Summary
Hier presenteren we een protocol voor het detecteren van de aanwezigheid van neutrofielen in secties van de histologie vaste/permeabel en beoordelen van de activeringsstatus van levende gezuiverde neutrofielen. In het bijzonder de MUB40 peptide gebonden Lactoferrine in submodules neutrofiele-specifieke en tertiaire aanwezig. Blootstelling van de submodule inhoud via permeabilization of neutrofiele activering zorgt voor de markering van de neutrofielen.
Abstract
Wij bieden hier een protocol met betrekking tot het gebruik van MUB40, een gesynthetiseerde peptide met de mogelijkheid om het binden van geglycosyleerde lactoferrine opgeslagen in hoge concentraties in specifieke en tertiaire korrels van neutrofiele granulocyten. De gegevens van dit protocol hoe MUB40 geconjugeerd rechtstreeks met een fluorophore kunnen worden gebruikt om vlek neutrofielen in vaste/permeabel weefsels zo goed hoe dit kan worden gebruikt in het leven-cel imaging om assay voor neutrofiele activering en ambtshalve korreling. Neutrofiele detectiemethoden zijn beperkt tot soortspecifieke monoclonal antilichamen, die niet altijd geschikt voor bepaalde toepassingen zijn. MUB40 doet niet doordringen in het celmembraan en is dus uitgesloten van lactoferrine opgeslagen in niet-geactiveerd/niet-permeabel neutrofiele granulocyten. MUB40 heeft het extra voordeel van de erkenning van lactoferrine uit een brede gastheer, waardoor het vooral handig voor het vergelijken van resultaten in studies meerdere onderzoeksmodellen, waarbij het aantal dubbele reagentia te verminderen, en vereenvoudiging van de protocollen via-voor-stapmodus kleuring.
Introduction
Neutrofielen zijn een van de belangrijkste takken van het aangeboren immuunsysteem en routinematig worden gerekruteerd voor de sites van ontsteking rond het lichaam. De studie van neutrofielen heeft geschaad grotendeels door hun korte levensduur in vitro (minder dan 8 h) en beperkte detectieprogramma's onder basale omstandigheden of na activering. Hier presenteren we een uitgebreid geteste protocol voor de brede en specifieke detectie van zoogdieren neutrofielen in vaste/permeabel monsters. We bieden ook een gedetailleerd protocol voor live neutrofiele granulocyten met MUB40kleuring. Met behulp van de live neutrofiele kleuring protocol, kunnen het tijdstip en de locatie van neutrofiele activering worden gelokaliseerd. Dit protocol is ideaal voor onderzoekers die willen studeren neutrofiele activering of submodule release. Buiten hun antimicrobiële functies, worden neutrofielen nu gewaardeerd als immunomodulerende cellen betrokken bij een breed scala van ziekten en immuunrespons (aangeboren en adaptief)1,2. Neutrofielen zijn aanwezig in de meest opruiende weefsels, op hoge aantallen in geïnfecteerde weefsels, inflammatoire tumoren3, tijdens IBS en ziekte van Crohn flare-ups4, en op gebied van niet-infectieuze ontstekingen zoals de synovia van reumatoïde artritis ( RA) patiënten5. Neutrofielen bevatten vier klassen van pre-gevormde korrels genaamd azurophil (α), specifieke (β1), tertiaire (β2) korrels en secretoire blaasjes (γ)6. Na de migratie naar een inflammatoire site, aangeworven neutrofielen worden geactiveerd en opeenvolgend afscheiden submodule inhoud (samengesteld uit hechting, antimicrobiële verbindingen en immunomodulerende moleculen), die bevordert verder werving en draagt bij aan infectie resolutie (maar ook voor host weefselschade)7. Terwijl neutrofielen worden beschouwd als een kritiek aspect van aangeboren immuniteit, tot op heden er zijn paar detectie reagentia beschikbaar voor deze bestuderen, en nog minder dat kan worden gebruikt voor het beoordelen van de activeringsstatus van levende neutrofiele granulocyten.
Huidige methoden voor het opsporen van neutrofielen afhankelijk van monoklonale antilichamen tegen celoppervlak blootgestelde antigenen, zoals Ly - 6 G2 of eiwitten specifiek opgeslagen in neutrofiele korrels onder basale omstandigheden (bijvoorbeeld myeloperoxidase gegenereerd Lactoferrine). Voordelen van monoclonal antilichamen zijn hun sterke bindende, gevoeligheid en veelzijdigheid onder verschillende omstandigheden van de test. Er zijn echter ook verschillende nadelen aan het gebruik van monoklonale antilichamen en anti-Ly - 6G in het bijzonder. Deze nadelen zijn de specificiteit, zoals Ly - 6G is aanwezig op een meerderheid van myeloïde cellen in het beenmerg en op alle granulocyten met inbegrip van de eosinofielen; zo, neutrofielen van eosinofielen ontcijferen met deze markering vereist meer complexen benaderingen8. Een andere frequente afweging met monoklonale antilichamen is hun vaak beperkte host gastheerspecificiteit, waardoor vergelijking studies met meer dan één diersoort omvat moeilijk. Een derde nadeel van antilichaam detectiemethoden, vooral bij het gebruik van levende cellen of in vivo, is hun potentieel voor het verstoren van de functie cel of leiden tot cel activatie. Bijvoorbeeld, is de administratie van anti-Ly - 6G te muizen vaak toegepast op neutrofiele uitputting en voorbijgaande neutropenie9. Bovendien is gebleken dat antilichaam injectie neutrofiele antitumorale functie10kan stimuleren. Tot slot, de opsporing van antilichamen van neutrofielen niet onthullen de activeringsstatus van de cel.
We hebben een 40-amino acid peptide genaamd MUB40, die kan worden gebruikt in een aantal testen om label neutrofielen in vitro of in vivo voorwaarden evenals de activeringsstatus van levende neutrofielen11assay aangemerkt. MUB40 is afgeleid van de MUB7012, een domein van de Lactobacillus reuteri oppervlakte slijm-bindend-proteïne oorspronkelijk beschreven voor haar vermogen om te binden slijm13,14. MUB40 interageert met geglycosyleerde lactoferrine die aanwezig is bij hoge concentraties in neutrofiele-specifieke en tertiaire korrels. MUB40 kunt worden blootgesteld aan deze submodules standaard permeabilization stapsgewijs aanwezig in histopathologie of fluorescentie-activated cell sorting (FACS) protocollen voor robuuste kleuring van vaste neutrofiele granulocyten. Wanneer live neutrofielen in een geïnactiveerd staat worden gehouden, de MUB40 peptide is uitgesloten van de inhoud van de submodule en cellen doen geen positieve vlekken met de markering. Na activatie, kan MUB40 binden aan blootgestelde lactoferrine en leiden tot robuuste kleuring met de peptide. Dus, MUB-40 mag worden gebruikt om de activeringsstatus van gezuiverde neutrofiele granulocyten, waardoor het een aantrekkelijke marker om de besmettelijke proces te volgen. Het vermogen om te binden aan het leven van geactiveerde neutrofiele granulocyten kan ook MUB40 worden gebruikt als een instrument om te controleren op gebieden van neutrofiele ontsteking in levende dierlijke modellen (bijvoorbeeld een muis artritis model15). De protocollen in dit manuscript detail hoe fluorescently label MUB40 kunnen worden gebruikt om te onthullen van de neutrofielen in histologie weefsels en hoe de activering van levende gezuiverde neutrofielen in vitroassay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn herzien en goedgekeurd door de Franse organisaties CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) en CNIL (Commissie Nationale Informatique et Liberté).
1. vlekken neutrofielen in histopathologie weefsel met Fluorescently geëtiketteerd MUB40
- Voor het verkrijgen van het weefsel voor histopathologisch onderzoek, vast weefsel/biopsie secties in een geschikt volume van 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 minuten tot 4 uur afhankelijk van de dikte van het monster. Leg de monsters in een koelkast 4 ° C tijdens fixatie.
Opmerking: Alternatieve fixatie methoden/tijdsinstellingen kan worden vervangen op basis van de unieke behoeften van de gebruiker.- De PFA verwijderen, toevoegen van 16% sacharoseoplossing met genoeg volume ter helemaal dekking van het monster en leg het monster bij 4 ° C gedurende 4 h tot overnachting.
- 16% sacharoseoplossing verwijderen en toevoegen van 30% sacharoseoplossing op een groot genoeg volume ter helemaal dekking van het monster, en plaats deze bij 4 ° C gedurende 4 h tot overnachting.
- Verwijder de 30% sacharoseoplossing en vlek uit overtollige oplossing van het weefsel met een papieren handdoek. Plaats de weefselsectie in optimale scherpe temperatuur (OCT) media en module-freeze in 2-methylbutane gekoeld in een bad van droogijs-ethanol (-72 ° C). Zodra bevroren solide (na ~ 2 min), Verwijder blokken van de 2-methylbutane en leg ze op droog ijs totdat alle blokken afgewerkt en klaar voor langdurige opslag zijn. Winkel de bevroren blokken bij-80 ° C voor langdurige opslag.
- De nacht voordat weefsel blokken zijn om te worden gesneden, verwijder ze uit de diepvries-80 ° C en plaats ze bij-20 ° C's nachts tot equilibreer.
- Met behulp van een cryostaat, OCT-embedded weefsel in 10 - tot 30 μm-dikke plakjes gesneden en adsorberen aan kwalitatief hoogwaardige glazen dia's.
Opmerking: Afhankelijk van de experimentele vereisten kunnen dikker of dunner segmenten worden gebruikt. - Met een wax pen of andere hydrofobe methode, tekent u een vak rond het weefsel segment op het glasplaatje en laten drogen.
- Bereiden de kleurstofoplossing door het uitvoeren van een verdunning 1:1,000 MUB40-Cy5 (of andere tl MUB-versie40, 1 mg/mL stockoplossing) in 0,1% saponine-PBS oplossing. De optimale eindconcentratie voor MUB40 moet 1 μg/mL.
Opmerking: Lagere eindconcentraties mogen worden gebruikt (0.1-0,01 μg/mL) maar kan leiden tot lagere signaal intensiteit.
Let op: Saponine poeder kan irritatie van ademhaling. Zorg ervoor dat wegen saponine in een kast of beschermde gebied. Alternatieve permeabilization methoden kunnen worden gebruikt zoals Triton. Extra markeertekens toevoegen bij fabrikant-recommended concentraties (bv., 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, fluorescerende antilichamen). - Voorzichtig Dompel het glasplaatje in een oplossing van 0,1% saponine-PBS driemaal.
- Zorgvuldig blot weg overtollige vocht rond de weefselsectie en genoeg kleurstofoplossing om het volledig bedekt de weefselsectie toevoegen. Plaats de dia in een kamer vochtigheid te voorkomen van verdamping en het Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Houd het beschermd tegen licht.
- Voorzichtig Dompel de dia in 0,1% saponine-PBS oplossing 3 x. Vervolgens voorzichtig Dompel de dia in PBS oplossing 3 x. Ten slotte, voorzichtig Dompel de dia in gedestilleerd H2O 3 x. Zorgvuldig droog overtollige vloeistof uit de dia.
- Voeg een kleine hoeveelheid (~ 20 μL) van montage medium (20 mM Tris pH 8.0, 0,5% N-propyl gallaat, 90% glycerol) naast het weefsel segment en voorzichtig vast een glas dekglaasje aan bovenop het glasplaatje. Zacht en gelijkmatig druk op het dekglaasje aan op de weefselsectie en, met behulp van een papieren handdoek, verwijder voorzichtig alle montage-media die gesteenten langs de randen van het dekglaasje aan.
- Plaats de gekoppelde dia in een donkere kast gedurende 24 uur om de media van de montage te stollen. Als alternatief, plaatst u de gekoppelde dia bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Met behulp van een cryostaat, OCT-embedded weefsel in 10 - tot 30 μm-dikke plakjes gesneden en adsorberen aan kwalitatief hoogwaardige glazen dia's.
- Het imago van de plakjes weefsel op een fluorescente microscoop volgens de gewenste overname-methode.
2. visualisatie van neutrofiele activering met Retro-Inverso-MUB40-Cy5 Peptide
- Het verkrijgen van menselijke neutrofiele granulocyten met behulp van de onderstaande voorschriften. Voorbereiding van de volgende oplossingen en plaats ze in een zuurstofvrije kabinet overnachting. Blootstelling aan zuurstof zullen beginnen te activeren van neutrofielen en verdere induceren16,17van de dood van de cel.
Opmerking: Neutrofiele granulocyten kunnen ook gezuiverd worden "op de Bank" voor MUB40-labeling experimenten; echter, Let erop dat zuurstof blootstelling beginnen zal te beïnvloeden neutrofiele activering.- Bereid de volgende oplossing:
Oplossing 1 [natriumchloride (NaCl) 0.9%]: Meng 4.5 g NaCl 500 mL H2O. Filter de oplossing.
Oplossing 2 (dextran 6%): 6 g dextran in NaCl 0,9% oplossing toevoegen aan 100 mL.
Oplossing 3 (wassen buffer): Los ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in PBS pH 7,2 tot een uiteindelijke concentratie van het EDTA van 2 mM. Onmiddellijk vóór gebruik, ontbinden bovien serumalbumine (BSA) in PBS/EDTA-oplossing zodanig zijn dat de uiteindelijke concentratie van de BSA 10% w/v. - Centrifugeren van bloed collectie buizen bij 650 x g gedurende 20 min zonder pauzes.
- Zonder te onderbreken gescheiden bloed, door het bloed collectie buizen te overbrengen in een zuurstofvrije kabinet en verzamelen plasma breuken (boven) in een conische tube van 50 mL.
- Verwijder de plasma-bevattende buis uit de zuurstofvrije kabinet en centrifugeer bij 2900 x g gedurende 20 min met pauzes aan de bloedplaatjes pellet.
- Zonder de Ingehuld bloedplaatjes verstoren, transfer zachtjes de plasma buis terug in de zuurstofvrije kabinet en Pipetteer de bloedplaatjes arme plasma in een tube van de verse 50 mL (hierna genoemd "plasma").
- Bereid de volgende oplossing:
- Scheiding van de rode bloedcellen van leukocyten
- Met behulp van de buizen met de rode bloedcellen (RBC) uit stap 2.1.3., combineren de RBC in een conische 50 mL-buis (5 bloed collectie buis inhoud per tube 50 mL).
- Voeg NaCl 0,9% totdat het totale volume 44 mL bereikt. Voeg 6 mL dextran 6% (laatste).
- Meng het mengsel bloed/dextran zachtjes door het omkeren van de buis 10 - 20 keer. Laat het sediment buis voor minstens 30 min.
- Terwijl de sedimentatie plaatsvindt, bereiden een Percoll verloop door toevoeging van 4.2 mL van Percoll oplossing aan 5,8 mL plasma in een conische tube van 15 mL en meng goed door het omkeren van de buis.
- Het bovenste deel van de dextran verzamelen terwijl het proberen om te voorkomen dat pipetting rode bloedcellen.
- Draai de schroefdop, verwijderen de dextran buis uit de zuurstofvrije zaal en centrifugeer de buis bij 300 x g gedurende 10 minuten met pauzes.
- Zorgvuldig plaats de buis terug in de zuurstofvrije kamer zonder verstoring van de Ingehuld cellen, en verwijder de vloeistof via pipetteren.
- Zachtjes resuspendeer de cel pellet in 1 mL plasma en voeg heel langzaam naar de top van de Percoll oplossing. Wees voorzichtig niet voor het opwekken van de vermenging van de lagen wanneer pipetteren de cellen op de top.
- Verwijder voorzichtig de Percoll oplossing buis uit de zuurstofvrije kamer (het vermijden van mengen) en centrifugeer bij 800 x g gedurende 20 min zonder pauzes. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) zal blijven op het oppervlak van de oplossing Percoll en neutrofielen zal pellet met de RBC.
- Verwijdering van verontreiniging van RBC
- Bereiden van 14 mL bufferoplossing te wassen door toevoeging van 700 μL PBS + 10% BSA tot 14 mL buffer te wassen.
- Plaats de buis van de oplossing Percoll terug in de zuurstofvrije kamer. Verwijder de Percoll en de PBMCs via pipetteren en resuspendeer de Ingehuld cellen in 1 mL bufferoplossing te wassen. De pellet opnieuw geschorst worden zal een rode kleur als gevolg van contaminerende RBC hebben.
- 200 μL van anti-CD235a (glycophorin) magnetische kralen aan het opnieuw gesuspendeerde cellen toevoegen, voorzichtig mengen en incubeer gedurende een minimum van 15 min. Deze stap laadt de besmettende RBC met magnetische kralen zodat ze kunnen worden verwijderd.
- Wash de scheiding kolom met 2 mL wassen buffer 3 x.
- Houd een conische tube van 15 mL onder de kolom scheiding en Pipetteer langzaam de neutrofiele/RBC mengsel naar de top van de kolom. De cellen in de conische tube van 15 mL verzamelen als ze doorstromen. De doorstroming moet bewolkt en verliezen de rode kleur als gevolg van de RBC resterende gebonden aan de kolom.
- Voeg toe 2 mL buffer naar de top van de kolom te wassen en verzamelen in de dezelfde conische tube van 15 mL. Tegen het einde van the wash van 2 mL moet de doorstroming duidelijk zijn, wat betekent dat alle de neutrofielen zijn verzameld.
- Meng voorzichtig de buis om te zorgen voor gelijkmatige verdeling van neutrofielen en verzamelen van 10 μL voor het tellen van de cel. Opmerking het eindvolume voor cel tellen van doeleinden. Het totale aantal cellen met een standaard cel tellen methode opsommen
- Verwijder de neutrofiele buis uit de zuurstofvrije kamer en centrifugeer de neutrofielen bij 300 x g gedurende 20 min met pauzes.
- Gesedimenteerd neutrofielen terug in de zuurstofvrije kamer plaatsen en verwijderen van de buffer wassen via pipetteren. Resuspendeer de pellet neutrofiele in plasma met een maximale celdichtheid van 107 PMN/mL.
- Opsomming van gezuiverde neutrofielen en visualisatie met MUB40
- Voeg 1 μl van RI-MUB40-Cy5 (1 mg/mL) tot 1 mL van Rosewell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium zonder fenol rood. Meng door pipetteren goed.
- Voor de toepassing van dit protocol, is het resultaat beschreven als een krachtige neutrofiele activeren reagens, N-formylmethionyl-leucyl-fenylalanine (FMLP), is toegevoegd. Voeg 1 μm van FMLP aan de RPMI/RI-MUB40-Cy5 buis en mengeling via pipetteren op en neer.
Opmerking: Elke experimentele procedure zullen afwijken van dit punt naar voren, afhankelijk van de vragen. - Breng de 1 mL RPMI/RI-MUB40-Cy5/FMLP mengsel een glazen bodem microscopie schotel. Toevoegen aan dit gerecht, een volume van gezuiverde cellen overeenkomt met 106 totaal neutrofiele granulocyten. Meng door zachtjes pipetteren.
- Zet de schotel in een omgekeerde fluorescente microscoop en beeldacquisitie beginnen. Bijvoorbeeld, is het aanbevolen om het verwerven van basislijn beelden voordat het prestatiemeteritembestand van een reagens neutrofiele-activeren zoals FMLP of bacteriën. In dit voorbeeld start de overname van RPMI/RI-MUB40-Cy5/neutrofielen, en op een later timepoint, Pipetteer het reagens neutrofiele-activeren in de glazen schotel en beeldacquisitie blijven.
Opmerking: Wijzigingen in deze stappen kunnen worden gemaakt op basis van wetenschappelijke behoeften. - Proces verkregen beelden/one-time-lapse films zoals heeft betrekking op de specifieke Microscoop gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten van de MUB40-gebeitst weefsels van een histopathologisch onderzoek dia's onthullen meestal afzonderlijke cellen verspreid over het weefsel. MUB40 vlekken lactoferrine, die aanwezig is in neutrofiele korrels en verzuilde. Dus meestal gezien punctate kleuring of verschillende grote gescheiden gebieden van signaal afkomstig zijn uit afzonderlijke neutrofiele granulocyten (Figuur 1). Het is handig om een tweede cel markering zoals DAPI om te helpen lokaliseren mede de MUB40 signaal met de gekleurde cel toevoegen. Het totaal aantal gedetecteerde cellen is afhankelijk van het aantal neutrofielen aanwezig in het gezichtsveld en kan variëren sterk afhankelijk van de bron en sterkte van de immuunrespons. Hier worden weergegeven zijn representatieve beelden uit gezuiverde vaste menselijke neutrofiele granulocyten (Figuur 1A) en een biopsie van weefsel van een colitis ulcerosa patiënt (Figuur 1B). Ook getoond worden foto's genomen vanaf een relatief laag niveau van neutrofiele granulocyten in de longen van muizen geïnfecteerd met Klebsiella pneumoniae (Figuur 1C) en een hoog niveau van neutrofiele granulocyten in de dikke darm van een cavia die besmet zijn met Shigella sonnei (Figuur 1D).
Resultaten met behulp van live, gezuiverde neutrofielen Toon doorgaans weinig tot geen cel kleuring op vroege tijd punten en geleidelijk te verhogen in RI-MUB40 kleuring na verloop van tijd, zoals meer neutrofielen worden geactiveerd. Hieronder is een cursus tijdreeksen van beelden van een experiment met behulp van gezuiverde menselijke neutrofielen besmet met fluorescerende S. sonnei (Figuur 2). Afhankelijk van de sterkte van het signaal activeren, mag neutrofielen beginnen kleuring met MUB40 snel, dus het is aangeraden om te beginnen, voordat het prestatiemeteritembestand van activators afbeeldingen ophalen. Wanneer cellen worden geactiveerd en RI-MUB40 positief, moeten zij een soortgelijke kleuring Profiel van vaste en permeabel cellen, die een punctate vlekken geven vertonen. De optimale concentratie van MUB40 voor beide live en vaste cel kleuring is 1 μg/mL (Figuur 3). Lagere concentraties (0.1-0,01 μg/mL) kunnen worden gebruikt maar resultaat in lagere signaal intensiteit. Het is ook aanbevolen om een DIC-afbeelding of andere vlek live-cel gebruiken om te onderscheiden welke cellen een RI-MUB40 signaal weergeeft.
Figuur 1 : MUB 40 -gekleurd neutrofielen van mens, muis en cavia oorsprong. (A) vertegenwoordiger MUB40 kleuring (groen) van neutrofielen gezuiverd van gezonde menselijke donoren. Celkernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). (B) Staining van menselijke neutrofielen in het weefsel van een biopsie van colitis ulcerosa. Neutrofielen zijn geopenbaard met MUB40 (groen) en celkernen worden gekleurd met de DAPI (blauw). (C) histopathologisch onderzoek van de longen van een muis die besmet zijn met Klebsiella pneumoniae. Muis neutrofielen zijn geopenbaard in het weefsel met MUB40 (groen) en celkernen worden gekleurd met de DAPI (blauw). (D) histopathologisch onderzoek van de dikke darm van een cavia besmet met Shigella sonnei. Neutrofielen reageren op de infectie zijn geopenbaard in het weefsel met MUB40 (groen). S. sonnei bacteriën (rood) express de fluorescerende dsRED eiwit. Celkernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Live neutrofielen vlek met MUB 40 alleen wanneer geactiveerd. Afbeeldingen uit een tijdreeks komen te vervallen waarbij gezuiverde menselijke neutrofielen geïnfecteerd met S. sonnei in aanwezigheid van RI-MUB40geselecteerd. In de eerste ontmoetingen set van beelden (boven) een neutrofiele een bacterie met S. sonnei (rood) weergegeven met een groene pijl. In de tijdsverloop, is de bacterie door de neutrofiele geïnternaliseerd en verteerd. Zoals de neutrofiele wordt geactiveerd vanuit de bacteriën, kleurt het geleidelijk sterker met RI-MUB40. Afbeeldingen aan de linkerkant zijn fluorescerende kanalen bedekt met DIC beelden. Afbeeldingen aan de rechterkant zijn fluorescerende kanalen alleen. Beelden werden genomen 5-min tussenpozen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Effect van verschillende MUB 40 concentraties op neutrofiele kleuring. Representatieve kleuring van vaste/permeabel neutrofiele granulocyten met verschillende concentraties van MUB40-Cy5. Gezuiverde menselijke neutrofielen waren vastgesteld en gekleurd met de aangegeven concentraties van MUB40-Cy5. Celkernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier zijn twee tests beschreven waarin de MUB40 peptide wordt gebruikt om te studeren neutrofiele ontsteking en activering. Laten we zien hoe MUB40 kan onthullen neutrofielen presenteren in histopathologie secties of hun activeringsstatus met behulp van live gezuiverde neutrofielen weergeven. De kritische stappen voor het gebruik van MUB40 als een kleuring reagens zijn hetzelfde als met elke andere tl detectiemethode. Zorg moet men zich ervan vergewissen van de compatibiliteit van fluorescerende signalen en dat er voldoende wassen stappen zijn genomen om achtergrondkleuring. De belangrijkste overwegingen goede kleuring resultaten te bereiken zijn de kwaliteit van de Microscoop, glas dia's / cover slips en de weefselsecties. Bij het bekijken van live gezuiverde neutrofielen, zijn de belangrijkste stappen in het zuiveringsproces zelf. Neutrofielen zijn gevoelig en kunnen worden geactiveerd door een aantal verschillende signalen. Om ervoor te zorgen dat het experiment betekenisvolle resultaten oplevert, moet erop worden gelet de gezuiverde neutrofielen inactief houden tot ze zijn klaar om te worden gebruikt. Dit kan worden bereikt door het uitvoeren van het protocol van neutrofiele zuivering in een zuurstofvrije zaal te beperken van neutrofiele blootstelling aan zuurstof.
Zowel een beperking als een voordeel van MUB40, afhankelijk van de experimentele vraag aangepakt, is dat MUB40 enige vlekken neutrofielen geactiveerd, tenzij ze een of andere manier zijn permeabel. Dit kan een enorm voordeel zijn, als het experiment wordt aangedrongen op volgende ontsteking in een levend dier of gezuiverde cel, maar het kan een nadeel als het experiment detectie van alle levende neutrofielen ongeacht activeringsstatus vereist. Een tweede mogelijke beperking bij dit protocol is het feit dat Lactoferrine in verschillende lichamelijke secreties zoals tranen, melk en slijm aanwezig is. Voor histopathologisch onderzoek kleuring waarin deze afscheidingen (bijvoorbeeld Colon biopsieën waarin de laag slijm intact is) worden gehandhaafd, zal MUB40 ook de laag slijm samen met alle huidige neutrofielen vlekken. In de praktijk, dit is nog bij onze analyse, maar opgemerkt moet worden als een potentiële signaalbron.
MUB40 is momenteel de alleen neutrofiele biomerker dat onderscheid tussen geactiveerd en niet-geactiveerde live neutrofiele granulocyten maken kan. MUB40, in tegenstelling tot antilichaam detectiemethoden, lijkt ook niet te veranderen van de functie of het voortbestaan van de neutrofielen in vitro of in vivo. Toevoeging van specifieke antilichamen tegen live neutrofiele granulocyten kunnen bijvoorbeeld een activerend signaal beïnvloeden neutrofiele functie of overleving in de host. Dit maakt MUB40 een zeer nuttige reagens voor onderzoek waarbij neutrofiele activering of submodule release in vitro of in vivo. Bovendien MUB40 heeft een brede gastheer Gastheerspecificiteit en kan direct worden geconjugeerd met een aantal verschillende fluorophores, zodat voor gebruik in één stap kleuring testen over meerdere hosts. Dus, MUB40 kleuring is vergelijkbaar tussen muis, menselijke, en andere zoogdieren doelen, en het vereenvoudigt en vermindert het aantal reagentia die nodig zijn voor het detecteren van de neutrofielen.
Terwijl dit protocol richt zich specifiek op histopathologie en levende cel beeldvorming met MUB40, we hebben ook met succes gebruikt de peptide in FACS sorteren en leven dieren in vivo imaging. Wij verwachten dat MUB40 zullen zich lenen voor veel verschillende testen waarbij de opsporing van neutrofielen of visualisatie van inflammatoire gebeurtenissen in het lichaam, en dat toekomstige studies en protocollen ontwikkeld zal worden verder voortbouwen op het spectrum van MUB 40 toepassingen, met name via niet-invasieve beeldvormende technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.S.M. wordt vermeld als een uitvinder op MUB40 octrooien:
MUB40: Europees Patent EP11290403.2, 09/09/2011.
RI-MUB40: Europees octrooi EP no. 17306746.3, 11/12/17.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) en ANR JCJC verleent (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
