Summary
Aquí, presentamos un protocolo para detectar la presencia de neutrófilos en las secciones fijas/permeabilized histología y evaluar el estado de activación de los neutrófilos purificados vivo. En particular, el péptido de40 MUB ATA lactoferrina presente en gránulos específicos de neutrófilos y terciarios. Exposición de los contenidos del gránulo a través de permeabilización o neutrófila activación permite el marcado de los neutrófilos.
Abstract
Presentamos un protocolo que implica el uso de MUB40, un péptido sintetizado con la capacidad de enlazar glucosilada lactoferrina almacenado en altas concentraciones en específicos y terciarios los gránulos de los neutrófilos. Este detalles del protocolo MUB40 conjugado directamente a un fluoróforo pueden utilizarse para teñir neutrófilos en tejidos fijados/permeabilized así como cómo esto puede ser usado en imágenes de células vivas al ensayo para la granulación y la activación de neutrófila. Métodos de detección de neutrófilos se limitan a anticuerpos monoclonales específicos para cada especie, que no siempre son convenientes para ciertas aplicaciones. MUB40 no penetra la membrana celular y por lo tanto se excluye de lactoferrina en neutrófilos no-activado/no-permeabilized. MUB40 tiene la ventaja de reconocer lactoferrina de un rango de hospederos amplio, lo que es especialmente útil para comparar resultados en estudios con múltiples modelos de investigación, reduciendo el número de duplicados y simplificando protocolos a través del solo paso de tinción.
Introduction
Neutrófilos son uno de los principales brazos del sistema inmune innato y son reclutados sistemáticamente a los sitios de inflamación alrededor del cuerpo. El estudio de los neutrófilos se ha deteriorado en gran parte por su corta vida útil en vitro (menos de 8 h) y herramientas de detección limitada bajo condiciones basales o luego de la activación. Aquí, presentamos un protocolo bien probado para la detección amplio y específico de los neutrófilos mamíferos en muestras fijas/permeabilized. También proporcionamos un protocolo detallado para la tinción energizados neutrófilos con MUB40. Utilizando el protocolo de tinción neutrófilo vivo, el momento y el lugar de la activación de neutrófila pueden ser identificados. Este protocolo es ideal para investigadores que deseen estudiar la liberación de activación o del gránulo neutrófilo. Más allá de sus funciones antimicrobianas, neutrófilos ahora son apreciados como inmunomoduladores de células implicadas en una amplia gama de enfermedades y la respuesta inmune (innata y adaptativa)1,2. Están presentes en los tejidos más inflamatorios, en un número elevado en los tejidos infectados, en tumores inflamatorios3, IBS y enfermedad de Crohn las llamas4y en áreas de inflamación no infecciosa como el synovia de la artritis reumatoide (neutrófilos Pacientes de RA)5. Neutrófilos contienen cuatro clases de gránulos preformados llamados azurófilos (α), específicos (β1), gránulos terciarios (β2) y vesículas secretoras (γ)6. Migración a un sitio inflamatoria, neutrófilos reclutados se activan y secuencialmente secretan gránulos contenidos (compuestos de adherencia, compuestos antimicrobianos y moléculas inmunomoduladoras), que promueve la contratación y contribuye a resolución (pero también al daño de tejido de host) de infección7. Neutrófilos se consideran un aspecto fundamental de la inmunidad innata, hasta la fecha hay son pocos reactivos de detección disponibles para estudiarlos, y aun menos que puede utilizarse para evaluar el estado de activación de los neutrófilos de vida.
Los métodos actuales de detección de neutrófilos dependen de anticuerpos monoclonales generados contra los antígenos expuestos superficie de la célula, como proteínas específicamente almacenadas en gránulos neutrófilos bajo condiciones basales (por ejemplo, mieloperoxidasa o Ly - 6 G2 lactoferrina). Ventajas de anticuerpos monoclonales incluyen su atascamiento fuerte sensibilidad y versatilidad en diferentes condiciones de ensayo. Sin embargo, hay varias desventajas al uso de anticuerpos monoclonales y anti-Ly - 6G en particular. Estas desventajas incluyen la especificidad, como Ly - 6G está presente en la mayoría de las células mieloides en médula ósea y sobre todo granulocitos incluyendo eosinófilos; por lo tanto, descifrar neutrófilos de eosinófilos con este marcador requiere complejos más se acerca a8. Otro intercambio frecuente con anticuerpos monoclonales es su anfitrión a menudo limitada especificidad, dificultando los estudios de comparación con más de una especie animal. Un tercer inconveniente de los métodos de detección de anticuerpos, especialmente cuando se utilizan células vivas o en vivo, es su potencial para alterar la función de la célula o llevar a la activación de la célula. Por ejemplo, la administración de anti-Ly - 6G a los ratones se aplica comúnmente a agotamiento del neutrófilo y neutropenia transitoria9. Además se ha demostrado que la inyección de anticuerpos puede estimular función antitumoral neutrófilos10. Finalmente, la detección de anticuerpo de neutrófilos no revela el estado de activación de la célula.
Hemos identificado un péptido de 40 aminoácidos llamado MUB40, que puede utilizarse en un número de ensayos para etiqueta de neutrófilos bajo condiciones en vitro o en vivo , así como analizar el estado de activación de neutrófilos en11. MUB40 se deriva de MUB7012, un dominio de la proteína de unión a moco superficial Lactobacillus reuteri , descrito originalmente por su capacidad para enlazar moco13,14. MUB40 interactúa con lactoferrina glucosilada que está presente en altas concentraciones en los gránulos específicos de neutrófilos y terciarios. MUB40 puede estar expuesto a estos gránulos a través de pasos de permeabilización estándar presentes en la histopatología o celular activado por fluorescencia clasificación protocolos (FACS) para tinción robusto de neutrófilos fijadas. Cuando neutrófilos vivo se mantienen en un estado inactivo, el péptido de40 MUB queda excluido de los contenidos del gránulo, y células no tiñen positivamente con el marcador. Después de la activación, MUB40 puede enlazar a la lactoferrina expuesta y conducir a coloración robusta con el péptido. Por ello, MUB40 puede utilizarse para determinar el estado de activación de los neutrófilos purificados, lo que es un marcador de atractivo a seguir el proceso infeccioso. La capacidad de enlazar a vivir neutrófilos activados también permite MUB40 para ser utilizado como una herramienta para detectar áreas de inflamación neutrófila en modelo animal vivo (por ejemplo, un ratón artritis modelo15). Los protocolos en este detalle del manuscrito como fluorescencia etiquetada MUB40 pueden utilizarse para revelar neutrófilos en histología tejidos y cómo analizar la activación de neutrófilos purificados vivo en vitro.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido revisados y aprobadas por las organizaciones francesas CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) y CNIL (Comisión Nationale Informatique et Liberté).
1. neutrófilos en la histopatología del tejido con la coloración fluorescente etiquetado MUB40
- Para obtener el tejido para histopatología, fijar las secciones de biopsia de tejido en un volumen adecuado de paraformaldehído al 4% (PFA) durante 30 minutos hasta 4 h dependiendo del grosor de la muestra. Coloque las muestras en un refrigerador de 4 ° C durante la fijación.
Nota: Métodos/tiempos de fijación alternativos pueden ser sustituidos en base a las necesidades del usuario único.- Quitar la PFA 16% solución de sucrosa con suficiente volumen para cubrir completamente la muestra y coloque la muestra a 4 ° C por 4 h hasta la noche.
- Retirar 16% sacarosa solución Agregar solución de sacarosa al 30% en un volumen lo suficientemente grande como para cubrir completamente la muestra y colocar a 4 ° C por 4 h hasta la noche.
- Retirar la solución de sacarosa de 30% y luego el exceso de tejido con una toalla de papel. La sección del tejido en medios de comunicación de corte óptima temperatura (OCT) y snap-congelación de 2-Metilbutano enfriado en un baño de hielo seco-etanol (-72 ° C). Una vez congelado sólido (después de 2 min), retire los bloques de 2-Metilbutano y en hielo seco hasta que todos los bloques están terminado y listo para almacenamiento a largo plazo. Almacenar los bloques congelados a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
- La noche antes de ser corte, retire del congelador de-80 ° C y colocarlos a-20 ° C durante la noche para equilibrar bloques de tejido.
- Con un criostato, cortar tejido encajado OCT 10 - 30 μm de espesor y absorber a las diapositivas de vidrio de alta calidad.
Nota: Pueden utilizarse rodajas más gruesas o más finas según los requerimientos experimentales. - Con un lápiz de cera u otro método hidrofóbico, dibujar un cuadro alrededor de la rodaja de tejido sobre el portaobjetos de vidrio y dejar secar.
- Prepare la solución de tinción mediante la realización de una dilución de 1:1,000 de MUB40-Cy5 (u otra versión fluorescente de40MUB, solución stock de 1 mg/mL) en solución al 0.1% saponina-PBS. La óptima concentración de40 de MUB final debe ser 1 μg/mL.
Nota: Se pueden utilizar concentraciones finales inferiores (0.1-0.01 μg/mL) pero puede llevar a bajar la intensidad de la señal.
PRECAUCIÓN: Polvo de saponina puede causar irritación respiratoria. Asegúrese de que a pesar de la saponina en un gabinete o protegidas. Pueden utilizarse métodos de permeabilización alternativos tales como Triton. Agregar marcadores adicionales en concentraciones recomendadas por el fabricante (e.g., 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, anticuerpos fluorescentes). - Sumergir suavemente el portaobjetos de cristal en una solución de saponina-PBS 0.1% tres veces.
- Cuidadosamente, Seque lejos exceso de líquido alrededor de la sección de tejido y añadir suficiente solución de tinción para cubrir completamente la sección del tejido. Colocar el portaobjetos en una cámara de humedad para evitar la evaporación e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Mantenerlo protegido de la luz.
- Sumergir suavemente el portaobjetos en solución de saponina-PBS 0.1% 3 x. Luego, suavemente sumergir el portaobjetos en solución de PBS 3 x. Finalmente, suavemente sumergir el portaobjetos en agua destilada H2O x 3. Cuidadosamente seque el exceso de líquido de la diapositiva.
- Agregue una pequeña cantidad (20 μL) de medio de montaje (20 mM Tris, pH 8.0, 0.5% N-propil galato, 90% glicerol) al lado de la rebanada de tejido y colocar suavemente un cubreobjetos de cristal sobre el portaobjetos de cristal. Uniformemente y suavemente presione el cubreobjetos sobre la sección del tejido y, usando una toalla de papel, retire con cuidado cualquier medio de montaje que saca alrededor de los bordes del cubreobjetos.
- Coloque el portaobjetos montado en un gabinete oscuro durante 24 horas permitir que los medios de montaje solidificar. Como alternativa, coloque el portaobjetos montado a 37 ° C durante 1 hora.
- Con un criostato, cortar tejido encajado OCT 10 - 30 μm de espesor y absorber a las diapositivas de vidrio de alta calidad.
- Imagen de las rebanadas de tejido en un microscopio de fluorescencia según el método de adquisición deseada.
2. visualización de la activación de neutrófila con Retro-Inverso-MUB40-Cy5 péptido
- Obtener los neutrófilos humanos con el siguiente protocolo. Preparar las siguientes soluciones y colocarlas en una gabinete anoxia durante la noche. Exposición al oxígeno empezará a activar neutrófilos e inducir aún más la célula muerte16,17.
Nota: Neutrófilos pueden ser alternativamente purificados "en el Banco" para MUB40-etiquetado experimentos; sin embargo, tenga en cuenta que la exposición al oxígeno comenzará a afectar Activación Neutrófila.- Prepare la siguiente solución:
Solución 1 [cloruro de sodio (NaCl) 0,9%]: Añadir 4,5 g de NaCl en 500 mL de H2O. filtro la solución.
Solución 2 (6% de dextrano): agregar 6 g de dextrán en solución de NaCl al 0.9% a 100 mL.
Solución 3 (tampón de lavado): disolver el ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en pH 7.2 del PBS a una concentración final de EDTA de 2 milímetros. Inmediatamente antes del uso, disolver albúmina de suero bovino (BSA) en solución de PBS/EDTA tal que la concentración final de BSA es 10% p/v. - Centrifugar sangre colección tubos a 650 x g por 20 min sin interrupciones.
- Sin interrumpir la sangre separado, transferir los tubos para recogida de sangre a una fracciones anóxica gabinete y recoge el plasma (parte superior) en un tubo cónico de 50 mL.
- Quitar el tubo que contiene el plasma del gabinete anóxico y centrifugar a 2.900 x g por 20 min con descansos para que sedimenten las plaquetas.
- Sin interrumpir las plaquetas concentradas, transferir suavemente el tubo de plasma hacia el gabinete anóxico y la pipeta el plasma pobre en plaquetas en un nuevo tubo 50 mL (en lo sucesivo llamado "plasma").
- Prepare la siguiente solución:
- Separación de los glóbulos rojos de los leucocitos
- Utilizando los tubos que contienen los glóbulos rojos (gr) en el paso 2.1.3., los hematíes se combinan en un tubo cónico de 50 mL (5 sangre colección tubos contenidos por el tubo de 50 mL).
- Añadir NaCl 0.9% hasta que el volumen total alcanza los 44 mL. Añadir 6 mL de dextrano 6% (último).
- Mezclar la mezcla de sangre/dextran suavemente invirtiendo el tubo 10 - 20 veces. Que el sedimento del tubo por lo menos 30 minutos.
- Mientras se produce la sedimentación, preparar un gradiente de Percoll agregando 4,2 mL de Percoll solución a 5,8 mL de plasma en un tubo cónico de 15 mL y mezclar bien por inversión del tubo.
- Recoger la fracción superior de la dextrano intentando evitar pipetas de glóbulos rojos.
- Apretar el tapón, quitar el tubo del dextrano de la cámara anóxica y centrifugar el tubo a 300 x g durante 10 min con descansos.
- Con cuidado coloque el tubo en la cámara anóxica sin molestar a las celdas de peletizado y extraer el líquido a través de pipeteo.
- Suavemente, vuelva a suspender el precipitado de células en 1 mL de plasma y agregue muy lentamente a la parte superior de la solución de Percoll. Tenga cuidado de no inducir la mezcla de las capas al pipetear las células en la parte superior.
- Retire con cuidado el tubo de solución de Percoll de cámara anóxica (evitando la mezcla) y centrifugar a 800 x g por 20 min sin interrupciones. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) permanecerá en la superficie de la solución de Percoll y neutrófilos a pellet con los hematíes.
- Eliminación de contaminación de los glóbulos rojos
- Preparar 14 mL de solución tampón de lavado al agregar 700 μL PBS + BSA de 10% a 14 mL de tampón de lavado.
- Coloque el tubo de solución de Percoll en la cámara anóxica. Retire el Percoll y PBMCs mediante pipeteo y resuspender las células concentradas en 1 mL de solución tampón de lavado. El sedimento se suspende de nuevo tendrá un color rojo debido a los glóbulos rojos contaminantes.
- Añadir 200 μL de bolas magnéticas anti-CD235a (glycophorin) a las células suspendidas de nuevo, mezclar suavemente e incubar durante un mínimo de 15 minutos. Este paso carga los hematíes contaminantes con bolas magnéticas que se pueden quitar.
- Tampón de lavado la columna de la separación con 2 mL de lavado 3 x.
- Sosteniendo un tubo cónico de 15 mL en la columna de separación, pipeta lentamente la mezcla de neutrófilos, GR en la parte superior de la columna. Fluyen a través de recoger las células en el tubo cónico de 15 mL. El paso debe ser nublado y pierden su color rojo debido a los hematíes queda enlazado a la columna.
- Añadir 2 mL de tampón a la parte superior de la columna de lavado y recoger en el mismo tubo cónico de 15 mL. Al final de la colada de 2 mL, el flujo a través deben ser claro, lo que significa que los neutrófilos han sido recogidos.
- Mezclar suavemente el tubo para asegurar incluso la distribución de los neutrófilos y recoger 10 μL para el recuento celular. Tenga en cuenta el volumen final de celda contando fines. Enumerar el número total de células con cualquier celular estándar método de conteo.
- Retire el tubo del neutrófilo de la cámara anóxica y centrifugar a 300 x g durante 20 min con descansos a los neutrófilos.
- Coloque neutrófilos sedimentados en la cámara anóxica y quitar el tampón de lavado mediante pipeteo. Resuspenda el sedimento neutrófilo en plasma con una densidad celular máxima de 107 PMN/mL.
- Recuento de neutrófilos purificados y visualización utilizando MUB40
- Añadir 1 μL de RI-MUB40-Cy5 (1 mg/mL) a 1 mL de medio de Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sin rojo de fenol. Mezclar mediante pipeteo bien.
- Para los efectos del presente Protocolo, el resultado ha sido delineado como si un potente neutrófilo activación reactivo, N-formilmetionil-leucina-fenilalanina (FMLP), se añade. Añadir 1 μm de FMLP RPMI/RI-MUB40-Cy5 tubo y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
Nota: Cada procedimiento experimental será diferente de aquí en adelante, dependiendo de las preguntas que se están abordadas. - Transfiera el 1 mL RPMI/RI-MUB40-Cy5/FMLP mezcla a un plato de microscopia de fondo de cristal. A este plato, agregar un volumen de células purificadas correspondientes a 106 total neutrófilos. Mezclar mediante pipeteo suave.
- Coloque el plato en un microscopio fluorescente invertido y comenzar la adquisición de la imagen. Por ejemplo, se recomienda adquirir imágenes de línea de base antes de la adición de un reactivo activador de neutrófilo FMLP como bacterias. En este ejemplo, iniciar la adquisición de RPMI/RI-MUB40-Cy5/neutrófilos y en un punto posterior, pipetear el reactivo activador de neutrófilo en el plato de vidrio y continuar la adquisición de la imagen.
Nota: Modificaciones en estos pasos pueden hacer basados en las necesidades científicas. - Proceso adquirido películas imágenes/time-lapse como pertenece al microscopio específico utilizado.
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Representative Results
Resultados de MUB40-tejidos manchados de diapositivas de la histopatología normalmente revelan células individuales dispersadas por todo el tejido. MUB40 manchas de lactoferrina, que está presente en los gránulos neutrófilos y compartimentado. Así, típicamente visto manchas punteadas o varias grandes áreas separadas de la señal viene de los neutrófilos (figura 1). Es útil añadir un segundo marcador de célula como DAPI para ayudar a localizar Co la señal de40 MUB con la célula teñida. El número total de células detectados depende del número de neutrófilos presentes en el campo de visión y puede variar dramáticamente dependiendo de la fuente y la fuerza de la respuesta inmune. Aquí muestran imágenes representativas de los neutrófilos humanos fijados purificados (figura 1A) y de una biopsia de tejido de un paciente de colitis ulcerosa (figura 1B). También muestra imágenes proceden de un nivel relativamente bajo de neutrófilos en los pulmones de ratones infectados con Klebsiella pneumoniae (figura 1C) y un alto nivel de neutrófilos en el colon de un cerdo de guinea infectados con Shigella sonnei (Figura 1D).
Resultados utilizando neutrófilos vivo, purificadas por lo general muestran poco no célula tinción en primeros puntos del tiempo y gradualmente en RI-MUB40 con el tiempo de tinción como se activan más neutrófilos. Se muestra a continuación es una serie de cursos de tiempo de imágenes de un experimento usando purificados neutrófilos humanos infectados con fluorescente S. sonnei (figura 2). Dependiendo de la intensidad de la señal de activación, neutrófilos pueden comenzar la coloración con MUB40 rápidamente, por lo que se recomienda iniciar la adquisición de imágenes antes de la adición de activadores. Cuando las células se activan y RI-MUB40 positivo, exhiben un perfil de tinción similar a la de las células fijas y permeabilized, que dan una coloración punteada. La concentración óptima de MUB40 para ambos tinción celular vivo y fijo es 1 μg/mL (figura 3). Concentraciones más bajas (0.1-0.01 μg/mL) puede ser utilizado sino en menor intensidad de señal. También se recomienda usar una imagen DIC u otras manchas de células vivas para distinguir que las células muestran una señal de40 RI-MUB.
Figura 1 : MUB 40 -teñido neutrófilos de humano, ratón y conejillo de Indias origen. (A) representante MUB40 coloración (verde) de los neutrófilos purificados de donantes humanos sanos. Núcleos celulares son teñidos con DAPI (azul). (B) tinción de neutrófilos humanos en el tejido de una biopsia de la colitis ulcerosa. Neutrófilos se revelaron con MUB40 (verde) y núcleos celulares son teñidos con DAPI (azul). (C) histopatología del pulmón de un ratón infectado por Klebsiella pneumoniae. Neutrófilos de ratón se revelan en el tejido con MUB40 (verde) y núcleos celulares son teñidos con DAPI (azul). (D) la histopatología de los dos puntos de un cerdo de guinea infectado con Shigella sonnei. Neutrófilos en respuesta a la infección se revelan en el tejido con MUB40 (verde). S. sonnei bacterias (rojo) expresan la proteína fluorescente dsRED. Núcleos celulares son teñidos con DAPI (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Energizados neutrófilos se tiñen con MUB 40 sólo cuando activa. Seleccionar imágenes de una serie de lapso de tiempo que implica purificados neutrófilos humanos infectados por S. sonnei en presencia de RI-MUB40. En el primer conjunto de imágenes (arriba) un recuento de neutrófilos encuentra una bacteria de S. sonnei (rojo) se muestra con una flecha verde. En el transcurso del tiempo, la bacteria es internalizada por los neutrófilos y digerida. Como se activación los neutrófilos de las bacterias, manchas progresivamente más fuerte con MUB RI40. Imágenes de la izquierda son canales fluorescentes superpuestos con imágenes DIC. Imágenes de la derecha son sólo canales fluorescentes. Imágenes fueron tomadas a intervalos de 5 minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Efecto de diferentes MUB 40 concentraciones en la coloración neutrófilo. Manchas representativas de neutrófilos fijo/permeabilized con diferentes concentraciones de MUB40-Cy5. Neutrófilos humanos purificados fueron fijo y manchados con las concentraciones indicadas de MUB40-Cy5. Núcleos celulares son teñidos con DAPI (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, se describen dos ensayos en que el péptido de40 MUB se utiliza para estudiar la activación e inflamación neutrófila. Mostramos cómo puede revelar MUB40 neutrófilos presentan en las secciones de la histopatología o mostrar su estado de activación utilizando neutrófilos purificados vivo. Los pasos críticos para el uso de MUB40 como un reactivo de tinción son los mismos que con cualquier otro método de detección fluorescente. Debe tenerse cuidado para garantizar la compatibilidad de señales fluorescentes y que pasos de lavado adecuadas se han tomado para quitar tinción de fondo. Las consideraciones más importantes para lograr buenos resultados de tinción son la calidad del microscopio, se desliza portaobjetos/cubierta de vidrio y las secciones de tejido. Al ver vivo neutrófilos purificados, son los pasos más importantes en el proceso de purificación. Neutrófilos son sensibles y pueden ser activados por un número de señales diferentes. Para asegurarse de que la experimento produce resultados significativos, se debe tener cuidado para mantener inactivos los neutrófilos purificados hasta que estén listos para ser usados. Esto puede lograrse realizando el protocolo de purificación neutrófilos en una cámara anóxica a limitar neutrófila exposición al oxígeno.
Una limitación y ventaja de MUB40, dependiendo de la pregunta experimental se aborda, es que MUB40 manchas solamente activación neutrófilos a menos que de alguna manera son permeabilized. Esto puede ser una gran ventaja si el experimento requiere siguiente inflamación de una animal vivo o purificada, pero puede ser una desventaja si el experimento requiere detección de neutrófilos energizados todas sin importar el estado de activación. Una segunda limitación potencial de este protocolo es el hecho de que la lactoferrina está presente en varias secreciones corporales como lágrimas, leche y moco. Para histopatología coloración en la que estas secreciones se mantienen (por ejemplo, biopsias colónica en la cual la capa de moco está intacta), MUB40 también se mancha la capa de moco junto con cualquier neutrófilos presentes. En la práctica, esto aún tiene que afectar a nuestro análisis, pero cabe señalar como una potencial fuente de señal.
En la actualidad, MUB40 es el biomarcador sólo neutrófilo que puede distinguir entre activados y desactivado energizados neutrófilos. También, MUB40, a diferencia de los métodos de detección de anticuerpos, no parece alterar la función o la supervivencia de los neutrófilos in vitro o en vivo. Por ejemplo, adición de anticuerpos específicos contra neutrófilos vivo puede ser una señal de activación que afectan a la función del neutrófilo o la supervivencia en el hospedador. Esto hace que MUB40 un reactivo muy útil para la investigación de neutrófilo activación o gránulo de liberación in vitro o en vivo. Además, MUB40 tiene una amplia gama de especificidad y pueden ser conjugados directamente a un número de fluoróforos diferentes, permitiendo para el uso en ensayos de tinción solo paso a través de múltiples hosts. Así, MUB40 tinción es comparable entre ratón, humano, y otras metas de mamíferos y simplifica y reduce el número de reactivos necesarios para detectar neutrófilos.
Este protocolo se centra específicamente en la histopatología y la proyección de imagen de células vivas usando MUB40, ha utilizado también con éxito el péptido en FACS clasificación y vive animales en vivo la proyección de imagen. Anticipamos que MUB40 serán susceptibles a muchos diferentes ensayos que implican la detección de los neutrófilos o visualización de eventos inflamatorios en el cuerpo, y que protocolos y estudios futuros se desarrollará para aprovechar más el espectro de MUB 40 usos, especialmente utilizando técnicas de imagen no invasivas.
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Disclosures
B.S.M. figura como inventor en MUB40 patentes:
MUB40: EP11290403.2 patente Europea, 09/09/2011.
RI-MUB40: EP patente Europea Nº 17306746.3, 12/11/17.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Fundación Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) y convocatoria de ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
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