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Biology

MUB४० पेप्टाइड का पता लगाने में उपयोग के लिए न्युट्रोफिल-मध्यस्थता सूजन की घटनाओं

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58367
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 1,2
1Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur, 2INSERM Unité 1202, Institut Pasteur, 3Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires, Université Bordeaux Segalen, 4Unit of Technology and Service Photonic BioImaging, Institut Pasteur

Summary

यहाँ, हम निश्चित/permeabilized प्रोटोकॉल अनुभागों में न्यूट्रोफिल की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और लाइव शुद्ध न्यूट्रोफिल की सक्रियण स्थिति का आकलन करते हैं. विशेष रूप से, MUB४० पेप्टाइड बांधों लैक्टोफेरिन में मौजूद न्युट्रोफिल-विशिष्ट और तृतीयक granules । या तो permeabilization या न्युट्रोफिल सक्रियण के माध्यम से दाना सामग्री के जोखिम न्यूट्रोफिल के अंकन के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

यहां, हम एक MUB४०, न्यूट्रोफिल के विशिष्ट और तृतीयक granules में उच्च सांद्रता पर संग्रहीत ग्लाइकोसिलेटेड लैक्टोफेरिन बांध करने की क्षमता के साथ एक संश्लेषित पेप्टाइड के उपयोग को शामिल प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । यह प्रोटोकॉल विवरण कैसे MUB४० सीधे एक fluorophore करने के लिए संयुग्मित निश्चित/permeabilized ऊतकों में न्यूट्रोफिल दाग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से कैसे इस रहते सेल इमेजिंग में न्युट्रोफिल सक्रियकरण और de-दानेदार के लिए परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । न्युट्रोफिल पता लगाने के तरीकों प्रजातियों विशेष मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, जो हमेशा कुछ अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हैं करने के लिए सीमित कर रहे हैं । MUB४० कोशिका झिल्ली घुसना नहीं है और इस प्रकार गैर में संग्रहीत लैक्टोफेरिन से बाहर रखा गया है-सक्रिय/गैर permeabilized न्यूट्रोफिल । MUB४० एक व्यापक मेजबान रेंज से लैक्टोफेरिन पहचानने का जोड़ा लाभ है, यह विशेष रूप से कई शोध मॉडल को शामिल करने के अध्ययन में परिणामों की तुलना के लिए उपयोगी बनाने, डुप्लिकेट रिएजेंट की संख्या को कम करने, और प्रोटोकॉल सरल बनाना एकल कदम के माध्यम से धुंधला ।

Introduction

न्यूट्रोफिल जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के प्राथमिक हथियारों में से एक है और नियमित रूप से शरीर के आसपास सूजन की साइटों के लिए भर्ती कर रहे हैं । न्यूट्रोफिल का अध्ययन काफी हद तक इन विट्रो (8 ज से कम) और बेसल शर्तों के तहत सीमित पता लगाने के उपकरणों के द्वारा या सक्रियण के बाद से ख़राब किया गया है । यहां, हम निश्चित/permeabilized नमूनों में स्तनधारी न्यूट्रोफिल का व्यापक और विशिष्ट पता लगाने के लिए एक अच्छी तरह से परीक्षण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम भी MUB४०के साथ लाइव न्यूट्रोफिल धुंधला के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । लाइव न्युट्रोफिल दाग प्रोटोकॉल का उपयोग करना, समय और न्युट्रोफिल सक्रियण के स्थान को इंगित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं जो न्युट्रोफिल सक्रियकरण या दाना रिहाई का अध्ययन करना चाहते है के लिए आदर्श है । उनके रोगाणुरोधी कार्यों के अलावा, न्यूट्रोफिल अब रोगों और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में शामिल इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कोशिकाओं के रूप में सराहना कर रहे हैं (सहज और अनुकूली)1,2. न्यूट्रोफिल सबसे भड़काऊ ऊतकों में मौजूद हैं, संक्रमित ऊतकों में उच्च संख्या में, भड़काऊ ट्यूमर3में, आईबीएस और Crohn भड़क अप4के दौरान, और गैर संक्रामक सूजन के क्षेत्रों में ऐसे रुमेटी गठिया के synovia के रूप में ( रा) रोगियों5. न्यूट्रोफिल में azurophil (α), विशिष्ट (β1), तृतीयक (β2) granules, और स्रावी बुलबुले (γ)6नामक पूर्व-निर्मित granules की चार कक्षाएं शामिल हैं । एक भड़काऊ साइट के लिए प्रवास पर, भर्ती न्यूट्रोफिल सक्रिय हो जाते हैं और क्रमिक रूप से granules सामग्री (आसंजन, रोगाणुरोधी यौगिकों और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी अणुओं से बना), जो आगे भर्ती को बढ़ावा देता है और योगदान करने के लिए संक्रमण संकल्प (लेकिन यह भी ऊतक क्षति होस्ट करने के लिए)7. जबकि न्यूट्रोफिल जन्मजात प्रतिरक्षा का एक महत्वपूर्ण पहलू माना जाता है, तारीख करने के लिए वहां कुछ पता लगाने के लिए उंहें अध्ययन उपलब्ध एजेंट हैं, और भी कम है कि न्यूट्रोफिल रहने वाले सक्रियण राज्य का आकलन किया जा सकता है ।

न्यूट्रोफिल का पता लगाने के वर्तमान तरीकों मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सेल के खिलाफ उत्पन्न-सतह उजागर एंटीजन, जैसे कि 6G2 या प्रोटीन विशेष रूप से बेसल शर्तों के तहत न्युट्रोफिल granules में संग्रहीत (जैसे, myeloperoxidase , लैक्टोफेरिन) । मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लाभ उनके मजबूत बाध्यकारी, संवेदनशीलता, और विभिंन परख शर्तों के तहत बहुमुखी प्रतिभा शामिल हैं । हालांकि, विशेष रूप से मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और विरोधी-6G का उपयोग करने के लिए कई नकारात्मक पक्ष हैं । इन नकारात्मक पक्ष विशिष्टता शामिल हैं, के रूप में 6G अस्थि मज्जा में माइलॉयड कोशिकाओं के बहुमत पर मौजूद है और इयोस्नोफिल्स सहित सभी granulocytes पर उपस्थित है; इस प्रकार, इस मार्कर के साथ इयोस्नोफिल्स से न्यूट्रोफिल गूढ़ और अधिक परिसरों8दृष्टिकोण की आवश्यकता है । मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एक और लगातार tradeoff अपने अक्सर सीमित मेजबान विशिष्टता रेंज है, एक से अधिक पशु प्रजातियों के साथ तुलना अध्ययन मुश्किल बना । एंटीबॉडी का पता लगाने के तरीकों का एक तीसरा दोष, विशेष रूप से जब जीवित कोशिकाओं का उपयोग या vivo में, उनके सेल समारोह को बाधित या सेल सक्रियण के लिए नेतृत्व करने की क्षमता है । उदाहरण के लिए, एंटी-6G के प्रशासन चूहों को आमतौर पर न्युट्रोफिल कमी और क्षणिक न्यूट्रोपेनिया9करने के लिए लागू किया जाता है. यह इसके अतिरिक्त प्रदर्शन किया गया है कि एंटीबॉडी इंजेक्शन न्युट्रोफिल अर्बुदरोधी10समारोह को उत्तेजित कर सकते हैं । अंतत:, न्यूट्रोफिल के एंटीबॉडी डिटेक्शन कक्ष की सक्रियण स्थिति प्रकट नहीं होता है ।

हम एक ४०-एमिनो एसिड पेप्टाइड की पहचान की है बुलाया MUB४०, जो एक संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है परख के तहत न्यूट्रोफिल में इन विट्रो या vivo स्थितियों में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जी न्यूट्रोफिल11के सक्रियकरण स्थिति परख । MUB४० MUB७०12से व्युत्पंन है, लैक्टोबैसिलस reuteri सतह बलगम के एक डोमेन-बाध्यकारी प्रोटीन मूल रूप से अपने बलगम13,14बांध करने की क्षमता के लिए वर्णित है । MUB४० न्युट्रोफिल-विशिष्ट और तृतीयक granules में उच्च सांद्रता पर मौजूद है कि ग्लाइकोसिलेटेड लैक्टोफेरिन के साथ इंटरैक्ट करता है । MUB४० मानक permeabilization histopathology या प्रतिदीप्ति में मौजूद कदम के माध्यम से इन granules को उजागर किया जा सकता है-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) स्थिर न्यूट्रोफिल के मजबूत धुंधला के लिए प्रोटोकॉल । जब लाइव न्यूट्रोफिल एक निष्क्रिय राज्य में रखा जाता है, MUB४० पेप्टाइड granules सामग्री से बाहर कर दिया है, और कोशिकाओं मार्कर के साथ सकारात्मक दाग नहीं है । सक्रियण पर, MUB४० उजागर लैक्टोफेरिन को बांध और पेप्टाइड के साथ मजबूत धुंधला करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस प्रकार, MUB४० शुद्ध न्यूट्रोफिल के सक्रियकरण राज्य निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह एक आकर्षक मार्कर के लिए संक्रामक प्रक्रिया का पालन कर । सक्रिय न्यूट्रोफिल जीने के लिए बांध करने की क्षमता भी MUB४० एक उपकरण के लिए जीवित पशु मॉडल में न्युट्रोफिल सूजन के क्षेत्रों का पता लगाने के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है (जैसे, एक माउस गठिया मॉडल15) । इस पांडुलिपि विस्तार में प्रोटोकॉल कैसे फ्लोरोसेंट MUB४० लेबल प्रोटोकॉल ऊतकों में न्यूट्रोफिल प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कैसे परख करने के लिए रहते है इन विट्रो मेंशुद्ध न्यूट्रोफिल के सक्रियकरण ।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों की समीक्षा की गई और फ्रांसीसी संगठनों CoRC (Comité de सभ्य Clinique), CPP (Comité de protection des Personnes), और CNIL (आयोग के राष्ट्रीयकरण Informatique एट Liberté) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. Histopathology ऊतक में न्यूट्रोफिल की फ्लोरोसेंट बला MUB४०

  1. histopathology के लिए ऊतक प्राप्त करने के लिए, 4% paraformaldehyde (पीएफए) 30 मिनट के लिए 4 एच नमूना की मोटाई के आधार पर के लिए एक उपयुक्त मात्रा में ऊतक/ निर्धारण के दौरान नमूनों को 4 ° c रेफ्रिजरेटर में रखें ।
    नोट: उपयोगकर्ता की अद्वितीय आवश्यकताओं के आधार पर वैकल्पिक निर्धारण विधि/समय प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।
    1. पीएफए निकालें, पूरी तरह से नमूना कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ 16% सुक्रोज समाधान जोड़ें, और रात भर के लिए 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना जगह है ।
    2. 16% सुक्रोज समाधान निकालें और पूरी तरह से नमूना कवर करने के लिए एक बड़ी पर्याप्त मात्रा में 30% सुक्रोज समाधान जोड़ें, और यह 4 ° c पर रात भर के लिए 4 घंटे के लिए जगह है ।
    3. 30% सुक्रोज समाधान निकालें और एक कागज तौलिया के साथ ऊतक से अतिरिक्त समाधान बंद दाग । एक सूखी बर्फ इथेनॉल स्नान (-७२ डिग्री सेल्सियस) में ठंडा 2-methylbutane में इष्टतम काटने तापमान (OCT) मीडिया और स्नैप-फ्रीज में ऊतक अनुभाग प्लेस । एक बार (~ 2 मिनट के बाद) ठोस जमे हुए, 2-methylbutane से ब्लॉक हटाने और उंहें सूखी बर्फ पर जगह जब तक सभी ब्लॉकों और समाप्त लंबी अवधि के भंडारण के लिए तैयार हैं । लंबी अवधि के भंडारण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए ब्लॉकों की दुकान ।
  2. ऊतक ब्लॉकों से पहले रात को काट रहे हैं, उन्हें-८० ° c फ्रीजर से हटा दें और equilibrate करने के लिए-20 ° c रातोंरात उन्हें जगह.
    1. एक cryostat का प्रयोग, 10-30 माइक्रोन-मोटी स्लाइस और उच्च गुणवत्ता वाले ग्लास स्लाइड को adsorb में अक्टूबर-एम्बेडेड ऊतक काट ।
      नोट: मोटे या पतले स्लाइस प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. एक मोम पेन या अन्य hydrophobic विधि के साथ, कांच स्लाइड पर ऊतक टुकड़ा के आसपास एक बॉक्स ड्रा और सूख जाने ।
    3. MUB४०-Cy5 (या अंय फ्लोरोसेंट MUB४०संस्करण, 1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान) के 1:1000 कमजोर पड़ने के प्रदर्शन से धुंधला समाधान तैयार ०.१% saponin-पंजाब समाधान । इष्टतम अंतिम MUB४० एकाग्रता 1 μg/एमएल होना चाहिए ।
      नोट: कम अंतिम सांद्रता इस्तेमाल किया जा सकता है (0.1-0.01 μg/एमएल) लेकिन कम संकेत तीव्रता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
      चेतावनी: Saponin पाउडर श्वास जलन पैदा कर सकता है । एक कैबिनेट या संरक्षित क्षेत्र में saponin वजन करने के लिए सुनिश्चित करें । वैकल्पिक permeabilization तरीकों ट्राइटन जैसे इस्तेमाल किया जा सकता है । निर्माता-अनुशंसित सांद्रता (जैसे, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी) पर अतिरिक्त मार्कर जोड़ें ।
    4. धीरे ०.१% saponin-पंजाबियों तीन बार के एक समाधान में कांच स्लाइड डुबकी ।
    5. ध्यान से ऊतक अनुभाग के आसपास अतिरिक्त तरल दूर दाग और पर्याप्त धुंधला समाधान जोड़ने के लिए पूरी तरह से ऊतक अनुभाग को कवर । वाष्पीकरण से बचने और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए यह मशीन के लिए एक आर्द्रता चैंबर में स्लाइड प्लेस । इसे प्रकाश से सुरक्षित रखें ।
    6. धीरे ०.१% saponin-पंजाबियों समाधान 3x में स्लाइड डुबकी । फिर, धीरे से पंजाब के समाधान 3x में स्लाइड डुबकी । अंत में, धीरे से आसुत एच2हे 3x में स्लाइड डुबकी । ध्यान से स्लाइड से अतिरिक्त तरल सूखी ।
    7. एक छोटी राशि (~ 20 μL) बढ़ते मध्यम (20 मिमी Tris पीएच ८.०, ०.५% N-propyl gallate, ९०% ग्लिसरॉल) ऊतक स्लाइस के बगल में जोड़ें और धीरे गिलास स्लाइड के शीर्ष पर एक गिलास coverslip नीचे करना । धीरे और समान रूप से ऊतक अनुभाग पर coverslip प्रेस और, एक कागज तौलिया का उपयोग कर, ध्यान से किसी भी बढ़ते मीडिया कि coverslip के किनारों के आसपास बाहर निकालना दूर ।
    8. बढ़ते मीडिया को जमना की अनुमति देने के लिए 24 ज के लिए एक अंधेरी कैबिनेट में घुड़सवार स्लाइड रखें । वैकल्पिक रूप से, 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर घुड़सवार स्लाइड रखें ।
  3. छवि वांछित अधिग्रहण विधि के अनुसार एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर ऊतक स्लाइसें ।

2. रेट्रो-Inverso-MUB४०-Cy5 पेप्टाइड के साथ न्युट्रोफिल सक्रियण के दृश्य

  1. निंन प्रोटोकॉल का उपयोग करके मानव न्यूट्रोफिल प्राप्त करें । निंनलिखित समाधानों को तैयार करें और उंहें एक anoxic कैबिनेट में रात भर रखें । ऑक्सीजन के संपर्क में न्यूट्रोफिल को सक्रिय करने और आगे सेल मौत16,17प्रेरित शुरू हो जाएगा ।
    नोट: न्यूट्रोफिल वैकल्पिक रूप से शुद्ध किया जा सकता है "बेंच पर" MUB४०-लेबलिंग प्रयोगों के लिए; हालांकि, पता है कि ऑक्सीजन जोखिम न्युट्रोफिल सक्रियण को प्रभावित करने के लिए शुरू हो जाएगा ।
    1. निंन समाधान तैयार करें:
      समाधान 1 [सोडियम क्लोराइड (NaCl) ०.९%]: NaCl के ५०० मिलीलीटर के लिए ४.५ g जोड़ें O. समाधान फ़िल्टर करें ।
      समाधान 2 (dextran 6%): NaCl में dextran के 6 ग्राम जोड़ें ०.९% समाधान के लिए १०० मिलीलीटर ।
      समाधान 3 (वाशिंग बफर): पंजाब में ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) को भंग 2 मिमी की एक अंतिम EDTA एकाग्रता के लिए पीएच ७.२ तुरंत उपयोग करने से पहले, पंजाबियों में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) भंग/EDTA समाधान ऐसी है कि अंतिम BSA एकाग्रता 10% डब्ल्यू/
    2. ६५० एक्स जी में रक्त संग्रह ट्यूबों 20 मिनट के लिए ब्रेक के बिना केंद्रापसारक ।
    3. अलग खून बाधित बिना, एक anoxic कैबिनेट के लिए रक्त संग्रह ट्यूबों हस्तांतरण और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में प्लाज्मा भिन्न (ऊपर) इकट्ठा ।
    4. anoxic कैबिनेट से प्लाज्मा ट्यूब युक्त निकालें और 20 मिनट के लिए २,९०० एक्स जी पर ब्रेक के साथ प्लेटलेट्स गोली करने के लिए केंद्रापसारक ।
    5. बिना छर्रों प्लेटलेट्स बाधित, धीरे प्लाज्मा ट्यूब हस्तांतरण वापस anoxic कैबिनेट में और एक ताजा ५० मिलीलीटर ट्यूब में प्लेटलेट गरीब प्लाज्मा प्लास्टिक (इसके बाद कहा जाता है "प्लाज्मा").
  2. ल्यूकोसाइट्स से लाल रक्त कोशिकाओं की जुदाई
    1. कदम 2.1.3 से लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) युक्त ट्यूबों का उपयोग करना, एक शंकु ५० एमएल ट्यूब (5 रक्त संग्रह ट्यूब सामग्री प्रति ५० एमएल ट्यूब) में RBCs गठबंधन ।
    2. कुल मात्रा ४४ मिलीलीटर तक पहुंच जाता है जब तक NaCl ०.९% जोड़ें । 6 मिलीलीटर dextran 6% (अंतिम) जोड़ें ।
    3. धीरे ट्यूब 10-20 बार पलटने से रक्त/dextran मिश्रण मिश्रण । के लिए ट्यूब तलछट चलो कम से कम 30 मिनट ।
    4. जबकि अवसादन हो रही है, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में प्लाज्मा के ५.८ मिलीलीटर Percoll समाधान के ४.२ मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा एक Percoll ढाल तैयार करते हैं, और ट्यूब औंधा द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
    5. pipetting लाल रक्त कोशिकाओं से बचने की कोशिश करते हुए dextran के शीर्ष अंश लीजिए ।
    6. पेंच टोपी कस, anoxic कक्ष से dextran ट्यूब हटाने के लिए, और ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए ३०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक ।
    7. ध्यान से ट्यूब वापस anoxic कक्ष में छर्रों कोशिकाओं परेशान बिना जगह है, और pipetting के माध्यम से तरल हटा दें ।
    8. धीरे फिर से प्लाज्मा के 1 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित और बहुत धीरे Percoll समाधान के शीर्ष पर जोड़ें । शीर्ष पर कोशिकाओं pipetting जब परतों के मिश्रण को प्रेरित करने के लिए नहीं सावधान रहना ।
    9. ध्यान से anoxic चैंबर से Percoll समाधान ट्यूब को दूर (मिश्रण से परहेज), और 20 मिनट के लिए ८०० x g पर ब्रेक के बिना केंद्रापसारक । परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) Percoll समाधान सतह पर रहेगा, और न्यूट्रोफिल RBCs के साथ गोली जाएगा ।
  3. दूषित RBCs को हटाया जाए
    1. वाशिंग बफर के 14 मिलीलीटर ७०० μL पंजाबियों + 10% BSA जोड़कर धोने बफर समाधान के 14 मिलीलीटर तैयार करें ।
    2. Percoll समाधान ट्यूब वापस anoxic कक्ष में रखें । Percoll और pipetting के माध्यम से PBMCs निकालें और फिर से 1 मिलीलीटर में वाशिंग बफर समाधान की छर्रों कोशिकाओं को निलंबित । गोली पुन: निलंबित किया जा करने के लिए RBCs दूषित होने के कारण एक लाल रंग होगा ।
    3. एंटी-CD235a (glycophorin) चुंबकीय मोती के २०० μL जोड़ें पुनः निलंबित कोशिकाओं, धीरे मिश्रण, और 15 मिनट की एक ंयूनतम के लिए मशीन । यह चरण चुंबकीय मोतियों के साथ प्रदूषित RBCs को लोड करता है ताकि इन्हें हटाया जा सके ।
    4. धोने बफर 3x के 2 मिलीलीटर के साथ जुदाई कॉलम धो लो ।
    5. जबकि जुदाई कॉलम के तहत एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब पकड़े, धीरे स्तंभ के शीर्ष करने के लिए न्युट्रोफिल/आरबीसी मिश्रण पिपेट । 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा के रूप में वे के माध्यम से प्रवाह । प्रवाह के माध्यम से बादल होना चाहिए और स्तंभ के लिए बाध्य शेष RBCs के कारण अपने लाल रंग खोना ।
    6. 2 मिलीलीटर धोने बफर के कॉलम के शीर्ष करने के लिए जोड़ें और एक ही 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में इकट्ठा । 2 मिलीलीटर धोने के अंत तक, प्रवाह के माध्यम से स्पष्ट होना चाहिए, वाचक है कि सभी न्यूट्रोफिल एकत्र किया गया है ।
    7. धीरे न्यूट्रोफिल के भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब मिश्रण और सेल गिनती के लिए 10 μL इकट्ठा । सेल गिनती प्रयोजनों के लिए अंतिम मात्रा नोट करें । किसी भी मानक कक्ष की गणना विधि के साथ कक्षों की कुल संख्या की गणना करना ।
    8. anoxic कक्ष से न्युट्रोफिल ट्यूब निकालें, और ३०० x g पर ब्रेक के साथ 20 मिनट के लिए न्यूट्रोफिल केंद्रापसारक ।
    9. anoxic कक्ष में तलछटी न्यूट्रोफिल वापस प्लेस और pipetting के माध्यम से धोने बफर हटा दें । फिर से 107 PMN/एमएल के एक अधिकतम सेल घनत्व के साथ प्लाज्मा में न्युट्रोफिल गोली सस्पेंड ।
  4. MUB४० का उपयोग कर शुद्ध न्यूट्रोफिल और विज़ुअलाइज़ेशन का गणन
    1. Rosewell पार्क मेमोरियल इंस्टिट्यूट (RPMI) १६४० मीडियम के phenol रेड के बिना 1 मिलीलीटर के आरआई-MUB४०-Cy5 (1mg/एमएल) के 1 μL जोड़ें । pipetting अच्छी तरह से मिक्स ।
    2. इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, परिणाम के रूप में यदि एक शक्तिशाली न्युट्रोफिल सक्रिय करने एजेंट, एन formylmethionyl-leucyl-फेनिलएलनिन (FMLP), जोड़ा गया है रेखांकित किया गया है । RPMI/आरआई-MUB४०-Cy5 ट्यूब और मिश्रण के माध्यम से pipetting ऊपर और नीचे करने के लिए FMLP की 1 माइक्रोन जोड़ें ।
      नोट: प्रत्येक प्रयोगात्मक प्रक्रिया को संबोधित किया जा रहा सवालों पर निर्भर करता है, आगे इस बिंदु से अलग हो जाएगा ।
    3. 1 मिलीलीटर RPMI/आरआई-MUB४०-Cy5/FMLP मिश्रण एक गिलास नीचे माइक्रोस्कोपी डिश के लिए स्थानांतरण । इस डिश के लिए, 106 कुल न्यूट्रोफिल के लिए इसी शुद्ध कोशिकाओं की एक मात्रा जोड़ें । मिक्स करके धीरे से pipetting.
    4. एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप में पकवान प्लेस और छवि अधिग्रहण शुरू करते हैं । उदाहरण के लिए, यह एक न्युट्रोफिल के अतिरिक्त करने से पहले आधारभूत छवियों को प्राप्त करने के लिए अनुशंसा की जाती है-सक्रिय रिएजेंट जैसे FMLP या बैक्टीरिया । इस उदाहरण में, RPMI/आरआई-MUB४०-Cy5/न्यूट्रोफिल का अधिग्रहण प्रारंभ करें, और बाद में timepoint पर पिपेट-सक्रिय करने वाले रिएजेंट को ग्लास डिश में और छवि प्राप्ति जारी रखें ।
      नोट: इन कदमों में संशोधन वैज्ञानिक जरूरतों के आधार पर किए जा सकते हैं ।
    5. प्रक्रिया प्राप्त छवियों/समय चूक फिल्मों के रूप में इस्तेमाल विशिष्ट माइक्रोस्कोप से संबंधित है ।

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Representative Results

MUB४०-histopathology स्लाइड से सना हुआ ऊतकों के परिणाम आम तौर पर व्यक्तिगत ऊतक भर में बिखरे हुए कोशिकाओं से पता चलता है । MUB४० दाग लैक्टोफेरिन, जो न्युट्रोफिल granules और compartmentalized में मौजूद है । इस प्रकार, आम तौर पर देखा कबरा धुंधला या संकेत के कई बड़े अलग क्षेत्रों से आ रहे है व्यक्तिगत न्यूट्रोफिल (चित्रा 1) । यह MUB४० संकेत के साथ दाग सेल को स्थानीयकृत करने में मदद करने के लिए DAPI जैसे एक दूसरे सेल मार्कर को जोड़ने के लिए मददगार है । पता लगाए गए कक्षों की कुल संख्या देखने के क्षेत्र में मौजूद न्यूट्रोफिल की संख्या पर निर्भर करता है और नाटकीय रूप से स्रोत और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शक्ति के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । यहां दिखाया गया है से प्रतिनिधि छवियों को शुद्ध फिक्स्ड मानव न्यूट्रोफिल (चित्रा 1ए) और एक अल्सरेटिव कोलाइटिस रोगी (चित्रा 1बी) के एक ऊतक बायोप्सी से । यह भी दिखाया छवियों Klebsiella निमोनिया से संक्रमित चूहों के फेफड़ों में न्यूट्रोफिल के एक अपेक्षाकृत निम्न स्तर से लिया जाता है (चित्रा 1सी) और एक गिनी पिग के बृहदांत्र में न्यूट्रोफिल के उच्च स्तर से संक्रमित शिगेला sonnei (चित्रा 1डी) ।

लाइव का उपयोग कर परिणाम, शुद्ध न्यूट्रोफिल आम तौर पर छोटे दिखाने के लिए-कोई सेल जल्दी समय अंक में धुंधला हो जाना, और धीरे से आरआई-MUB४० में वृद्धि के रूप में अधिक न्यूट्रोफिल सक्रिय हो जाते समय पर धुंधला । यहां दिखाया एक शुद्ध फ्लोरोसेंट एस sonnei (चित्रा 2) से संक्रमित मानव न्यूट्रोफिल का उपयोग प्रयोग से छवियों के एक समय पाठ्यक्रम श्रृंखला है । सक्रिय संकेत की ताकत पर निर्भर करता है, न्यूट्रोफिल MUB४० के साथ तेजी से धुंधला शुरू हो सकता है, तो यह उत्प्रेरक के अलावा करने से पहले छवियों को प्राप्त करने शुरू करने के लिए सिफारिश की है । जब कोशिकाओं को सक्रिय हो जाते है और री-MUB४० सकारात्मक, वे एक समान धुंधला प्रोफ़ाइल तय की है कि और permeabilized कोशिकाओं है, जो एक कबरा धुंधला देने का प्रदर्शन करना चाहिए । दोनों लाइव और फिक्स्ड सेल धुंधला के लिए MUB४० के इष्टतम एकाग्रता 1 μg/एमएल (चित्रा 3) है । कम सांद्रता (0.1-0.01 μg/एमएल) इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन कम संकेत तीव्रता में परिणाम । यह भी एक डिक छवि या अंय जीवित सेल दाग का उपयोग करने के लिए अंतर है जो कोशिकाओं को एक आरआई-MUB४० संकेत प्रदर्शित कर रहे है की सिफारिश की है ।

Figure 1
चित्रा 1 : MUB ४० -मानव, माउस, और गिनी पिग मूल के दाग न्यूट्रोफिल। (एक) प्रतिनिधि MUB४० धुंधला (हरा) न्यूट्रोफिल स्वस्थ मानव दाताओं से शुद्ध । सेल नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग रहे हैं । (ख) एक अल्सरेटिव कोलाइटिस बायोप्सी से ऊतक में मानव न्यूट्रोफिल के दाग । न्यूट्रोफिल MUB के साथ पता चला रहे हैं४० (हरा) और सेल नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग रहे हैं. (ग) Klebsiella निमोनियासे संक्रमित माउस के फेफड़ों से Histopathology । माउस न्यूट्रोफिल MUB४० (हरा) और कोशिका नाभिक का उपयोग ऊतक में पता चला रहे है DAPI (नीला) के साथ दाग रहे हैं । (घ) एक गिनी पिग के बृहदांत्र से Histopathology से संक्रमित शिगेला sonnei. संक्रमण के लिए प्रतिक्रिया न्यूट्रोफिल MUB४० (हरा) के साथ ऊतक में पता चला रहे हैं । एस sonnei बैक्टीरिया (लाल) फ्लोरोसेंट dsRED प्रोटीन व्यक्त करते हैं । सेल नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : MUB के साथ लाइव न्यूट्रोफिल दाग ४० केवल जब सक्रिय । एक समय चूक न्यूट्रोफिल शुद्ध मानव sonnei की उपस्थिति में एस के साथ संक्रमित-MUB४०शामिल श्रृंखला से चयनित छवियां । छवियों के पहले सेट में (ऊपर) एक न्युट्रोफिल मुठभेड़ों एक एस sonnei जीवाणु (लाल) एक हरे तीर के साथ दिखाया गया है । समय पाठ्यक्रम पर, जीवाणु न्युट्रोफिल द्वारा आंतरिक है और पचा । के रूप में न्युट्रोफिल बैक्टीरिया से सक्रिय हो जाता है, यह दाग उत्तरोत्तर री-MUB४०के साथ मजबूत । बाईं ओर छवियां फ्लोरोसेंट उद्योग के साथ मढ़ा चैनल छवियों हैं । सही पर छवियां केवल फ्लोरोसेंट चैनल हैं । 5-ंयूनतम अंतराल पर छवियां ली गईं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : विभिन्न MUB का प्रभाव ४० न्युट्रोफिल धुंधला पर सांद्रता । MUB४०-Cy5 के विभिंन सांद्रता के साथ फिक्स्ड/permeabilized न्यूट्रोफिल के प्रतिनिधि दाग । शुद्ध मानव न्यूट्रोफिल तय कर रहे थे और MUB४०-Cy5 के संकेत सांद्रता के साथ दाग । सेल नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां, दो परख वर्णित है जिसमें MUB४० पेप्टाइड न्युट्रोफिल सूजन और सक्रियण अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हम बताएंगे कि कैसे MUB४० histopathology वर्गों में मौजूद न्यूट्रोफिल प्रकट कर सकते हैं या उनके सक्रियण लाइव शुद्ध न्यूट्रोफिल का उपयोग कर राज्य दिखाएँ. एक धुंधला रिएजेंट के रूप में४० MUB का उपयोग कर के लिए महत्वपूर्ण कदम के रूप में किसी भी अंय फ्लोरोसेंट जांच विधि के साथ ही कर रहे हैं । देखभाल फ्लोरोसेंट संकेतों की अनुकूलता सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए और है कि पर्याप्त धुलाई कदम पृष्ठभूमि धुंधला हटाने के लिए लिया गया है । अच्छे धुंधला परिणाम प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण विचार माइक्रोस्कोप की गुणवत्ता, कांच स्लाइड/कवर स्लिप, और ऊतक वर्गों रहे हैं । जब देखते रहो शुद्ध न्यूट्रोफिल, सबसे महत्वपूर्ण कदम शुद्धि प्रक्रिया में ही हैं । न्यूट्रोफिल संवेदनशील होते हैं और विभिन्न संकेतों के एक नंबर से सक्रिय किया जा सकता है. आदेश में यह सुनिश्चित करें कि प्रयोग सार्थक परिणाम पैदा करता है, ध्यान शुद्ध न्यूट्रोफिल निष्क्रिय रखने के लिए जब तक वे इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है लिया जाना चाहिए । यह एक anoxic चैंबर में न्युट्रोफिल शोधन प्रोटोकॉल प्रदर्शन ऑक्सीजन के लिए न्युट्रोफिल जोखिम सीमा से प्राप्त किया जा सकता है ।

दोनों एक सीमा और MUB४०का लाभ, प्रयोगात्मक सवाल पर निर्भर करता है संबोधित किया जा रहा है, कि MUB४० केवल न्यूट्रोफिल सक्रिय दाग जब तक वे किसी भी तरह permeabilized हैं । यह एक बहुत बड़ा लाभ हो सकता है अगर प्रयोग एक जीवित पशु या शुद्ध सेल में सूजन के बाद के लिए कहते हैं, लेकिन यह एक नुकसान हो सकता है अगर प्रयोग सभी जीवित न्यूट्रोफिल का पता लगाने की आवश्यकता है सक्रियण राज्य की परवाह किए बिना । इस प्रोटोकॉल के लिए एक दूसरे संभावित सीमा तथ्य यह है कि लैक्टोफेरिन ऐसे आंसू, दूध, और बलगम के रूप में विभिंन शारीरिक स्राव में मौजूद है । histopathology धुंधला के लिए जिसमें इन स्रावों का रखरखाव किया जाता है (जैसे, कोलन बायोप्सी में जो बलगम की परत बरकरार है), MUB४० भी किसी भी वर्तमान न्यूट्रोफिल के साथ साथ बलगम की परत को दाग देगा. व्यवहार में, यह अभी तक हमारे विश्लेषण को प्रभावित किया है, लेकिन यह एक संभावित संकेत स्रोत के रूप में ध्यान दिया जाना चाहिए ।

वर्तमान में, MUB४० केवल न्युट्रोफिल है कि सक्रिय और गैर सक्रिय रहते न्यूट्रोफिल के बीच अंतर कर सकते है कि मार्कर है । इसके अलावा, MUB४०, एंटीबॉडी का पता लगाने के तरीकों के विपरीत, समारोह या इन विट्रो में या vivoमें न्यूट्रोफिल के अस्तित्व में परिवर्तन करने के लिए प्रकट नहीं होता है । उदाहरण के लिए, लाइव न्यूट्रोफिल के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी के अलावा एक सक्रिय न्युट्रोफिल समारोह या मेजबान में अस्तित्व को प्रभावित करने के संकेत हो सकता है । इस बनाता है MUB४० एक बहुत ही उपयोगी reagent में शामिल अनुसंधान के लिए एजेंट सक्रियण या इन विट्रो या vivo मेंरिलीज । इसके अतिरिक्त, MUB४० एक व्यापक मेजबान विशिष्टता रेंज है और सीधे विभिंन fluorophores के एक नंबर के लिए संयुग्मित जा सकता है, एकल में उपयोग के लिए अनुमति कदम कई मेजबान भर में परख धुंधला । इस प्रकार, MUB४० धुंधला माउस, मानव, और अंय स्तनधारी लक्ष्य के बीच तुलनीय है, और यह सरल और न्यूट्रोफिल का पता लगाने के लिए आवश्यक एजेंट की संख्या कम कर देता है ।

हालांकि इस प्रोटोकॉल histopathology और लाइव सेल MUB४०का उपयोग इमेजिंग पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित है, हम भी सफलतापूर्वक FACS छंटाई में पेप्टाइड का इस्तेमाल किया और vivo इमेजिंग में पशु रहते हैं । हमें आशा है कि MUB४० कई अलग न्यूट्रोफिल या शरीर में भड़काऊ घटनाओं के दृश्य का पता लगाने को शामिल परख के लिए उत्तरदायी होगा, और है कि भविष्य के अध्ययन और प्रोटोकॉल आगे MUB के स्पेक्ट्रम का लाभ उठाने के लिए विकसित किया जाएगा ४० का उपयोग करता है, विशेष रूप से गैर इनवेसिव इमेजिंग टेकनीक का उपयोग ।

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Disclosures

B.S.M. MUB४० पेटेंट पर एक आविष्कारक के रूप में सूचीबद्ध है:

MUB४०: यूरोपीय पेटेंट ep 11290403.2, 09/09/2011 ।

री-MUB४०: यूरोपीय पेटेंट EP no १७३०६७४६.३, 11/12/17 ।

Acknowledgments

इस काम के शौकीनों लौरेट Fugain (वामो-2015-15) (B.S.M.) और ANR JCJC पलाश (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MUB40-Cy5 Benoit Marteyn benoit.marteyn@pasteur.fr Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)
RI-MUB40-Cy5 Benoit Marteyn benoit.marteyn@pasteur.fr Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)
Parformaldehyde Sigma-Aldrich 16005 Fixative for histology
Sucrose Sigma-Aldrich S7903 Solution used to remove excess PFA
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) Sakura Finetek USA 4583 Used to freeze tissue before cryostat sectioning
2-Methylbutane Sigma-Aldrich M32631 Used to freeze tissue before cryostat sectioning
Ethanol Sigma-Aldrich 1.00974 Used for dry ice bath to freeze tissue
Leica Cryostat Leica Biosystems CM1520 Used to section tissues
Glass microscopy slides Fisher Scientific 12-518-101
Cover slips Thor Labs CG15CH Hi precision coverslip
Dako pen  Sigma-Aldrich Z377821 Used to prevent liquid loss during tissue staining
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Used to permeabilize cells for IF staining
DAPI Sigma-Aldrich 10236276001 Stains DNA 
Alexa fluor 488 Phalloidin  Fisher Scientific A12379 Binds actin
Prolong Gold antifade Mountant Fisher Scientific P36930 Prolongs IF signal and resistance to photobleaching
Fluorescent microscope Various Various Used to image IF slides
Anoxic Cabinet Various Various Used for the purification of live inactivated neutrophils
Sodium Chloride NaCL Sigma-Aldrich S7653
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Washing buffer component
MACS BSA buffer Miltenyi Biotec 130-091-376 Washing buffer component
Percoll Sigma-Aldrich P4937 Gradient for neutrophil purification
CD235a glycophorin magnetic microbeads Miltenyi Biotec 130-050-501 Used to remove contaminating RBCs
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Used in the removal of RBCs from neutrophils
RPMI-1640 without Phenol Red Sigma-Aldrich R8755 Used for neutrophil assays

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References

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बायोलॉजी इश्यू १४३ MUB४० पेप्टाइड रेट्रो-inverso न्युट्रोफिल सूजन स्मार्कर लैक्टोफेरिन वीवो में
MUB<sub>४०</sub> पेप्टाइड का पता लगाने में उपयोग के लिए न्युट्रोफिल-मध्यस्थता सूजन की घटनाओं
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Anderson, M. C., Injarabian, L., Andre, A., Tournebize, R., Marteyn, B. S. The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events. J. Vis. Exp. (143), e58367, doi:10.3791/58367 (2019).

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