Summary
Здесь мы представляем протокол обнаружить присутствие нейтрофилов в разделах фиксированной/permeabilized гистология и оценить состояние активации живой очищенный нейтрофилов. В частности MUB пептид40 связывает лактоферрина в гранулы нейтрофилов конкретных и высшего. Экспозиции блок содержимого через permeabilization или нейтрофилов активации позволяет для маркировки нейтрофилов.
Abstract
Здесь мы предоставляем протокол с применением MUB40, синтезированных пептидов с способностью связывать гликозилированного лактоферрин, хранящиеся в высоких концентрациях в конкретных и третичного Гранулы нейтрофилов. Этот протокол детали, как MUB40 конъюгированных непосредственно к Флюорофор может использоваться для пятно нейтрофилов в фиксированной/permeabilized тканей также, как это может использоваться в живой клетки imaging для анализа для активации нейтрофилов и де грануляции. Методы обнаружения нейтрофилов ограничены к поставляемому моноклональные антитела, которые не всегда подходят для определенных приложений. MUB40 не проникают клеточной мембраны и таким образом, исключается из лактоферрин, хранящиеся в не активировано/не permeabilized нейтрофилов. MUB40 имеет добавленное преимущество признания лактоферрина из широкого хозяйского диапазона, что делает его особенно полезны для сравнения результатов исследований с участием нескольких исследований моделей, сократить количество повторяющихся реагентов и упрощения протоколы через единый этапа окрашивания.
Introduction
Нейтрофилы являются одним из основных оружия иммунной системы и регулярно привлекаются к местам воспаления вокруг тела. Изучение нейтрофилов была значительной степени снижена путем их короткий срок в пробирке (менее 8 h) и средства ограничены обнаружения базальных условиях или после активации. Здесь мы представляем испытанный протокол для обнаружения широкого и конкретного млекопитающих нейтрофилов в образцах исправлены/permeabilized. Мы также предоставляем подробный протокол для окрашивания живой нейтрофилов с MUB40. Можно pinpointed по протоколу живой нейтрофилов окрашивание, сроков и местоположения нейтрофилов активации. Этот протокол является идеальным для исследователей, которые желают учиться нейтрофилов активации или гранул выпуска. Помимо их антимикробной функций нейтрофилы теперь ценятся как иммуномодулирующих клеток, участвующих в широкий спектр заболеваний и иммунных реакций (врожденная и адаптивного)1,2. Нейтрофилы присутствуют в наиболее воспалительных тканей, на высоких числах в инфицированных тканях, в воспалительных опухоли3, во время IBS и крона вспышки4и в районах неинфекционного воспаления например synovia (ревматоидный артрит Больных РА)5. Нейтрофилов содержат четыре класса с именем azurophil (α), специфические (β1), третичные (β2) гранул и секреторные пузырьки (γ)6предварительно сформированные гранулы. После миграции воспалительных сайт набранных нейтрофилы активируются и последовательно выделяют содержимое гранул (состоящий из адгезии, антимикробных соединений и иммуномодулирующих молекул), которые способствует дальнейшему вербовки и способствует инфекция резолюции (но и повреждение тканей хост)7. В то время как нейтрофилы считаются важным аспектом врожденного иммунитета, на сегодняшний день являются несколько обнаружения реагентов для их изучения, и даже меньше, который может использоваться для оценки состояния активации нейтрофилов жизни.
Нынешние методы обнаружения нейтрофилов полагаться на моноклональные антитела, созданных против клетк поверхности подвергаются антигенов, например Ly - 6 G2 или белки, специально хранится в нейтрофильных гранул в базальных условиях (например, миелопероксидаза лактоферрин). Преимущества их сильной привязки, чувствительность и гибкость при различных условиях пробирного моноклональных антител. Однако есть несколько недостатков с помощью моноклональных антител и анти Ly - 6G в частности. Эти недостатки включают специфику, как Ly - 6G присутствует на большинстве миелоидных клеток в костном мозге и на всех гранулоцитов, включая эозинофилов; Таким образом расшифровка нейтрофилов из эозинофилов с этот маркер требует более комплексы подходов к8. Другой частой компромисс с моноклональными антителами — их часто ограниченный узел специфика хребет, затрудняет сравнение исследований с более чем одной видов животных. Третий недостаток методы обнаружения антител, особенно при использовании живой клетки или в естественных условиях, является их потенциал нарушить функцию клеток или привести к активации клеток. Например администрация анти Ly - 6G для мышей обычно применяется для нейтрофилов истощения и переходных нейтропении9. Дополнительно было продемонстрировано, что инъекции антител может стимулировать нейтрофилов противоопухолевые функции10. Наконец обнаружение антител нейтрофилов не показывают состояние активации клеток.
Мы определили 40-амино кислоты пептид, под названием MUB40, который может использоваться в ряде анализов ярлык нейтрофилов в условиях in vitro или в естественных условиях , а также анализа состояния активации живой нейтрофилов11. MUB40 является производным от MUB7012, домен Lactobacillus reuteri поверхности слизь связывающий белок, первоначально описанных за его способность связывать слизи13,14. MUB40 взаимодействует с гликозилированного лактоферрин, который присутствует в высоких концентрациях в гранулы нейтрофилов конкретных и высшего. MUB40 могут быть подвержены эти гранулы через стандартный permeabilization шаги в гистопатологии или активирована флуоресценции клеток, сортировка (FACS) протоколы для надежной пятнать фиксированной нейтрофилов. Когда живой нейтрофилов хранятся в состоянии инактивированная, пептид40 MUB исключается из содержимое гранул, и клетки не испачкать положительных с маркером. После активации MUB40 можно привязать к воздействию лактоферрин и привести к надежной окрашивание с пептида. Таким образом MUB40 может использоваться для определения состояния активации очищенный нейтрофилов, что делает его привлекательным маркер следовать инфекционного процесса. Возможность привязать жить активированные нейтрофилы также позволяет MUB40 , чтобы использоваться в качестве инструмента для выявления областей нейтрофилов воспаления в живых животных моделях (например, мыши артрит модель15). Протоколы в этой рукописи детали как дневно помечены MUB40 может использоваться раскрыть нейтрофилов в Гистология ткани и как assay активации живой очищенный нейтрофилов в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были проанализированы и одобрены французских организаций веймутовой (Comité de исследований Clinique), CPP (Comité de защиты des Personnes) и CNIL (Комиссии Nationale Informatique et Liberté).
1. Окрашивание дневно нейтрофилов в гистопатологии ткани с маркировкой MUB40
- Для получения ткани для гистопатология, исправьте разделов ткани/биопсии в соразмерную громкость параформальдегида 4% (PFA) за 30 мин до 4 ч в зависимости от толщины образца. Поместите образцы в холодильнике 4 ° C во время фиксации.
Примечание: Альтернативные фиксации методы/тайминги можно заменить основаны на уникальных потребностей пользователя.- Удаление PFA, добавить 16% раствор сахарозы с достаточным объемом для полностью покрывают образца и поместите образец в 4 ° C на 4 ч до ночлега.
- Удаление 16% раствор сахарозы и добавить 30% раствора сахарозы на достаточно большой объем, чтобы полностью покрыть образца и поместите его на 4 ° C на 4 ч до ночлега.
- Удаление 30% раствор сахарозы и пятно от избыточного решения из ткани с бумажным полотенцем. Место в разделе ткани в СМИ оптимального раскроя температуры (OCT) и оснастки замораживание в 2-methylbutane охлаждением в ванне с сухим льдом этанол (-72 ° C). После замерзла (после ~ 2 мин), удалите блоки из 2-methylbutane и разместите их на сухой лед, пока все блоки закончена и готова для длительного хранения. Хранение замороженных блоков на-80 ° C для длительного хранения.
- В ночь перед блоков ткани должны быть вырезать, удалить их из морозильной камеры-80 ° C и разместить их на 20 ° C ночь до сбалансировать.
- С помощью криостат, нарезать 10 - 30 мкм толстые ломтики OCT-врезанных тканей и абсорбируются высококачественных стеклянных скольжениях.
Примечание: Толще или тоньше фрагментов может использоваться экспериментальные зависимости. - С ручкой воска или других гидрофобные метода нарисуйте прямоугольник вокруг кусочек ткани на слайде стекло и высушить.
- Подготовить окрашивание решение, выполнив разведения 1:1,000 MUB40-Cy5 (или другой флуоресцентный MUB40версии, Стоковый раствор 1 мг/мл) в 0,1% раствора сапонина PBS. Оптимальная концентрация окончательный MUB40 должно быть 1 мкг/мл.
Примечание: Нижняя окончательный концентрации могут быть использованы (0.1-0,01 мкг/мл), но может привести к снижению интенсивности сигнала.
Предупреждение: Сапонин порошок может вызвать раздражение дыхание. Убедитесь, что весят сапонин в кабинет или защищенной области. Permeabilization альтернативные методы могут использоваться как Тритон. Добавить дополнительные маркеры в концентрациях, рекомендованный изготовителем (например., 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), Фаллоидин, флуоресцентные антитела). - Аккуратно опустите стеклянное скольжение в раствор 0,1% сапонины PBS три раза.
- Тщательно пятно от лишней жидкости вокруг секции ткани и добавить достаточно окрашивание решение полностью покрывают ткани секции. Поместите слайд в камере влажности, чтобы избежать испарения и проинкубируйте 1 ч при комнатной температуре. Держите его от света.
- Аккуратно погрузите слайд в 0,1% раствора сапонина PBS 3 x. Затем, аккуратно погрузите слайд в PBS решение 3 x. Наконец, мягко погрузите слайд в дистиллированной H2O 3 x. Тщательно высушите избыток жидкости от слайда.
- Добавить небольшое количество (~ 20 мкл) монтажа средних (20 мм трис рН 8,0, 0,5% Н-пропиловый галлат, 90% глицерина) рядом с кусок ткани и аккуратно сложить стекла coverslip поверх стеклянное скольжение. Аккуратно и равномерно насадить coverslip на разделе ткани и, используя бумажным полотенцем, осторожно извлеките носитель монтажа, вытяжки по краям coverslip.
- Место слайдов в темный шкаф для 24 h разрешить СМИ монтажа закрепить. Кроме того место слайдов при 37 ° C в течение 1 ч.
- С помощью криостат, нарезать 10 - 30 мкм толстые ломтики OCT-врезанных тканей и абсорбируются высококачественных стеклянных скольжениях.
- Изображения срезов ткани на флуоресцентный Микроскоп согласно методу желаемого приобретения.
2. Визуализация нейтрофилов активации с ретро Inverso-MUB40-Cy5 пептида
- Получение нейтрофилов человека, используя следующий протокол. Подготовить следующие решения и поместите их в ночевкой аноксии кабинета. Воздействия кислорода начнут активировать нейтрофилов и далее побуждать клетки смерти16,17.
Примечание: Нейтрофилов может альтернативно очиститься «на стенде» MUB40-маркировки экспериментов; Однако имейте в виду, что воздействия кислорода начнет влиять на активацию нейтрофилов.- Подготовьте следующее решение:
Решение 1 [0,9% хлорида натрия (NaCl)]: добавить 4,5 г NaCl в 500 мл H2O. фильтр решение.
Решение 2 (6% декстрана): добавить 6 g декстрана в растворе 0,9% NaCl в 100 мл.
Решение 3 (Отмывающий буфер): растворить Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в PBS pH 7,2 до конечной концентрации ЭДТА 2 мм. Непосредственно перед использованием Растворите бычьим сывороточным альбумином (БСА) в растворе PBS/ЭДТА, что конечная концентрация BSA 10% w/v. - Центрифуга пробирки на 650 x g 20 минут без перерыва.
- Не нарушая разлученных крови, передать аноксии кабинета и сбор плазмы фракций (сверху) в 50 мл Конические трубки трубки для сбора крови.
- Снять трубку плазмы содержащих из анаэробной кабинета и центрифуги на 2900 x g 20 минут с перерывами в гранулы тромбоцитов.
- Не нарушая гранулированных тромбоцитов, аккуратно передача плазмы трубку обратно в аноксии кабинета и пипетки тромбоцитов бедных плазмы в свежий 50 мл трубки (в дальнейшем именуется «плазмы»).
- Подготовьте следующее решение:
- Разделение красных кровяных клеток из лейкоцитов
- С помощью пробирки, содержащие красные кровяные клетки (эритроциты) из шага 2.1.3., объединить эритроцитов в конической 50 мл трубки (5 крови трубки содержимое коллекции за Тюбик 50 мл).
- Добавьте NaCl 0,9%, до тех пор, пока общий объем достигает 44 мл. Добавьте 6 мл 6% декстрана (последний).
- Осторожно Смешайте смесь крови/декстрана, инвертирование трубки 10 - 20 раз. Пусть отложений трубки для по крайней мере 30 мин.
- В то время как происходит осаждение, подготовить Percoll градиент, добавив 4.2 мл Percoll раствора до 5,8 мл плазмы в 15 мл Конические трубки и перемешать хорошо, инвертирование трубки.
- Соберите верхняя часть декстран при попытке избежать дозирования красных кровяных клеток.
- Затяните резьбовую крышку, извлеките трубку декстрана из анаэробной камеры и центрифуги трубки на 300 g x 10 минут с перерывами.
- Тщательно место трубку обратно в зале аноксии не нарушая гранулированных клетки и удаление жидкости через закупорить.
- Аккуратно вновь приостановить Пелле клеток в 1 мл плазмы и очень медленно, добавить в верхней части Percoll решения. Будьте осторожны, чтобы не вызвать смешивание слоев при закупорить клетки на вершине.
- Осторожно удалите трубки Percoll решения из анаэробной камеры (избегая смешивания) и центрифуги на 800 x g 20 минут без перерыва. Мононуклеаров периферической крови (получения) останется на поверхности раствора Percoll, и будет гранулах нейтрофилов с БС.
- Удаление загрязняющих эритроцитов
- Подготовка 14 мл моющего раствора буфера путем добавления 700 мкл PBS + 10% BSA 14 мл отмывающего буфера.
- Место Percoll решение трубки обратно в зале аноксии. Удалить Percoll и репликацию через закупорить и вновь приостановить гранулированных клеток в 1 мл моющего раствора буфера. Пелле быть вновь приостановлено будет иметь красный цвет из-за загрязнения эритроцитов.
- Добавить 200 мкл магнитные бусы анти CD235a (Гликофорины) повторно подвесной клетки, осторожно перемешать и инкубировать в течение как минимум 15 мин. Этот шаг загружает загрязняющих эритроцитов с магнитной бусины, так что они могут быть удалены.
- Мыть разделения столбцов с 2 мл промывки буфер 3 x.
- Во время проведения 15 мл конические пробки в столбце разделения, медленно Пипетка нейтрофилов/RBC смесь в верхней части столбца. Соберите клетки в 15 мл Конические трубки, как они проходят через. Поток через должны быть мутной и потерять свой красный цвет из-за RBCs, оставаясь привязанным к столбцу.
- Добавить 2 мл отмывающего буфера в верхней части столбца и собирать в же 15 мл Конические трубки. К концу 2 мл мыть потока через должно быть ясно, означающий, что были собраны все нейтрофилы.
- Аккуратно перемешайте трубки для обеспечения равномерного распределения нейтрофилов и собирать 10 мкл для подсчета клеток. Обратите внимание, окончательный объем ячейки, считая целей. Перечислите общее количество клеток с любой стандартной ячейки, подсчитывая метод.
- Удаление нейтрофилов трубки из анаэробной камеры и центрифуги нейтрофилов в 300 x g 20 минут с перерывами.
- Место отложившейся нейтрофилов обратно в анаэробных камеру и удалите Отмывающий буфер через закупорить. Вновь приостановить нейтрофильных гранул в плазме с максимальной клеток плотность 107 ПМН/мл.
- Перечисление очищенный нейтрофилов и визуализация с помощью MUB40
- Добавить 1 мкл ри-MUB40-Cy5 (1 мг/мл) в 1 мл Розуэллом парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 среды без фенола красного. Смешайте хорошо закупорить.
- Для целей настоящего Протокола результат был разработан как если бы мощным нейтрофилов, Активация реагентов, N-formylmethionyl лейцил фенилаланин (FMLP), добавляется. Добавить 1 мкм FMLP RPMI/ри-MUB40-Cy5 трубки и смеси через закупорить вверх и вниз.
Примечание: Каждая экспериментальная процедура будет отличаться от этой точки вперед, в зависимости от рассматриваемых вопросов. - Передача 1 мл RPMI/ри-MUB40-Cy5/FMLP смесь для микроскопии блюдо дно стекла. К этому блюду добавьте объем очищенной клеток соответствует 106 всего нейтрофилов. Смешайте нежно закупорить.
- Поместите блюдо в Перевернутый флуоресцентный микроскоп и начать получение изображения. Например рекомендуется приобрести исходных изображений до добавления реагента, активация нейтрофилов, например FMLP или бактерий. В этом примере, начать приобретение RPMI/ри-MUB40-Cy5/нейтрофилов и в более поздних timepoint, Пипетка активация нейтрофилов реагента в стеклянную посуду и продолжить получение изображения.
Примечание: Эти шаги могут быть внесены изменения на основе научных потребностей. - Процесс приобрел изображения/времени-покадровой фильмов, которые касаются конкретных Микроскоп используется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты MUB40-окрашенных тканей от гистопатология слайды обычно показывают отдельные клетки, разбросанных по всей ткани. MUB40 пятна лактоферрин, который присутствует в нейтрофильных гранул и разобщенным. Таким образом обычно видели пунктата пятнать или несколько больших разделенных областей сигнала приходят из отдельных нейтрофилов (рис. 1). Это полезно для добавления второй маркер клеток например DAPI помочь совместно локализовать сигнала40 MUB с окрашенных клеток. Общее количество обнаруженных клетки зависит количество нейтрофилов в поле зрения и может изменяться резко в зависимости от источника и силы иммунного ответа. Показанный здесь образы представителя из очищенного фиксированной нейтрофилов человека (рис. 1А) и биопсия тканей пациента язвенного колита (рис. 1Б). Также показаны изображения взяты из относительно низкий уровень нейтрофилов в легких мышей, инфицированных Klebsiella pneumoniae (рис. 1C) и высокий уровень нейтрофилов в толстой кишке свинки инфицированных Shigella sonnei (Рис. 1D).
Результаты с использованием живой, очищенный нейтрофилы обычно показывают мало к нет клеток, пятнать в ранние моменты времени и постепенно увеличивать в Ри-MUB40 окрашивание с течением времени, как более нейтрофилов активируются. Здесь показан времени курс серии изображений из эксперимента с использованием очищенного нейтрофилов человека, инфицированных флуоресцентные S. sonnei (рис. 2). В зависимости от активации сигнала нейтрофилов может начать окрашивание с MUB40 быстро, поэтому он рекомендуется для начала получения изображений перед добавлением активаторы. Когда клетки активируются и Ри-MUB40 положительные, они должны показывать аналогичный профиль окрашивание, фиксированной и permeabilized клеток, которые дают пунктата пятнать. Оптимальная концентрация40 MUB для окраски как живой и фиксированной ячейки – 1 мкг/мл (рис. 3). Снижение концентрации (0.1-0,01 мкг/мл) может использоваться, но результат в нижней интенсивности сигнала. Также рекомендуется использовать образ DIC или других жить элементная пятен для различения, какие ячейки отображаются в Ри-MUB40 сигнал.
Рисунок 1 : MUB 40 -витражи нейтрофилов человека, мыши и морской свинки происхождения. (A) представитель MUB40 окрашивание (зеленый) нейтрофилов, очищенного от здорового человека доноров. Ядра клеток окрашенных с DAPI (синий). (B) окрашивания нейтрофилов человека в ткани из биопсии язвенного колита. Нейтрофилы раскрываются с MUB40 (зеленый) и клеточных ядер окрашенных с DAPI (синий). (C) гистопатология из легких мыши инфицированных Klebsiella pneumoniae. Нейтрофилы мыши раскрываются в ткани, с помощью MUB40 (зеленый) и клеточных ядер окрашенных с DAPI (синий). (D) гистопатология из толстой кишки, морской свинки, инфицированных с Shigella sonnei. Нейтрофилы, отвечая на инфекции выявлены в ткани с MUB40 (зеленый). Ф. sonnei бактерий (красный) Экспресс флуоресцентный dsRED белка. Ядра клеток окрашенных с DAPI (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Live нейтрофилов пятно с MUB 40 только тогда, когда активирована. Выбранные изображения из серии промежуток времени с участием очищенный нейтрофилов человека, инфицированных S. sonnei присутствии ри-MUB40. В первый набор изображений (вверху) нейтрофилов встречает S. sonnei бактерии (красный), показано с зеленой стрелкой. В течение времени бактерии интернализации, нейтрофилов и переваривается. Как нейтрофилов активизируется от бактерий, пятна постепенно сильнее с ри-MUB40. Изображения слева-флуоресцентные каналы, обложил с изображениями DIC. Изображения на права являются только флуоресцентные каналов. Изображения были взяты с интервалом 5-мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Влияние различных MUB 40 концентрации на нейтрофилов пятнать. Представитель пятнать фиксированной/permeabilized нейтрофилов с различных концентраций MUB40-Cy5. Очищенный нейтрофилов человека были исправлены и витражи с указанной концентрации MUB40-Cy5. Ядра клеток окрашенных с DAPI (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь двух анализов описаны, в котором MUB пептид40 используется для изучения нейтрофилов воспаление и активации. Мы покажем, как можно выявить MUB40 нейтрофилов присутствует в гистопатологии секций или показать их состояние активации с использованием живой очищенный нейтрофилов. Важнейшие шаги для использования MUB40 как окрашивание реактива такие же, как и с любым другим методом флуоресцентного обнаружения. Необходимо позаботиться для обеспечения совместимости флуоресцентные сигналов и что адекватные Стиральная были шаги для удаления фона пятнать. Наиболее важные соображения для достижения хороших результатов окрашивание являются качество Микроскоп, скользит слайды/крышка стекла и разделах ткани. При просмотре живой очищенный нейтрофилов, наиболее важные шаги, в сам процесс очистки. Нейтрофилы чувствительны и могут быть активированы по ряду различных сигналов. Для того, чтобы гарантировать, что эксперимент производит значимые результаты, необходимо позаботиться держать очищенный нейтрофилы неактивных до тех пор, пока они готовы для использования. Это может быть достигнуто путем выполнения протокола нейтрофилов очистки в камеру аноксии ограничить нейтрофилов воздействия кислорода.
Ограничения и преимущества MUB40, зависящ на экспериментальной вопрос решается, — что MUB40 только пятна активации нейтрофилов, если они каким-то permeabilized. Это может быть огромным преимуществом, если эксперимент требует следующих воспаления в живых животных или очищенной ячейки, но это может быть недостатком, если эксперимент требует обнаружения всех живых нейтрофилов, независимо от состояния активации. Второй потенциальным ограничением этот протокол является тот факт, что лактоферрин присутствует в различных телесных секреции слезы, молоко и слизи. Для гистопатология окрашивания, в котором эти выделениями поддерживаются (например, в которых слой слизи нетронутыми кишечное биопсии), MUB40 будет также пятно слой слизи вместе с любой настоящей нейтрофилов. На практике этого пока не влияет на наш анализ, но следует отметить, как потенциальный источник сигнала.
В настоящее время MUB40 является только нейтрофилов биомаркеров, которое может различать активирована и неактивированные живой нейтрофилов. Кроме того MUB40, в отличие от методов обнаружения антител, не изменить функцию или выживания нейтрофилов в vitro или в естественных условиях. Например добавление специфических антител против живой нейтрофилов может быть активируя сигнал, затрагивающих нейтрофилов функции или выживания в узле. Это делает MUB40 очень полезным реагент для исследований с участием нейтрофилов активации или гранул релиз в vitro или в естественных условиях. Кроме того MUB40 имеет ряд особенностей широкий принимающей и может быть непосредственно конъюгированных ряда различных флуорофоров, позволяя для использования в единый этапа окрашивания анализов по нескольким узлам. Таким образом MUB40 пятнать сопоставима между мыши, человека, и других млекопитающих целей и это упрощает и сокращает количество реагентов, необходимых для выявления нейтрофилов.
Хотя этот протокол конкретно посвящен гистопатология и живой клетки изображений с помощью MUB40, мы также успешно использовали пептида в сортировке СУИМ и жить изображения животных в естественных условиях . Мы ожидаем, что MUB40 будет подходят для многих различных анализов с участием обнаружения нейтрофилов или визуализации воспалительных явлениях в теле, и что будущие исследования протоколы будут разрабатываться и далее эффективно использовать спектр MUB 40 видов, особенно использование неинвазивной визуализации техники.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.S.M. указан как изобретатель на MUB40 патентов:
MUB40: Европейский патент EP11290403.2, 09/09/2011.
РИ MUB40: 11/12/17, Европейского патента EP № 17306746.3.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фюгеном Лоретт Fondation (LF-2015-15) (B.S.M.) и ANR JCJC грантов (АНР-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
