Summary
Nous présentons ici un protocole visant à détecter la présence de neutrophiles dans les sections fixes/perméabilisées histologie et évaluer l’état d’activation des neutrophiles purifiées direct. En particulier, le peptide de40 MUB lie la lactoferrine présente dans les granules spécifiques neutrophile et tertiaires. Exposition du contenu par perméabilisation ou activation neutrophile granule permet le marquage des neutrophiles.
Abstract
Ici, nous fournissons un protocole impliquant l’utilisation de MUB40, un peptide synthétisé avec le pouvoir de lier la lactoferrine glycosylée stockée à des concentrations élevées dans les granules spécifiques et tertiaires des neutrophiles. Ce détails du protocole comment MUB40 conjugué directement à un fluorophore peuvent être utilisé pour colorer les neutrophiles en fixe/perméabilisées tissus ainsi que la façon dont ceci peut être utilisé dans l’imagerie de cellules vivantes à analyser pour la granulation et activation de neutrophile. Méthodes de détection neutrophiles sont limités à des anticorps monoclonaux spécifiques à l’espèce, qui ne sont pas toujours adaptés pour certaines applications. MUB40 ne pénètre pas la membrane cellulaire et est donc exclu de la lactoferrine stockée dans les neutrophiles non-activé/non-perméabilisées. MUB40 a l’avantage de reconnaître la lactoferrine d’une vaste gamme d’hôtes, ce qui en fait surtout utile pour comparer les résultats dans les études impliquant des modèles de recherche multiple, réduisant le nombre de réactifs en double et en simplifiant les protocoles par la seule étape souillure.
Introduction
Neutrophiles sont une des branches principales du système immunitaire inné et sont systématiquement recrutés aux sites d’inflammation autour du corps. L’étude des neutrophiles a été grandement altérée par leur courte durée de vie in vitro (moins de 8 h) et par les outils de détection limitée dans des conditions basales ou après l’activation. Nous présentons ici un protocole éprouvé pour la détection large et spécifique des neutrophiles mammifères dans les échantillons fixe/perméabilisées. Nous fournissons également un protocole détaillé pour la coloration des neutrophiles direct avec MUB40. En utilisant le protocole de coloration neutrophil direct, le calendrier et la localisation d’activation neutrophile peuvent être déterminées. Ce protocole est idéal pour les chercheurs qui souhaitent étudier les neutrophile libération d’activation ou de granules. Au-delà de leurs fonctions antimicrobiennes, neutrophiles sont maintenant appréciés comme des immunomodulateurs cellules impliqués dans un large éventail de maladies et de la réponse immunitaire (inné et adaptatif)1,2. Les neutrophiles sont présents dans les tissus inflammatoires plus, à des nombres élevés dans les tissus infectés et dans les tumeurs inflammatoires3, au cours de l’IBS et de Crohn poussées4, dans les zones d’inflammation non infectieuses comme le synovia de polyarthrite rhumatoïde ( Les patients de RA)5. Neutrophiles contiennent des quatre classes de granules préformés nommées azurophiles (α), spécifiques (β1), granules tertiaires (β2) et vésicules de sécrétion (γ)6. Lors de la migration vers un site inflammatoire, neutrophiles recrutés deviennent activés et sécrètent séquentiellement contenu de granule (composé d’adhérence, composés antimicrobiens et molécules immunomodulatrices), qui favorise davantage le recrutement et contribue à infection de résolution (mais aussi à des lésions tissulaires hôte)7. Tandis que les neutrophiles sont considérés comme un aspect essentiel de l’immunité innée, ce jour là sont peu réactifs de détection disponibles à les étudier, et encore moins qui peut être utilisé pour évaluer l’état d’activation des neutrophiles vivant.
Les méthodes actuelles de détection des neutrophiles s’appuient sur des anticorps monoclonaux contre des antigènes exposés de surface cellulaire, comme Ly - 6 G2 ou protéines spécifiquement stockés dans des granules de neutrophiles dans les conditions basales (p. ex., myéloperoxydase la lactoferrine). Avantages des anticorps monoclonaux sont leur forte liaison, une sensibilité et polyvalence dans diverses conditions de test. Cependant, il y a plusieurs inconvénients à l’utilisation des anticorps monoclonaux et anti-Ly - 6G en particulier. Ces inconvénients incluent la spécificité, comme Ly - 6G est présent sur la plupart des cellules myéloïdes dans la moelle osseuse et sur tous les granulocytes notamment éosinophiles ; déchiffrage des neutrophiles d’éosinophiles avec ce marqueur requiert donc8des approches plus complexes. Un autre compromis fréquents avec des anticorps monoclonaux est leur gamme de spécificité d’hôte souvent limité, complique les comparaisons effectuées avec plus d’une espèce animale. Un troisième inconvénient des méthodes de détection d’anticorps, en particulier lors de l’utilisation des cellules vivantes ou in vivo, est leur capacité à perturber la fonction cellulaire ou mènent à l’activation des cellules. Par exemple, l’administration d’anti-Ly - 6G de souris est couramment appliquée à l’appauvrissement de neutrophil et de neutropénie transitoire9. En outre, il a été démontré qu’injection d’anticorps pourrait stimuler la fonction antitumorale neutrophiles10. Enfin, la détection des anticorps des neutrophiles ne révèle pas l’état d’activation de la cellule.
Nous avons identifié un peptide d’acides aminés 40 appelé MUB40, qui peut être utilisé dans un certain nombre d’épreuves pour étiqueter des neutrophiles dans des conditions in vitro ou in vivo ainsi que d’analyse l’état d’activation des neutrophiles direct11. MUB40 est dérivé de MUB7012, un domaine de la protéine liant le mucus de surface de Lactobacillus reuteri décrite à l’origine pour sa capacité à lier les mucus13,14. MUB40 interagit avec la lactoferrine glycosylée qui est présente à des concentrations élevées dans les granules spécifiques neutrophile et tertiaires. MUB40 peuvent être exposés à ces granules des étapes perméabilisation standard qui sont présents en histopathologie ou fluorescence-lancée de cellules tri des protocoles (FACS) pour coloration robuste des neutrophiles fixes. Lorsque live neutrophiles sont conservés dans un état inactivé, le peptide de40 MUB est exclu le contenu de granule et cellules tache pas positifs avec le marqueur. Lors de l’activation, MUB40 peut se lier à la lactoferrine exposée et conduire à coloration robuste avec le peptide. Ainsi, MUB40 peut servir à déterminer l’état d’activation des neutrophiles purifiés, ce qui en fait un marqueur attrayant de suivre le processus infectieux. La capacité de liaison aux neutrophiles activés en direct permet également aux MUB40 à être utilisé comme un outil pour détecter les zones d’inflammation neutrophile dans des modèles animaux vivants (par exemple, une souris arthrite modèle15). Les protocoles ce manuscrit en détail comment fluorescent étiqueté MUB40 peuvent être utilisés pour révéler des neutrophiles dans les tissus de l’histologie et comment analyser l’activation des neutrophiles purifiée live in vitro.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été examinées et approuvées par les organismes Français CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) et CNIL (Commission Nationale Informatique et Liberté).
1. coloration des neutrophiles dans le tissu d’histopathologie avec fluorescent étiquetés MUB40
- Pour obtenir le tissu pour l’histopathologie, difficulté sections/biopsie de tissu dans un volume adéquat de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 30 min à 4 h selon l’épaisseur de l’échantillon. Placer les échantillons dans un réfrigérateur à 4 ° C durant la fixation.
Remarque : Méthodes de fixation Alternative/horaires peuvent être remplacés selon les exigences uniques de l’utilisateur.- Supprimer la PFA, ajouter la solution de saccharose de 16 % avec un volume suffisant pour recouvrir entièrement l’échantillon et placer l’échantillon à 4 ° C pendant 4 h jusqu'à la nuit.
- Enlever la solution de saccharose de 16 % et ajouter une solution de saccharose 30 % à un volume assez grand pour recouvrir entièrement l’échantillon et placez-le à 4 ° C pendant 4 h jusqu'à la nuit.
- Enlever la solution de saccharose 30 % et éponger hors excédent de solution du tissu avec du papier absorbant. Placer la section de tissu dans les médias de température (OCT) de coupe optimale et clin d’oeil-gel 2-méthylbutane refroidi dans un bain de glace sèche-éthanol (-72 ° C). Une fois gelé (après environ 2 min), retirer les blocs de la 2-méthylbutane et placez-les sur la glace sèche jusqu'à ce que tous les blocs sont terminé et prêt pour le stockage à long terme. Stocker les blocs congelés à-80 ° C pour le stockage à long terme.
- La veille de blocs de tissus doivent être coupés, les sortir du congélateur-80 ° C et placez-les à-20 ° C pendant la nuit s’équilibrer.
- À l’aide d’un cryostat, couper le tissu OCT-encastré en tranches de 10 à 30 μm d’épaisseur et s’adsorber sur lames de verre de haute qualité.
Remarque : Plus épais ou plus minces tranches peuvent être utilisés selon les conditions expérimentales. - Avec un crayon de cire ou autre méthode hydrophobe, dessinez un rectangle autour de la tranche de tissu sur la lame de verre et laissez sécher.
- Préparer la solution colorante en effectuant une dilution de 1 : 1 000 de MUB40-Cy5 (ou autre version fluorescente de40MUB, 1 mg/mL de solution) dans une solution de saponine-PBS de 0,1 %. La concentration optimale de40 MUB finale devrait être de 1 μg/mL.
Nota : La concentration finale inférieure peut être utilisée (0,01-0,1 μg/mL), mais peut conduire à abaisser l’intensité du signal.
Attention : Poudre de saponine peut causer une irritation respiratoire. Prenez soin de peser la saponine dans un placard ou protégées. Méthodes perméabilisation alternatives peuvent être utilisées comme Triton. Ajouter des marqueurs supplémentaires à des concentrations de fabricant-recommandé (p. ex.., 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), la phalloïdine, anticorps fluorescents). - Doucement, trempez la lame de verre dans une solution de saponine-PBS de 0,1 % trois fois.
- Soigneusement éponger le liquide en excès loin autour de la section de tissus et ajouter assez solution colorante pour couvrir complètement la section de tissu. Placez le chariot dans une chambre humide pour éviter l’évaporation et il incuber pendant 1 heure à température ambiante. Gardez-la à l’abri de la lumière.
- Tremper délicatement la lame dans la solution de saponine-PBS 0,1 % 3 x. Puis, doucement tremper la lame dans la solution de PBS 3 x. Enfin, doucement tremper la lame dans distillée H2O 3 x. Séchez soigneusement le liquide en excès de la diapositive.
- Ajouter une petite quantité (~ 20 μL) de milieu de montage (20 mM Tris pH 8,0, gallate de propyle de 0,5 %, 90 % de glycérol) à côté de la tranche de tissu et poser délicatement vers le bas une lamelle de verre sur le dessus de la lame de verre. Légèrement et uniformément, appuyer sur la lamelle couvre-objet sur la section de tissu et, à l’aide d’une serviette en papier, retirez soigneusement tout support de montage qui extrude autour des bords de la lamelle.
- Placez le chariot monté dans une armoire sombre pendant 24 heures afin de permettre le support de montage solidifier. Vous pouvez également mettre la lame montée à 37 ° C pendant 1 h.
- À l’aide d’un cryostat, couper le tissu OCT-encastré en tranches de 10 à 30 μm d’épaisseur et s’adsorber sur lames de verre de haute qualité.
- Les tranches de tissu sur un microscope à fluorescence selon la méthode d’acquisition souhaitée de l’image.
2. visualisation des neutrophile Activation avec rétro-Inverso-MUB40-Peptide Cy5
- Obtenir des neutrophiles humains en utilisant le protocole suivant. Préparer les solutions suivantes et placez-les dans une nuit armoire anoxique. Exposition à l’oxygène commence à activer des neutrophiles et induire davantage cellule mort16,17.
Remarque : Neutrophiles peuvent être alternativement purifiés « sur le banc » MUB40-étiquetage des expériences ; Toutefois, sachez qu’exposition oxygène vont commencer à affecter les neutrophile activation.- Préparer la solution suivante :
Solution 1 [chlorure de sodium (NaCl) 0,9 %] : ajouter 4,5 g de NaCl à 500 mL d’H2O. filtrer la solution.
Solution 2 (dextran 6 %) : ajouter 6 g de dextran dans NaCl 0,9 % solution à 100 mL.
Solution 3 (tampon de lavage) : dissoudre l’acide tétraacétique (EDTA) dans le tampon au phosphate pH 7,2 à une concentration finale de EDTA de 2 mM. Immédiatement avant l’utilisation, dissoudre l’albumine sérique bovine (BSA) dans la solution de PBS/EDTA telle que la concentration finale de BSA est 10 % p/v. - Centrifuger les tubes de prélèvement sanguin à 650 x g pendant 20 minutes sans pauses.
- Sans perturber le sang séparé, transférer les tubes de prélèvement sanguin à un fractions anoxique plasma frais virés et du cabinet (en haut) dans un tube conique de 50 mL.
- Retirer le tube contenant du plasma du cabinet anoxique et centrifuger à 2 900 x g pendant 20 min avec des pauses pour granuler les plaquettes.
- Sans perturber les plaquettes granulés, transfert de doucement le tube de plasma dans le cabinet anoxique et la pipette le plasma pauvre en plaquettes dans un tube de frais 50 mL (ci-après dénommé « plasma »).
- Préparer la solution suivante :
- Séparation des globules rouges de leucocytes
- En utilisant les tubes contenant les globules rouges (hématies) de l’étape 2.1.3., combiner les globules rouges dans un tube conique de 50 mL (5 sang tube contenu de la collection par tube de 50 mL).
- Ajouter NaCl 0,9 % jusqu'à ce que le volume total s’élève à 44 mL. Ajouter 6 mL de dextran 6 % (dernier).
- Mélanger délicatement le mélange de sang/dextran en renversant le tube de 10 à 20 fois. Laissez le sédiment du tube pendant au moins 30 min.
- Alors que la sédimentation se produit, préparer un gradient de Percoll en ajoutant 4,2 mL de solution de Percoll à 5,8 mL de plasma dans un tube conique de 15 mL et bien mélanger en renversant le tube.
- Recueillir la fraction supérieure du dextran tout en essayant d’éviter de pipetage de globules rouges.
- Serrer le bouchon à vis, retirez le tube de dextran de la chambre anoxique et centrifuger le tube à 300 x g pendant 10 min avec des pauses.
- Soigneusement placer le tube dans la chambre d’anoxique sans déranger les cellules granulés et évacuer le liquide par pipetage.
- Doucement resuspendre le culot dans 1 mL de plasma et ajouter très lentement vers le haut de la solution de Percoll. Veillez à ne pas induire le mélange des couches lors du pipetage les cellules sur le dessus.
- Retirer délicatement le tube de solution Percoll de la chambre anoxique (en évitant le mélange) et centrifuger à 800 x g pendant 20 minutes sans pauses. Les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) restera à la surface de solution Percoll et neutrophiles seront pellet avec les globules rouges.
- Enlèvement de contaminer des globules rouges
- Préparation de 14 mL de solution tampon de lavage en ajoutant 700 μL PBS + 10 % de BSA à 14 mL de tampon de lavage.
- Placer le tube de solution Percoll dans la chambre d’anoxique. Retirez le Percoll et PBMC par pipetage et remettre en suspension les cellules boulettes dans 1 mL de solution tampon de lavage. Le culot d’être remises en suspension aura une couleur rouge en raison de la contamination de globules rouges.
- Ajouter 200 μl de billes magnétiques anti-CD235a (glycophorine) aux cellules remises en suspension, mélanger doucement et incuber pendant au moins 15 min. Cette étape charge les hématies contaminantes avec billes magnétiques afin qu’ils puissent être enlevés.
- Laver la colonne de séparation avec 2 mL de lavage tampon x 3.
- Tout en maintenant un tube conique de 15 mL sous la colonne de séparation, lentement déposer le mélange de neutrophile/RBC en haut de la colonne. Recueillir les cellules dans le tube de 15 mL conique qu’ils traversent. Le cheminement sera nuageux et perdre sa couleur rouge à cause de la SCFR restant lié à la colonne.
- Ajouter 2 mL de tampon vers le haut de la colonne de lavage et de recueillir dans le même tube conique de 15 mL. La fin du cycle de lavage 2 mL, le cheminement doit être clair, ce qui signifie que tous les neutrophiles ont été recueillis.
- Mélanger doucement le tube pour assurer une répartition égale des neutrophiles et collecter 10 μL pour le comptage des cellules. Noter le volume final de cellule comptage fins. Énumérer le nombre total de cellules avec n’importe quelle cellule standard méthode de comptage.
- Retirer le tube de neutrophil de la chambre anoxique et centrifuger les neutrophiles à 300 x g pendant 20 min avec des pauses.
- Placer les neutrophiles sédimentés dans la chambre d’anoxique et retirer le tampon de lavage par pipetage. Resuspendre le culot de neutrophil dans le plasma avec une densité maximale de 107 PMN/mL.
- Énumération des neutrophiles purifiées et visualisation à l’aide de MUB40
- Ajouter 1 μL de RI-MUB40-Cy5 (1 mg/mL) à 1 mL de milieu Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sans rouge de phénol. Mélanger en pipettant également bien.
- Aux fins du présent protocole, le résultat a été décrit comme si un puissant neutrophile activation réactif, N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (FMLP), est ajouté. Ajouter 1 μm de FMLP dans le RPMI/RI-MUB40-mélange par pipetage et Cy5 tube haut et bas.
Remarque : Chaque procédure expérimentale sera différente à partir de ce moment, selon les questions abordées. - Transférer le RPMI/RI-MUB40de 1 mL-Cy5/FMLP mélange dans un plat de microscopie de fond de verre. Pour ce plat, ajouter un volume de cellules purifiées correspondant à 106 total neutrophiles. La composition de pipetage doucement.
- Placer le plat dans un microscope inversé à fluorescent et acquisition d’images de démarrage. Par exemple, il est recommandé d’acquérir des images de référence avant l’addition d’un réactif d’activation des neutrophiles comme FMLP ou bactéries. Dans cet exemple, commencer l’acquisition de RPMI/RI-MUB40-Cy5/neutrophiles, un validant ultérieure, pipeter le réactif de l’activation des neutrophiles dans le plat en verre et à poursuivre l’acquisition d’images.
Remarque : Modifications à ces étapes peuvent être effectuées selon besoins scientifiques. - Processus acquis films images/time-lapse comme se rapporte au microscope spécifique utilisé.
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Representative Results
Résultats de MUB40-tissus tachés de diapositives d’histopathologie révèlent en général des cellules individuelles, dispersés à travers le tissu. MUB40 taches lactoferrine, qui est présente dans les granules neutrophiles et compartimentée. Ainsi, généralement vu sont ponctuée de taches ou de plusieurs grandes surfaces séparées du signal en provenance des neutrophiles (Figure 1). Il est utile d’ajouter un deuxième marqueur de cellules comme DAPI pour aider a localiser le signal de40 MUB avec la cellule tachée. Le nombre total de cellules détectées dépend du nombre de neutrophiles présents dans le champ de vision et peut varier considérablement selon la source et la force de la réponse immunitaire. Montré ici sont des images représentatives de neutrophiles humains fixes purifiées (Figure 1A) et d’une biopsie de tissu d’un patient de la colite ulcéreuse (Figure 1B). Également montré les images proviennent d’un niveau relativement bas de neutrophiles dans les poumons des souris infectées avec Klebsiella pneumoniae (Figure 1C) et un niveau élevé de neutrophiles dans le côlon d’un cobaye infecté par Shigella sonnei (Figure 1D).
Résultats à l’aide de neutrophiles live, purifiées présentent généralement des cellules peu ou pas aux premiers moments de coloration et augmentent graduellement en RI-MUB40 coloration au fil du temps que les neutrophiles plus devient activés. Montré ici est une série de cours de temps d’images à partir d’une expérience utilisant des neutrophiles humains purifiés infectés fluo S. sonnei (Figure 2). Selon la force du signal activant, neutrophiles peuvent commencer coloration avec MUB40 rapidement, il est donc recommandé de commencer à acquérir des images avant l’addition d’activateurs. Quand les cellules deviennent activées et RI-MUB40 positive, ils devraient montrer un profil coloration similaire à celle des cellules fixes et perméabilisées, qui donnent une coloration ponctuée. La concentration optimale de MUB40 pour les deux cellules vivantes et fixe la souillure est 1 μg/mL (Figure 3). Des concentrations plus faibles (0,1-0,01 µg/mL) peut être utilisé mais le résultat plus faible intensité du signal. Il est également recommandé d’utiliser une image de la DIC ou autres taches de cellules vivantes pour différencier les cellules affichent un signal de40 RI-MUB.
Figure 1 : MUB 40 -teinté de neutrophiles de l’homme, la souris et cobaye origine. (A) représentant MUB40 coloration (vert) des neutrophiles purifiées à partir de donneurs humains en bonne santé. Noyaux cellulaires sont colorées au DAPI (bleus). (B) souillant des neutrophiles humains dans les tissus par une biopsie de la colite ulcéreuse. Neutrophiles sont révélées avec MUB40 (vert) et les noyaux cellulaires sont colorées au DAPI (bleus). (C) histopathologie des poumons de souris infectée par Klebsiella pneumoniae. Neutrophiles de souris sont révélés dans le tissu à l’aide de MUB40 (vert) et les noyaux des cellules sont colorées au DAPI (bleus). (D) histopathologie du colon d’un cobaye infecté par Shigella sonnei. Neutrophiles en réponse à l’infection sont manifestent dans les tissus avec MUB40 (vert). S. sonnei bactéries (rouge) expriment la protéine fluorescente dsRED. Noyaux cellulaires sont colorées au DAPI (bleus). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Live neutrophiles tachent avec MUB 40 uniquement lorsque activé. Choisis les images d’une série de laps de temps impliquant purifiées neutrophiles humains infectés par S. sonnei en présence de RI-MUB40. Dans le premier jeu d’images (en haut) un neutrophile rencontre une bactérie S. sonnei (rouge), repérée par une flèche verte. Au cours du temps, la bactérie est internalisée par les neutrophiles et digérée. Comme le neutrophile est activé par la bactérie, il les taches progressivement plus fort avec RI-MUB40. Images sur la gauche sont fluorescents chaînes superposées aux images DIC. Images sur la droite sont fluorescents canaux seulement. Des images ont été prises à intervalles de 5 min. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Effet de différent MUB 40 concentrations sur la coloration de neutrophiles. Représentant la coloration des neutrophiles fixe/perméabilisées avec différentes concentrations de MUB40-Cy5. Neutrophiles humains purifiés ont été fixées et colorées avec les concentrations indiquées de MUB40-Cy5. Noyaux cellulaires sont colorées au DAPI (bleus). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ici, deux essais sont décrits dans lequel le peptide de40 MUB est utilisé pour étudier l’activation et l’inflammation neutrophile. Nous montrons comment MUB40 peut révéler des neutrophiles présent dans les sections de l’histopathologie ou montrent leur état d’activation à l’aide de direct neutrophiles purifiées. Les étapes critiques d’utilisation MUB40 comme réactif de coloration sont les mêmes qu’avec n’importe quelle autre méthode de détection par fluorescence. Il faut pour assurer la compatibilité des signaux fluorescents et que les étapes de lavage adéquat ont été prises pour éliminer la coloration de fond. Les considérations les plus importantes pour obtenir de bons résultats de coloration sont la qualité du microscope, lames/lamelles de verre et les coupes de tissus. Lors de l’affichage direct neutrophiles purifiées, étapes les plus importantes sont dans le processus de purification. Neutrophiles sont sensibles et peuvent être activés par un certain nombre de signaux différents. Afin d’assurer que l’expérience produit des résultats significatifs, il faut garder les neutrophiles purifiées inactif jusqu'à ce qu’ils sont prêts à être utilisés. Ceci peut être réalisé en effectuant le protocole de purification neutrophile dans une chambre anoxique pour limiter l’exposition des neutrophile à l’oxygène.
Une limitation et avantage de MUB40, selon la question expérimentale étant adressée, est que MUB40 taches uniquement activé neutrophiles, sauf s’ils sont en quelque sorte perméabilisées. Cela peut être un énorme avantage, si l’expérience réclame suivant l’inflammation dans une cellule purifiée ou un animal vivant, mais il peut être un inconvénient si l’expérience nécessite la détection de tous les neutrophiles direct quel que soit l’état d’activation. Une autre limite potentielle au présent protocole est le fait que la lactoferrine est présente dans diverses sécrétions corporelles comme les larmes, le lait et du mucus. Pour coloration dans lequel ces sécrétions sont maintenues (par exemple, les biopsies colique dans lequel la couche muqueuse est intacte), l’histopathologie MUB40 tachera aussi la couche de mucus ainsi que les neutrophiles présents. Dans la pratique, cela n’a pas encore d’affecter notre analyse, mais il convient de noter comme une source de signal possible.
Actuellement, MUB40 est le biomarqueur seulement neutrophil qui peut faire la différence entre les neutrophiles direct activés et non activé. Aussi, MUB40, à la différence des méthodes de détection des anticorps, ne semble pas modifier la fonction ou la survie des neutrophiles in vitro ou in vivo. Par exemple, ajout d’anticorps spécifiques contre des neutrophiles direct peut être un signal activant affectant la fonction neutrophile ou survie chez l’hôte. Cela rend MUB40 un réactif très utile pour la recherche impliquant des neutrophiles activation ou granule libération in vitro ou in vivo. En outre, MUB40 dispose d’une gamme de spécificité de large spectre d’hôtes et peut être directement conjugué à un certain nombre de différents fluorophores, permettant l’utilisation dans des essais de coloration seule étape sur plusieurs hôtes. Ainsi, MUB40 coloration est comparable entre les humaine, la souris, et autres cibles chez les mammifères et il simplifie et réduit le nombre de réactifs nécessaires pour détecter des neutrophiles.
Alors que ce protocole se concentre spécifiquement sur l’histopathologie et imagerie de cellules vivantes à l’aide de MUB40, nous ont utilisé également avec succès le peptide dans le tri des FACS et vivre animaux in vivo de l’imagerie. Nous prévoyons que MUB40 sera prête à beaucoup de différentes épreuves portant sur la détection des neutrophiles ou visualisation des manifestations inflammatoires dans le corps, et que des protocoles et études futures seront élaborées à effet de levier supplémentaire le spectre de MUB 40 utilisations, en particulier en utilisant des techniques d’imagerie non invasive.
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Disclosures
Préstation est répertorié en tant qu’inventeur MUB40 brevets :
MUB40: EP11290403.2 de brevet européen, 09/09/2011.
RI-MUB40: brevet européen EP no 17306746.3, 12/11/17.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (préstation) et ANR JCJC accorde (ANR-17-CE15-0012) (préstation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
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- Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
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