode non-descanned, avec un miroir dichroïque maître à 560 nm. Dans la configuration utilisée dans le présent protocole, un second miroir dichroïque diviser le signal à 495 nm pour séparer le canal 1 (filtre d’émission 475/50) du canal 2 (filtre d’émission 525/50) (Figure 2 a). Cette configuration recueille SHG lumière du collagène dans la première manche, tandis que les émissions de PCP sont recueillie dans les chaînes 1 et 2 et YFP est collectée uniquement dans le canal 2.
- Définir une gamme de 50 μm selon l’axe Z, avec une taille d’étape de 3 μm (voxel taille 0.86 μm x 3 μm). Enregistrement des images toutes les 30 s pour une durée totale de 30 min.
- Si vous le souhaitez, acquérir plusieurs régions. Avant d’exécuter davantage d’acquisitions, vérifier les signes vitaux et réinjecter l’anesthésie par le cathéter si nécessaire (voir étape 3.3.10).
- À la fin du processus d’imagerie, euthanasier la souris par le biais de surdosage de kétamine/xylazine suivie par dislocation cervicale.
5. transformation et Quantitative analyse de motilité neutrophile-DC et d’Interaction des images
Remarque : Dans le présent protocole, un logiciel d’imagerie spécialisé a été utilisé pour analyser les données de la microscopie.
- Après l’acquisition d’images 4D est terminée, transférer les fichiers (données et métadonnées) sur un poste de travail avec des ressources informatiques suffisantes (suggéré la configuration minimale requise : 32 Go de RAM, un CPU rapide solid-state-disques, récent, dédié GPU basé sur un massivement architecture parallèle).
- Ouvrez les fichiers dans les logiciels d’imagerie.
- Lire la vidéo et faire en sorte que les cellules d’intérêt sont clairement visibles et que les artefacts d’imagerie sont absentes.
Remarque : à cette fin, vérifiez que les deux le mouvement de l’échantillon et la variation de luminosité sont suffisamment limités. En effet, ceux-ci représentent des défis pour l' analyse automatique26. Si le mouvement de l’échantillon entre les images adjacentes est excessif, appliquer une méthode de correction de dérive, en utilisant par exemple la chaîne SHG comme référence fixe. Cela permet de mieux mesurer le mouvement des cellules plutôt que le mouvement de l’échantillon. En outre, en présence de fond clair ou débris, taillez les surfaces reconstituées à l’aide de volume comme un paramètre de sélection. - Générer une co-localisation canal spécifique pour les cellules de la CFP+ , afin de séparer le signal entre CFP et le collagène (SHG). À cette fin, désigner un polygone de blocage (Figure 2 bje) qui sélectionne uniquement les voxels ayant une intensité positive dans le canal vert et dans la couche bleue.
Remarque : Cette procédure peut varier selon le jeu de filtre du microscope et la coloration des cellules. Il est possible en sélectionnant seulement les voxels avec une intensité suffisante en les canaux bleus et le vert. Parmi les outils disponibles, la fonctionnalité « coloc » peut servir à calculer automatiquement le canal de colocalisation basé sur le seuil d’intensité. En outre, méthodes basées sur l’apprentissage automatique peuvent servir pour cette étape avec la supervision d’un expert27. - Détecter et pister les cellules CFP+ , à l’aide de reconstruction de surface automatique et suivi (outil de surface) sur le canal approprié co-localisation.
Remarque : Curation manuelle de suivi des éventuelles erreurs et l’exclusion des titres d’une durée inférieure à un seuil défini (par exemple, 150 s) peuvent être nécessaires. - Générer une co-localisation canal spécifique pour les cellules CD11c-YFP+ , afin de séparer les signaux CFP et YFP. À cette fin, désigner un mécanisme de sélection polygone (Figure 2 bii) qui sélectionne uniquement les voxels ayant une intensité positive dans le canal vert mais faible intensité dans le canal bleu.
Remarque : représentant micrographies montrant les signaux du canal 1, canal 2, le canal de co-localisation pour PCP, le canal de co-localisation pour YFP et la combinaison de tous les canaux se trouve dans la Figure 2 biii. - Reconstruire la surface des cellules CD11c-YFP+ et de suivre leur position dans le temps (outil de surface).
NOTE : Correction manuelle des erreurs de suivi éventuel n’est pas nécessaire pour cette étape. En effet, en raison de la dynamique spatio-temporelle complexe de DC, reconstruire leur surface précise de données 2p-IVM est une tâche difficile qui ne peut être réalisée avec le logiciel de segmentation disponible. Parmi les raisons qui rendent cette tâche difficile, saillies fines variations de luminosité ne permettent pas pour l’utilisation de certaines techniques de traitement d’images, telles que le lissage des filtres ou seuillage statique. Par ailleurs, dans un réseau de DC, il est difficile de séparer les cellules individuelles basés uniquement sur leur apparence en données 2p-IVM. Pour ces raisons, plutôt que de tenter une segmentation précise par le réglage des paramètres du logiciel, nous vous proposons de reconstruire des surfaces non-précises de DC. Gérez ensuite les erreurs possibles au moyen d’indicateurs robustes, comme décrit dans 5,8. -
Mesurer la migration cellulaire.
- Exporter les mesures classiques de migration pour les PCP+ et cellules CD11c-YFP+ . Parmi celles-ci, la « moyenne de vitesse de voie » indique la vitesse moyenne de migration des cellules, tandis que la « voie de rectitude » indique la directionnalité des cellules. Ces mesures peuvent être exportées vers un fichier de feuille de calcul du logiciel d’imagerie.
- Dans les fichiers de feuille de calcul exportée, calculer la « rectitude de piste corrigée » (également dénommée ratio de confinement corrigée) pour les PCP+ et cellules CD11c-YFP+ , qui est défini comme « rectitude de piste » multiplié par la racine carrée de « suivre la durée » divisé par la racine carrée de la durée de la vidéo. Cette mesure est plus robuste que la « piste de rectitude » en présence de courtes pistes28, provenant par exemple des erreurs de suivi.
Remarque : uniquement les vidéos de la même longueur peuvent être comparés à cette mesure.
-
Interaction de cellule de mesure.
- Définir un contact entre une cellule CFP+ et une cellule CD11c-YFP+ si leur distance (plus proche voxels) est inférieure ou égale à un seuil (c.-à-d., 2 μm).
Remarque : Ce seuil devrait être suffisamment strict pour détecter un contact uniquement lorsque les cellules sont à proximité. Cependant, nous encourageons à garder ce seuil supérieur à 0, idéalement N fois plus grand que le rayon de voxel (N > 2), parce que la frontière lissage peut rendre la reconstruction des cellules plus petites que la taille de cellule réelle. - Compter le nombre et la durée des contacts entre CFP+ et cellules CD11c-YFP+ . Dans le logiciel d’imagerie c’est possible, par exemple, en exécutant un « baiser et exécuter » plug-in. Ces mesures peuvent être exportées vers un fichier de feuille de calcul de l’onglet statistiques.
- Définir un contact entre une cellule CFP+ et une cellule CD11c-YFP+ si leur distance (plus proche voxels) est inférieure ou égale à un seuil (c.-à-d., 2 μm).
- Importer les mesures calculées précédemment dans un logiciel de statistique, générer les parcelles et effectuer des tests statistiques.
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Representative Results
Dans cet ouvrage, nous décrit un protocole détaillé pour l’étude in vivo la motilité et les interactions entre les neutrophiles et DC au cours de l’infection grippale dans la trachée murine (Figure 3 a). À cette fin, nous avons isolé les neutrophiles CFP+ (92 % de pureté ; Figure 3 b) de CK6-ECFP souris et nous Moutschen transférés dans une souris CD11c-YFP contaminée par un virus. Après cela, nous avons réalisé 2P-IVM de la trachée au jour 3 p.i. À ce moment, nous avons observé un recrutement clair de neutrophiles dans la zone infectée, comme en témoigne la cytométrie (Figure 3). Le protocole 2p-IVM nécessite l’utilisation d’une chirurgie spécifique et un fournisseur d’oxygène pour les rongeurs (Figure 1 a). Fournissant de l’oxygène à travers une canule insérée dans la trachée, a contribué à l’animal de respirer, a facilité l’exposition de la trachée et contrôlé le mouvement de l’organe associé à la respiration (Figure 1 b). Suite à ce contexte expérimental, nous avons acquis stable 4D images in vivo dans la trachée infectée pendant une période de 30 min (Figure 3Dfilm 1).
L’analyse des images acquises par le biais de logiciels d’imagerie spécialisés a permis de mesurer la migration des cellules et de quantifier la dynamique spatio-temporelle des neutrophiles et DC 4D. Au sujet de la motilité cellulaire, nous avons observé des différences significatives entre le mouvement de la DC et les neutrophiles recrutés, qui a montré une vitesse beaucoup plus rapide que le second (Figure 4 a). Ce résultat confirme la nature dynamique des neutrophiles, d’abord décrit comme des cellules très mobiles capables de migrer vers un facteur chimiotactique source29. Au sujet de l’orientation, nous avons conclu que la morphologie complexe du contrôleur de domaine a produit des erreurs fréquentes dans la cellule de suivi, qui à son tour produit des titres dont la durée a diminué et la variance accrue du comportement directionnel mesurée (Figure 4 b). Pour cette raison, nous avons calculé une métrique robuste qui est capable de mesurer la capacité bidirectionnelle en considérant la durée de la piste. À l’aide de cette mesure, nous avons observé une différence significative dans la directionnalité des neutrophiles vs DC (Figure 4).
En outre, le calcul de la distance entre les neutrophiles et DC a permis de détecter et d’analyser leurs contacts au fil du temps. Dans ce modèle expérimental, nous avons observé quelques neutrophiles qui ont formé les contacts de multiple-brief avec DC et d’autres qui ne faisaient pas tout contact au cours de la période image (Figure 4). En outre, l’étude de la tendance moyenne de la distance entre les neutrophiles et DC au fil du temps nous a permis d’étudier le positionnement global des cellules étudiées (Figure 4E), tandis que l’enquête sur l’évolution des cellules spécifiques a permis de caractériser les comportement de chaque cellule unique (Figure 4Ffilm 2).
Figure 1 : équipement et étapes pour 2p-IVM de trachée murine. (IA) Le système portable anesthésie animale responsable de la ventilation automatisée est relié à une pompe qui fournit l’oxygène à la souris. Vue de face (Aii) et vue de côté (Aiii) du Conseil sur mesure chirurgical utilisé pour le modèle trachéal. Le Conseil est composé d’un stade du métal avec une souris en plastique positionnel (Aii-a), une tige pour maintenant un collier mobile (Aii-b) et une amende accordable traducteur XYZ (Aii-c). (B) les étapes successives du modèle chirurgical trachéal : épilation (Bi) de la zone chirurgicale, (Bii) positionnement de la souris anesthésiée au sein du Conseil chirurgical, (Biii) exposition chirurgicale de la trachée, (Biv ) avec un cathéter avec ventilation artificielle, la fixation du cathéter (Bv), ajout (Bvi) de PBS à la trachée exposée, l’intubation (Bvii) montage de la lamelle couvre-objet et (Bviii) mise en place d’un cathéter avec l’anesthésie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : détection de signal Fluorescent pendant 2p-IVM. (A) Représentation schématique de la détection de microscope filter Set-up et les canaux correspondants. Miroir dichroïque à 560 nm sépare bleu/vert rouge rouge/sombre émissions. Miroir dichroïque supplémentaire à 495 nm est utilisé pour reconnaître davantage les différentes sous-régions du spectre d’émission. Canal 1 emploie un détecteur hybride (filtre d’émission 475/50), tout en sensibilité élevée de 2 utilisations canal GaAsP PMT (filtre d’émission 525/50). (B) point de nuages de points représentant des parcelles de 2p signaux montrant la stratégie de blocage pour la génération des canaux colocalisation pour l’identification du signal provenant de la PCP (Bi) et les fluorophores YFP (Bii). (Biii) Micrographies représentatives montrant les signaux spécifiques du canal 1 (Ch 1, bleu foncé), canal 2 (Ch 2, vert), le canal de co-localisation pour PCP (bleu clair), le canal de co-localisation pour YFP (jaune) et la combinaison de tous les canaux (Ch 1 + Ch 2 + CFP + YFP). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : imagerie 4D intravitale des neutrophiles et DC une trachée infectés par la grippe. (A) le plan schématique du protocole. (B) flux représentatif par cytométrie en flux dispersion indiquant le pourcentage de neutrophiles en ce qui concerne les cellules CD45 + totales dans une suspension de cellules isolées du murin de la moelle osseuse à l’aide de la méthode du gradient de Percoll. (C) flux représentatif par cytométrie en flux diagrammes montrant une augmentation de la fréquence des neutrophiles dans les trachées des souris infectées par rapport à des souris infectées par le virus de la grippe à jour 3 p.i. (D) (panneau de gauche) anatomiques image d’un murin trachée montrant la zone choisie pour l’acquisition d’images. (Panneau de droite) Projection 3D représentative d’une micrographie 2p-IVM montrant la surface reconstruction des neutrophiles (bleu clair) et DC (jaune) ainsi que leurs titres au 3e jour p.i. SHG sera montré dans noir bleu. Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : caractérisation des DC migration et l’interaction dynamique des trachées infectés par la grippe et du neutrophile. Parcelles représentant montrant la vitesse en voie signifient (A), suivre la rectitude (B) et corrigé piste rectitude (C), tel que défini par Beltman et ses collègues (2009)28, des neutrophiles et DC dans la trachée au jour 3 p.i. avec virus de la grippe. La mesure de rectitude piste corrigé pièces robustesse aux erreurs de suivi. (D) histogramme 2D représentant la fréquence des neutrophiles selon leur nombre de contacts avec le DC et la durée de contact moyenne. (E) la distance moyenne des neutrophiles au contrôleur de domaine le plus proche pendant toute la durée du film. (F) (à gauche) analyse de la distance d’un représentant de neutrophil au contrôleur de domaine le plus proche dans le temps. La ligne rouge en pointillés indique la distance seuil pour considérer qu’un neutrophile établi un contact avec un contrôleur de domaine. (Droite i-iii) Micrographies acquises à des moments différents représentant la migration d’un neutrophile (bleu clair) vers un contrôleur de domaine (jaune). Les titres de cellule sont représentés par une ligne multicolore qui change de couleur du bleu au rouge pour représenter l’heure. Signal SHG de collagène fibrillaire apparaît en bleu foncé. Echelle = 50 µm. Dans tous les chiffres, les données présentées sont représentatifs d’au moins trois expériences indépendantes. Résultats sont donnés comme moyen ± SD. statistiques de test de Welch. ns p > 0,05 ; p < 0,0001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Movie 1 : neutrophiles et DC dynamique dans la trachée au cours de l’infection grippale. 30 min Time-lapse 3D, l’image dynamique de l’interaction entre les neutrophiles (bleu clair) et DC (jaune) ainsi que leurs titres respectifs en ce qui concerne le réseau de collagène (bleu foncé) de la trachée. Les interactions représentatives de neutrophile-DC sont indiquées par les flèches blanches. Les titres de cellule sont représentés par une ligne multicolore qui change de couleur du bleu au rouge pour représenter l’heure. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Movie 2 : interaction à court terme dans la trachée neutrophile-DC représentative au cours de l’infection grippale. 30 min Time-lapse 3D image montrant une interaction représentante entre un neutrophile (bleu clair) et un contrôleur de domaine (jaune) et leurs titres respectifs. Les titres de cellule sont représentés par une ligne multicolore qui change de couleur du bleu au rouge pour représenter l’heure. Signal SHG de collagène est affiché en bleu foncé. Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Cet ouvrage présente un protocole détaillé pour la génération d’images de 4D montrant la migration des neutrophiles Moutschen transférés et de leurs interactions avec les DC lors d’une infection grippale dans la trachée de souris. Le modèle décrit 2p-IVM sera pertinent d’étudier la dynamique de cellules immunitaires lors d’une infection des voies respiratoires.
Récemment, plusieurs modèles basés sur la visualisation dynamique de cellules dans les voies aériennes ont été développés9,10,11,12,13,14,15 ,,16. Toutefois, l’imagerie in vivo du poumon est encore difficile, compte tenu de la position anatomique de cet organe et les difficultés techniques pour réduire au minimum le mouvement pendant le cycle de respiration30. Pour résoudre ces problèmes, certains auteurs ont proposé l’utilisation d’une chambre d’aspiration circulaire sur mesure, qui doit être inséré chirurgicalement dans le thorax13,14. Toutefois, cette procédure nécessite une intervention invasive qui pourrait compromettre les résultats, en particulier dans les études qui ont porté sur l’étude de la réponse inflammatoire. En outre, modèles chirurgicale pulmonaire présentent une limitation pour l’imagerie des tissus profonds en raison de la réfraction de lumière émises par l’air dans les alvéoles17. À l’inverse, différents modèles trachéales ont été récemment utilisées pour étudier la dynamique de la cellule dans l’épithélium des voies respiratoires. Imagerie de cet organe présente des avantages évidents par rapport aux poumons, comme la chirurgie relativement simple pour exposer et immobiliser l’orgue, ainsi que l’accessibilité supérieure à l’épithélium trachéal. Le modèle proposé trachéal est aussi pertinent enquêter sur l’initiation de la réponse contre les agents pathogènes des voies respiratoires, tels que les virus de la grippe, car la trachée est l’un des premiers sites de réplication virale au cours d’une infection de grippe8.
Fait intéressant, une étude montrant une alternative exempte d’intubation méthode d’imagerie de la trachée a été récemment publié12. Cette méthode est caractérisée par une inflammation réduite et présente des avantages évidents dans les études où la fonction de mucociliarity des cellules épithéliales doit être préservées. Toutefois, cette méthode ne garantit pas une stabilité suffisante et l’acquisition des signaux lumineux nécessaires d’étudier les contacts cellule-cellule dans une plage de quelques µm. a l’inverse, la méthode présentée dans le protocole actuel fournit la meilleure immobilisation de l’organe Grâce à l’intubation et permet la détection des signaux de fluorescence plus fortes en raison de la distance la plus courte entre l’orgue et la lamelle12.
Accomplir l’immobilisation des tissus au cours de l’acquisition d’images in vivo 2p-IVM est l’étape la plus critique pour générer des données optimales. Certaines mesures essentielles qui contribuent à la stabilité de la méthode présentée comprennent : une anesthésie de souris approprié ; une intubation souris correcte ; et une exposition chirurgicale de la trachée qui permet un accès facile à l’orgue de la lamelle. En outre, l’imagerie le bon nombre de cellules (cellules idéalement 30 / champ de vision) renforcera les résultats obtenus. Le recrutement du nombre optimal de cellules dépendra dans une large mesure sur la dose d’infection virale, qui est très influencée par la bonne administration de l’inoculum viral.
Une autre étape critique du protocole est l’exposition chirurgicale de la trachée. Différentes mesures peuvent être adoptées pour minimiser les dommages causés à l’orgue pendant la chirurgie. Par exemple, la trachée ne devrait pas être directement touchée avec outils chirurgicaux. Au lieu de cela, il doit être exposé en manipulant uniquement les tissus environnants (peau, glandes salivaires et les muscles). Si absolument nécessaire, la trachée doit être manipulée en utilisant des éléments non accentuées. En outre, des efforts devraient être faits pour éviter d’endommager les vaisseaux sanguins. Enfin, pour prévenir la déshydratation de l’orgue, il est également important de le couvrir avec du PBS immédiatement après la chirurgie.
Malgré les avantages uniques de cette méthode par rapport aux méthodes décrites précédemment pour la visualisation des interactions des cellules immunitaires de la muqueuse trachéale, l’utilisation de ce modèle présente certaines limitations. Comme indiqué ci-dessus, la présence de l’inflammation associées à la chirurgie trachéale peut représenter un inconvénient lors de l’étude des réponses immunitaires. Pour contourner cette limitation, il est possible d’administrer des anti-inflammatoires non stéroïdiens avant l’ouverture de la procédure. Une autre limitation de ce modèle est liée à la présence d’un signal de forte autofluorescence existant dans les voies respiratoires, qui est principalement généré par les cellules résidentes et la couche de mucus. Cette fluorescence non-spécifiques crée des objets qui pourraient gêner l’analyse. En outre, calcul trompeur du paramètre rectitude piste peut être générée lorsque la comparaison cellule titres de différentes durées et lorsque les erreurs de suivi va présenter les titres de courte durée26. Pour contourner ce problème, nous avons appliqué un coefficient de pénalité pour corriger la rectitude de la voie. Cette correction vise à minimiser l’effet de miss-suivi dans les résultats de28.
Un aspect crucial d’expériences 2p-IVM est la possibilité de réutiliser les souris qui ont subi une chirurgie et imagerie. L' in vivo d’imagerie protocole décrit ici ne nécessite pas collection animale de l’euthanasie ou d’un organe, laissant ainsi la possibilité de récupérer et réutiliser les souris après chirurgie d’autres procédures. À l’aide d’une souris, par exemple, pour effectuer l’imagerie de la trachée en des temps différents points pourraient diminuer considérablement le nombre d’animaux total nécessaire lors d’une expérience, en soutenant le principe de réduction animale . En outre, elle pourrait également réduire la variabilité interindividuelle. Cependant, réutilisation et récupération animale doivent respecter les normes de bien-être animal qui comprend l’administration de bon médicaments analgésiques et d’antibiotiques aux animaux au cours de la période de récupération. Toutes ces procédures doivent être inclus dans le protocole de l’expérimentation animale et agréés par les autorités locales de vétérinaire.
Le protocole décrit peut être facilement adapté à l’étude d’autres types de cellules immunitaires. Par exemple, isolement et injection de cellules de T de pathogènes spécifiques (fluorescentes ou teintés) pourraient servir à étudier les lymphocytes T activation dynamique31 ainsi que leur interaction avec d’autres cellules tels que DC trachéale. De façon similaire, la visualisation de sang ou de vaisseaux lymphatiques pourrait représenter une approche intéressante pour étudier le recrutement des cellules inflammatoires dans le tissu trachéal au cours de l’infection. En outre, 2p-IVM de la trachée pourrait également être appliquée pour étudier la dynamique de la réponse immunitaire aux autres pathogènes aéroportés. Donc, l’utilisation des transgéniques pathogènes aéroportés fluorescents, tels que Streptococcus pneumoniae32, créera des nouvelles opportunités d’étudier leurs interactions avec le système immunitaire. Bien que cette procédure se concentre sur la mesure de la dynamique des cellules immunitaires au cours de l’infection, elle pourrait également être appliquée à différents domaines y compris le cancer, l’asthme, ou de cicatrisation.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions de la Fondation National Suisse (FNS) (176124, 145038 et 148183), la Commission européenne Marie Curie réinsertion Grant (612742) et le SystemsX.ch une subvention pour la D.U.P. (2013/124).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3x 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20 °C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20 °C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20 °C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20 °C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
References
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