Summary
I denna studie presenterar vi ett protokoll för att utföra två-photon intravital imaging och cell interaktion analys i murina luftrör slemhinna efter infektion med influensavirus. Detta protokoll kommer att vara relevanta för forskare som studerar immunceller dynamics under luftvägsinfektioner.
Abstract
Analysen av cell-cell eller cell-patogen interaktion i vivo är ett viktigt verktyg för att förstå dynamiken i immunsvaret mot infektion. Två-foton intravital mikroskopi (2P-IVM) tillåter observation av cell interaktioner i djup vävnad i levande djur, samtidigt minimera de fotoblekning som genereras under bild förvärv. Hittills har har olika modeller för 2P-IVM lymfoida och icke-lymfoida organ beskrivits. Avbildning av andningsorgan är dock fortfarande en utmaning på grund av den rörelse som är associerad med andning cykeln av djuret.
Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera i vivo immunceller interaktioner i luftstrupen av möss som infekterats med influensavirus med hjälp av 2 P-IVM. Till detta ändamål har vi utvecklat en anpassad avbildning plattform som ingår i kirurgisk exponering och intubation av luftstrupen, följt av förvärvet av dynamiska bilder på neutrofiler och dendritiska celler (DC) i slemhinnorna epitel. Dessutom detaljerade vi steg som behövs för att utföra influensa intranasalt infektion och flöde flödescytometrisk analys av immunceller i luftstrupen. Slutligen, vi analyserat neutrofiler samt DC motilitet och deras interaktioner under loppet av en film. Detta protokoll möjliggör generering av stabila och ljusa 4D bilder behövs för bedömning av cell-cell interaktioner i luftstrupen.
Introduction
Två-foton intravital mikroskopi (2P-IVM) är en effektiv teknik för realtid avbildning av cell-till-cell interaktioner som förekommer i deras naturliga miljö1. En av de främsta fördelarna med denna metod är att det tillåter att studera cellulära processer på ett större exemplar djup (500 µm till 1 mm) jämfört med andra traditionella imaging tekniker2. Samtidigt minimerar användningen av två låg-energi fotoner genereras av två-photon laser foto-vävnadsskadan vanligtvis förknippas med bild förvärv processen2. Under det senaste decenniet, har 2P-IVM tillämpats för att studera olika typer av cell-cell interaktioner i flera discipliner3,4,5. Dessa studier har varit särskilt relevant att undersöka immunceller, som kännetecknas av deras höga dynamik och bildandet av framstående kontakter efter de signaler som genereras av andra celler och miljön. 2P-IVM har också tillämpats för att studera interaktioner mellan patogen och värd6. Faktiskt, det har tidigare visat att vissa patogener kan ändra typ och varaktighet av kontakterna mellan immunceller, hämmar, som ett resultat, den immunsvar7.
Slemhinnan i luftvägarna är den första platsen där immunsvaret mot luftburna patogener är genererat8. I vivo analys av patogen-host interaktioner i denna vävnad är därför viktigt att förstå inledande om värd försvarsmekanismer under infektion. 2P-IVM i luftvägarna är dock utmanande främst på grund av de artefakter som produceras av andning cykeln av djuret, vilket äventyrar processen för bild förvärv. Nyligen, olika kirurgiska modeller har beskrivits för imaging murina luftstrupen9,10,11,12 och lungor13,14,15, 16. Trakeal 2P-IVM modellerna representerar en utmärkt set-up att visualisera den inledande fasen av en immunreaktion i de övre luftvägarna, medan lung-alveolerna 2P-IVM modeller är mer lämplig att studera den sena fasen av infektioner. De utveckla lung modellerna presentera en begränsning som är associerad med förekomst av luftfyllda alveolerna, som begränsar den optiska genomträngningen av laser och göra det slemhinnor skiktet av intrapulmonell luftvägarna oåtkomliga för i vivo imaging17 . Däremot underlättar strukturen i luftstrupen, bildas genom en kontinuerlig epitel, bild förvärv.
Här presenterar vi ett protokoll som innehåller en detaljerad beskrivning av de steg som krävs för att utföra influensainfektion, kirurgisk beredning av djuren, och 2P-IVM i luftstrupen. Dessutom beskriver vi en specifik experimental set-up för visualisering av neutrofiler och dendritiska celler (DC), två typer av immunceller som spelar en viktig roll som medlare av mekanismen för försvar mot influensa virus18,19 . Slutligen beskriver vi ett förfarande för att analysera antal neutrofila-DC interaktioner. Dessa kontakter har visat att modulera DC aktivering och därefter påverka immunsvaret mot patogener20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden som inbegriper möss utfördes i enlighet med den schweiziska federala veterinärfrågor riktlinjer och djur protokoll godkändes av de lokala veterinär-myndigheterna.
1. influensainfektion CD11c-YFP möss
- Biosäkerhet
Obs: Mus anpassad stam av influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) var odlas i befruktade ägg, renat och titreras som tidigare beskrivits21. Alla stegen med smittade djur eller biologiska prover var genomförs enligt en biosäkerhet skåp enligt biosäkerhet nivå (BSL) 2 villkor.- Ren skåpet biosäkerhet med en 70% etanol lösning före och efter ingreppet infektion.
- Kassera allt avfall som produceras under proceduren efter korrekt som biosäkerhet riktlinjer (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Kassera fast avfall i autoklaverbart lagerplatser och förorenade vätskor i plastpåsar fyllda med 70% etanol lösning eller medicinskt desinfektionsmedel.
- Intranasala influensainfektion
OBS: B6. CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-YFP)22 på C57BL/6J bakgrund användes i denna studie. Möss bibehölls i den specifikt patogenfria anläggningen vid Institutet för forskning i biomedicin.- Placera högst 5 och sex-åldersmatchade (sex till åtta veckor gamla) CD11c-YFP möss per bur. Vänta minst två dagar för möss acklimatisering till boendeförhållanden innan förfarandet för infektion.
- Frosta PR8 lager och förbereda motsvarande utspädning med kall 1 x Dulbeccos fosfat buffert saltlösning modifieras utan kalciumklorid och magnesiumklorid (PBS) för att erhålla en slutlig koncentration på 200 plack bildar enheter (PFU) 30 µL. hålla virus utspädning. på is under hela förfarandet.
Obs: titrering av varje parti av influensavirus före dess användning rekommenderas för att säkerställa en exakt infektion dos. - Injicera en dos av ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) intraperitonealt (i.p.) med en 26 G nål 1 mL spruta.
- Vänta tills musen är fullt sövda (fullständig förlust av både rätande och pedal tillbakadragande reflexen). Djup anestesi är nödvändigt för en optimal infektion, eftersom inte-helt sövda möss kommer svälja eller utvisa den virus inokulum, leder till variationer i infektion dosen.
- Placera musen för sövda i ryggläge. Samla 15 µL av virus inokulatet. Placera pipettspetsen nära den musen vänster näsborren och fördela det virala inokulatet droppe för droppe. Som droppar måste inhaleras, Pipettera dem inte direkt inuti näsan hålighet.
- Vänta 2-5 min och placera pipettspetsen innehållande de återstående 15 µL av virus inokulatet i högra näsborren.
Obs: För att undvika kvävning, fördela små droppar i ca 20 s intervaller. - Kontrollera att musen korrekt andning och placera den i en bur i laterala decubitus. Övervaka mus andning och anestesi återhämtning (ca 60 min efter induktion).
Obs: Det är möjligt att infektera mer än 1 mus samtidigt. I detta fall administrera viral inokulum i vänstra näsborren av alla möss i en sekvens, vänta i 2 – 5 min och sedan administrera viruset i högra näsborren. För att undvika variabilitet mellan individer, infektera högst 3 möss på samma gång. - Övervaka status och vikt förlust av djurhälsa dagligen.
- Euthanize möss enligt humana slutpunkten bestäms av myndigheten riktlinjerna. Metoden dödshjälp måste godkännas av djurförsök myndigheter och måste respektera lokala etiska regler. Efter två-photon experiment, eutanasi möss genom administrering av en överdos av ketamin/xylazin följt av cervikal dislokation. I alla andra experiment, använda CO2 inandning som en metod för dödshjälp.
Obs: För att mäta de virala titrarna av infekterade luftstrupen, 50% vävnadskultur smittsam dos (TCID50) assay eller realtid polymeras-kedjereaktion (RT-PCR)-analysen kan utföras som tidigare beskrivits23.
- Utvärdering av neutrofila rekrytering i luftstrupen av flödescytometri
Obs: Denna del av protokollet är valfritt. Det syftar till att utvärdera neutrofila rekrytering i luftrör slemhinna efter infektion med influensa.- Euthanize infekterade och icke-infekterade kontroll möss på dag 3 efter infektion (PI) av CO2 inandning.
Obs: För att förhindra luftrör skador, Undvik att använda cervikal dislokation för att avliva djur. Dessutom, är perfusion av euthanized möss tillrådligt att undvika kontamination från blod neutrofiler. - Spray mus halsen med 70% etanol lösningen och utföra en huden snitt med kirurgisk sax från bröstet till hakan.
- Separata spottkörtlarna använder tången och exponera luftstrupen.
- Dissekera musklerna runt luftstrupen med pincett och sax.
Obs: Detta steg måste utföras noga eftersom luftstrupen skadas lätt under förfarandet. - Håll luftstrupen med pincett och försiktigt lossa matstrupen genom dissektion.
- Håller å intratorakalt luftstrupen med pincett, gör ett snitt i början av bronker. Sedan lossa luftstrupen från struphuvudet och ta försiktigt bort eventuella muskulatur kvar.
- Placera orgeln i en 1,5 mL tub som innehåller RPMI 1640 + HEPES medium (RPMI) på is.
- Förbered blandningen enzym för luftstrupen matsmältningen, som innehåller 0,26 enheter/mL kollagenas (I och II) och 0,2 mg/mL av DNAS I RPMI.
- Placera dissekerade luftstrupen i en 6-well platta innehållande 1 mL av enzymet blandning.
- Skär orgeln i små bitar med hjälp av pincett och sax. Hålla plattan på is under detta steg.
- Inkubera vid 37 ° C i 45 min. Under denna tid, skaka plattan varje 15 min.
- Stoppa enzym matsmältningen genom att tillsätta 1 mL FACS tvätt buffert (2 mM EDTA och 2% Värmeinaktiverade filter-steriliseras fetalt bovint serum (FBS)) i PBS.
- Återsuspendera lösningen med en 1 mL pipett för att avassociera delvis osmält bitar av vävnad.
- Överför lösningen till en annan brunn som passerar innehållet genom en 40 µm SIL. Sedan försiktigt krossa de återstående delarna av orgeln instängd ovanpå silen med en 2 mL sprutkolven.
Obs: Smashing delvis osmält bitar av luftstrupen över silen är ett viktigt steg för att få ett optimalt antal celler under flöde flödescytometrisk analys. - Tvätta brunnen och silen med FACS tvätt buffra och överföra suspensionen i en 5 mL tub förvaras på is.
- Centrifugera rören på 166 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 µL av FACS tvätt buffert.
- Fortsätt med antikropp ytan färgning för flödescytometri. Kort, blockera Fc receptorer av isolerade celler med en antikropp mot CD16/32, följt av surface färgning. För att korrekt identifiera neutrofiler, panelen flöde flödescytometri bör innehålla följande antikroppar: αLy6G, αCD11b, αCD45, samt en livskraft färga för att utesluta döda celler.
- Kör hela innehållet av proverna på en flödescytometer och analysera data.
- För att få ett optimalt antal immunceller, kör den enda cellsuspensionen med en hastighet som är inte högre än 3 000 evenemang/s. Detta kommer att minska antalet händelser som utesluten under förvärv. Använder det här protokollet, bör det vara möjligt att få 1 till 2 miljoner celler per luftstrupen.
- Euthanize infekterade och icke-infekterade kontroll möss på dag 3 efter infektion (PI) av CO2 inandning.
2. isolering och injektion av neutrofiler
Obs: I den här proceduren B6.129 (ICR)-Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J möss (CK6-ECFP) var begagnad24. Dessa djur uttrycker GFP i alla celltyper under mänskliga β-aktin arrangören. Alternativt, det är också möjligt att använda C57BL/6J möss att isolera cellerna och färga dem enligt beskrivningen i steg 2,6-protokollet. Rening och manipulation av neutrofiler kan öka deras aktiveringsstatus, potentiellt förändra deras flyttande och funktionella egenskaper.
- Avliva djuret av CO2 inandning.
- Ta bort både lårbenet och skenbenet och försiktigt rengöra dem med pincett.
- Skär ben epifyser och spola benmärgen med en 1 mL spruta fylld med sterila kalla PBS, i en 50 mL tub förvaras på is.
- Omsuspendera cellerna med en 18 G nål och filtrera cellsuspension med en 40 μm SIL. Tvätta en gång med PBS vid 110 x g i 5 minuter vid 4 ° C och resuspendera cellerna i 2 mL kall PBS.
-
Späd 100% Percoll 9:1 i 10 x PBS och förbereda gradient lösningar av percoll 72%, 64% och 52% använder 1 x PBS. Lager noggrant 2 mL av varje av de tre lutningarna i en 15 mL tub, start från mest koncentrerade en.
- Tillsätt försiktigt 2 mL benmärg cellsuspension på toppen av övertoningar och centrifugera vid 1100 x g i 30 min i rumstemperatur (RT) utan acceleration och broms.
- Försiktigt bort bandet i gränssnittet mellan 64% och 72% och tvätta den en gång vid 200 x g i 5 minuter vid 4 ° C med kalla PBS. Omsuspendera cellerna i en volym av 100 μL av PBS och hålla dem på isen. Renhet av neutrofilerna förväntas vara högre än 90%.
- Alternativt, etikett neutrofiler med en cell spridning kit med tillverkarens protokollet. Lägga till färgämnet att cellsuspensionen till en slutlig koncentration av 10 μM i en volym om 1 mL, inkubera vid 37 ° C i 30 min och tvätta (166 x g, 5 min).
- Uppskatta cell koncentration med hjälp av en hemocytometer och injiceras intravenöst 5 x 106 celler i en maximal volym av 100 μL i tidigare smittade CD11c-YFP+ möss med en 26 G nål 1 mL spruta, 12 h innan imaging.
3. förbereda musen för Imaging
-
Anestesi
- Söva infekterade CD11c-YFP+ möss på dag 3 p.i. enligt steg 1.2.3.
- När möss är djupt sövda, förbereda en kateter för anestesi åter dosering.
- Ta bort en 30 G nål från en spruta med pincett.
- Stick in nålen till en 20 cm bit av PE-10 medicinsk silicon slangar.
- Infoga en 30 G nål spruta fylld med ketamin/xylazin blandning på andra sidan av röret.
- Ta bort luften inne i röret.
- Förbereda en 20 G kateter kopplad till ett rör från en insufflating maskin för syre att upprätthålla automatisk ventilation (figur 1Ajag). Ställ den på ett andetag förhållande av 130 slag per minut (b.p.m.) med en tidalvolym 0,2 ml med en 100% syre gasförsörjning.
-
Förbereda musen för kirurgi
- Håll musen på en anpassad kirurgisk anslagstavlan (figur 1Aii-iii) över en uppvärmd platta eller en uppvärmd kirurgiska bänk ställa vid 37 ° C för alla tiden för operationen.
- Raka håret från nacken av musen med en rakapparat och en hårborttagningsprodukter kräm (figur 1Bjag).
- Placera musen ovanför plast musen positionella (figur 1Aii-en), att hålla djur huvudet utanför den positionella (figur 1Bii) skapa en vinkel som underlättar intubation av luftstrupen.
- Fixa frambenen, tassarna och svansen med kirurgisk tejp, fukta mus ögon med en vitamin A berikad gel och desinficera mus halsen (figur 1Bii).
-
Kirurgi
- Förbereda ordentligt Ånghärdad objekt, nämligen, sax, mikrokirurgisk sax och pincett.
- Utföra ett litet snitt på halsen, cirka 1 cm lång, i det mellersta området mellan övre delen av bröstkorgen och den linje som passerar genom den nedre punkten av underkäken (figur 1Biii) länge mediala axel.
- Flytta sidled hudfläckar och spottkörtlarna och visualisera luftstrupen, omfattas av musklerna. Sedan dissekera luftrör musklerna försiktigt med tången (figur 1Biii).
- Intubation musen med en kateter och börja konstgjord ventilation (figur 1Biv).
Obs: Katetern består av en yttre plast-delen, som skyddar slemhinnan i luftrör och en inre järn nål. Förekomsten av nålen representerar den idealiska lösningen att förlänga och stabilisera luftstrupen och reglera dess exposition. Konstgjord ventilation genom katetern garanterar korrekt andning av musen. - Omedelbart börja konstgjord ventilation till ordningsmanen mus andas.
- Fixa katetern höjd och orientering med en kirurgisk krok (figur 1Bv) ansluten till specifika stången på kirurgiska styrelsen (figur 1Aii-b). Exponera luftstrupen på samma höjd på hakan.
- Omringa luftstrupen med vaselin och täck den med några droppar av förvärmd PBS att garantera ordentlig återfuktning till organ (figur 1Bvi).
- Montera täckglaset ovanpå beredning. I detta steg måste limma ett täckglas på en metallhållare (figur 1Bvii), som kommer att skruvas fast XYZ översättaren (figur 1Aii-c). Justera XYZ översättaren för att placera täckglaset ovanpå den kirurgisk beredningen.
- Placera katetern för administrationen av anestesi intraperitonealt (figur 1Bviii).
- Injicera 50% av den initiala dosen av ketamin/xylazin blandning varje 30 min.
Obs: Nytt dosering från 50% till 25% av den ursprungliga ketamin/xylazin blandningen är en säker och giltig alternativa25. Men eftersom detta protokoll är terminal och en strikt immobilisering av djur krävs under hela förfarandet, använda högre doser för att upprätthålla ett djupt kirurgiska plan av anestesi.
4. in Vivo Time-lapse Imaging
Obs: Bilden förvärv utfördes med en upprätt två-foton Mikroskop, utrustad med två Ti:Sa lasrar, tempererad inkubation kammare och en 25 X / NA 1.1 vatten nedsänkning mål. De fotomultiplikatorer (PMT) används för bild förvärv var antingen hybrid detektorer eller hög känslighet GaAsP.
- Placera kirurgiska styrelsen med sövda musen inne i mikroskopet inkubation kammaren (förvärmd till 37 – 38 ° C) och tillsätt en droppe vatten på täckglaset.
- Center och hitta fokus på luftrör vävnad.
-
Inställd avsökningsfrekvens på 800 Hz, med 520 x 520 pixlar, en 440 x 440 μm2 synfält och linje genomsnittliga 1.
- Tune Ti:Sa laser till 830 nm att väcka andra harmoniska generation (SHG) från kollagen, med en vägledande kraft källa till 150 mW. Finjustera andra Ti:Sa lasern på 920 nm med 94 mW vid källan, att väcka både gemensamma fiskeripolitiken och YFP.
- Set-up 3D och timelapse förvärv läge med samtidiga magnetisering
Obs: Håll laser befogenheter så lågt som möjligt för att minimera fotoblekning och fototoxicitet.
- Spela in fluorescens med två kanaler i icke-descanned läge, med en master dichroic spegel på 560 nm. I set-up används i detta protokoll, en andra dichroic spegel dela signalen vid 495 nm till separat kanal 1 (utsläpp filter 475/50) från kanal 2 (utsläpp filter 525/50) (figur 2A). Denna konfiguration samlar SHG ljus från kollagen i den första kanalen, medan gemensamma fiskeripolitiken utsläpp samlas i båda kanalerna 1 och 2 och YFP samlas endast i kanal 2.
- Definiera ett intervall 50 μm längs Z-axeln, med en stegstorlek 3 μm (voxel storlek 0.86 μm x 3 μm). Post bilder varje 30 s för en total varaktighet på 30 min.
- Om du vill förvärva flera regioner. Innan du kör fler förvärv, kontrollera vitala tecken och återfå anestesi genom katetern om det behövs (se steg 3.3.10).
- I slutet av avbildningsprocessen, avliva musen genom ketamin/xylazin överdosering följt av cervikal dislokation.
5. bild bearbetning och kvantitativ analys av neutrofiler-DC motilitet och interaktion
Obs: I detta protokoll, en specialiserad avbildningsprogrammet användes för att analysera mikroskopi data.
- Efter 4D bild förvärvet slutförs, överföra filer (data och metadata) på en arbetsstation med tillräckliga resurser (föreslog systemkrav: 32 GB RAM, snabbt Solid-State-solid-state-enheter, senaste CPU, dedikerad GPU baserad på ett massivt parallella arkitekturen).
- Öppna filerna i avbildningsprogrammet.
- Spela videon och säkerställa att cellerna av intresse är tydligt synliga och att imaging artefakter är frånvarande.
Obs: i detta syfte Kontrollera att båda rörelsen av provet och variationen i ljusstyrka begränsas tillräckligt. Sannerligen, dessa utgör utmaningar för automatisk analys26. Om förflyttning av provet mellan intilliggande ramar är överdriven, tillämpa en avdrift korrigering metod, med till exempel SHG kanalen som fast referens. Detta tillåter att bättre mäta rörelsen av cellerna i stället för förflyttning av provet. Dessutom, i närvaro av ljus bakgrund eller skräp, beskära de rekonstruerade ytor med volym som en urvalsparametern. - Generera en samtidig lokalisering kanal specifikt för GFP+ celler, för att separera signalen mellan den gemensamma fiskeripolitiken och kollagen (SHG). Beteckna en Usenets polygon (figur 2Bjag) som väljer endast de voxlar med en positiv intensitet både i den gröna kanalen och i den blå kanalen i detta syfte.
Observera: Denna procedur kan variera beroende filter uppsättning mikroskopet och färgningen av cellerna. Det kan uppnås genom att välja endast voxlar med tillräcklig intensitet i både gröna och blå kanalerna. Bland de tillgängliga verktygen, kan funktionen ”coloc” användas för att automatiskt beräkna den colocalization kanalen baserat på intensitet tröskelvärde. Metoder baserade på maskininlärning kan dessutom användas för det här steget med överinseende av en expert27. - Identifiera och spåra GFP+ celler, använder automatisk ytan återuppbyggnad och spårning (surface verktyg) över kanalen lämpliga samtidig lokalisering.
Obs: Manuell curation av eventuell spårning fel och utslagning av spår med en löptid kortare än ett visst tröskelvärde (dvs 150 s) kan krävas. - Generera en samtidig lokalisering kanal specifikt för CD11c-YFP+ celler, för att separera GFP och YFP signaler. Beteckna en Usenets polygon (figur 2Bii) som väljer endast de voxlar har en positiv intensitet i den gröna kanalen men en låg intensitet i den blå kanalen i detta syfte.
Obs: representativa micrographs visar signalerna från kanal 1, kanal 2, samtidig lokalisering kanalen för GFP, samtidig lokalisering kanalen för YFP och kombinationen av alla kanaler finns i figur 2Biii. - Rekonstruera de CD11c-YFP+ cellerna yta och spåra deras position över tid (surface verktyg).
Obs: Manuell korrigering av eventuell spårning fel krävs inte för detta steg. På grund av komplex plats och tid dynamiken i DC faktiskt rekonstruera deras exakta yta från 2 P-IVM data en utmanande uppgift som inte kan uppnås med tillgängliga segmentering programvara. Bland de skäl som gör denna uppgift utmanande, tillåter tunn utskjutande delar och ljusstyrka variationer inte för användningen av vissa bildbehandling tekniker, såsom kantutjämning filter eller statiska tröskelvärde. Dessutom i ett nätverk av DC är det svårt att separera enstaka celler endast utifrån deras utseende i 2P-IVM data. För dessa skäl, snarare än försöker en korrekt segmentering av tuning programvara parametrar, föreslår vi att rekonstruera icke-korrekt ytor av DC. Sedan, hantera de möjliga fel med hjälp av robusta mätetal som beskrivs i 5,8. -
Mäta cellmigration.
- Exportera de klassiska migrering åtgärderna för både gemensamma fiskeripolitiken+ och CD11c-YFP+ celler. Bland dessa visar ”spår hastighet medelvärdet” den genomsnittliga flyttande hastigheten av celler medan den ”spår rakhet” visar riktningen på cellerna. Dessa åtgärder kan exporteras som en kalkylbladsfil från avbildningsprogrammet.
- I de exporterade kalkylbladsfiler, beräkna ”korrigerade spår rakhet” (även kallad korrigerade instängdhet baserat) för både gemensamma fiskeripolitiken+ och CD11c-YFP+ celler, som definieras som ”spår rakhet” multiplicerat med kvadratroten av ”spår varaktighet” dividerat med kvadratroten av video varaktighet. Denna åtgärd är mer robust än ”spår rakhet” i närvaro av kort spår28, kommer till exempel från spårning fel.
Obs: endast videor av samma längd kan jämföras med denna åtgärd.
-
Mäta cell interaktion.
- Definiera en kontakt mellan en GFP+ cell och en CD11c-YFP+ cell om deras avstånd (närmaste voxlar) är mindre eller lika än ett tröskelvärde (dvs 2 μm).
Obs: Detta tröskelvärde bör vara tillräckligt stränga för att upptäcka en kontakt bara när celler finns i närheten. Vi uppmuntrar dock för att hålla denna tröskel större än 0, idealiskt N gånger större än voxel radien (N > 2), eftersom gränsen utjämning kan göra återuppbyggnaden av celler mindre än faktiska Cellstorlek. - Räkna antalet och varaktigheten av kontakter mellan GFP+ och CD11c-YFP+ celler. I avbildningsprogrammet kan detta göras exempelvis genom att köra en ”kiss och kör” plugg i. Dessa åtgärder kan exporteras som en kalkylbladsfil från fliken statistik.
- Definiera en kontakt mellan en GFP+ cell och en CD11c-YFP+ cell om deras avstånd (närmaste voxlar) är mindre eller lika än ett tröskelvärde (dvs 2 μm).
- Importera de tidigare beräknade åtgärderna i en statistisk programvara, generera tomterna och utföra statistiska tester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta arbete beskrev vi ett detaljerat protokoll att studera i vivo motiliteten och samspelet mellan neutrofiler och DC under influensainfektion i murina luftstrupen (figur 3A). Till detta ändamål isolerat vi GFP+ neutrofiler (92% renhet; Figur 3B) från CK6-ECFP visasi möss och vi adoptively dem en CD11c-YFP mus smittats med influensa. Efter att utfört vi 2P-IVM luftstrupen på dag 3 p.i. Vid denna tidpunkt observerat vi en tydlig rekrytering av neutrofiler i det smittade området, vilket framgår av flöde flödescytometrisk analys (figur 3 c). 2P-IVM protokollet kräver användning av en specifik kirurgiska styrelse och en syre-leverantör för gnagare (figur 1A). Leverera syre genom en kanyl in i luftstrupen hjälpte djuret andas, underlättas utläggningen av luftstrupen och kontrollerade organrörelsen associerade med andning (figur 1B). Efter detta experimentella set-up förvärvade vi stabilt 4D bilder i vivo i infekterade luftstrupen under en period av 30 min (figur 3Dfilm 1).
Analysen av de förvärvade 4D bilderna genom specialiserade avbildningsprogrammet tillåtet att mäta migreringen av celler och kvantifiera plats och tid dynamiken i neutrofiler och DC. Om cellen motilitet observerat vi betydande skillnader mellan rörligheten för DC och rekryterade neutrofilerna, som visade en betydligt snabbare hastighet än senare (figur 4A). Detta resultat bekräftar den dynamiska karaktären av neutrofiler, tidigare beskrivits som mycket motila celler kan migrera mot en korrektiv källa29. Angående riktverkan fann vi att komplexa morfologi av DC gav frekvent fel i cell tracking, som i sin tur producerat låtar med minskad längd och ökad variansen av uppmätta riktad beteende (figur 4B). Därför beräknas vi en robust mått som kan mäta riktningen genom att betrakta varaktighet för spårning. Med detta mått, observerat vi en betydande skillnad i riktningen på neutrofiler vs DC (figur 4 c).
Uträkningen av avståndet mellan neutrofiler och DC tillåts dessutom att upptäcka och analysera sina kontakter över tid. I den här experimentella modellen observerat vi några neutrofiler som bildade flera-brief kontakter med DC och andra som inte utgjorde någon kontakt under perioden avbildad (figur 4 d). Dessutom studien av den genomsnittliga kursutvecklingen av avståndet mellan neutrofiler och DC över tiden tillät oss att studera övergripande placeringen av de studera cellerna (figur 4E), medan utredningen av trenden i specifika celler tillåts att karakterisera den beteendet hos varje enskild cell (figur 4FMovie 2).
Figur 1: utrustning och åtgärder för 2P-IVM av murina luftstrupe. (Ai) Bärbar djur anestesi systemet som ansvarar för den automatisk ventilationen ansluts till en pump som levererar syre till musen. Framifrån (Aii) och sidoutsikt (Aiii) styrelsens skräddarsydda kirurgiska används för trakeal modellen. Styrelsen består av en metall scen med en plast mus positionella (Aii-en), en rod för att hålla en lös klämma (Aii-b) och en fin avstämbara XYZ översättare (Aii-c). (B) sekventiella steg av luftrör kirurgiska modell: (Bi) hårborttagning av kirurgiska området, (Bii) positionering av sövda musen i kirurgiska styrelsen, (Biii) kirurgiska exposition av luftstrupen, (Biv ) intubation med en kateter med konstgjord ventilation, (Bv) fixering av katetern, (Bvi) tillägg av PBS till exponerade luftstrupen, (Bvii) montering av täckglas och (Bviii) placering av en kateter med anestesi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: fluorescerande signaldetektion under 2P-IVM. (A) Schematisk framställning av mikroskopet upptäckt filtrera set-up och motsvarande kanaler. Dichroic spegeln på 560 nm avskiljer grön från röd/långt rött utsläpp. Ytterligare dichroic spegel vid 495 nm används för att ytterligare identifiera de olika underregioner utsläpp spektrum. Kanal 1 sysselsätter en hybrid detektor (utsläpp filter 475/50), medan kanal 2 använder hög känslighet GaAsP PMT (utsläpp filter 525/50). (B) representativa scatter dot tomter av 2 P signaler visar Usenets strategin för generering av colocalization kanaler för identifiering av signalen från den gemensamma fiskeripolitiken (Bi) och den YFP (Bii) fluorophores. (Biii) Representativ micrographs visar specifika signalerna från kanal 1 (Ch 1, mörkblå), kanal 2 (Ch 2, grön), samtidig lokalisering kanalen för GFP (ljusblå), samtidig lokalisering kanalen för YFP (gul) och kombinationen av alla kanaler (Ch 1 + Ch 2 + gemensamma fiskeripolitiken + YFP). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Intravital 4D imaging av neutrofiler och DC i en influensa infekterade luftstrupe. (A) Schematisk disposition av protokollet. (B) representativa flöde flödescytometrisk spridningsdiagram visar andelen neutrofiler med avseende på de totala CD45 +-cellerna i en cellsuspension isolerade från murina benmärg med metoden Percoll lutning. (C) representativa flöde flödescytometrisk scatterplots visar en ökning i frekvens av neutrofiler i tracheas från icke-infekterade möss jämfört med möss som infekterats med influensavirus på dag 3 PI (D) (till vänster) anatomisk bild av en murin luftstrupen som visar det område som valts för bild förvärv. (Höger panel) Representativa 3D projektion av en 2P-IVM Mikrograf visar surface återuppbyggnaden av neutrofiler (ljusblå) och DC (gul) tillsammans med sina spår på dag 3 p.i. SHG signalen visas i mörk blå. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: karakterisering av neutrofiler och DC migration och interaktion dynamik i influensa infekterade luftstrupe. Representativa tomter visar spår hastighet menar (A), spåra rakhet (B) och korrigerade spår rakhet (C), som definieras av Beltman och kollegor (2009)28, neutrofiler och DC i luftstrupen på dag 3 p.i. med influensavirus. Den korrigerade spår rakhetsmätning uppvisar robusthet att spåra fel. (D) 2D histogram visar frekvensen av neutrofiler enligt deras antal kontakter med DC och genomsnittlig kontakt varaktighet. (E) Genomsnittligt avstånd av neutrofiler till närmaste DC under filmen. (F) (vänster) analys av distansera av en representant som neutrofila till närmaste DC i tid. Den streckade röda linjen anger avstånd tröskeln att överväga att neutrofiler etablerat en kontakt med en DC. (Rätt i-iii) Micrographs förvärvade vid olika tidpunkter som representerar migration av neutrofiler (ljusblå) mot en DC (gul). Cell spår visas som en mångfärgad linje som ändrar färg från blått till rött att representera tid. SHG signalen från fibrillary kollagen visas i mörkblått. Skalstapeln = 50 µm. I alla siffror är presenterade uppgifter representativa för minst tre oberoende experiment. Resultaten anges som menar ± SD. statistik av Welch's test. ns p > 0,05; p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: neutrofiler och DC dynamik i luftstrupen under influensainfektion. 30 min time-lapse 3D bilden visar interaktion dynamiken mellan neutrofiler (ljusblå) och DC (gul) samt deras respektive spår med avseende på kollagen nätverket (mörkblå) av luftstrupen. Representativt antal neutrofila-DC interaktioner indikeras med vita pilar. Cell spår visas som en mångfärgad linje som ändrar färg från blått till rött att representera tid. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Movie 2: representativa kortfristiga neutrofiler-DC interaktion i luftstrupen under influensainfektion. 30 min time-lapse 3D-bilden visar en representativ interaktionen mellan neutrofiler (ljusblå) och en DC (gul) och deras respektive spår. Cell spår visas som en mångfärgad linje som ändrar färg från blått till rött att representera tid. SHG signalen från kollagen visas i mörkblått. Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete presenterar ett detaljerat protokoll för generering av 4D bilder visar migration av adoptively överförda neutrofiler och deras interaktioner med DC under en influensainfektion i mus luftstrupen. Den beskrivna 2P-IVM-modellen kommer att vara relevanta att studera immunceller dynamics under en infektion i luftvägarna.
Nyligen har har flera modeller baserat på visualisering av cell dynamics i luftvägarna varit utvecklade9,10,11,12,13,14,15 ,16. I vivo imaging av lungan är dock fortfarande utmanande, att detta organ och de tekniska svårigheterna att minimera rörelsen under andning cykel30anatomiska läge. För att övervinna dessa problem, har vissa författare föreslagit användning av en specialbyggd cirkulär sug kammare, som måste vara opereras in i bröstkorgen13,14. Detta förfarande kräver dock en invasiv intervention som kan äventyra resultat, särskilt i de studier som har fokuserat på utredningen av den inflammatoriska reaktionen. Dessutom presenterar lung kirurgiska modeller en begränsning för djup vävnad avbildning på grund av den ljusbrytning som härrör från luften i alveolerna17. Däremot har olika luftrör modeller använts nyligen att studera cell dynamics i luftvägarna epitel. Avbildning av detta organ presenterar tydliga fördelar jämfört med lungcancer, såsom den relativt enkel kirurgi krävs att exponera och immobilisera orgel, samt högre tillgänglighet till trakeal epitel. Den föreslagna luftrör modellen är också relevant att undersöka inledandet av svaret mot luftvägarna patogener, såsom influensa-virus, eftersom luftstrupen är en av de första platserna av virusreplikation under loppet av en influensa infektion8.
Intressant, publicerad en studie som visar ett alternativ intubation-fri metod för imaging luftstrupen har varit nyligen12. Metoden kännetecknas av en minskad inflammation och visar tydliga fördelar i studier där funktionen mucociliarity av epitelceller måste bevaras. Men denna metod garanterar inte tillräcklig stabilitet och förvärvet av ljusare signaler nödvändigt att studera cell-cell kontakter i ett spektrum av några µm. däremot metoden presenteras i det nuvarande protokollet ger bättre immobilisering av organ Tack vare intubation och möjliggör upptäckt av starkare fluorescens signaler till följd av kortare avståndet mellan orgel och täckglas12.
Åstadkomma vävnad immobilisering under i vivo 2 P-IVM bild förvärv är det mest kritiska steget att generera optimal data. Några avgörande åtgärder som bidrar till stabiliteten i den presenterade metoden inkluderar: en lämplig mus anestesi; en rätt mus intubation; och en kirurgisk exposition av luftstrupen som gör en enkel tillgång till organ av täckglaset. Dessutom kommer att imaging rätt antal (helst 30 celler per synfält) stärka de erhållna resultaten. Rekrytering av det optimala antalet celler beror i stor utsträckning på virusinfektion dos, som är mycket influerad av det virala inokulatet korrekt administration.
En annan avgörande steg i protokollet är kirurgiska utläggningen av luftstrupen. Olika åtgärder kan vidtas för att minimera skador på organ under operation. Exempelvis bör luftstrupen inte direkt vidröras med kirurgiska verktyg. I stället bör det exponeras genom att manipulera endast omgivande vävnader (hud, saliv-körtlar och muskler). Om absolut nödvändigt på hanteras luftstrupen med unsharpened objekt. Dessutom bör ansträngningar göras för att undvika blodkärl skador. Slutligen, för att förhindra orgel uttorkning, det är också viktigt att täcka den med PBS omedelbart efter operationen.
Trots de unika fördelarna med denna metod jämfört med de tidigare beskrivna metoderna för visualisering av immunceller interaktioner i luftrör slemhinnan presenterar användningen av denna modell vissa begränsningar. Som beskrivits ovan, kan förekomst av inflammation i samband med luftrör operationen representera en nackdel när man studerar immunsvar. För att övervinna denna begränsning, är det möjligt att administrera antiinflammatoriska läkemedel före inledandet av förfarandet. En annan begränsning av denna modell är relaterad till förekomsten av en stark autofluorescens signal befintliga i luftvägarna, som genereras huvudsakligen av bosatt cellerna och slem lagret. Denna icke-specifik fluorescens skapar artefakter som kan hindra analysen. Dessutom kan vilseledande beräkning av parametern spår rakhet genereras när jämförde cellen spår av olika löptider och när spårning fel införa spår av kort varaktighet26. För att lösa detta problem, tillämpat vi en straff koefficient för att korrigera banan rakhet. Sådan rättelse är avsedd att minimera effekten av miss-tracking i resultat28.
En avgörande aspekt av 2P-IVM experiment är möjligheten till återanvändning möss som har genomgått kirurgi och imaging. Den i vivo imaging protokollet som beskrivs här kräver inte dödshjälp eller orgel djursamling, lämna således möjligheten att återvinna och återanvända möss efter operation för andra förfaranden. Med ett enda musklick, till exempel att utföra luftstrupen imaging vid olika tid punkter kan dramatiskt minska antalet totala djur behövs i ett experiment, stödja principen om djurs minskning . Dessutom kunde det också minska interindividuell variabilitet. Men måste djur återvinning och återanvändning följa djurskyddsnormer som omfattar förvaltning av ordentlig smärtstillande läkemedel och antibiotika till djuren under återhämtningstiden. Alla dessa procedurer måste inkluderas i protokollet djurförsök och godkänts av de lokala veterinär-myndigheterna.
Protokollet beskrivs kan lätt anpassas till studien av andra immunceller typer. Isolering och injektion av (fluorescerande eller betsad) patogen-specifika T-celler kan exempelvis användas för att studera T cell aktivering dynamics31 samt deras samspel med andra celler såsom luftrör DC. På liknande sätt, kan visualisering av blod- eller lymfkärl utgöra en intressant metod att studera rekrytering av inflammatoriska celler i luftrör vävnaden under infektion. Dessutom kan 2P-IVM luftstrupen också tillämpas för att studera dynamiken i immunsvaret mot andra luftburna patogener. Därför, användningen av transgena fluorescerande luftburna patogener, såsom Streptococcus pneumoniae32, skapar nya möjligheter att studera deras interaktion med immunsystemet. Även om proceduren fokuserar på att mäta dynamiken i immunceller under infektion, skulle det också kunna tillämpas på olika områden inklusive cancer, astma, eller sårläkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av de schweiziska nationella stiftelsen (SNF) bidrag (176124, 145038 och 148183), den Europeiska kommissionen Marie Curie återintegreringsbidrag (612742) och SystemsX.ch för ett bidrag till D.U.P. (2013/124).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3x 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20 °C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20 °C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20 °C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20 °C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
References
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
- Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694 (2017).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
- Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live Imaging of the Lung. Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
- Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
- Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
- Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
- Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
- Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
- Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
- Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
- Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
- Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
- Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881 (2016).
- Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).
