Summary
여기, 선물이 조직학 고정/permeabilized 섹션에서 호 중구의 존재를 감지 하 고 라이브 순화 된 호 중구의 활성화 상태를 평가 하는 프로토콜. 특히, MUB40 펩타이드 lactoferrin neutrophil 및 3 차과 립에 바인딩합니다. Permeabilization 또는 호 중구 활성화 통해과 립 내용의 노출 호 중구의 마킹 할 수 있습니다.
Abstract
여기, 우리 MUB40, 호 중구의 특정 및 3 차과 립에 높은 농도에서 저장 하는 당화 lactoferrin 바인딩 수와 합성된 펩 티 드의 사용을 포함 하는 프로토콜을 제공 합니다. 이 호 중구 활성화 및 탈과 립에 대 한 분석 결과를 라이브 셀 이미징에 사용할 수 있는 방법 뿐만 아니라 고정/permeabilized 조직에 호 중구 얼룩 어떻게 MUB40 는 fluorophore에 직접 활용이 프로토콜 세부 정보를 사용할 수 있습니다. 호 중구 탐지 방법 항상 특정 응용 프로그램에 적합 하지 않은 종의 단일 클론 항 체로 제한 됩니다. MUB40 세포 막 침투 하지 않습니다 하 고 따라서 lactoferrin 비-활성화/비-permeabilized 호 중구에 저장에서 제외 됩니다. MUB40 는 그것을 여러 연구 모델을 포함 하는 연구에서 결과 비교 하는 데 특히 유용 하 게 만드는 광범위 한 호스트 범위에서 lactoferrin 인식의 추가 혜택 중복 시 약의 수를 줄이고 프로토콜을 단순화 통해 단일 단계 얼룩.
Introduction
호 중구는 타고 난 면역 시스템의 주 무기 중 하나 이며 정기적으로 시체 주위 염증의 사이트에 보충. 호 중구의 연구는 그들의 짧은 수명에은 생체 외에서 (8 h 미만) 및 제한 된 검색 도구 기저 조건 또는 활성화 후 크게 손상 되었습니다. 여기, 우리 고정/permeabilized 샘플에 포유류 호 중구의 광범위 하 고 구체적인 검색 잘 테스트 프로토콜을 제시. 우리는 또한 라이브 neutrophils MUB40얼룩에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 라이브 호 중구 얼룩 프로토콜을 사용 하는 타이밍 및 호 중구 활성화의 위치 수 수 정확히 지적. 이 프로토콜은 호 중구 활성화 또는 립 출시를 공부 하고자 연구에 이상적입니다. 넘어 그들의 항균 기능, 호 중구 지금 immunomodulatory 셀 다양 한 질병 및 면역 반응 (타고 난 및 적응형)1,2에 참여 감사 합니다. 호 중구는 가장 염증 성 조직, 감염 된 조직, 염증 성 종양3, IBS, Crohn의 플레어4, 그리고 류 마티스 관절염 (synovia 등 비 감염 성 염증의 지역에서 높은 숫자에 RA) 환자5. 호 중구 미리 형성 된과 립 명명 된 azurophil (α), 특정 (β1), 차 (β2)과 립 분 비 소포 (γ)6의 4 개의 클래스를 포함 합니다. 염증 성 사이트에 마이그레이션, 채용된 호 중구 활성화 되 고 순차적으로 분 비과 립 내용 (접착, 항균 성 화합물 및 immunomodulatory 분자 구성), 추가 모집을 추진 하 고 있으며에 기여 감염 확인 (뿐만 아니라 호스트 조직 손상)7. 호 중구는 간주 하는 동안 거기까지 타고 난 면제의 중요 한 측면은 공부, 사용할 수 있는 몇 가지 탐지 시 약 그리고 생활 호 중구의 활성화 상태를 평가 하기 위해 사용할 수 있는 적은.
Ly-6 G2 등 특히 기저 조건 (예: myeloperoxidase 호 중구과 립에 저장 된 단백질 세포 표면 노출 된 항 원에 대해 생성 하는 단일 클론 항 체에 의존 하는 중 성구 검색의 현재 방법 lactoferrin). 단일 클론 항 체의 장점에는 그들의 강한 바인딩, 감도, 및 다양 한 분석 결과 조건 다양성 포함 됩니다. 그러나, 특히 단일 클론 항 체 및 안티-Ly-6 G을 사용 하 여 여러 가지 단점이 있습니다. 이러한 단점은 포함 특이성, Ly-6 G은 골에 호 산 구는;를 포함 하 여 모든 granulocytes 골수성 세포의 대부분에 존재 따라서,이 표시와 함께 호 중구 호 산 구는에서 해독 더 많은 단지8에 접근 해야 합니다. 단일 클론 항 체와 다른 자주 있 네 개 이상의 동물 종 비교 연구를 어렵게 하 그들의 자주 제한 호스트 특이성 범위입니다. 항 체 탐지 방법, 라이브 셀 또는 vivo에서 사용 하는 경우에 특히의 세 번째 단점은 세포의 기능을 방해 하거나 세포 활성화로 이어질 그들의 잠재력 이다. 예를 들어 관리의 안티-Ly-6 G 마우스 호 중구 감소 및 일시적인 호 중구 감소 증9에 일반적으로 적용 됩니다. 그것은 또한 항 체 주입 호 중구 antitumor 기능10을 자극 수 있습니다 입증 되었습니다. 마지막으로, 호 중구의 항 체 탐지는 셀의 활성화 상태를 공개 하지 않습니다.
우리는 40-아미노 산 펩 티 드 라는 MUB40, 생체 외에서 또는 vivo에서 조건 호 중구 라벨 라이브 neutrophils11의 활성화 상태를 시험 하 수 분석 실험에서에서 사용 될 수 있는 확인 했습니다. MUB40 MUB7012, 원래 점액13,14바인딩할 능력에 대 한 설명 유산 균 reuteri 표면 점액-바인딩 단백질 도메인에서에서 파생 됩니다. MUB40 당화 lactoferrin neutrophil 및 3 차과 립에 높은 농도에서 존재 하는 상호 작용 합니다. MUB40 histopathology 또는 형광 활성화 된 세포 (FACS) 프로토콜 고정된 호 중구의 강력한 얼룩에 대 한 정렬에 표준 permeabilization 단계를 통해이 립에 노출 될 수 있습니다. 라이브 neutrophils 비활성 상태로 유지 됩니다, MUB40 펩 티 드과 립 내용에서 제외 하 고 셀 할 하지는 표시와 함께 긍정적인 얼룩. 활성화, MUB40 노출된 lactoferrin 바인딩할 하 고 펩 티 드와 강력한 얼룩으로 이어질 수 있습니다. 따라서, MUB40 감염 과정을 따라 매력적인 마커 만들기 순화 된 호 중구의 활성화 상태를 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다. 활성화 된 호 중구 살 바인딩할 수 또한 MUB40 라이브 동물 모델 (예를 들어, 마우스 관절염 모델15)에서 호 중구 염증의 영역을 감지 하는 도구로 사용할 수 있습니다. 이 원고 자세히 어떻게 놓여있는지 MUB40 라는 프로토콜 neutrophils 조직학 조직 및 시험의 시험관에라이브 순화 된 호 중구의 활성화 하는 방법에 공개 사용할 수 있습니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 방법을 검토 되었고 CoRC (위원회 회의 드 Recherche 크리니크), CPP (위원회 회의 드 보호 des Personnes), 및 CNIL 프랑스 조직에 의해 승인 (위원회 국립 사회 외 리).
1. 얼룩과 Histopathology 조직에 호 중구 붙일 MUB40 개
- Histopathology 위한 조직을 얻기 위해 30 분 동안 4 %paraformaldehyde (PFA)의 적합 한 볼륨에 조직/생 섹션 최대 4 샘플의 두께 따라 h 수정. 고정 동안 4 ℃ 냉장고에서 샘플을 놓습니다.
참고: 다른 고정 방법/타이밍 교체하실 수 있습니다 사용자의 고유한 요구에 따라.- 제거는 PFA 16% 자당 솔루션 샘플, 표지에 충분 한 볼륨을 추가 하 고 하룻밤까지 h 4 4 ° C에서 샘플을 놓습니다.
- 16% 자당 해결책을 제거 하 고 완전히 커버 샘플, 충분히 큰 볼륨에서 30% 자당 해결책을 추가 4 하룻밤까지 h 4 ° C에서 그것을 배치.
- 30% 자당 해결책을 제거 하 고 종이 타월로 조직에서 솔루션을 초과 떨어져 되 리. 조직 섹션 최적의 절삭 온도 (10 월) 미디어에서 장소와 스냅-2-methylbutane 드라이 아이스-에탄올 목욕 (-72 ° C) 냉각에 동결. (~ 2 분) 후 꽁꽁 얼어, 일단 2 methylbutane에서 블록을 제거 하 고 모든 블록 완료 하 고 장기 보관을 위해 준비 될 때까지 드라이 아이스에 넣어. 장기 저장을 위한-80 ° C에서 냉동된 블록을 저장 합니다.
- 밤 전에 조직 블록 컷,-80 ° C 냉장고에서 그들을 제거-20 ° C 하룻밤 equilibrate에서 그들을 배치 하는.
- cryostat 사용 하 여, 10 월 임베디드 조직 10 ~ 30 μ m 두꺼운 조각으로 잘라내어 높은-품질의 유리 슬라이드에 흡착.
참고: 두꺼운 또는 얇은 조각 실험 요구 사항에 따라 사용할 수 있습니다. - 왁 스 펜 또는 다른 소수 성 방법, 유리 슬라이드에 조직 조각 주위에 상자를 그려와 건조 하자.
- 얼룩 솔루션 MUB40의 1:1,000 희석을 수행 하 여 준비-Cy5 (또는 다른 형광 MUB40버전 1 mg/mL 재고 솔루션) 0.1% 사포닌 PBS 솔루션에서. 최적의 최종 MUB40 농도 1 μ g/mL 이어야 한다.
참고: 낮은 최종 농도 사용할 수 있습니다 (0.1-0.01 μ g/mL) 하지만 낮은 신호 강도 발생할 수 있습니다.
주의: 사포닌 분말 호흡 자극을 일으킬 수 있습니다. 캐비닛 또는 보호 지역에서 사포닌의 무게에 있는지 확인 합니다. 트리톤 등 대체 permeabilization 메서드를 사용할 수 있습니다. 제조업체 권장 농도에서 추가 마커를 추가 (예., 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, 형광 항 체). - 부드럽게 0.1% 사포닌-PBS의 솔루션으로 유리 슬라이드 3 번 찍어.
- 신중 하 게 조직 섹션 주위 멀리 초과 액체 얼룩을 완전히 조직 단면도 커버에 충분 한 얼룩 솔루션을 추가 합니다. 증발을 방지 하 여 실 온에서 1 h에 그것을 품 어 습도 챔버로 슬라이드를 놓습니다. 빛 으로부터 보호 유지.
- 부드럽게 0.1% 사포닌 PBS 솔루션 3으로 슬라이드를 찍어 x. 그런 다음, 부드럽게 찍어 PBS 솔루션 3으로 슬라이드 x. 마지막으로, 부드럽게 찍어 소 주 H2O로 슬라이드 3 배. 신중 하 게 슬라이드에서 과잉 액체를 건조.
- 장착 매체 (20 mM Tris pH 8.0, 0.5 %N 틸 gallate 90% 글리세롤) 조직 슬라이스 옆의 작은 금액 (~ 20 μ)을 추가 하 고 부드럽게 유리 슬라이드 위에 유리 coverslip 내려 놓 아 라. 부드럽고 고르게는 coverslip 조직 섹션에 누르고는 coverslip의 가장자리 돌출 하는 설치 미디어를 제거 조심 스럽게 종이 타월을 사용 하 여.
- 공고히 장착 미디어 있도록 24 h에 대 한 어두운 캐비닛에 탑재 된 슬라이드를 배치 합니다. 또는 1 시간 동안 37 ° C에 탑재 된 슬라이드를 배치 합니다.
- cryostat 사용 하 여, 10 월 임베디드 조직 10 ~ 30 μ m 두꺼운 조각으로 잘라내어 높은-품질의 유리 슬라이드에 흡착.
- 원하는 인수 방법에 따라 형광 현미경에서 조직을 조각 이미지.
2. 복고풍 링크 MUB40호 중구 활성화의 시각화-Cy5 펩 티 드
- 인간의 호 중구는 다음 프로토콜을 사용 하 여 얻을. 다음 솔루션을 준비 하 고 무산 소 캐비닛 하룻밤에 그들을 배치. 산소에 노출 호 중구 활성화 하 고 더 유도 세포 죽음16,17시작 됩니다.
참고: 호 중구 수 있습니다 또는 정화 "벤치"에 MUB40-라벨 실험; 그러나, 산소 노출 호 중구 활성화에 영향을 미칠 시작 됩니다 유의 하십시오.- 다음과 같은 솔루션을 준비:
해결 방법 1 [0.9% 염화 나트륨 (NaCl)]: NaCl의 4.5 g H2o. 필터 솔루션의 500 mL를 추가.
해결 방법 2 (dextran 6%): 100 ml 6 g dextran의 NaCl 0.9% 솔루션에 추가.
해결 방법 3 (세척 버퍼): PBS pH 7.2 m m 2의 최종 EDTA 농도에 있는 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 분해. 사용 직전 마지막 BSA 농도 10 %w / v를 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS/EDTA 솔루션에서을 디졸브. - 혈액 컬렉션 튜브 휴식 없이 20 분 650 x g에서 원심
- 분리 된 혈액을 방해 하지 않고 무산 소 캐비닛 및 수집 플라즈마 분수 (맨 위) 50 mL 원뿔 튜브에 혈액 컬렉션 튜브를 전송 합니다.
- 무산 소 캐비닛 및 작은 공의 혈소판을 휴식 20 분 2900 x g에서 원심 분리기에서 포함 하는 플라즈마 튜브를 제거 합니다.
- 수송과 혈소판을 방해 하지 않고 부드럽게 전송할 플라즈마 튜브 다시 무산 소 캐비닛 및 피펫으로 (이 하 "플라즈마"에 게 불리는) 신선한 50 mL 튜브에 혈소판 가난한 플라스마.
- 다음과 같은 솔루션을 준비:
- 백혈구에서 붉은 혈액 세포의 분리
- 적혈구 (Rbc) 단계 2.1.3에서에서 포함 된 튜브를 사용 하 여., 50 mL 원뿔 튜브 (5 혈액 컬렉션 튜브 내용 50 mL 튜브 당)으로 Rbc를 결합.
- 0.9 %NaCl 추가 총 볼륨 44 mL에 도달할 때까지. Dextran 6% (마지막)의 6 mL를 추가 합니다.
- 부드럽게 반전 튜브 시간 10-20 여 혈액/dextran 혼합물을 혼합. 적어도 30 분 동안 튜브 앙금을 하자.
- 침전을 수행 하는 동안 Percoll 솔루션의 4.2 mL 15 mL 원뿔 튜브에 플라즈마의 5.8 mL을 추가 하 여 Percoll 그라데이션을 준비 하 고 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합.
- Pipetting 붉은 혈액 세포를 방지 하는 동안는 dextran의 최고 분수를 수집 합니다.
- 나사 모자를 강화, 무산 소 상공에서 dextran 튜브를 제거 하 고 10 분 휴식 x 300g에 튜브 원심.
- 조심 스럽게 수송과 세포를 방해 하지 않고 무산 소 상공에 다시 튜브를 배치 하 고 pipetting 통해 액체를 제거.
- 부드럽게 플라즈마의 1 ml에서에 다시 셀 펠 릿을 일시 중단 하 고 매우 느리게 Percoll 솔루션의 상단에 추가 합니다. 수 위에 셀 pipetting 때 레이어의 혼합을 유도 하지 않도록 주의 하십시오.
- 무산 소 상공 (피하 혼합), 그리고 휴식 없이 20 분 800 x g에서 원심 분리기에서 Percoll 솔루션 튜브를 조심 스럽게 제거. 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) Percoll 솔루션 표면에 남아 있을 것 이다 고 호 중구는 Rbc와 작은 것입니다.
- Rbc 오염 제거
- 버퍼를 세척의 14 ml 700 μ PBS + 10 %BSA 추가 하 여 버퍼 솔루션을 세척의 14 mL를 준비 합니다.
- 무산 소 상공에 다시 Percoll 솔루션 튜브를 놓습니다. Pipetting 통해 Percoll와 PBMCs를 제거 하 고 다시 세척 버퍼 솔루션의 1 mL에 수송과 셀을 일시 중단. 다시 일시 중단 되도록 펠 릿 오염 Rbc 인해 빨간색이 있을 것 이다.
- 다시 일시 중단 된 셀 안티-CD235a (glycophorin) 자석 구슬의 200 μ를 추가 하 고 부드럽게 혼합, 최소 15 분의 품 어. 이 단계 그들은 제거 될 수 있도록 자석 구슬 가진 오염 RBCs를 로드 합니다.
- 워시 세척의 2 mL와 함께 분리 열 버퍼 3 배.
- 분리 열 아래 15 mL 원뿔 튜브를 잡고, 천천히 열 상단의 neutrophil/RBC 혼합 플라스틱. 그들은 통해 흐름 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 수집 합니다. 통해 흐름 해야 흐린 고 때문에 열에 바인딩된 남아 있는 Rbc의 붉은 색을 잃고.
- 버퍼는 칼럼의 상단에 세척의 2 개 mL를 추가 하 고 동일한 15 mL 원뿔 튜브에 수집. 2 mL 워시 말까지 흐름 통해 명확 해야 한다, 모든 호 중구 수집 된 상징.
- 부드럽게 믹스 하 호 중구의 동등한 배급을 보장 하 고 셀 카운팅을 위한 10 μ를 수집 튜브. 목적을 계산 하는 셀에 대 한 최종 볼륨 note 계산 방법 모든 표준 셀 셀의 총 개수를 열거 합니다.
- 무산 소 상공에서 호 중구 튜브를 제거 하 고 원심 휴식 20 분에 대 한 300 x g에서 호 중구.
- 무산 소 상공에 다시 sedimented neutrophils 놓고 pipetting 통해 세척 버퍼를 제거 합니다. 다시 10의 최대 셀 밀도 플라즈마에 호 중구 펠 릿을 중단7 PMN/mL.
- 순화 된 호 중구 및 시각화 MUB40 을 사용 하 여 열거
- 추가 리 MUB40의 1 μ-Cy5 (1 mg/mL)의 페 놀 레드 없이 Rosewell 공원 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체 1 ml. 잘 pipetting으로 혼합.
- 이 프로토콜의 목적을 위해 결과 마치 강력한 neutrophil 활성화 시, N-formylmethionyl-leucyl-페닐알라닌 (FMLP) 추가 개설 되었습니다. 1 μ m의 FMLP RPMI/RI-MUB40추가-Cy5 튜브 및 pipetting 통해 믹스 고 아래로.
참고: 각 실험 절차가이 시점에서 해결 되 고 질문에 따라 달라 집니다. - 1 mL RPMI/RI-MUB40전송-유리 하단 현미경 요리 Cy5/FMLP 혼합물. 이 접시에 순화 된 셀 106 총 호 중구에의 볼륨을 추가. 부드럽게 pipetting으로 혼합.
- 거꾸로 형광 현미경에 접시를 놓고 이미지 수집을 시작 합니다. 예를 들어 FMLP 또는 박테리아 같은 neutrophil 활성화 시 약의 추가 이전 초기 이미지를 수집 하는 것이 좋습니다. 이 예제에서는 시작 RPMI/RI-MUB40의 수집-Cy5/호 중구, 나중 timepoint neutrophil 활성화 시 유리 그릇에 플라스틱 그리고 이미지 수집을 계속.
참고: 다음이 단계를 수정 할 수 있다 기반으로 과학적 요구에. - 프로세스는 이미지/시간 lapse 영화로 특정 현미경 사용에 관련 된 인수.
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Representative Results
MUB40의 결과-얼룩진된 조직 histopathology 슬라이드에서 일반적으로 조직에 걸쳐 흩어져 개별 셀을 공개. MUB40 얼룩 lactoferrin, 호 중구과 립에 존재 하 고로 한정. 따라서, 일반적으로 본 punctate 얼룩 또는 신호의 여러 큰 분리 한 지역에서에서 오고 있다 개별 neutrophils (그림 1). 공동 스테인드 셀 MUB40 신호를 지역화할 수 있도록 DAPI 같은 두 번째 셀 표식 추가 도움이 됩니다. 검색 된 셀의 총 수 시야에 호 중구의 수에 의존 하 고 극적으로 소스 및 면역 반응의 강도에 따라 다를 수 있습니다. 여기은 순화 고정된 인간 호 중구 (그림 1A)와 (그림 1B) 궤 양성 대 장 염 환자의 조직 생 검에서 대표 이미지입니다. 또한 Klebsiella 균 (그림 1C)로 감염 된 쥐의 폐에서 호 중구의 상대적으로 낮은 수준에서 촬영 한 이미지는 기니 피그의 콜론에 호 중구의 높은 수준의 Shigella sonnei 감염 표시 (그림 1D).
라이브, 순화 중 성구를 사용 하 여 결과 일반적으로 이른 시간 점에서 얼룩 없음 작은 셀을 표시 하 고 RI MUB40 더 호 중구 활성화 되 서 시간이 지남에 얼룩에 점차적으로 증가. 여기에 표시 된 이미지의 순화 된 인간의 호 중구 감염 된 형광 S. sonnei (그림 2)를 사용 하 여 실험에서 시간 코스 시리즈가 이다. 활성화 신호의 강도 따라 호 중구 시작할 수 있습니다 MUB40 , 얼룩 시작 활성의 추가 이전 이미지를 획득 하는 것이 좋습니다. 세포 활성화 될 때 및 RI MUB40 긍정적인, 그들은 punctate 얼룩 줄 고정 및 permeabilized 세포의 유사한 착 색 프로필을 전시 한다. MUB40 두 라이브 및 고정 셀 얼룩의 최적 농도 1 μ g/mL (그림 3). 낮은 농도 (0.1-0.01 μ g/mL) 낮은 신호 강도 결과만 사용할 수 있습니다. 그것은 또한를 사용 하 여 DIC 이미지 또는 다른 라이브 셀 얼룩 셀 리 MUB40 신호를 표시 하는 것이 좋습니다.
그림 1 : MUB 40 -인간의 호 중구, 마우스, 및 기니 피그 출처 스테인드. (A) 대표 MUB40 (녹색) 건강 한 인간 기증자에서 정화 하는 호 중구의 얼룩. 세포 핵 (파란색) DAPI와 얼룩이 있습니다. (B)에서 궤 양성 대 장 염 생 검 조직에서 인간의 호 중구의 얼룩. 호 중구는 MUB40 (녹색) 그리고 세포 핵은 물 DAPI (파란색). (C) 마우스 Klebsiella 균감염의 폐에서 Histopathology. 마우스 호 중구는 MUB40 (녹색)를 사용 하 여 조직에서 그리고 세포 핵은 물 DAPI (파란색). (D) histopathology Shigella sonnei감염 하는 기니 피그의 콜론에서. 호 중구는 감염에 응답 MUB40 (녹색)와 조직에 계시는. S. 형광 dsRED 단백질을 표현 하는 sonnei 박테리아 (레드). 세포 핵 (파란색) DAPI와 얼룩이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 라이브 neutrophils MUB와 얼룩 40 활성화 하는 경우에. 시간 경과 시리즈 관련 된 RI MUB40존재 S. sonnei 감염 정화 인간 호 중구에서에서 선택한 이미지. 첫 번째에서 이미지 (위)는 neutrophil의 세트 녹색 화살표와 함께 표시 하는 S. sonnei 박테리아 (레드) 발생 합니다. 시간 동안, 박테리아는 neutrophil에 의해 내 면 이며 소화. 로 neutrophil 박테리아에서 활성화 되 면, 그것은 얼룩 RI MUB40점차적으로 강한. 왼쪽에 이미지는 형광 채널 DIC 이미지와 겹쳐 있다. 오른쪽 이미지는 형광 채널만. 이미지 5 분 간격으로 찍은 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 다른 MUB의 효과 40 호 중구 얼룩에 농도. 다양 한 농도로 MUB40의 고정/permeabilized 호 중구의 대표적인 얼룩-Cy5. 순화 된 인간의 호 중구 고정 되었고 MUB40의 표시 농도와 스테인드-Cy5. 세포 핵 (파란색) DAPI와 얼룩이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 두 분석 MUB40 펩 티 드 호 중구 염증 및 활성화 연구에 사용 되는 설명 합니다. 우리는 어떻게 MUB40 neutrophils histopathology 섹션에 제시 하거나 라이브 정화 중 성구를 사용 하 여 그들의 활성화 상태를 밝힐 수 있습니다 보여줍니다. 착 색 시 약으로 MUB40 을 사용 하는 중요 한 단계는 다른 형광 탐지 방법으로 동일 합니다. 형광 신호 호환성 및 적절 한 세척 단계 배경 얼룩 제거 내용이 되도록 주의 해야 합니다. 좋은 착 결과 달성 하기 위해 가장 중요 한 고려는 현미경, 유리 슬라이드/커버 전표 그리고 조직 단면도의 품질. 라이브 정화 중 성구를 볼 때 가장 중요 한 단계는 자체 정화 과정에 있습니다. 호 중구 민감합니다 그리고 다양 한 다른 신호에 의해 활성화 될 수 있다. 실험 의미 있는 결과가 있도록 해야 주의 사용 될 준비가 될 때까지 비활성 정제 호 중구를 유지 하. 이 호 중구 산소 노출을 제한 하는 무산 소 상공에서 호 중구 정화 프로토콜을 수행 하 여 달성 될 수 있다.
모두 제한 및 MUB40, 해결 되 고, 실험적인 질문에 따라 활용 MUB40 만 얼룩에 호 중구 활성화 하지 않는 한 그들은 어떻게든 permeabilized는 이다. 이 경우 실험 살아있는 동물 또는 순화 된 셀에 다음과 같은 염증에 대 한 호출 하지만 실험 활성화 상태에 관계 없이 모든 라이브 호 중구의 경우 불이익이 있을 수 있습니다 큰 장점 수 있습니다. 이 프로토콜을 두 번째 잠재적인 한계는 사실 그 lactoferrin 눈물, 우유, 점액 등 다양 일 분 비 물에 존재 하는. Histopathology 이러한 분 비이 물 (예: 저 승 biopsies 있는 점액 층은 그대로)을 유지는, 얼룩이 지기에 대 한 MUB40 또한 어떤 현재 neutrophils 함께 점액 레이어를 얼룩 것입니다. 실제로, 이것은 아직 우리의 분석에 영향을 하지만 그것은 잠재적인 신호 소스로 주목 해야 합니다.
현재, MUB40 활성화 하 고 활성화 비 라이브 neutrophils 구별할 수만 호 중구 바이오 마커 이다. 또한, MUB40, 항 체 검출 방법, 달리 함수 또는 호 중구 체 외 또는 vivo에서의 생존을 표시 되지 않습니다. 예를 들어 라이브 호 중구에 대 한 특정 항 체의 추가 활성화 신호 호 중구 기능 또는 호스트에 생존에 영향을 미치는 수 있습니다. 이로써 MUB40 호 중구 활성화 또는 립 출시 체 외에서 또는 vivo에서관련 연구에 대 한 매우 유용한 시 약. 또한, MUB40 는 광범위 한 호스트 특이성 범위 그리고 다른 fluorophores, 여러 호스트에 걸쳐 단일 단계 얼룩 분석 실험에서 사용 하기 위해 허용의 수에 직접 활용 될 수 있습니다. 따라서, 마우스, 인간, 사이 비교는 MUB40 얼룩 그리고 다른 포유류, 대상과 그것 단순화 중 성구를 검색 하는 데 필요한 시 약의 수를 감소.
이 프로토콜 histopathology 및 MUB40을 사용 하 여 라이브 셀 이미징에 특히 초점을 맞추고, 하는 동안 우리는 또한 성공적으로 FACS 정렬에 펩 티 드 및 라이브 동물 vivo에서 화상 진 찰. 우리 예상 MUB40 호 중구의 검출, 본문에 염증 성 이벤트의 시각화를 포함 하는 많은 다른 분석 실험 의무가 있을 것입니다 그리고 그 미래 연구 및 프로토콜 개발 더 활용에 MUB의 스펙트럼 40 사용, 특히 비 침략 적 영상 장비를 사용 하 여 합니다.
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Disclosures
B.S.M.는 MUB40 특허에 발명자로 표시 됩니다.
MUB40: 유럽 특허 EP11290403.2, 09/09/2011.
RI MUB40: 유럽 특허 EP no. 17306746.3, 11/12/17.
Acknowledgments
이 작품은 Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.)에 의해 지원 되었다 고 ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.)를 부여 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
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