El péptido de40 de MUB para uso en la detección de eventos de la inflamación mediada por neutrófilos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para detectar la presencia de neutrófilos en las secciones fijas/permeabilized histología y evaluar el estado de activación de los neutrófilos purificados vivo. En particular, el péptido de₄₀ MUB ATA lactoferrina presente en gránulos específicos de neutrófilos y terciarios. Exposición de los contenidos del gránulo a través de permeabilización o neutrófila activación permite el marcado de los neutrófilos.

Resumen

Presentamos un protocolo que implica el uso de MUB₄₀, un péptido sintetizado con la capacidad de enlazar glucosilada lactoferrina almacenado en altas concentraciones en específicos y terciarios los gránulos de los neutrófilos. Este detalles del protocolo MUB₄₀ conjugado directamente a un fluoróforo pueden utilizarse para teñir neutrófilos en tejidos fijados/permeabilized así como cómo esto puede ser usado en imágenes de células vivas al ensayo para la granulación y la activación de neutrófila. Métodos de detección de neutrófilos se limitan a anticuerpos monoclonales específicos para cada especie, que no siempre son convenientes para ciertas aplicaciones. MUB₄₀ no penetra la membrana celular y por lo tanto se excluye de lactoferrina en neutrófilos no-activado/no-permeabilized. MUB₄₀ tiene la ventaja de reconocer lactoferrina de un rango de hospederos amplio, lo que es especialmente útil para comparar resultados en estudios con múltiples modelos de investigación, reduciendo el número de duplicados y simplificando protocolos a través del solo paso de tinción.

Introducción

Neutrófilos son uno de los principales brazos del sistema inmune innato y son reclutados sistemáticamente a los sitios de inflamación alrededor del cuerpo. El estudio de los neutrófilos se ha deteriorado en gran parte por su corta vida útil en vitro (menos de 8 h) y herramientas de detección limitada bajo condiciones basales o luego de la activación. Aquí, presentamos un protocolo bien probado para la detección amplio y específico de los neutrófilos mamíferos en muestras fijas/permeabilized. También proporcionamos un protocolo detallado para la tinción energizados neutrófilos con MUB₄₀. Utilizando el protocolo de tinción neutrófilo vivo, el momento....

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido revisados y aprobadas por las organizaciones francesas CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) y CNIL (Comisión Nationale Informatique et Liberté).

1. neutrófilos en la histopatología del tejido con la coloración fluorescente etiquetado MUB₄₀

1. Para obtener el tejido para histopatología, fijar las secciones de biopsia de tejido en un volumen adecuado de paraformaldehído al 4% (PFA) durante 30 minutos hasta 4 h dependiendo del grosor de la muestra. Coloque las muestras en un refrigerador de 4 ° C durante la fijación.
   Nota: Métodos/tiempos de....

Resultados

Resultados de MUB₄₀-tejidos manchados de diapositivas de la histopatología normalmente revelan células individuales dispersadas por todo el tejido. MUB₄₀ manchas de lactoferrina, que está presente en los gránulos neutrófilos y compartimentado. Así, típicamente visto manchas punteadas o varias grandes áreas separadas de la señal viene de los neutrófilos (figura 1). Es útil añadir un segundo marcador de célula como DAPI para ayudar a local.......

Discusión

Aquí, se describen dos ensayos en que el péptido de₄₀ MUB se utiliza para estudiar la activación e inflamación neutrófila. Mostramos cómo puede revelar MUB₄₀ neutrófilos presentan en las secciones de la histopatología o mostrar su estado de activación utilizando neutrófilos purificados vivo. Los pasos críticos para el uso de MUB₄₀ como un reactivo de tinción son los mismos que con cualquier otro método de detección fluorescente. Debe tenerse cuidado para garantizar la compatibilidad de se.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Péptido fluorescente MUB40 (disponible con otros fluoróforos conjugados)
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Péptido MUB40 fluorescente retroinverso. Sintetizado con D-aminoácidos y resistente a las proteasas (disponible con otros fluoróforos conjugados)
Parformaldehído	Sigma-Aldrich	16005	Fijador para histología
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S7903	Solución utilizada para eliminar el exceso de PFA
Temperatura óptima de corte Compuesto (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	Se utiliza para congelar tejido antes del
2-metilbutano	Sigma-Aldrich	M32631	Se utiliza para congelar tejido antes del corte con criostato
	Etanol Sigma-Aldrich	1.00974	Se utiliza para baño de hielo seco para congelar tejidos
Criostato Leica	Leica Biosystems	CM1520	Se utiliza para seccionar tejidos
Portaobjetos de microscopía de vidrio	Fisher Scientific	12-518-101
Cubreobjetos	Thor Labs	CG15CH	Pluma
	Sigma-Aldrich	Z377821	Se utiliza para prevenir la pérdida de líquido durante la tinción de tejidos
Saponina	Sigma-Aldrich	47036	Se utiliza para permeabilizar células para la tinción de FI
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	Tinciones de ADN
Alexa fluor 488 Faloidina	Fisher Scientific	A12379	Se une a la actina
Prolong, Gold antidecoloración Mountant	Fisher Scientific	P36930	Prolonga la señal de FI y la resistencia al fotoblanqueo
Microscopio fluorescente	Varios	Varios	Se utiliza para obtener imágenes de portaobjetos de FI
Gabinete anóxico	Varios	Varios	Se utiliza para la purificación de neutrófilos vivos inactivados
Cloruro de sodio NaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Componente tampón de lavado
MACS BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	Componente tampón de lavado
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	Gradiente para purificación de neutrófilos
CD235a microperlas magnéticas de glicoforina	Miltenyi Biotec	130-050-501	Se utiliza para eliminar los glóbulos rojos contaminantes
Columnas LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	Se utiliza en la eliminación de glóbulos rojos de neutrófilos
RPMI-1640 sin rojo de fenol	Sigma-Aldrich	R8755	Se utiliza para ensayos de neutrófilos

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