Summary
In deze studie presenteren we een protocol voor het uitvoeren van twee-foton intravital beeldvorming en cel interactie analyse in de lymfkliertest tracheale mucosa na infectie met influenzavirus. Dit protocol is relevant voor onderzoekers bestuderen immuun cel dynamiek tijdens infecties van de luchtwegen.
Abstract
De analyse van de cel of cel-ziekteverwekker interactie in vivo is een belangrijk instrument om te begrijpen de dynamiek van de immune reactie op de infectie. Twee-foton intravital microscopie (2P-GODT) kan de waarneming van cel interacties in diepe weefsel in levende dieren, terwijl het minimaliseren van de photobleaching gegenereerd tijdens Beeldacquisitie. Tot op heden zijn verschillende modellen voor 2P-GODT van lymfoïde en niet-lymfoïde organen beschreven. Beeldvorming van de ademhalingsorganen blijft echter een uitdaging als gevolg van de beweging die is gekoppeld aan de ademhaling cyclus van het dier.
Hier beschrijven we een protocol om te visualiseren in vivo immuun cel interacties in de luchtpijp van muizen geïnfecteerd met influenza-virus met behulp van 2 P-GODT. Hiervoor ontwikkelden we een aangepaste imaging platform, waaronder de chirurgische blootstelling en intubatie van de luchtpijp, gevolgd door de overname van dynamische beelden van neutrofielen en dendritische cellen (DC) in de mucosal epitheel. Bovendien, gedetailleerde we de stappen die nodig zijn voor het uitvoeren van influenza intranasale infectie en stroom cytometrische analyse van immuuncellen in de luchtpijp. Ten slotte, geanalyseerd wij neutrofiele en beweeglijkheid van de DC, evenals hun interacties in de loop van een film. Dit protocol zorgt voor de generatie van stabiel en helder 4D beelden nodig zijn voor de beoordeling van cel-cel-interacties in de luchtpijp.
Introduction
Twee-foton intravital microscopie (2P-GODT) is een effectieve techniek voor real-time imaging van cel naar cel interacties zoals die in hun natuurlijke omgeving1plaatsvinden. Een van de belangrijkste voordelen van deze methode is dat het mogelijk de studie van cellulaire processen op een groter model diepte (500 µm tot 1 mm maakt) in vergelijking met andere traditionele beeldvormende technieken2. Op hetzelfde moment minimaliseert het gebruik van twee lage-energie fotonen gegenereerd door de twee-foton laser de foto-weefselschade meestal gekoppeld aan de afbeelding acquisitie proces2. Tijdens het laatste decennium is 2P-GODT toegepast om te bestuderen van de verschillende types van cel-cel-interacties in de verschillende disciplines-3,-4,5. Deze studies zijn met name relevant zijn voor het onderzoeken van immune cellen, die worden gekenmerkt door hun hoge dynamiek en de vorming van prominente contacten na de signalen gegenereerd door andere cellen en het milieu. 2P-GODT is ook toegepast om te bestuderen van de interacties tussen pathogene en host6. Inderdaad, het is eerder aangetoond dat sommige ziekteverwekkers veranderen als kunnen het type en de duur van de contacten tussen immune cellen, belemmeren, dientengevolge, de immuunrespons7.
De mucosa van de luchtwegen is de eerste site die de immuunrespons tegen lucht ziekteverwekkers zich gegenereerd8. Daarom, in vivo analyse van pathogene agens-gastheer interacties in dit weefsel is kritiek te begrijpen van de inleiding van de afweermechanismen van de host tijdens de infectie. 2P-GODT van de luchtwegen is echter uitdagende voornamelijk te wijten aan de artefacten geproduceerd door de ademhaling cyclus van het dier, dat het proces van Beeldacquisitie compromissen. Onlangs, verschillende chirurgische modellen zijn beschreven voor imaging lymfkliertest luchtpijp9,10,11,12 en longen13,14,15, 16. De tracheale 2P-GODT modellen vertegenwoordigen een uitstekende set-up om te visualiseren van de beginfase van de immune reactie in de bovenste luchtwegen, terwijl de Long-longblaasjes 2P-GODT modellen zijn meer geschikt voor het bestuderen van de late fase van infecties. De ontwikkelde longen modellen presenteren een beperking die zijn gekoppeld aan de aanwezigheid van lucht gevulde longblaasjes, waardoor de optische penetratie van de laser worden beperkt en maak de mucosal laag van de intrapulmonary airways ontoegankelijk voor in vivo imaging17 . De structuur van de luchtpijp, gevormd door een continue epitheel, vergemakkelijkt daarentegen Beeldacquisitie.
Hier presenteren we een protocol dat een gedetailleerde beschrijving van de stappen die nodig zijn bevat voor het uitvoeren van de besmetting van de griep, chirurgische voorbereiding van de dieren, en 2P-GODT van de luchtpijp. Daarnaast beschrijven we een specifieke experimentele opstelling voor de visualisatie van neutrofielen en dendritische cellen (DC), twee soorten van immuun cellen die een belangrijke rol als bemiddelaars van het afweermechanisme tegen influenza virus18,19 spelen . Ten slotte, beschrijven we een procedure voor het analyseren van neutrofiele-DC interacties. Deze contacten is gebleken moduleren DC activering en vervolgens bij de immuunrespons tegen ziekteverwekkers20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures waarbij muizen werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de Zwitserse federale Veterinair Bureau en de dierlijke protocollen werden goedgekeurd door de lokale dierenarts autoriteiten.
1. influenza infecties van CD11c-YFP muizen
- Bioveiligheid
Opmerking: De muis aangepast stam van influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) was gegroeid in bevruchte eieren, gezuiverd en getitreerd zoals eerder beschreven21. Al de stappen waarbij besmette dieren of biologische monsters werden uitgevoerd onder een bioveiligheid kabinet volgens bioveiligheidsniveau (BSL) 2 voorwaarden.- Reinig de bioveiligheid kast met een 70% ethanol oplossing vóór en na de ingreep van de infectie.
- Gooi alle afvalstoffen geproduceerd tijdens deze procedure richtsnoeren voor goede die bioveiligheid (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Gooi afval in de autoclaaf opslaglocaties en verontreinigde vloeistoffen in plastic zakjes gevuld met 70% ethanol oplossing of medische ontsmettingsmiddel.
- Intranasale besmetting van de griep
OPMERKING: B6. CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-YFP)22 op de achtergrond van een C57BL/6J werden gebruikt in deze studie. Muizen werden onderhouden in de specifieke pathogenen vrije faciliteit in het Institute for Research in biomedische ontwikkelingen.- Plaats een maximum van 5 leeftijd en geslacht-zoekwoorden (zes tot acht weken oude) CD11c-YFP muizen per kooi. Wacht ten minste twee dagen voor muizen acclimatisatie aan huisvesting voordat de infectie-procedure.
- Ontdooi PR8 voorraad en maak de corresponderende verdunning met koude 1 x Dulbecco van fosfaat buffer saline zonder calciumchloride en magnesiumchloride (PBS bewerkt) te verkrijgen van een eindconcentratie van 200 plaque vormende eenheden (FPU) in 30 µL. Houd virus verdunning op het ijs tijdens de hele procedure.
Opmerking: titratie van elke batch van influenzavirus voorafgaand aan het gebruik ervan wordt aanbevolen om de dosis van een precieze infectie. - Injecteren van een dosis van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) intraperitoneally (i.p.) met behulp van een 26 G naald 1 mL spuit.
- Wacht totdat de muis is volledig narcose (volledig verlies van restarmen zowel pedaal terugtrekking reflex). Diepe anesthesie is noodzakelijk voor een optimale infectie, omdat niet-volledige narcose muizen zal slikken of royement van het virus entmateriaal, leiden tot variaties in de dosis van de infectie.
- Plaats de narcose muis in een liggende positie. Verzamelen 15 µL van virus entmateriaal. Plaats het uiteinde van de pipet dicht bij de muis linker neusgat en afzien van het virale entmateriaal druppel voor druppel. Zoals druppels moeten worden ingeademd, ze niet Pipetteer rechtstreeks in de holte van de neus.
- 2 – 5 min wachten en plaats het uiteinde van de pipet met de resterende 15 µL van virus entmateriaal in het rechter neusgat.
Opmerking: Om te voorkomen dat verstikking, afzien klein druppels in ongeveer 20 s intervallen. - Controleer dat de muis goed ademt en plaatst u deze in een kooi in de laterale decubitus. Toezicht op de ademhaling en anesthesie herstel muis (ongeveer 60 min na inductie).
Opmerking: Het is mogelijk om te infecteren meer dan 1 muis op hetzelfde moment. In dit geval, beheren van virale entmateriaal in het linker neusgat van alle muizen in een reeks, 2-5 min wachten en vervolgens beheren van het virus in het rechter neusgat. Om te voorkomen dat de variabiliteit tussen personen, niet meer dan 3 muizen te infecteren op hetzelfde moment. - Diergezondheid status en gewicht verlies dagelijks controleren.
- Euthanaseren muizen volgens het humane eindpunt bepaald door de autoriteit richtsnoeren. De euthanasie-methode moet worden goedgekeurd door de autoriteiten van dierproeven en lokale ethische regels moet respecteren. Na twee-foton experimenten, euthanaseren muizen door toediening van een overdosis van ketamine/xylazine gevolgd door cervicale dislocatie. In alle andere experimenten, CO2 inademing als een methode voor euthanasie te gebruiken.
Opmerking: Voor het meten van de virale titers van besmette luchtpijp, 50% weefselkweek infectieuze dosis (TCID50) assay of real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR) test kan worden uitgevoerd als eerder beschreven23.
- Evaluatie van neutrofiele aanwerving in de luchtpijp door stroom cytometry
Opmerking: Dit deel van het protocol is optioneel. Het programma wil evalueren neutrofiele werving in tracheale mucosa na besmetting van de griep.- Besmette en niet-geïnfecteerde muizen op dag 3 na infectie (p.i.) euthanaseren CO2 inademing.
Opmerking: Tracheale om schade te voorkomen, Vermijd het gebruik van cervicale dislocatie naar euthanaseren van dieren. Perfusie van euthanized muizen is bovendien aan te raden om te voorkomen dat besmetting van bloed neutrofiele granulocyten. - Spray de muis hals met 70% ethanol oplossing en het uitvoeren van een insnijding van de huid met behulp van chirurgische schaar uit de borst aan de kin.
- Scheid de speekselklieren met pincet en bloot in de luchtpijp.
- Het ontleden van de spieren rond de luchtpijp met behulp van Tang en schaar.
Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd zorgvuldig omdat luchtpijp kan gemakkelijk worden beschadigd tijdens de procedure. - Houd de luchtpijp met een tang en zorgvuldig het loskoppelen van de slokdarm door dissectie.
- Houd het intrathoracale deel van de luchtpijp met een tang en maak een incisie aan het begin van de bronchiale boom. Vervolgens het loskoppelen van de luchtpijp van het strottenhoofd en verwijder voorzichtig alle spieren links.
- Plaats het orgel in een tube van 1,5 mL met RPMI 1640 + HEPES medium (RPMI) op het ijs.
- Het enzym mengsel voorbereiden luchtpijp spijsvertering, met 0,26 eenheden/mL collagenase (I en II) en 0,2 mg/mL DNase ik in RPMI.
- Plaats de ontleed luchtpijp in een 6-well plaat met 1 mL van het mengsel van de enzymen.
- Snijd het orgel in kleine stukjes met de hulp van de Tang en schaar. Houd de plaat op ijs tijdens deze stap.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten. Gedurende deze tijd, schud de plaat elke 15 min.
- Stop de enzym vertering door toevoeging van 1 mL FACS wassen buffer (2 mM EDTA en 2% warmte-geïnactiveerd filter-gesteriliseerde foetale runderserum (FBS)) in PBS.
- Resuspendeer de oplossing met een 1 mL pipet om te helpen om te distantiëren van de gedeeltelijk onverteerd stukjes weefsel.
- Breng de oplossing aan een ander goed door het passeren van de inhoud door een 40 µm zeef. Vervolgens voorzichtig smash de resterende stukken van het orgel gevangen op de top van de zeef met behulp van een zuiger 2 mL spuit.
Opmerking: Smashing luchtpijp gedeeltelijk onverteerd stukken over de zeef is een cruciale stap voor een optimale aantal cellen tijdens flow cytometrische analyse. - Wash de put en de zeef met FACS wassen spoel de suspensie in een tube van 5 mL buffer gehouden op ijs.
- Centrifugeer de buizen bij 166 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 µL van FACS wassen buffer.
- Ga verder met het oppervlak vlekken van het antilichaam voor stroom cytometry. Kort, blokkeren Fc receptoren van de geïsoleerde cellen met behulp van een antilichaam tegen CD16/32, gevolgd door het oppervlak vlekken. Om het correct identificeren neutrofielen, de stroom cytometry paneel de volgende antistoffen moet bevatten: αLy6G, αCD11b, αCD45, evenals een levensvatbaarheid kleurstof uit te sluiten van de dode cellen.
- De gehele inhoud van de monsters worden uitgevoerd op een stroom cytometer en analyseren van gegevens.
- Om een optimale nummer van immune cellen, de eencellige schorsing met een snelheid die niet hoger dan 3000 events/s worden uitgevoerd. Dit vermindert het aantal gebeurtenissen uitgesloten tijdens de overname. Met behulp van dit protocol, moet het kunnen verkrijgen van 1 tot 2 miljoen van cellen per luchtpijp.
- Besmette en niet-geïnfecteerde muizen op dag 3 na infectie (p.i.) euthanaseren CO2 inademing.
2. isolatie en injectie van neutrofiele granulocyten
Opmerking: In deze procedure, B6.129 (ICR)-GS (CAG-ECFP) CK6Nagy/J muizen (CK6-ECFP) waren gebruikte24. Deze dieren express GVB in alle celtypes onder de menselijke β-actine promotor. Anderzijds is het ook mogelijk met C57BL/6J muizen te isoleren van de cellen en vlek ze volgens het protocol beschreven in stap 2.6. De zuivering en manipulatie van neutrofielen kunnen het verhogen van hun status van de activering, potentieel veranderen hun migratiestromen en functionele eigenschappen.
- Het dier euthanaseren CO2 inademing.
- Verwijder zowel dijbeen en zijn verbeend en ze voorzichtig schoon met pincet.
- Knip bot epifyses en spoelen van het beenmerg met behulp van een spuit van 1 mL gevuld met steriel koude PBS, in een tube van 50 mL, gehouden op het ijs.
- Resuspendeer de cellen met een naald 18 G en filteren van de celsuspensie met een zeef 40 μm. Een keer wassen met PBS bij 110 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de cellen in 2 mL zuiver koude PBS.
-
100% verdund Percoll 9:1 in 10 x PBS en kleurovergang oplossingen van percoll 72%, 64% en 52% met behulp van 1 x PBS te bereiden. Zorgvuldig laag 2 mL van elk van de drie verlopen in een tube van 15 mL, een vanaf het meest geconcentreerd.
- Voeg voorzichtig 2 mL celsuspensie van het beenmerg bovenop de hellingen en centrifuge bij 1100 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) zonder versnelling en rem.
- Zorgvuldig verwijderen van de band op het raakvlak tussen de 64 tot 72% en een keer wassen bij 200 x g gedurende 5 min bij 4 ° C met koude PBS. Resuspendeer de cellen in een volume van 100 μl van PBS en houd ze op het ijs. De zuiverheid van de neutrofielen verwachting hoger dan 90%.
- Optioneel label neutrofiele granulocyten met een cel proliferatie kit met behulp van de fabrikant-protocol. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten, voeg de kleurstof toe aan de celsuspensie om een eindconcentratie van 10 μM in een volume van 1 mL en wassen (166 x g, 5 min).
- Concentratie van de cel met behulp van een hemocytometer schatten en intraveneus 5 x 106 cellen in een maximumvolume van 100 μl in de eerder geïnfecteerd CD11c-YFP+ muizen met behulp van een 26 G naald 1 mL spuit, 12 h voor imaging te injecteren.
3. voorbereiding van de muis voor Imaging
-
Anesthesie
- Anesthetize besmette CD11c-YFP+ muizen op dag 3 p.i. volgens stap 1.2.3.
- Zodra muizen zijn diep verdoofd, bereiden een katheter voor anesthesie opnieuw doseren.
- Verwijder een 30 G naald uit een spuit met pincet.
- Plaats de naald op een stuk van 20 cm van PE-10 medische Siliconen slang.
- Invoegen van een 30 G naald-spuit gevuld met ketamine/xylazine mengsel aan de andere kant van de buis.
- Verwijder de lucht binnenkant van de buis.
- Bereiden een 20 G katheter aangesloten op een buis van een insufflating machine van zuurstof te handhaven van geautomatiseerde ventilatie (figuur 1Aik). Zet deze dan op een verhouding van de adem van 130 beats per minuut (b.p.m.) met een ademhalingsvolume van 0,2 mL met behulp van een 100% zuurstof gasvoorziening.
-
De muis voor te bereiden op de operatie
- Houd de muis op een specifieke aangepaste chirurgische bord (figuur 1A-ii-iii) over een verwarmde plaat of een verwarmde chirurgische bankje ingesteld bij 37 ° C voor alle tijd van de ingreep.
- Scheren van het haar vanaf de nek van de muis met behulp van een elektrisch scheerapparaat en een ontharende room (figuur 1Bik).
- Plaatst u de muisaanwijzer boven de plastic muis positionele (figuur 1Aii-a), de dierlijke hoofd buiten de positionele te houden (figuur 1Bii) maken een hoek die de intubatie van de luchtpijp vergemakkelijkt.
- Herstellen van de voorpoten, de poten en de staart met de chirurgische tape, Bevochtig muis ogen met een gel vitamine A verrijkt en Desinfecteer de muis nek (figuur 1Bii).
-
Chirurgie
- Voorbereiden van goed gesteriliseerde met autoclaaf items, namelijk, schaar, microchirurgische schaar en pincet.
- Een kleine incisie op de lange mediale as van de nek, ongeveer 1 cm lang, in het midden gebied tussen de bovenste borst en de lijn door het onderste punt van de onderkaak (figuur 1Biii) uitvoeren.
- Lateraal verplaatst de patches van de huid en de speekselklieren en visualiseren van de luchtpijp, vallen de spieren. Vervolgens ontleden de tracheale spieren zorgvuldig gebruik van de verlostang (figuur 1Biii).
- Intubate van de muis met een katheter en kunstmatige ventilatie (figuur 1Biv) beginnen.
Opmerking: De katheter is samengesteld uit een externe van plastic vaneengaan, die de tracheale mucosa en een innerlijke ijzer naald beschermt. De aanwezigheid van de naald biedt de ideale oplossing uit te breiden en de luchtpijp te stabiliseren en te reguleren zijn expositie. Kunstmatige ventilatie door de katheter garandeert een goede ademhaling van de muis. - Onmiddellijk beginnen de kunstmatige ventilatie aan monitor muis ademhaling.
- Het vaststellen van de hoogte van de katheter en oriëntatie met behulp van een chirurgische haak (figuur 1Bv) verbonden met de specifieke staaf op de chirurgische bord (figuur 1Aii-b). Bloot in de luchtpijp op dezelfde hoogte van de kin.
- Omcirkelen de luchtpijp met vaseline en bedek het met een paar druppels van voorverwarmde PBS te garanderen van de goede hydratatie naar het orgel (figuur 1Bvi).
- Monteer het dekglaasje aan op de top van de voorbereiding. Lijm voor deze stap, een dekglaasje aan op een metalen houder (figuur 1Bvii), die zal worden geschroefd aan de XYZ-vertaler (figuur 1Aii-c). Pas de XYZ-vertaler om te plaatsen het dekglaasje aan op de top van de chirurgische voorbereiding.
- Plaatsen van de katheter voor het beheer van de narcose intraperitoneally (figuur 1Bviii).
- Injecteren van 50% van de begindosis van ketamine/xylazine mengsel elke 30 min.
Nota: Opnieuw doseren van 50% tot 25% van het oorspronkelijke mengsel van ketamine/xylazine is een veilige en geldige alternatieve25. Echter gebruiken aangezien dit protocol terminal is en een strikte immobilisatie van het dier vereist tijdens de hele procedure is, hogere doseringen te handhaven van een diep chirurgische vliegtuig van de verdoving.
4. in Vivo Time-lapse Imaging
Opmerking: Beeldacquisitie werd uitgevoerd met een rechtop twee-foton microscoop, uitgerust met twee Ti:Sa lasers, temperatuurgevoelig incubatie-kamer en een 25 X / nb 1.1 water onderdompeling doelstelling. De photomultipliers (PMT) gebruikt voor Beeldacquisitie waren ofwel hybride detectoren of hoge gevoeligheid GaAsP.
- Plaats de chirurgische bord met de narcose muis binnen de Microscoop incubatie kamer (pre-water verwarmd bij 37 – 38 ° C) en voeg een druppel water op het dekglaasje aan.
- Center en zoeken de focus op de tracheale weefsel.
-
Instellen van de scan frequentie op 800 Hz, met 520 x 520 pixels, een beeldveld van 440 x 440 μm2 en lijn gemiddelde 1.
- Melodie Ti:Sa laser 830 nm tot tweede-harmonische generatie (SHG) prikkelen van collageen, met een indicatieve macht aan de bron van 150 mW. De tweede Ti:Sa laser op 920 Tune nm met 94 mW aan de bron te wekken zowel GVB en YFP.
- Set-up het 3D en timelapse overname modus met gelijktijdige excitatie
Opmerking: Houd de laser bevoegdheden zo laag mogelijk om photobleaching en fototoxiciteit te minimaliseren.
- Record fluorescentie met behulp van twee kanalen in niet-descanned modus, met een master dichroïde spiegel op 560 nm. In het set-up gebruikt in dit protocol, een tweede dichroïde spiegel splitsen het signaal op 495 nm te scheiden kanaal 1 (emissie filter 475/50) van kanaal 2 (emissie filter 525/50) (figuur 2A). Deze configuratie verzamelt SHG licht van collageen in het eerste kanaal, terwijl GVB emissie wordt verzameld in beide kanalen 1 en 2 en YFP wordt verzameld alleen in kanaal 2.
- Definieer een 50 micrometer langs de Z-as, met een stap grootte van 3 μm (voxel grootte 0,86 μm x 3 μm). Record beelden elke 30 s voor een totale duur van 30 min.
- Indien gewenst, verwerven meerdere regio's. Voordat u meer overnames, vitale functies controleren en terug verdoving via de katheter indien nodig (zie stap 3.3.10).
- Aan het eind van het proces van beeldvorming, euthanaseren de muis door ketamine/xylazine overdosis gevolgd door cervicale dislocatie.
5. beeld verwerking en kwantitatieve analyse van de beweeglijkheid van de neutrofiele-DC en interactie
Opmerking: In dit protocol, een gespecialiseerde imagingsoftware werd gebruikt voor het analyseren van de gegevens van de microscopie.
- Nadat 4D Beeldacquisitie is voltooid, overdracht van de bestanden (data en metadata) op een werkstation met voldoende rekenkracht (voorgesteld minimale systeemvereisten: 32 GB RAM, snelle Solid-state-state-drives, recente CPU, dedicated GPU gebaseerd op een massaal parallelle architectuur).
- Open de bestanden in de beeldbewerkingssoftware.
- Afspelen van de video en ervoor te zorgen dat de cellen van belang duidelijk zichtbaar zijn en dat de beeldvorming artefacten afwezig zijn.
Opmerking: te dien einde verifiëren dat zowel de beweging van het monster en de helderheid variatie voldoende zijn beperkt. Inderdaad, deze uitdagingen voor de automatische analyse26vertegenwoordigen. Als de verplaatsing van het monster tussen aangrenzende frames overdreven is, een drift correctie methode, met bijvoorbeeld het SHG-kanaal als een vaste verwijzing wilt toepassen. Hierdoor kan beter maatregel het verkeer van de cellen in plaats van de beweging van het monster. Bovendien, in aanwezigheid van lichte achtergrond of puin, Snoei de gereconstrueerde oppervlakken gebruik volume als een parameter van de selectie. - Het genereren van een specifiek kanaal co lokalisatie voor GVB+ cellen, om te scheiden van het signaal tussen het GVB en het collageen (SHG). Te dien einde duiden een gating veelhoek (figuur 2Bik) die alleen de voxels hebben van een positieve intensiteit zowel in het groene kanaal en in het blauwe kanaal selecteert.
Opmerking: Deze procedure kan variëren naargelang de filter set van de Microscoop en de kleuring van de cellen. Het kan worden bereikt door het selecteren van alleen voxels met voldoende intensiteit in zowel de groene en de blauwe kanalen. Onder de beschikbare instrumenten, kan de "coloc"-functionaliteit worden gebruikt voor het automatisch berekenen van het kanaal van de colocalization gebaseerd op intensiteit drempelmethode. Methoden op basis van machinaal leren kunnen daarnaast worden gebruikt voor deze stap onder supervisie van een deskundige27. - Detecteren en bijhouden van GVB+ cellen, met behulp van automatische oppervlakte wederopbouw en bijhouden (oppervlakte gereedschap) via de juiste co lokalisatie-kanaal.
Opmerking: Handmatige curatie van uiteindelijke tracking fouten en uitsluiting van tracks met een duur die korter is dan een opgegeven drempelwaarde (dat wil zeggen, 150 s) mogelijk. - Het genereren van een specifiek kanaal co lokalisatie voor CD11c-YFP+ cellen, om te scheiden van de signalen van het GVB en YFP. Te dien einde duiden een gating veelhoek (figuur 2Bii) die alleen de voxels hebben een positieve intensiteit in het groene kanaal, maar een lage intensiteit in het blauwe kanaal selecteert.
Opmerking: vertegenwoordiger microfoto tonen de signalen van kanaal 1, kanaal 2 de co lokalisatie kanaal voor GVB, het kanaal van de co lokalisatie voor YFP en de combinatie van alle kanalen vindt u in figuur 2Biii. - Reconstrueren van het oppervlak van de cellen van de CD11c-YFP+ en bijhouden van hun standpunt na verloop van tijd (oppervlakte gereedschap).
Opmerking: Handmatige correctie van fouten van de uiteindelijke bijhouden is niet vereist voor deze stap. Inderdaad, als gevolg van de complexe spatio-temporele dynamiek van DC, wederopbouw van hun precieze oppervlak van 2 P-GODT gegevens is een uitdagende taak die niet kan worden bereikt met de segmentering van de beschikbare software. Onder de redenen waardoor deze taak uitdagende, toestaan dunne uitsteeksels en variaties van de helderheid niet voor het gebruik van bepaalde beeldverwerking technieken, zoals het vloeiend maken van filters of statische drempelmethode. Bovendien, in een netwerk van DC is het moeilijk te scheiden van enige cellen alleen gebaseerd op hun verschijning in 2P-GODT gegevens. Voor deze redenen, in plaats van een nauwkeurige segmentatie probeert door softwareparameters tuning, stellen wij voor om te reconstrueren van niet-nauwkeurige oppervlakken van DC. Dan, omgaan met de mogelijke fouten door middel van robuuste statistieken zoals beschreven in 5,8. -
Cel migratie te meten.
- Exporteer de klassieke migratie maatregelen voor zowel GVB+ en CD11c-YFP+ cellen. Onder deze geeft de "track snelheid betekenen" de gemiddelde trekkende snelheid van de cellen terwijl de "track rechtheid" de directionaliteit van de cellen aangeeft. Deze maatregelen kunnen worden geëxporteerd als een spreadsheet-bestand van de beeldbewerkingssoftware.
- In de geëxporteerde spreadsheet-bestanden, het berekenen van de "gecorrigeerde track rechtheid" (ook gecorrigeerde opsluiting verhouding genoemd) voor zowel GVB+ en CD11c-YFP+ cellen, die wordt gedefinieerd als "track rechtheid" vermenigvuldigd met de vierkantswortel van "track duur" gedeeld door de vierkantswortel van de video duur. Deze maatregel is robuuster dan 'rechtheid bijhouden' in het bijzijn van korte28, bijvoorbeeld afkomstig van de tracking fouten bijgehouden.
Opmerking: alleen video's van dezelfde lengte kunnen vergeleken worden met deze maatregel.
-
Maatregel cel interactie.
- Definieer een contact tussen een GVB+ -cel en de cel van een CD11c-YFP+ als hun afstand (dichtstbijzijnde voxels) minder of gelijk dan een drempel (dat wil zeggen, 2 μm is).
Opmerking: Deze drempel moeten voldoende streng zijn om op te sporen van een contactpersoon alleen wanneer cellen in de nabijheid. Echter, wij raden te houden deze drempel groter is dan 0, idealiter N keer groter is dan de straal voxel (N > 2), omdat de grens vloeiend maken de wederopbouw van de cellen kleiner is dan de werkelijke celgrootte kunt maken. - Tellen van het aantal en de duur van contacten tussen GVB+ en CD11c-YFP+ cellen. In de denkbaar software kan dit bijvoorbeeld gebeuren door het uitvoeren van een "kussen en uitgevoerd" plug in. Deze maatregelen kunnen worden geëxporteerd als een spreadsheet-bestand uit het tabblad Statistieken.
- Definieer een contact tussen een GVB+ -cel en de cel van een CD11c-YFP+ als hun afstand (dichtstbijzijnde voxels) minder of gelijk dan een drempel (dat wil zeggen, 2 μm is).
- De eerder berekende maatregelen in een statistische software importeren, genereren de percelen en statistische tests uitvoeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit werk beschreven we een gedetailleerd protocol om te studeren in vivo de beweeglijkheid en de interacties tussen neutrofielen en DC tijdens de besmetting van de griep in lymfkliertest luchtpijp (figuur 3A). Voor dit doel, we geïsoleerd GVB+ neutrofiele granulocyten (92% zuiverheid; Figuur 3B) vanaf CK6-ECFP overgedragen muizen en we adoptively hen in een CD11c-YFP-muis geïnfecteerd met influenza. Na dat we 2P-GODT van de luchtpijp op dag 3 p.i. uitgevoerd Op dit punt van tijd zien we een duidelijke werving van neutrofielen in het besmette gebied, zoals blijkt uit de flow cytometrische analyse (Figuur 3 c). Het 2P-GODT-protocol vereist het gebruik van een specifieke chirurgische bestuur en een zuurstof-leverancier voor knaagdieren (figuur 1A). Leveren van zuurstof via een canule in de luchtpijp geplaatst hielp het dier ademhaling, vergemakkelijkt de expositie van de luchtpijp en de beweging van de orgel is gekoppeld (figuur 1B) ademhaling gecontroleerd. Na deze experimentele set-up verworven we stabiel 4D beelden in vivo in de besmette luchtpijp gedurende een periode van 30 min (3D figuurfilm 1).
De analyse van de verworven 4D beelden via gespecialiseerde imagingsoftware toegestaan te meten van de migratie van de cellen en te kwantificeren van de spatio-temporele dynamiek van neutrofielen en DC. We hebben vastgesteld met betrekking tot de beweeglijkheid van de cel, verschillen tussen het verkeer van de DC en de aangeworven neutrofielen, waaruit bleek een aanzienlijk sneller dan de laatste (figuur 4A). Dit resultaat bevestigt de dynamische aard van neutrofiele granulocyten, eerder omschreven als zeer motile cellen kunnen migreren naar een chemoattractant bron29. Met betrekking tot de directionaliteit, wij gesloten dat complexe morfologie van de DC opgeleverd van voorkomende fouten in cel bijhouden, die op zijn beurt tracks met verminderde duur en verhoogde afwijking van de gemeten directionele gedrag (figuur 4B). Om deze reden berekend we een robuuste metriek welk vermag meten directionaliteit rekening houdend spoor duur. Gebruik deze statistiek, vastgesteld we hebben een significant verschil in de directionaliteit van neutrofielen vs DC (figuur 4C).
Bovendien mag de berekening van de afstand tussen neutrofielen en DC te detecteren en te analyseren hun contacten na verloop van tijd. In dit experimenteel model waargenomen we sommige neutrofiele granulocyten die meerdere-brief contacten met DC en anderen die geen contact gedurende de verbeelde (Figuur 4 d vormden) gevormd. Bovendien, de studie van de gemiddelde trend van de afstand tussen neutrofielen en DC na verloop van tijd konden we bestuderen de algehele positionering van de bestudeerde cellen (figuur 4E), terwijl het onderzoek van de tendens in bepaalde cellen kunnen karakteriseren de gedrag van elke eencellige (figuur 4FMovie 2).
Figuur 1: apparatuur en stappen voor 2P-GODT van lymfkliertest luchtpijp. (Ai) Het systeem van de draagbare dierlijke verdoving die belast is met de geautomatiseerde ventilatie is verbonden met een pomp die zuurstof naar de muis levert. Vooraanzicht (Aii) en zijaanzicht (Aiii) van de op maat gemaakte chirurgische bestuur gebruikt voor de tracheale model. De Raad van bestuur bestaat uit een metalen fase met een plastic muis positionele (Aii-a), een staaf voor het houden van een beweegbare klem (Aii-b), en een boete afstembare XYZ vertaler (Aii-c). (B) opeenvolgende stappen van de trachea chirurgische model: (Bi) ontharing van het chirurgische gebied, (Bii) positionering van de narcose muis in de chirurgische board, de chirurgische expositie (Biii) van de luchtpijp, (Biv ) met een katheter met kunstmatige ventilatie (Bv) fixatie van de katheter, (Bvi) aanvulling van PBS op de blootgestelde luchtpijp, intubatie (Bvii) montage van het dekglaasje aan, en (Bviii) plaatsing van een katheter met verdoving. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Fluorescent signaal detectie tijdens 2P-GODT. (A) Schematische weergave van de Microscoop detectie filter set-up en bijbehorende kanalen. Dichroïde spiegel op 560 nm scheidt blauw/groen van rood/ver rode emissies. Extra dichroïde spiegel op 495 nm wordt gebruikt voor verdere herkennen de verschillende deelgebieden van het emissiespectrum. Kanaal 1 maakt gebruik van een hybride-detector (emissie filter 475/50), terwijl het kanaal 2 gebruik hoge gevoeligheid GaAsP PMT (emissie filter 525/50). (B) vertegenwoordiger scatter dot percelen van 2 P signalen waaruit de gating strategie voor de generatie van de colocalization kanalen voor de identificatie van signaal uit het GVB (Bi) en de YFP (Bii) fluorophores. (Biii) Representatieve microfoto tonen de specifieke signalen van kanaal 1 (Ch 1, donkerblauw), kanaal 2 (Ch 2, groen), het co lokalisatie kanaal voor GVB (lichtblauw), het co lokalisatie kanaal voor YFP (geel) en de combinatie van alle kanalen (Ch 1 + Ch 2 + GVB + YFP). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Intravital 4D beeldvorming van neutrofielen en DC in de luchtpijp van een griep besmet. (A) schematisch overzicht van het protocol. (B) vertegenwoordiger stroom cytometrische scatterplot met het percentage van neutrofiele granulocyten met betrekking tot de totale CD45 + cellen in een celsuspensie geïsoleerd uit lymfkliertest beenmerg met behulp van de Percoll-gradiëntenmethode. (C) vertegenwoordiger stroom cytometrische scatterplots een toename in de frequentie van de neutrofielen in tracheas tonen van niet geïnfecteerde muizen in vergelijking met muizen geïnfecteerd met influenza-virus op dag 3 p.i. (D) (linkerdeel) anatomische afbeelding van een RattenUitrustingen luchtpijp tonen het gebied geselecteerd voor Beeldacquisitie. (Rechtervenster) Representatieve 3D projectie van de opname van een 2P-GODT tonen de oppervlakte wederopbouw van neutrofiele granulocyten (lichtblauw) en DC (geel) samen met hun sporen op dag 3 p.i. SHG signaal wordt weergegeven in donker blauw. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: karakterisering van neutrofiele en DC migratie en interactie dynamiek in griep besmet luchtpijp. Representatieve percelen tonen de track snelheid betekenen (A), rechtheid (B) bijhouden en gecorrigeerd track rechtheid (C), zoals gedefinieerd door Beltman en collega's (2009)28, van neutrofielen en DC in luchtpijp op dag 3 p.i. met influenza-virus. De gecorrigeerde track rechtheid meting vertoont robuustheid voor het bijhouden van fouten. (D) 2D histogram weergegeven: de frequentie van neutrofiele volgens hun aantal contacten met de DC en de gemiddelde contact duur. (E) gemiddelde afstand van neutrofielen naar de dichtstbijzijnde DC tijdens de duur van de film. (F) (links) analyse van de afstand van een vertegenwoordiger neutrofiele naar de dichtstbijzijnde DC in tijd. De gestippelde rode lijn geeft de afstand drempel te overwegen dat een neutrofiele een contact met een DC opgericht. (Juiste i-iii) Microfoto verworven op verschillende tijdstippen vertegenwoordigen de migratie van een neutrofiele (lichtblauw) naar een DC (geel). Cel nummers worden weergegeven als een veelkleurige lijn die van kleur van blauw naar rood verandert te vertegenwoordigen tijd. SHG signaal van fibrillary collageen wordt weergegeven in het donkerblauw. Schaal bar = 50 µm. In alle cijfers zijn de gepresenteerde gegevens representatief voor ten minste drie onafhankelijke experimenten. Resultaten worden gegeven zoals bedoel ± SD. statistieken door Welch's test. NS p > 0,05; p < 0,0001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Film 1: neutrofielen en DC dynamiek in de luchtpijp tijdens besmetting van de griep. 30 min time-lapse 3D afbeelding toont interactie dynamiek tussen neutrofiele granulocyten (lichtblauw) en DC (geel), alsmede hun respectieve sporen met betrekking tot het netwerk van de collageen (donker blauw) van de luchtpijp. Representatieve neutrofiele-DC interacties worden aangegeven met witte pijltjes. Cel nummers worden weergegeven als een veelkleurige lijn die van kleur van blauw naar rood verandert te vertegenwoordigen tijd. Schaal bar = 50 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Movie 2: vertegenwoordiger op korte termijn neutrofiele-DC interactie in de luchtpijp tijdens besmetting van de griep. 30 min time-lapse 3D afbeelding toont een representatieve interactie tussen een neutrofiele (lichtblauw) en een DC (geel) en hun respectievelijke tracks. Cel nummers worden weergegeven als een veelkleurige lijn die van kleur van blauw naar rood verandert te vertegenwoordigen tijd. SHG signaal van collageen wordt weergegeven in het donkerblauw. Schaal bar = 10 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit werk presenteert een gedetailleerd protocol voor de generatie van 4D beelden tonen van de migratie van adoptively overgedragen neutrofielen en hun interacties met DC tijdens een besmetting van de griep in de luchtpijp van de muis. De beschreven 2P-GODT-model zullen relevant zijn voor de studie van immuun cel dynamiek tijdens een infectie in de luchtwegen.
Verschillende modellen gebaseerd op de visualisatie van de dynamiek van de cel in de luchtwegen hebben onlangs ontwikkelde9,10,11,12,13,14,15 ,16. In vivo imaging van de longen is echter nog steeds uitdagende, gelet op de anatomische positie van dit orgaan en de technische problemen om te minimaliseren van het verkeer tijdens de ademhaling cyclus30. Om deze problemen, hebben sommige auteurs voorgesteld het gebruik van een custom-built circulaire zuig kamer, die moet chirurgisch worden ingevoegd in de thorax13,14. Deze procedure vereist echter een invasieve ingreep die de resultaten, met name in die studies die zijn gericht op het onderzoek van de inflammatoire respons in gevaar kan brengen. Bovendien, Long chirurgische modellen presenteren een beperking voor diepe weefsel imaging als gevolg van de lichtbreking ontstaan door de lucht in de longblaasjes17. Omgekeerd, verschillende tracheale modellen zijn onlangs tewerkgesteld te bestuderen van de dynamiek van de cel in het epitheel van de luchtwegen. Beeldvorming van dit orgel biedt duidelijke voordelen ten opzichte van Long, zoals de relatief eenvoudige operatie moeten blootstellen en immobiliseren van het orgaan, alsmede de hogere toegankelijkheid van de trachea epitheel. Het voorgestelde tracheale model is ook relevant voor het onderzoeken van de inleiding van de reactie tegen luchtwegen ziekteverwekkers, zoals griepvirus, aangezien de luchtpijp een van de eerste sites van virale replicatie in de loop van een influenza-infectie8 is.
Interessant is dat een onderzoek waaruit blijkt dat een alternatief intubatie-vrije methode voor imaging-de luchtpijp heeft onlangs gepubliceerd12. Deze methode wordt gekenmerkt door een verminderde ontsteking en toont duidelijke voordelen in studies waar de mucociliarity functie van de epitheliale cellen moet worden bewaard. Echter, deze methode is geen garantie voor voldoende stabiliteit en de verwerving van helderder signalen nodig om te studeren-cel contactpersonen in een bereik van enkele µm. omgekeerd, de methode die in het huidige protocol biedt betere immobilisatie van het orgel Dankzij de intubatie en kunt de detectie van sterkere fluorescentie signalen als gevolg van de kortere afstand tussen het orgel en het dekglaasje aan12.
Totstandbrenging van weefsel immobilisatie tijdens in vivo 2 P-GODT Beeldacquisitie is de meest kritische stap om optimale gegevens te genereren. Sommige cruciale maatregelen die tot de stabiliteit van de onderhavige methode bijdragen omvat: een passende muis anesthesie; een juiste muis intubatie; en een chirurgische expositie van de luchtpijp waarmee een gemakkelijke toegang tot het orgel door het dekglaasje aan. Bovendien zal het juiste aantal cellen (ideaal 30 cellen per gezichtsveld) imaging versterken de verkregen resultaten. De aanwerving van het optimale aantal cellen zal voor een groot deel afhankelijk van de dosis van virale infectie, die is zeer beïnvloed door de juiste toediening van het virale entmateriaal.
Een andere belangrijke stap van het protocol is de chirurgische expositie van de luchtpijp. Verschillende maatregelen kunnen worden vastgesteld om te minimaliseren van de schade aan het orgel tijdens de operatie. Bijvoorbeeld, moet de luchtpijp niet rechtstreeks getroffen worden met chirurgische gereedschappen. In plaats daarvan moet het worden blootgesteld door het manipuleren van alleen het omliggende weefsel (huid, speekselklieren en spieren). Als strikt noodzakelijk is, moet de luchtpijp worden behandeld met behulp van unsharpened artikelen. Bovendien moeten inspanningen worden gedaan om te voorkomen bloedvat schade. Tot slot, om te voorkomen uitdroging van het orgel, het is ook belangrijk om het te dekken met PBS onmiddellijk na de operatie.
Ondanks de unieke voordelen van deze methode ten opzichte van de eerder beschreven methoden voor de visualisatie van de immuun cel-interacties in de trachea mucosa presenteert het gebruik van dit model enkele beperkingen. Zoals hierboven beschreven, kan de aanwezigheid van ontsteking geassocieerd met de tracheale operatie een nadeel vertegenwoordigen bij de studie van de immuunrespons. Om deze beperking te overwinnen, is het mogelijk voor het beheer van de anti-inflammatoire geneesmiddelen voorafgaand aan de inleiding van de procedure. Een andere beperking van dit model is gerelateerd aan de aanwezigheid van een sterke autofluorescence signaal bestaande in de luchtwegen, die wordt voornamelijk gegenereerd door de ingezeten cellen en de laag slijm. Deze niet-specifieke fluorescentie creëert artefacten die de analyse zouden kunnen belemmeren. Misleidende berekening van de track rechtheid parameter kan bovendien worden gegenereerd wanneer vergelijken cel nummers van verschillende duur en als tracking fouten tracks van korte duur26 introduceren. Om dit probleem te verhelpen, we een coëfficiënt van de straf om te corrigeren track rechtheid toegepast. Deze correctie is bedoeld om te minimaliseren van het effect van miss-tracking in de resultaten-28.
Een cruciaal aspect van 2P-GODT experimenten is de mogelijkheid om hergebruik muizen die hebben ondergaan chirurgie en beeldvorming. De in vivo imaging protocol beschreven hier vereist geen dierlijke euthanasie of orgel-collectie, waardoor de mogelijkheid om te herstellen en hergebruik muizen na de operatie voor andere procedures. Gebruik een enkele muis, bijvoorbeeld voor het uitvoeren van de luchtpijp imaging op ander moment punten drastisch het aantal totale dieren nodig in een experiment verminderen kunnen, ondersteuning van het beginsel van vermindering van de dierlijke . Bovendien kan het ook tussen individuele variabiliteit verminderen. Echter voldoen dierlijke terugwinning en hergebruik aan de normen voor dierenwelzijn die omvat het beheer van goede pijnstillende drugs en antibiotica voor de dieren tijdens de hersteltijd. Alle deze procedures moeten worden opgenomen in het protocol van dierproeven en goedgekeurd door de lokale dierenarts autoriteiten.
Het beschreven protocol kunnen gemakkelijk aan te passen aan de studie van andere immuun celtypes. Bijvoorbeeld kunnen isolatie en injectie van (TL of gekleurd) pathogeen-specifieke T-cellen worden gebruikt om te studeren van T cel activatie dynamiek31 alsook hun interactie met andere cellen zoals tracheale DC. Op een gelijkaardige manier, kan de visualisatie van bloed- of lymfevaten vertegenwoordigen een interessante benadering om te studeren de rekrutering van ontstekingscellen in de trachea weefsel in de loop van de infectie. 2P-GODT van de luchtpijp kan bovendien ook worden toegepast om te bestuderen van de dynamiek van de immune reactie op andere airborne ziekteverwekkers. Daarom zal het gebruik van transgene fluorescerende airborne ziekteverwekkers, zoals Streptococcus pneumoniae32, nieuwe kansen om te studeren van hun interactie met het immuun systeem maken. Hoewel deze procedure zich richt op het meten van de dynamiek van immune cellen tijdens de infectie, kan het ook worden toegepast op verschillende gebieden met inbegrip van kanker, astma, of de wond-genezing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Zwitserse nationale Stichting (SNF) subsidies (176124, 145038 en 148183), de Europese Commissie Marie Curie reïntegratietoelage (612742) en de SystemsX.ch voor een subsidie voor de D.U.P. (2013/124).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3x 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20 °C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20 °C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20 °C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20 °C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
References
- Helmchen, F., Denk, W.
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
- Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694 (2017).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
- Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R.
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
- Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
- Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
- Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
- Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
- Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
- Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
- Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
- Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
- Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
- Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881 (2016).
- Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).
