Summary
В этом исследовании мы представляем протокол для анализа двух Фотон прижизненной изображений и ячеек взаимодействия в мышиных слизистой оболочки трахеи после заражения вирусом гриппа. Этот протокол будет актуален для исследователей, изучения динамики иммунных клеток во время инфекции дыхательных путей.
Abstract
Анализ ячеек или ячеек возбудитель взаимодействия в естественных условиях является важным инструментом для понимания динамики иммунной реакции на инфекции. Двух Фотон прижизненной микроскопии (2P-IVM) позволяет наблюдения взаимодействий клеток в глубоких тканях живых животных, при сведении к минимуму Фотообесцвечивание, созданные во время захвата изображений. На сегодняшний день, были описаны различные модели для 2P-IVM лимфоидных и не лимфоидных органов. Однако томография органов дыхания остается проблемой из-за движения, связанных с циклом дыхания животных.
Здесь мы описываем протокол для визуализации в vivo иммунных клеток взаимодействий в трахею мышей, инфицированных вирусом гриппа, используя 2 P-КБПБ. С этой целью мы разработали пользовательские изображений платформы, которая включала хирургического воздействия и интубация трахеи, после приобретения динамических изображений нейтрофилов и дендритных клеток (DC) в эпителии слизистой оболочки. Кроме того мы подробно шаги, необходимые для выполнения гриппа интраназального инфекции и потока гранулярных анализ иммунокомпетентных клеток в трахею. Наконец мы проанализировали нейтрофилов и DC моторики, а также их взаимодействия в ходе фильма. Этот протокол позволяет для создания стабильных и яркие изображения 4D необходимое для оценки взаимодействия ячеек в трахею.
Introduction
Двух Фотон прижизненной микроскопии (2P-IVM) является эффективным методом для реального времени изображений к ячейке взаимодействий, как они происходят в их природной среды1. Одним из главных преимуществ этого метода является, что она позволяет изучение клеточных процессов на большей глубине образца (500 мкм до 1 мм) по сравнению с другими традиционными изображений методы2. В то же время использование двух низкой энергии фотонов, порожденных два фотона лазерного минимизирует фото повреждение тканей, обычно связанных с процессом приобретения изображения2. В течение последнего десятилетия 2P-IVM был применен для изучения различных типов взаимодействий ячеек в нескольких дисциплинах3,4,5. Эти исследования были особенно важны для расследования иммунные клетки, которые характеризуются их высокая динамичность и формирование известных контактов после сигналов другие клетки и окружающей среды. 2P-IVM также применяется для изучения взаимодействия между возбудителя и принимающих6. Действительно было ранее показано, что некоторые патогены могут изменить тип и продолжительность контактов между иммунных клеток, препятствуя, в результате иммунного ответа7.
На слизистую оболочку дыхательных путей это первый сайт, в котором иммунный ответ против бортовых патогенов сгенерированное8. Таким образом в естественных условиях анализ взаимодействий возбудителя хост в этой ткани очень важно понять начало механизмов обороны хост во время инфекции. Однако 2P-IVM дыхательных путей является сложной задачей, главным образом благодаря артефакты, производимые цикл дыхания животного, которое подрывает процесс приобретения изображений. Недавно были описаны различные хирургические модели для визуализации мышиных трахеи9,10,11,легких и12 13,14,15, 16. Трахеи 2P-IVM модели представляют отличную set-up визуализировать на начальном этапе иммунной реакции в верхних дыхательных путях, в то время как модели 2P-IVM легких альвеолы больше подходят для изучения поздней фазе инфекции. Модели развитых легких представляют ограничения, связанные с присутствием альвеол заполненными воздухом, которые ограничивают оптических проникновения лазерных и сделать недоступными для в vivo imaging17 слизистая слой внутрилегочного airways . И наоборот структура трахеи, образованное непрерывного эпителия, облегчает получение изображения.
Здесь мы представляем протокол, который содержит подробное описание шагов, необходимых для выполнения инфекции гриппа, хирургической подготовки животных, а также 2P-IVM трахеи. Кроме того мы описывают конкретные экспериментальные установки для визуализации нейтрофилов и дендритных клеток (DC), два типа иммунных клеток, которые играют важную роль в качестве посредников механизм обороны против гриппа вирус18,19 . Наконец мы описываем процедуры для анализа взаимодействий нейтрофилов DC. Было показано, что эти контакты модулировать DC активации и, впоследствии, чтобы повлиять на иммунный ответ против патогенов20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Всех животных процедуры с участием мышей были исполнены в соответствии с швейцарским Федеральным управлением ветеринарии руководства и животных протоколы были одобрены властями местным ветеринаром.
1. гриппа инфекция CD11c-рекламы ЯФП мышей
- Биобезопасности
Примечание: Мыши адаптированы штамм гриппа H1N1 Рико/8/34 A/Puerto (PR8) вырос в оплодотворенных яиц, очищенная и титруют как описано21. Все действия, связанные с зараженных животных или биологических образцов были проведены под биобезопасности кабинета по биобезопасности уровня (BSL) 2 условий.- Очистите биобезопасности кабинет с 70% этанола раствор до и после процедуры заражения.
- Отменить все отходы производства во время этой процедуры, после надлежащего, кто биобезопасности руководящие принципы (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Отбросить загрязненных жидкостей в пластиковые мешки заполнены с 70% этанола раствор или медицинские дезинфицирующие и твердых отходов в автоклавируемый бункеров.
- Интраназального инфекции гриппа
ПРИМЕЧАНИЕ: B6. В этом исследовании были использованы CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-рекламы ЯФП)22 на фоне C57BL/6J. Мышей были сохранены в конкретном объекте возбудителя бесплатно в Институте исследований в биомедицине.- Место максимум 5 возраста и пола соответствием (6-8 недельных) CD11c-рекламы ЯФП мышей в клетке. Подождите, по крайней мере два дня для мышей адаптационного жилищных условий перед процедурой инфекции.
- Размораживания PR8 фондовых и подготовить соответствующие разрежения с помощью холодной 1 x Дульбекко фосфатный буфер изменяться без хлорида кальция и магния хлорид (PBS) для получения конечной концентрации 200 единиц формирования зубного налета (ОРП) в 30 мкл. Держите вирус разбавления на льду в течение всей процедуры.
Примечание: титрование каждой партии вируса гриппа перед его использованием рекомендуется обеспечить точное инфекции доза. - Вводить дозу кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) внутрибрюшинно (и.п.) с помощью 26 G иглы 1 мл шприца.
- Подождите, пока мышь полностью наркотизированных (полная потеря рефлекс вывод восстанавливающих и педали). Глубокий наркоз необходима для оптимального инфекции, так как не полностью наркотизированных мышей будут глотать или высылать вирус посевным материалом, приводит к изменениям в дозе инфекции.
- Место наркотизированных мышь в лежачем положении. Сбор 15 мкл вирус посевным материалом. Поместите наконечник пипетки недалеко от мыши левую ноздрю и отказаться от вирусных посевным материалом по капле. Как капли должны быть вдыхании, не Пипетка их непосредственно внутри полости носа.
- Подождите 2-5 мин и поместите наконечник пипетки, содержащий оставшиеся 15 мкл посевным материалом вируса в правую ноздрю.
Примечание: Чтобы избежать удушья, обойтись малый размер капель в приблизительно 20 s интервалы. - Проверьте, что мышь правильно дышать и поместите его в клетке в боковой пролежни. Монитор мыши дыхание и анестезии восстановления (примерно 60 мин после индукции).
Примечание: Это можно заразить более чем 1 мыши в то же время. В этом случае администрирования Вирусная посевным материалом в левую ноздрю всех мышей в последовательности, подождите 2-5 мин и затем управлять вируса в правую ноздрю. Чтобы избежать изменчивость между людьми, заразить не более чем 3 мышей в то же время. - Мониторинг состояния и вес потеря здоровья животных ежедневно.
- Усыпить мышей согласно гуманного конечной точки определяется руководящими принципами органа. Эвтаназия метод должен быть одобрен властями экспериментов на животных и должны уважать местные этические правила. После двух Фотон экспериментов усыпить мышей администрацией передозировки кетамина/Ксилазина следуют шейки матки дислокации. В всех других экспериментов используйте CO2 ингаляции в качестве метода для эвтаназии.
Примечание: Чтобы измерить вирусного титры зараженных трахеи, 50% пробирного инфекционный дозы (TCID50) культуры ткани или реального времени полимеразной цепной реакции (RT-PCR) анализа могут быть выполнены как ранее описанных23.
- Оценка нейтрофилов вербовки в трахею, проточной цитометрии
Примечание: Эта часть протокола является необязательным. Она направлена на оценку нейтрофилов вербовки в слизистой трахеи, после инфекции гриппа.- Усыпить мышей, инфицированных и неинфицированных управления на 3 день после инфекции (ПЗ), CO2 ингаляции.
Примечание: Во избежание повреждения трахеи, Избегайте шейки матки дислокации чтобы усыпить животных. Кроме того желательно, чтобы избежать загрязнения от крови нейтрофилы перфузии Усыпленных мышей. - Спрей мыши шеи с 70% этанола раствор и выполнять разрез кожи, используя Ножницы хирургические от груди к подбородку.
- Отдельные слюнных желез, с помощью щипцов и разоблачить трахеи.
- Рассечь мышцы вокруг трахеи, с помощью щипцов и ножницы.
Примечание: Этот шаг должен выполняться тщательно поскольку трахеи может быть легко поврежден во время процедуры. - Держите трахеи с щипцами и аккуратно отсоединить пищевода, рассечение.
- Проведение в внутригрудного части трахеи с щипцами, надрезать в начале бронхиального дерева. Затем отсоедините трахеи от гортани и тщательно удалить любые мускулатура слева.
- Место орган в 1,5 мл тубы RPMI 1640 + HEPES среднего (RPMI) на льду.
- Подготовьте смесь ферментов для переваривания трахеи, содержащий 0.26 единиц/мл коллагеназы (I и II) и 0,2 мг/мл DNase I в RPMI.
- Место расчлененных трахеи в 6-ну пластины, содержащие 1 мл смеси ферментов.
- Орган мелко нарежьте с помощью щипцов и ножницы. Держите пластины на льду во время этого шага.
- Инкубируйте при 37 ° C на 45 мин. В это время встряхните пластину каждые 15 мин.
- Остановите Пищеварение энзима, добавив 1 мл СУИМ Отмывающий буфер (2 мм ЭДТА и 2% тепло инактивированная фильтр стерилизации плода бычьим сывороточным (ФБС)) в PBS.
- Ресуспензируйте решение с 1 мл пипетку, чтобы помочь отделить частично непереваренных кусочков ткани.
- Решение передать другой хорошо, передавая содержимое через стрейнер 40 мкм. Затем аккуратно разбить оставшиеся части органа, оказавшихся на вершине сетчатый фильтр, используя поршень шприца 2 мл.
Примечание: Smashing частично непереваренных части трахеи через ситечко является важным шагом для получения оптимальное количество клеток во время анализа потока гранулярных. - Мыть хорошо и ситечко с СУИМ, промывание буфер и передачи, подвеска в 5 мл трубке хранится на льду.
- Центрифуга для трубы на 166 x g 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 100 мкл СУИМ Отмывающий буфер.
- Продолжите с поверхности Пятнать антитела для проточной цитометрии. Вкратце блокировать рецепторы Fc изолированных клеток, используя антитело против CD16/32, следуют поверхности окраски. Чтобы правильно определить нейтрофилов, панель цитометрия потоков должен содержать следующие антитела: αLy6G, αCD11b, αCD45, а также жизнеспособность красителя исключить мертвые клетки.
- Запустите все содержимое образцов на проточный цитометр и анализировать данные.
- Чтобы получить оптимальное количество иммунных клеток, запустите одну ячейку подвеска со скоростью не выше, чем 3000 событий/сек. Это позволит сократить количество событий, исключены во время приобретения. Используя этот протокол, можно получить 1 до 2 миллионов клеток в трахею.
- Усыпить мышей, инфицированных и неинфицированных управления на 3 день после инфекции (ПЗ), CO2 ингаляции.
2. изоляция и инъекции нейтрофилов
Примечание: В этой процедуре, B6.129 (ICR)-Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J мышей (CK6-ECFP) были используется24. Эти животные Экспресс КФП во всех типах клеток под человека β-актина промоутер. Кроме того это также можно использовать для изоляции клеток и выведение их согласно протоколу, описанный в шаге 2.6 мышей C57BL/6J. Очистка и манипуляции нейтрофилов может увеличить их статус активации, потенциально изменяя их миграционных и функциональных свойств.
- Усыпить животных вдыханием CO2 .
- Удаление бедра и tibias и Осторожно очищайте их с помощью щипцов.
- Вырезать эпифизов костей и промойте костного мозга с помощью 1 мл шприц, наполненный стерильного холодного PBS, в 50 мл трубки хранится на льду.
- Ресуспензируйте клетки с 18 G иглы и фильтрация суспензию клеток с помощью стрейнер 40 мкм. Один раз Помойте с PBS на 110 x g 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте клетки в 2 мл холодного PBS.
-
Разбавляют 100% Percoll 9:1 в 10 x PBS и подготовить градиента решения percoll 72%, 64% и 52%, с использованием ПБС. Тщательно слой 2 мл каждого из трех градиентов в 15 мл, начиная от наиболее сосредоточены один.
- Добавьте тщательно 2 мл суспензии клеток костного мозга на вершине градиентов и центрифуги на 1100 x г за 30 мин при комнатной температуре (RT) без разгона и торможения.
- Осторожно удалите группу на стыке между 64% и 72% и мыть его один раз в 200 x g 5 минут при температуре 4 ° C с холодной PBS. Ресуспензируйте клеток в объеме 100 мкл PBS и держать их на льду. Чистоту нейтрофилы, как ожидается, будет выше, чем 90%.
- При необходимости лейбл нейтрофилов с комплектом распространения клеток, используя протокол изготовителя. Добавить краситель суспензию клеток до конечной концентрации 10 мкм в объеме 1 мл, инкубации при 37 ° C за 30 мин и мыть (166 x g, 5 мин).
- Оценка концентрации клеток с помощью Горяева и вводить внутривенно 5 х 106 клеток в максимальный объем 100 мкл в ранее зараженных мышей CD11c-рекламы ЯФП+ , с помощью шприца иглы 1 мл 26 G, 12 h до изображений.
3. Подготовка мышь для изображений
-
Анестезия
- Анестезировать зараженных мышей CD11c-рекламы ЯФП+ на 3 день п.и. Согласно шаг 1.2.3.
- После того, как мышь глубоко под наркозом, подготовьте катетер для анестезии повторно дозирования.
- Удаление иглой 30 G из шприца с помощью щипцов.
- Вставьте иглу в 20 см кусок трубки медицинской силиконовой PE-10.
- Вставьте шприц иглой 30 G заполнены смесью кетамин/ксилазина на другой стороне трубки.
- Удалите воздух внутри трубки.
- Подготовьте катетер 20 G подключен к трубе из insufflating машины кислорода для поддержания автоматической вентиляции (рис. 1Aя). Установите его на соотношении дыхание 130 ударов в минуту (b.p.m.) с приливной объемом 0,2 мл, с использованием 100% кислорода газоснабжения.
-
Подготовить мышь для хирургии
- Держите мышь на конкретные индивидуальные хирургические доску (рис. 1Aii-iii) над табличкой с подогревом или лежаком с подогревом хирургический набор при 37 ° C для все время операции.
- Бритье волос из шеи мыши, с помощью электрической бритвой и депиляционный крем (рис. 1Bi).
- Поместите курсор мыши над пластиковые мыши позиционные (рис. 1Aii-a), сохраняя голова животного вне позиционные (рис. 1Bii) для создания угол, облегчает интубации трахеи.
- Прикрепите Передние конечности, лапы и хвост с хирургическая лента, мочим мыши глаза с витамином А обогащенная гель и продезинфицируйте мыши шеи (рис. 1Bii).
-
Хирургия
- Подготовьте должным образом газобетона элементов, а именно, ножницы, микрохирургическая ножницы и пинцет.
- Выполните небольшой надрез на долго медиальной оси шеи, примерно 1 см длиной, в средней зоне между верхней части груди и линией, проходящей через точку нижней челюсти (рис. 1Biii).
- Переместить с боков патчи кожи и слюнных желез и визуализировать трахеи, охватываемых мышц. Затем вскрыть трахеи мышцы, тщательно с использованием щипцов (iiiрис. 1B).
- Интубировать мыши с катетером и начала искусственной вентиляции (рис. 1Biv).
Примечание: Катетер состоит из внешней пластиковые части, которая защищает слизистую оболочку трахеи и внутренняя железа иглы. Присутствие иглы представляет идеальное решение для расширения и стабилизировать трахеи и регулировать ее экспозиции. Искусственная вентиляция через катетер будет гарантировать правильное дыхание мыши. - Немедленно Начните искусственной вентиляции для мыши Монитор дыхания.
- Исправьте высоту катетера и ориентации с помощью хирургического крюк (рис. 1Bv) подключены к конкретным стержень на плате хирургические (ii-bрис. 1A). Разоблачить трахеи на той же высоте подбородка.
- Окружить трахеи с вазелином и покрыть ее с несколькими каплями предварительно нагретой PBS для обеспечения надлежащей гидратации для органа (viрис. 1B).
- Установите coverslip на вершине подготовки. Для этого шага клей coverslip на металлический держатель (рис. 1Bvii), который будет привинчен к XYZ переводчик (рис. 1Aii-c). Отрегулируйте XYZ переводчик поставить coverslip на вершине хирургической подготовки.
- Поместить катетер для администрирования анестезии внутрибрюшинно (viiiрис. 1B).
- Придать 50% первоначальной дозы кетамина/Ксилазина смеси каждые 30 мин.
Примечание: Повторно дозирования от 50% до 25% от первоначального кетамин/Ксилазина смесь является безопасной и действительный альтернативных25. Однако поскольку этот протокол является терминал и строгой иммобилизации животного во время всей процедуры не требуется, используйте более высоких дозах для поддержания плоскости глубоко хирургического анестезии.
4. в естественных условиях покадровой изображений
Примечание: Получение изображения была выполнена с помощью микроскопа вертикально двух фотонов, оснащен двумя лазерами сапфировый, контролем температуры инкубации камеры и 25 X / NA 1.1 воды цель погружения. Photomultipliers (ПЛТ) используется для захвата изображений были гибрид детекторов или высокая чувствительность Гаасп.
- Место хирургические доска с наркотизированных мыши внутри камеры инкубации микроскоп (предварительного подогрева при температуре 37-38 ° C) и добавить каплю воды на coverslip.
- Центр и найти фокус на ткани трахеи.
-
Установите частоту сканирования до 800 Гц, с 520 x 520 пикселей, поле зрения 440 x 440 мкм2 и линии средняя 1.
- Мотив сапфировый лазер 830 нм для возбуждения генерации второй гармоники (SHG) из коллагена, с ориентировочной мощности источника 150 МВт. Настройте второй сапфировый лазер на 920 Нм с 94 МВт на источник, чтобы пробудить CFP и рекламы ЯФП.
- Создание 3D и timelapse приобретение режиме с одновременным возбуждения
Примечание: Держите лазерной полномочий как низкий, как можно свести к минимуму Фотообесцвечивание и Фототоксичность.
- Запись флуоресценции, с использованием двух каналов в режиме, не descanned, с мастер дихроичное зеркало на 560 Нм. В настройки, используемые в настоящем Протоколе, второй дихроичное зеркало разделить сигнал в 495 нм для разделения канала 1 (фильтр 475/50 выбросов) из канала 2 (выбросов фильтр 525/50) (рис. 2A). Эта конфигурация собирает SHG свет из коллагена в первом канале, в то время как CFP выбросов собирается в обоих каналах 1 и 2 и рекламы ЯФП собирается только в канале 2.
- Определите диапазон 50 мкм вдоль оси Z с размером шаг 3 мкм (voxel размер 0,86 мкм x 3 мкм). Запись фото каждые 30 s для общей продолжительностью 30 минут.
- При желании приобрести несколько областей. Перед запуском более поглощений, проверьте жизненно важные признаки и reinject анестезии через катетер, если это необходимо (см. шаг 3.3.10).
- В конце процесса создания образов усыпить мыши через кетамин/Ксилазина передозировка следуют шейки матки дислокации.
5. изображения обработки и количественный анализ подвижность нейтрофилов DC и взаимодействия
Примечание: В настоящем Протоколе, специализированное программное обеспечение обработки изображений использовался для анализа данных микроскопии.
- После завершения загрузки изображений 4D передачи файлов (данные и метаданные) на рабочей станции с достаточными вычислительными ресурсами (предложил минимальные системные требования: 32 ГБ ОЗУ, быстро solid государство-диски, недавно ЦП, выделенные GPU, основанные на массивно параллельная архитектура).
- Откройте файлы изображений программного обеспечения.
- Воспроизведение видео и убедитесь, что клетки интерес хорошо видны и что артефакты изображения отсутствуют.
Примечание: с этой целью, убедитесь, что оба движения образца и вариации яркости достаточно ограничены. Действительно они представляют собой проблемы для автоматического анализа26. Если движение образца между соседними кадрами является чрезмерным, примените метод коррекции дрейф, например с помощью ГСП канала как фиксированной ссылка. Это позволяет лучше оценивать движение клеток, а не движение образца. Кроме того при наличии яркий фон или мусора, подрежьте реконструированный поверхностей, использование тома в качестве параметра выбора. - Создание конкретного канала сотрудничества локализации на СЛП+ клетки, для того чтобы отделить сигнала между CFP и коллагена (SHG). С этой целью обозначить стробирования многоугольник, (Рисунок 2Bя), который выбирает только вокселей, имея положительный интенсивности, как в зелёном канале, так и в канале синего.
Примечание: Эта процедура может меняться в соответствии набор фильтров микроскопа и окрашивания клеток. Это может быть достигнуто путем выбора только вокселей с достаточной интенсивностью в зеленый и синий каналы. Среди доступных инструментов функцию «coloc» может использоваться автоматически вычислить colocalization канал, основанный на интенсивности порога. Кроме того методы, основанные на машинного обучения может использоваться для этого шага с наблюдением экспертов27. - Обнаруживать и отслеживать CFP+ клетки, с помощью автоматического восстановления поверхности и отслеживания (поверхности) по каналу соответствующего совместного локализации.
Примечание: Ручной курирование последующего отслеживания ошибок и исключения треков с длительностью короче, чем определенный порог (т.е., 150 s) могут потребоваться. - Генерировать определенный канал совместно локализации для CD11c-рекламы ЯФП+ клетки, для того чтобы отделить CFP и рекламы ЯФП сигналов. С этой целью обозначить многоугольник шлюзовые (iiРисунок 2B), который выбирает только вокселей, имея положительный интенсивности в зелёном канале, но низкой интенсивности в канале синего.
Примечание: представитель микроскопии, показаны сигналы от канала 1, канал 2, Сопредседатель локализации канала для СЛП, Сопредседатель локализации канала для рекламы ЯФП и сочетание всех каналов можно найти в Рисунок 2Biii. - Реконструировать поверхности клеток CD11c-рекламы ЯФП+ и отслеживать их положение со временем (поверхности инструмента).
Примечание: Ручная коррекция последующего отслеживания ошибок не требуется для этого шага. Действительно из-за сложной пространственно временной динамики DC, реконструировать их точное поверхности от 2 P-IVM данных является сложной задачей, которая не может быть достигнута с программным обеспечением доступных сегментации. Среди причин, которые делают эту задачу трудной тонкий выступов и вариации яркости не позволяют для использования определенных обработки изображений техники, такие как сглаживание фильтры или статические порога. Кроме того в сети постоянного тока, трудно отделить отдельные ячейки, основанные только на их появление в 2P-IVM данных. Для этих причин, а не пытаться точной сегментации, настроив параметры программного обеспечения мы предлагаем восстановить не точных поверхностей DC. Затем обрабатывайте возможные ошибки с помощью надежных показателей, как описано в 5,8. -
Мера миграции клеток.
- Экспортируйте классической миграции меры для CFP+ и CD11c-рекламы ЯФП+ клетки. Среди них «средняя скорость трек» указывает средняя скорость миграции клеток, а «трек прямолинейности» направленность клеток. Эти меры могут быть экспортированы в файл электронной таблицы из обработки изображений программное обеспечение.
- В экспортируемые таблицы файлов, вычислить «исправленные трек прямолинейности» (также упоминаемый как исправленные родов коэффициент) для CFP+ и CD11c-рекламы ЯФП+ клетки, которая определяется как «трек прямолинейности», умноженное на квадратный корень из «отслеживать длительность» разделена на квадратный корень длительность видео. Эта мера является более надежной, чем «трек прямолинейности» в присутствии короткие треки28, например возникая от отслеживания ошибок.
Примечание: только видео такой же длины можно сравнить с этой мерой.
-
Мера взаимодействия клеток.
- Определите контакта между CFP+ клеток и клеток CD11c-рекламы ЯФП+ , если их расстояние (ближайший вокселей) равно или меньше чем порогового значения (т.е. 2 мкм).
Примечание: Этот порог должен быть достаточно строгим, чтобы обнаружить контакт только тогда, когда клетки находятся в непосредственной близости. Однако, мы рекомендуем держать этот порог больше 0, идеально N раз больше, чем радиус voxel (N > 2), потому что Сглаживание границы может сделать восстановление клеток меньше, чем размер фактические ячейки. - Граф количество и продолжительность контактов между CFP+ и CD11c-рекламы ЯФП+ клетки. В программе обработки изображений это можно сделать например путем выполнения «поцелуй и запустить» подключить. Эти меры могут быть экспортированы в файл электронной таблицы на вкладке Статистика.
- Определите контакта между CFP+ клеток и клеток CD11c-рекламы ЯФП+ , если их расстояние (ближайший вокселей) равно или меньше чем порогового значения (т.е. 2 мкм).
- Импорт ранее вычисляемые меры в статистическое программное обеспечение, создавать участки и выполняют статистические тесты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой работе мы описали подробный протокол учиться в vivo моторику и взаимодействия между нейтрофилов и DC во время инфекции гриппа в мышиных трахеи (рис. 3A). С этой целью мы изолированы CFP+ нейтрофилов (92% чистоты; Рисунок 3B) CK6-ECFP мышей и мы восприимчивую передало их в CD11c-рекламы ЯФП мышь инфицированных гриппом. После этого мы провели 2P-IVM трахеи на 3 день п.и. В этот момент времени мы наблюдали четкий набор нейтрофилов в зараженной зоны, как показано на гранулярных анализа потока (рис. 3 c). 2P-IVM протокол требует использования конкретной хирургической платы и поставщиком кислорода для грызунов (рис. 1A). Поставка кислорода через канюлю, вставляется в трахею помог животное дыхание, способствует Экспозиция трахеи и контролировать движение органа, связанное с дыханием (рис. 1B). После этой экспериментальной установки мы приобрели стабильные 4D изображения в естественных условиях в зараженных трахеи в течение 30 мин (Рисунок 3Dкино 1).
Анализ полученных изображений 4D через специализированные изображений программное обеспечение позволило измерить миграции клеток и количественную оценку пространственно временной динамики нейтрофилов и DC. Что касается подвижности клеток мы наблюдали существенные различия между движением DC и набранных нейтрофилов, которые показали значительно быстрее, чем последний (рис. 4A). Этот результат подтверждает динамичный характер нейтрофилов, описано как высоко подвижные клетки способны мигрируют к хемотаксического источник29. Что касается направленности мы пришли к выводу что сложную морфологию DC принесли частые ошибки в ячейке отслеживания, который в свою очередь подготовил треков с снижение продолжительности и увеличение отклонение измеренного направленного поведения (рис. 4B). По этой причине мы вычислить надежные метрику, которая сможет оценить направленность, учитывая продолжительность трека. Используя этот показатель, мы отметили значительные различия в направленности нейтрофилов против DC (рис. 4 c).
Кроме того Вычисление расстояния между нейтрофилов и DC, позволило обнаружить и проанализировать их контактов с течением времени. В этой экспериментальной модели мы наблюдали некоторые нейтрофилов, которые формируются несколько краткие контакты с DC и другие, которые не образуют любой контакт в период образа (Рисунок 4 d). Кроме того, изучение средний тренд расстояния между нейтрофилов и DC со временем позволило нам изучить общий позиционирования исследованных клеток (Рисунок 4E), во время расследования тенденции в отдельных ячеек разрешено характеризуют поведение каждого одной ячейки (Рисунок 4Fфильм 2).
Рисунок 1: оборудование и шаги для 2P-IVM мышиных трахеи. (Ai) Системы портативные животных анестезии отвечает за автоматической вентиляции подключен к насос, который поставляет кислород для мыши. Вид спереди (Aii) и вид сбоку (Aiii) на заказ хирургические Совета используется для трахеи модели. Совет состоит из металлической сцене с пластиковых мыши позиционные (Aii-a), стержень для проведения подвижных зажим (Aii-b) и штраф перестраиваемый XYZ переводчик (Aii-c). (B) последовательные шаги трахеи хирургические модели: удаление волос (Bi) хирургические области, (ВП) позиционирование наркотизированных мыши в Совете хирургическая, хирургическая экспозиция (Biii) трахеи, (Biv ) интубации с катетером с искусственной вентиляции, фиксация катетера (Bv), добавление (Bvi) PBS подвергаются трахеи, монтажа (Bvii) и coverslip (Bviii) размещения катетера с анестезией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: флуоресцентные сигнал обнаружения во время 2P-КБПБ. (A) схематическое представление обнаружение Микроскоп фильтр set-up и соответствующих каналов. Дихроичное зеркало на 560 Нм отделяет синий/зеленый красный/дальний красный выбросов. Дополнительные дихроичных зеркало на 495 нм используется для дальнейшего признания различных субрегионов спектра излучения. Канал 1 использует гибридный детектор (выбросов фильтр 475/50), а канал 2 использует высокую чувствительность Хаасп ПЛТ (выбросов фильтр 525/50). (B) представитель разброс точка участки 2 P сигналов показаны стробирования стратегия для генерации colocalization каналов для идентификации сигналов, поступающих от СЛП (Bi) и флуорофоров рекламы ЯФП (ВП). (Biii) Представитель микроскопии, показаны конкретные сигналы от канала 1 (Ch 1, темно-синий), канал 2 (Ch 2, зеленый), Сопредседатель локализации канала для CFP (светло-голубой), Сопредседатель локализации канала для рекламы ЯФП (желтый) и сочетание всех каналов (Ch 1 + Ch 2 + CFP + РЕКЛАМЫ ЯФП). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: прижизненные 4D изображений нейтрофилов и DC в гриппа в инфицированы трахеи. (A) схематический план протокола. (B) представитель потока рассеяния гранулярных доле нейтрофилов в отношении всего CD45 + клеток в суспензии клеток, изолированных из мышиных костного мозга с помощью градиентного метода Percoll. (C) представитель потока гранулярных scatterplots показаны увеличение частоты нейтрофилов в трахеи от неинфицированных мышей, по сравнению с мышей, инфицированных вирусом гриппа на 3 день п.и. (D) (левая панель) Анатомические образ мышиным Трахея показаны области, выбранные для захвата изображений. (Правая панель) Представитель 3D проекция 2P-IVM Микрофотография показаны поверхности реконструкции нейтрофилов (светло-голубой) и DC (желтый) вместе с их треки на 3 день что п.и. SHG сигнал отображается в темно синий. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: характеристика нейтрофилов и DC миграции и взаимодействия динамики в гриппа в инфицированы трахеи. Представитель участков, показывающая скорость трек означает (A), отслеживать прямолинейность (B) и исправлены трек прямолинейность (C), как определено в Белтман и коллеги (2009)28, нейтрофилов и DC в трахеи на 3 день п.и. с вирус гриппа. Исправленные трек прямолинейности экспонатов надежности для отслеживания ошибок. (D) 2D гистограмма показаны частоты нейтрофилов по данным их количество контактов с DC и средняя продолжительность контакта. (E) среднее расстояние нейтрофилов в ближайший DC во время продолжительности фильма. (F) (слева) анализ расстояния представитель нейтрофилов к ближайшей DC во времени. Пунктирная красная линия указывает пороговое расстояние для рассмотрения что нейтрофилов установили контакт с контроллером домена. (Право i-iii) Микроскопии, приобретенных в разное время точек, представляющих миграции нейтрофилов (светло-голубой) к DC (желтый). Треки ячейки отображаются как разноцветные линии, которая меняет цвет от синего до красного, представляют время. Темно-синий показан SHG сигнала от фибриллово коллагена. Шкалы бар = 50 мкм. В все цифры представленные данные являются представитель по меньшей мере три независимых экспериментов. Результаты выдаются Уэлча тест как средний ± SD. статистики. NS p > 0,05; p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1: нейтрофилы и DC динамика в трахею во время инфекции гриппа. 30 мин покадровой 3D изображением динамика взаимодействия между нейтрофилов (светло-голубой) и DC (желтый), а также их соответствующих треков в отношении коллагена сети (синий) трахеи. Представитель нейтрофилов DC взаимодействий обозначаются белые стрелки. Треки ячейки отображаются как разноцветные линии, которая меняет цвет от синего до красного, представляют время. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Фильм 2: представитель краткосрочных нейтрофилов DC взаимодействия в трахею во время инфекции гриппа. 30 мин покадровой 3D изображением представителя взаимодействия между нейтрофилов (светло-голубой) и DC (желтый) и их соответствующих треков. Треки ячейки отображаются как разноцветные линии, которая меняет цвет от синего до красного, представляют время. SHG сигнал от коллаген отображается темно-синего цвета. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта работа представляет подробный протокол для поколения 4D изображения показаны миграции восприимчивую передаваемых нейтрофилов и их взаимодействия с DC во время инфекции гриппа в мыши трахеи. Описанные 2P-IVM модель будет отношение к изучению динамики иммунных клеток во время инфекции в дыхательных путях.
Недавно несколько моделей, основанных на визуализации динамики клетки в дыхательных путях были развитые9,10,11,12,13,14,15 ,16. Однако по-прежнему сложно, учитывая анатомические позицию этого органа и технические трудности для сведения к минимуму движение во время цикла дыхания30 в vivo томографии легких. Для преодоления этих проблем, некоторые авторы предложили использование заказных круговой всасывания палаты, которая необходимо хирургически вставляется в грудной клетке13,14. Однако эта процедура требует инвазивное вмешательство, которое может поставить под угрозу результаты, особенно в тех исследований, которые были сосредоточены на расследование воспалительной реакции. Кроме того легкого хирургическое модели представляют ограничения для визуализации глубоких тканей вследствие преломления света, возникла в воздухе в альвеолы17. Наоборот различные модели трахеи недавно использовались для изучения динамики клеток эпителия дыхательных путей. Изображения этого органа представляет явные преимущества по сравнению с легких, например относительно простой операции, обязаны подвергать и иммобилизации орган, а также более высокой доступности для эпителия трахеи. Предлагаемая модель трахеи также имеет отношение к расследованию инициирования реакции против сократимость патогенов, таких как вирус гриппа, так как трахеи является одним из первых сайтов вирусной репликации в течение инфекции гриппа8.
Интересно, что исследование, показывающ альтернативы интубации, свободной метод для визуализации трахеи был недавно опубликован12. Этот метод характеризуется уменьшение воспаления и показывает очевидные преимущества в исследованиях, где необходимо сохранить функцию mucociliarity эпителиальных клеток. Однако этот метод не гарантирует достаточную стабильность и приобретение ярче сигналов необходимо изучить контактов ячеек в диапазоне несколько мкм. и наоборот, метод, представленный в текущем протоколе обеспечивает лучшую иммобилизации органа Спасибо для интубации и позволяет обнаружение сильнее флуоресценции сигналов в результате короче расстояние между органом и coverslip12.
Выполнение ткани иммобилизации во время в естественных условиях получение изображения 2 P-КБПБ является наиболее важным этапом создания оптимальных данных. Некоторые крайне важных мер, которые способствуют стабильности представленных метода включают: соответствующие мыши анестезии; интубация правильный мыши; и хирургического экспозиция трахеи, которая позволяет легкий доступ к органу по coverslip. Кроме того изображения право количество клеток (в идеале 30 в поле зрения) будет укреплять полученные результаты. Набор оптимальное количество клеток в значительной степени будет зависеть от вирусной инфекции доза, которая очень сильно зависит от надлежащего отправления вирусный посевным материалом.
Еще один важный шаг протокола является хирургическое экспозиция трахеи. Можно принять различные меры для сведения к минимуму ущерба, причиненного орган во время операции. Например Трахея должна не трогать непосредственно с хирургические инструменты. Вместо этого он должен быть предоставлен, манипулируя только окружающих тканей (слюнных желез, кожи и мышц). Если строго необходимым, трахеи должны обрабатываться с помощью тупые предметы. Кроме того усилия должно быть сделано, чтобы избежать повреждения кровеносных сосудов. Наконец чтобы избежать обезвоживания орган, важно также для покрытия ее с PBS сразу же после операции.
Несмотря на уникальные преимущества этого метода над ранее описанных методов для визуализации взаимодействия иммунных клеток в слизистой оболочки трахеи использование этой модели представляет некоторые ограничения. Как описано выше, наличие воспаления, связанные с хирургии трахеи может представлять недостаток при изучении иммунных реакций. Чтобы преодолеть это ограничение, можно администрировать противовоспалительных препаратов до начала процедуры. Другое ограничение этой модели связана с наличием сильной аутофлюоресценция сигнала существующих в дыхательные пути, который формируется главным образом резидентов клетки и слой слизи. Это неспецифический флуоресценции создает артефакты, которые могут помешать анализа. Кроме того заблуждение вычисления параметра прямолинейность трек может быть создано, если сравнивать ячейки отслеживает различные длительности и когда отслеживания ошибок ввести треков короткой продолжительности26. Чтобы преодолеть эту проблему, мы применяется штраф коэффициент исправить трек прямолинейность. Такая коррекция предназначен для минимизации эффекта Мисс отслеживания в результаты28.
Важнейшим аспектом 2P-IVM экспериментов является возможность повторного использования мышей, которые подверглись хирургии и изображений. В естественных условиях imaging протокол, описанные здесь не требуют животных эвтаназии или орган коллекции, оставляя таким образом возможность для восстановления и повторного использования мышей после операции для других процедур. С помощью мыши, например, для выполнения визуализации трахеи в разное время, очки могут резко уменьшить количество всего животных, необходимых в эксперименте, поддерживая принцип животных сокращения . Кроме того он также может уменьшить межличностная изменчивость. Однако животных восстановления и повторного использования должно соответствовать стандартам животных, которые включает в себя управление надлежащего болеутоляющие препараты и антибиотики для животных во время восстановления. Все эти процедуры должны включены в протокол экспериментов на животных и утверждены властями местным ветеринаром.
Описывается протокол может быть легко адаптирована к изучению других типов иммунных клеток. К примеру изоляция и инъекций (люминесцентные или окрашенных) возбудителя специфичные Т-клетки могут использоваться для изучения динамики активация Т-клеток31 , а также их взаимодействие с другими клетками, например трахеи DC. Аналогичным образом визуализация крови или лимфатические сосуды могут представлять интересный подход к изучению набор воспалительных клеток в трахеи ткани в течение инфекции. Кроме того 2P-IVM трахеи может также применяться для изучения динамики иммунного ответа на других бортовых патогенов. Таким образом использование трансгенных флуоресцентные бортовых патогенов, таких, как пневмококк32, создаст новые возможности для изучения их взаимодействия с иммунной системой. Хотя эта процедура предназначена для измерения динамики иммунных клеток во время инфекции, он также может применяться в различных областях, включая рак, астма, или заживления раны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана швейцарского национального фонда (СНФ) гранты (176124, 145038 и 148183), Грант реинтеграции Мари Кюри Европейской Комиссии (612742) и SystemsX.ch на грант для D.U.P. (2013/124).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3x 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20 °C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20 °C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20 °C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20 °C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
References
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
- Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694 (2017).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
- Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live Imaging of the Lung. Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
- Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
- Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
- Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
- Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
- Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
- Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
- Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
- Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
- Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
- Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881 (2016).
- Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).
