Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at påvise tilstedeværelsen af neutrofiler i fast/permeabilized histologi sektioner og vurdere aktiveringstilstand for levende renset neutrofiler. Især binder MUB40 peptid lactoferrin stede i neutrofile-specifikke og tertiære granulat. Eksponering af granulet indholdet gennem enten permeabilization eller neutrofile aktivering giver mulighed for mærkning af neutrofiler.
Abstract
Her, leverer vi en protokol, der involverer brugen af MUB40, en syntetiseret peptid med evnen til at binde glykosyleret lactoferrin gemt i høje koncentrationer i specifikke og tertiære granulat af neutrofiler. Denne protokol detaljer hvordan MUB40 konjugeret direkte til en fluorophore kan bruges til at plette neutrofiler i fast/permeabilized væv samt, hvordan dette kan bruges i live-celle imaging til assay for neutrofile aktivering og deaktivering sker en granulering tørrer. Neutrofile påvisningsmetoderne er begrænset til artsspecifikke monoklonale antistoffer, som ikke altid er egnet til visse anvendelser. MUB40 trænge ind ikke i cellemembranen og er dermed udelukket fra lactoferrin gemt i ikke-aktiveret/ikke-permeabilized neutrofiler. MUB40 har den ekstra fordel af anerkende lactoferrin fra en bred værtsspektrum, gør det især nyttig for at sammenligne resultater i undersøgelser, hvor flere forskning modeller, at reducere antallet af dublerede reagenser, og forenkle protokoller gennem trinvis farvning.
Introduction
Neutrofile er en af de primære våben af den medfødte immunsystem og rekrutteres rutinemæssigt at lokaliteter af betændelse omkring kroppen. Studiet af neutrofiler har været i høj grad svækket af deres korte levetid i vitro (mindre end 8 h) og af begrænset registreringsværktøjer basal betingelser eller efter aktivering. Vi præsenterer her, en velafprøvet protokol for den brede og specifik påvisning af pattedyr neutrofiler i fast/permeabilized prøver. Vi tilbyder også en detaljeret protokol for farvning live neutrofiler med MUB40. Ved hjælp af live neutrofile farvnings-protokollen, kan timing og placering af neutrofile aktivering være identificeret. Denne protokol er ideel til forskere, der ønsker at studere neutrofile aktivering eller granula frigivelse. Ud over deres antimikrobielle funktioner, er neutrofile nu værdsat som immunmodulerende celler involveret i en bred vifte af sygdomme og immunrespons (medfødte og adaptive)1,2. Neutrofiler er til stede i de fleste inflammatorisk væv, på høje tal i inficeret væv, i inflammatoriske tumorer3, under IBS og Crohns flare-ups4, og i områder af ikke-infektiøs inflammation som Gunnbjørn af leddegigt ( RA) patienter5. Neutrofiler indeholder fire klasser af præformerede granulat opkaldt azurophil (α), specifikke (B1), tertiær (β2) granulat og sekretoriske vesikler (γ)6. Ved overflytning til en inflammatorisk websted, rekrutterede neutrofiler blive aktiveret og udskiller sekventielt granulet indholdet (sammensat af adhæsion, antimikrobielle forbindelser og immunmodulerende molekyler), der fremmer yderligere rekruttering og bidrager til infektion opløsning (men også til værten vævsskader)7. Mens neutrofiler betragtes et kritisk aspekt af medfødt immunitet, indtil der er par påvisning reagenser tilgængelige at studere dem, og endnu færre der kan bruges til at vurdere aktiveringstilstand for levende neutrofiler.
Nuværende metoder til påvisning af neutrofiler stole på monoklonale antistoffer dannet mod celle-overflade udsat antigener, såsom Ly - 6 G2 eller proteiner specifikt gemt i neutrofile granulat under basale forhold (f.eks. myeloperoxidase lactoferrin). Fordele af monoklonale antistoffer omfatter deres stærke binding, følsomhed og alsidighed under forskellige assay. Der er dog flere ulemper ved at bruge monoklonale antistoffer og anti-Ly - 6G i særdeleshed. Disse ulemper omfatter specificitet, som Ly - 6G er til stede på et flertal af myeloide celler i knoglemarven og på alle granulocytter herunder eosinofile; således er kræver decifrere neutrofiler fra eosinofile med denne markør mere komplekser tilgange8. En anden hyppig afvejning med monoklonale antistoffer er deres ofte begrænsede vært værtsspecificitet, vanskeliggør sammenligning undersøgelser med mere end én dyreart. En tredje ulempe af antistof påvisningsmetoder, især når du bruger levende celler eller in vivo, er deres potentiale til at forstyrre cellefunktion eller føre til celle aktivering. For eksempel, er administration af anti-Ly - 6G til mus almindeligvis anvendes til neutrofile udtynding og forbigående neutropeni9. Det er desuden påvist, at antistof injektion kan stimulere neutrofile antitumor funktion10. Påvisning af antistof af neutrofiler afslører endelig ikke aktiveringstilstand for cellen.
Vi har identificeret en 40-amino syre peptid kaldet MUB40, som kan bruges i en række af assays til label neutrofiler i in vitro eller vivo betingelser samt assay aktivisering statussen af levende neutrofiler11. MUB40 er afledt fra MUB7012, et domæne af Lactobacillus reuteri overflade Slim-bindende protein oprindeligt beskrevet for sin evne til at binde Slim13,14. MUB40 interagerer med glykosyleret Laktoferrin, der er til stede i høje koncentrationer i neutrofile-specifikke og tertiære granulat. MUB40 kan blive udsat for disse granulatet gennem standard permeabilization trin i histopatologi eller fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) protokoller for robust farvning af faste neutrofiler. Når levende neutrofiler holdes i en inaktiveret stat, MUB40 peptid er udelukket fra granulet indholdet, og celler pletter ikke positivt med markøren. Ved aktivering, kan MUB40 binde til udsatte lactoferrin og føre til robust farvning med peptid. MUB40 kan således bruges til at bestemme aktiveringstilstand for renset neutrofiler, hvilket gør det til et attraktivt markør til at følge den infektiøse proces. Evnen til at binde til live aktiveret neutrofiler tillader også MUB40 skal bruges som et redskab til at opdage områder af neutrofile betændelse i live dyremodeller (f.eks. en mus gigt model15). Protokoller i dette manuskript detaljer hvordan fluorescently mærket MUB40 kan bruges til at afsløre neutrofiler i histologi væv og sådan assay aktivering af levende renset neutrofiler i vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der beskrives her har gennemgået og godkendt af de franske organisationer CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) og CNIL (Kommissionen Nationale Informatique et Liberté).
1. farvning neutrofiler i histopatologi væv med Fluorescently mærket MUB40
- For at få væv til histopatologisk undersøgelse, lave væv/biopsi sektioner i en passende mængde af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 30 min op til 4 h afhængigt af tykkelsen af prøven. Placer prøverne i 4 ° C køleskab under fiksering.
Bemærk: Alternative fiksering metoder/tider kan erstattes baseret på brugerens unikke behov.- Fjerne PFA, tilføje 16% rørsukkeropløsning med nok volumen til fuldstændig dækning af prøven, og prøven anbringes ved 4 ° C for 4 h op til natten.
- Fjern 16% rørsukkeropløsning og tilføje 30% rørsukkeropløsning på en stor nok mængde til fuldstændig dækning af prøven og placere det ved 4 ° C for 4 h op til natten.
- Fjerne 30% rørsukkeropløsning og duppes off overskydende løsning fra væv med et stykke køkkenrulle. Placere afsnittet væv i optimal opskæring temperatur (OCT) medier og snap-fryse i 2-methylbutane afkølet i et tøris-ethanol bad (-72 ° C). Når frosset fast (efter ~ 2 min), fjerne blokke fra 2-methylbutane og placere dem på tøris, indtil alle blokke er færdig og klar til langtidsopbevaring. Gemme de frosne blokke på-80 ° C til langtidsopbevaring.
- Natten før væv blokke skal være skåret, fjerne dem fra-80 ° C fryser og placere dem på-20 ° C natten over til Reagensglasset.
- Bruger en kryostaten, skåret OCT-embedded væv i 10 - 30 μm-tykke skiver og adsorberes til høj kvalitet glas lysbilleder.
Bemærk: Tykkere eller tyndere skiver kan anvendes alt efter de eksperimentelle krav. - Med en voks pen eller andre hydrofobe metode, tegner en boks omkring væv skive på glas dias og lad tørre.
- Forberede Farvningsopløsningen ved at udføre en 1:1,000 fortynding af MUB40-Cy5 (eller andre fluorescerende MUB40version, 1 mg/mL stamopløsning) i 0,1% saponin-PBS løsning. Den optimale endelige MUB40 koncentration skal være 1 μg/mL.
Bemærk: Lavere endelige koncentrationer kan bruges (0.1-0,01 μg/mL) men kan føre til lavere signal intensitet.
Forsigtig: Saponin pulver kan forårsage vejrtrækning irritation. Sørg for at afveje saponin i et kabinet eller beskyttede område. Alternative permeabilization metoder kan bruges som Triton. Tilføje yderligere markører i koncentrationer, der anbefales af producenten (fx., 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, fluorescerende antistoffer). - Forsigtigt dyppe glas dias i en opløsning af 0,1% saponin-PBS tre gange.
- Forsigtigt skamplet væk overskydende væske omkring afsnittet væv og tilføje nok Farvningsopløsningen helt dækker afsnittet væv. Placere diasset i et fugtigt kammer at undgå fordampning og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Holde den beskyttet mod lys.
- Forsigtigt dyppe dias i 0,1% saponin-PBS løsning 3 x. Derefter forsigtigt dyppe dias i PBS løsning 3 x. Endelig, dukkert forsigtigt dias i destilleret H2O 3 x. Forsigtigt tørre overskydende væske fra diaset.
- Tilføje en lille mængde (~ 20 μL) montering medium (20 mM Tris pH 8,0, 0,5% N-propyl gallate, 90% glycerol) ved siden af væv skive og forsigtigt lægge ned et glas coverslip oven på glas dias. Forsigtigt og jævnt Tryk på coverslip på afsnittet væv, og ved hjælp af en køkkenrulle, forsigtigt fjerne udskriftsmedie montering, der Ekstruderer omkring kanterne af coverslip.
- Placer den monterede dias i et mørkt skab i 24 timer til at tillade montering medierne til at størkne. Alternativt kan du placere det monterede dias ved 37 ° C i 1 time.
- Bruger en kryostaten, skåret OCT-embedded væv i 10 - 30 μm-tykke skiver og adsorberes til høj kvalitet glas lysbilleder.
- Billede vævet skiver på et fluorescerende mikroskop efter den ønskede erhvervelse metode.
2. visualisering af neutrofile aktivering med Retro-Inverso-MUB40-Cy5 peptid
- Få human neutrofiler ved hjælp af følgende protokol. Forberede følgende løsninger og placere dem i en anoxiske kabinet overnatning. Eksponering for ilt vil begynde at aktivere neutrofile og yderligere fremkalde celle død16,17.
Bemærk: Neutrofiler kan alternativt renses "på bænken" for MUB40-mærkning eksperimenter; Du skal dog være opmærksom, at ilt eksponering vil begynde at påvirke neutrofile aktivering.- Forberede følgende løsning:
Løsning 1 [natriumchlorid (NaCl) 0,9%]: tilføje 4,5 g NaCl til 500 mL H2O. Filter løsningen.
Løsning 2 (dextran 6%): tilføje 6 g af dextran i NaCl 0,9% opløsning til 100 mL.
Løsning 3 (vask buffer): opløses ethylendiamintetra syre (EDTA) i PBS pH 7,2 til en slutkoncentration 2 mM-EDTA. Umiddelbart før brug, opløse bovint serumalbumin (BSA) i PBS/EDTA-oploesning, BSA slutkoncentration er 10% w/v. - Der centrifugeres blod indsamling rør på 650 x g i 20 min. uden pauser.
- Uden at forstyrre adskilt blod, overføre blod indsamling rør til en anoxiske kabinet og indsamle plasma fraktioner (top) i en 50 mL konisk slange.
- Fjerne den plasma, der indeholder rør fra anoxiske kabinet og centrifugeres ved 2,900 x g i 20 min. med pauser til at pille blodpladerne.
- Uden at forstyrre de pelleted blodplader, forsigtigt overføre plasma tube tilbage i den anoxiske kabinet og afpipetteres trombocyt fattige plasma i en frisk 50 mL tube (herefter kaldet "plasma").
- Forberede følgende løsning:
- Adskillelse af røde blodlegemer fra leukocytter
- Ved hjælp af de rør, der indeholder de røde blodlegemer (RBC) fra trin 2.1.3., kombinere de røde blodlegemer i en konisk 50 mL tube (5 blod collection tube indhold pr. 50 mL tube).
- Tilføje NaCl 0,9%, indtil det samlede volumen når 44 mL. Tilføj 6 mL af dextran 6% (sidste).
- Forsigtigt blandes blod/dextran blandingen ved at vende røret 10 - 20 gange. Lad tube sediment i mindst 30 min.
- Mens sedimentation forekommende, forberede et Percoll forløb ved at tilføje 4,2 mL af Percoll løsning til 5,8 mL plasma i en 15 mL konisk slange, og bland godt ved at vende røret.
- Indsamle den øverste del af dextran forsøget på at undgå pipettering røde blodlegemer.
- Spænd skruelåg, fjerne dextran røret fra den anoxiske kammer og centrifugeres rør på 300 x g i 10 min. med pauser.
- Omhyggeligt placere røret tilbage ind i iltfattige mødesalen uden at forstyrre de pelleted celler, og fjern væsken via pipettering.
- Forsigtigt genopslæmmes celle pellet i 1 mL af plasma og meget langsomt tilføje til toppen af Percoll løsningen. Vær omhyggelig med ikke at fremkalde opblanding af lagene, når pipettering celler på toppen.
- Fjern forsigtigt Percoll løsning tube fra anoxiske kammer (undgå blanding), og der centrifugeres ved 800 x g i 20 min. uden pauser. Perifert blod mononukleære celler (PBMC) vil forblive på Percoll løsning overflade, og neutrofile vil pellet med de røde blodlegemer.
- Fjernelse af kontaminerende røde blodlegemer
- Forberede 14 mL vask bufferopløsning ved at tilføje 700 μL PBS + 10% BSA 14 mL vask buffer.
- Placer Percoll løsning tube tilbage i den anoxiske kammer. Fjern Percoll og PBMC via pipettering og genopslæmmes pelleted cellerne i 1 mL vask stødpudeopløsning. Pellet skal re suspenderede vil have en rød farve på grund af kontaminerende RBC.
- Tilføje 200 μl af anti-CD235a (glycophorin) magnetiske perler til re suspenderede cellerne, forsigtigt blandes og inkuberes i mindst 15 min. Dette trin indlæser de kontaminerende røde blodlegemer med magnetiske perler, således at de kan fjernes.
- Vask kolonnen adskillelse med 2 mL af vask buffer 3 x.
- Mens du holder en 15 mL konisk rør under kolonnen adskillelse langsomt afpipetteres neutrofile/RBC blandingen til toppen af kolonnen. Indsamle cellerne i 15 mL konisk tube, som de flyder gennem. Gennemstrømnings-bør være uklar og mister sin røde farve på grund af de røde blodlegemer forbliver bundet til kolonnen.
- Der tilsættes 2 mL vask buffer til toppen af kolonnen og indsamle i de samme 15 mL konisk tube. Ved udgangen af 2 mL vask bør gennemstrømnings-være klar, betyder at alle neutrofile er blevet indsamlet.
- Forsigtigt blandes i røret for at sikre ligelig fordeling af neutrofile og indsamle 10 μL til celle optælling. Bemærk det endelige rumfang for celle tælle formål. Optælle antallet af celler med en standard celle tælle metode.
- Fjerne den neutrofile rør fra den anoxiske kammer, og centrifugeres neutrofiler ved 300 x g i 20 min. med pauser.
- Placer aflejret neutrofiler tilbage i den anoxiske kammer og fjerne vask buffer via pipettering. Genopslæmmes i neutrofile pellet i plasma med et maksimalt celle tæthed af 107 PMN/mL.
- Optælling af renset neutrofile og visualisering ved hjælp af MUB40
- Tilsæt 1 μL af RI-MUB40-Cy5 (1 mg/mL) til 1 mL Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medie uden phenol rød. Mix af pipettering godt.
- Med henblik på denne protokol, er resultatet blevet skitseret, som om en potent neutrofile aktivering reagens, N-formylmethionyl-leucyl-fenylalanin (FMLP), er tilføjet. Tilføj 1 μm af FMLP til RPMI/RI-MUB40-Cy5 tube og mix via pipettering op og ned.
Bemærk: Hver forsøgsmetoden vil være forskellig fra dette punkt fremad, afhængigt af de forespørgsler. - Der overføres 1 mL RPMI/RI-MUB40-Cy5/FMLP blanding til et glas bund mikroskopi parabol. Denne parabol, tilføje en volumen i oprensede celler svarende til 106 samlede neutrofiler. Bland forsigtigt når der afpipetteres.
- Placer fadet i en inverteret fluorescerende mikroskop og begynde at image erhvervelse. Eksempelvis anbefales det at erhverve baseline billeder før tilføjelsen af en aktivering af neutrofile reagens såsom FMLP eller bakterier. I dette eksempel starte erhvervelse af RPMI/RI-MUB40-Cy5/neutrofiler, og på et senere tidspunkt, afpipetteres aktivering af neutrofile reagens i glasfad og fortsætte billede erhvervelse.
Bemærk: Ændringer til disse trin kan gøres baseret på videnskabelige behov. - Processen erhvervet billeder/gang-lapse film, som vedrører de specifikke mikroskop bruges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne af MUB40-farvede væv fra histopatologi dias typisk afsløre individuelle celler spredt over hele væv. MUB40 pletter Laktoferrin, som er til stede i neutrofile granulat og opdelte. Således ses typisk punktformet farvning eller flere store adskilte områder af signalet kommer fra individuelle neutrofile (figur 1). Det er nyttigt at tilføje en anden celle markør som DAPI at hjælpe Co lokalisere MUB40 signal med den farvede celle. Det samlede antal fundne celler afhænger af antallet af neutrofiler i synsfeltet og kan variere drastisk afhængig af kilde og styrken af immunresponset. Vist her er repræsentative billeder fra renset fast human neutrofiler (fig. 1A) og en væv biopsi af en colitis ulcerosa patienten (figur 1B). Også vist billeder taget fra et relativt lavt niveau af neutrofiler i lungerne på mus inficeret med Klebsiella pneumoniae (figur 1C) og et højt niveau af neutrofiler i tyktarmen af et marsvin inficeret med Shigella sonnei (Fig. 1D).
Resultater ved hjælp af live, renset neutrofiler typisk vise lidt at ingen celle farvning i tidlig tidspunkter, og øge gradvist i RI-MUB40 farvning over tid som mere neutrofiler blive aktiveret. Vist her er en gang kursus serie af billeder fra et eksperiment ved hjælp af renset human neutrofiler inficeret med fluorescerende S. sonnei (figur 2). Afhængigt af styrken af signalet fra aktiverende kan neutrofiler begynde farvning med MUB40 hurtigt, så det anbefales at starte hentning af billeder før tilsætning af aktivatorer. Når celler bliver aktiveret og RI-MUB40 positive, bør de udviser en lignende farvnings-profil til at faste og permeabilized celler, hvilket giver en punktformet farvning. Den optimale koncentration af MUB40 for både levende og faste celle farvning er 1 μg/mL (figur 3). Lavere koncentrationer (0,1-0,01 μg/mL) kan bruges men resultatet i lavere signal intensitet. Det anbefales også at bruge en DIC billede eller andre live-celle pletten til at skelne mellem, hvilke celler der fremvisningen af en RI-MUB40 signal.
Figur 1 : MUB 40 -farves neutrofiler af menneskelige, mus og marsvin oprindelse. (A) repræsentant MUB40 farvning (grønne) af neutrofiler renset fra sunde menneskelige donorer. Cellekerner farves med DAPI (blå). (B) farvning af human neutrofiler i væv fra en colitis ulcerosa biopsi. Neutrofiler er afsløret med MUB40 (grøn) og cellekerner farves med DAPI (blå). C histopatologi fra lungen musen inficeret med Klebsiella pneumoniae. Musen neutrofile er afsløret i væv ved hjælp af MUB40 (grøn) og cellekerner farves med DAPI (blå). (D) histopatologi fra kolon af et marsvin, inficeret med Shigella sonnei. Neutrofiler reagerer på infektionen er afsløret i væv med MUB40 (grøn). S. sonnei bakterier (rød) express fluorescerende dsRED protein. Cellekerner farves med DAPI (blå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Levende neutrofiler pletten med MUB 40 kun når aktiveret. Udvalgte billeder fra en time lapse serie der involverer renset human neutrofiler inficeret med S. sonnei i overværelse af RI-MUB40. I først møder sæt af billeder (øverst) en neutrofile en S. sonnei bakterie (rød) vist med en grøn pil. Løbet tid er bakterien internaliseret af neutrofile og fordøjet. Som neutrofile bliver aktiveret fra bakterier, pletter det gradvist stærkere med RI-MUB40. Billederne til venstre er fluorescerende kanaler belagt med DIC billeder. Billeder til højre er kun fluorescerende kanaler. Billeder blev taget med 5 min. mellemrum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Effekt af forskellige MUB 40 koncentrationer på neutrofile farvning. Repræsentative farvning af faste/permeabilized neutrofiler med forskellige koncentrationer af MUB40-Cy5. Renset human neutrofiler var fast og farves med de angivne koncentrationer af MUB40-Cy5. Cellekerner farves med DAPI (blå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrives to assays hvor MUB40 peptid er brugt til at studere neutrofile betændelse og aktivering. Vi viser, hvordan MUB40 kan afsløre neutrofiler i histopatologi sektioner eller vise deres aktivering staten bruger live renset neutrofiler. De kritiske trin til brug af MUB40 som en farvning reagens er den samme som med enhver anden fluorescerende påvisningsmetode. Skal sørges for at sikre kompatibilitet af fluorescerende signaler og at have taget tilstrækkelig vask skridt til at fjerne baggrunden farvning. De vigtigste overvejelser at opnå god farvning resultaterne er kvaliteten af mikroskopet, glas dias/cover underkjoler og afsnittene væv. Når du ser live renset neutrofiler, er de mest vigtige skridt ved rensning sig selv. Neutrofiler er følsomme og kan aktiveres ved en række forskellige signaler. For at sikre, at eksperimentet producerer meningsfulde resultater, skal der udvises forsigtighed at holde de renset neutrofiler inaktive, indtil de er klar til at blive brugt. Dette kan opnås ved at udføre neutrofile rensning-protokollen i et iltfrit kammer at begrænse neutrofile eksponering for ilt.
Både en begrænsning og fordel af MUB40, afhængigt af den eksperimentelle spørgsmål bliver behandlet, er, at MUB40 eneste pletter aktiveret neutrofiler, medmindre de er en eller anden måde permeabilized. Dette kan være en kæmpe fordel, hvis eksperimentet kræver følgende inflammation i levende dyr eller renset celle, men det kan være en ulempe, hvis eksperimentet kræver registrering af alle levende neutrofiler uanset aktiveringstilstanden. En anden potentiel begrænsning i denne protokol er faktum, at lactoferrin er til stede i forskellige kropslige sekreter såsom tårer, mælk og slim. For histopatologi farvning, hvori disse sekreter er vedligeholdes (fx Colon biopsier hvor mukuslagets er intakt), vil MUB40 også pletten mukuslagets sammen med enhver nuværende neutrofiler. I praksis, dette har endnu til at påvirke vores analyse, men det bemærkes som en potentiel signalkilde til.
MUB40 er i øjeblikket, de kun neutrofile biomarkør, der kan differentiere mellem aktiveret og ikke-aktiveret live neutrofiler. MUB40, i modsætning til antistof påvisningsmetoder, synes også, ikke at ændre funktion eller overlevelse af neutrofiler in vitro eller i vivo. For eksempel, kan tilsætning af specifikke antistoffer mod live neutrofiler være en aktiverende signal påvirker neutrofile funktion eller overlevelse i værten. Dette gør MUB40 en meget nyttig reagens for forskning, der indebærer neutrofile aktivering eller granula release in vitro eller i vivo. Derudover MUB40 har en bred vært værtsspecificitet og kan være direkte konjugeret med et antal forskellige fluorophores, giver mulighed for brug i trinvis farvning assays på tværs af flere værter. Således MUB40 farvning er sammenlignelige mellem mus, menneskelige, og andre pattedyr mål, og det forenkler og reducerer antallet af reagenser skulle opdage neutrofiler.
Mens denne protokol fokuserer specifikt på histopatologi og levende celle imaging ved hjælp af MUB40, vi har også med succes brugt peptid i FACS sortering og levende dyr i vivo billeddannelse. Vi forventer at MUB40 bliver modtagelig for mange forskellige assays der involverer detektion af neutrofiler eller visualisering af inflammatoriske begivenheder i kroppen, og at fremtidige undersøgelser og protokoller vil blive udviklet yderligere udnytte spektret af MUB 40 anvendelser, især ved hjælp af ikke-invasive billeddannelse teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.S.M. er opført som en opfinder på MUB40 patenter:
MUB40: europæisk Patent EP11290403.2, 2011/09/09.
RI-MUB40: europæisk Patent EP nr. 17306746.3, 11/12/17.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) og ANR JCJC tilskud (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
