Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

تحليل الغشاء ثايلاكويد البروتين المجمعات بالتفريد جل الأصلي الأزرق

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58369

Summary

بروتوكول لاستجلاء هذه النباتات ثايلاكويد البروتين منظمة معقدة وتكوينها مع الأزرق polyacrylamide الأصلي هلام التفريد (BN-صفحة) وهو وصف 2D-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. البروتوكول هو الأمثل التمويل نبات، ولكن يمكن استخدامها للأنواع النباتية الأخرى مع تعديلات طفيفة.

Abstract

سلسلة نقل الإلكترون الضوئي (إلخ) بتحويل الطاقة الشمسية إلى طاقة كيميائية على شكل ATP و NADPH. أربعة مجمعات البروتين الكبيرة المضمنة في غشاء ثايلاكويد حصاد الطاقة الشمسية لدفع الإلكترونات من الماء إلى NADP+ عن طريق فوتوسيستيمس اثنين، واستخدام التدرج بروتون الذي تم إنشاؤه لإنتاج ATP. بسيي Photosystem، هذه المبادرة والسيتوكروم ب6و (و6ب سيت) ATPase جميع مجمعات مولتيبروتين مع التوجه متميزة والديناميات في غشاء ثايلاكويد. يمكن الحصول على معلومات قيمة حول تكوين وتفاعلات البروتين المجمعات في غشاء ثايلاكويد قبل سولوبيليزينج المجمعات من سلامة الغشاء بالمنظفات خفيفة تليها هلام الأصلية فصل الغرواني الكهربي المجمعات. هلام polyacrylamide الأصلي الأزرق التفريد (BN-صفحة) أسلوب تحليلية المستخدمة لفصل البروتين المجمعات في شكلها الأصلي والوظيفية. يمكن استخدام الأسلوب لتنقية البروتين معقدة للتحليل الهيكلي أكثر تفصيلاً، ولكنه يوفر أيضا أداة لتشريح التفاعلات الدينامية بين مجمعات البروتين. تم تطويره لتحليل البروتين التنفسية المتقدرية المجمعات، الأسلوب ولكن منذ ذلك الحين تم الأمثل وتحسين لتشريح مجمعات البروتين ثايلاكويد. هنا، نحن نقدم بروتوكول حديثة مفصلة لتحليل البروتين التمثيل الضوئي مجا المجمعات وتفاعلاتها في نبات التمويل.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

فوتوسيستيم مجمعات كبيرة من البروتين مولتيسوبونيت هذه المبادرة وبسيي، سيت ب6و و ATPase تنسيق إنتاج NADPH و ATP في التمثيل الضوئي الضوء ردود. في أعلى النباتات المعايشة، تقع المجمعات في الغشاء ثايلاكويد، الذي بنية غشاء هيكلياً غير متجانسة، تتألف من أبريسيد وجرانة وسدى غير أبريسيد ثيلاكويدس. هلام polyacrylamide الأصلي الأزرق التفريد (BN-صفحة) أسلوب المستخدمة على نطاق واسع في التحليل للمجمعات الكبيرة من البروتين مولتيسوبونيت في شكلها الأصلي والنشيطة بيولوجيا. الأسلوب أنشئت لتشريح غشاء الميتوكوندريا البروتين المجمعات1، ولكن في وقت لاحق تم تخصيصها لفصل البروتين المجمعات من شبكة غشاء ثايلاكويد3. الأسلوب مناسب (ط) لتنقية ثايلاكويد الفردية البروتين المجمعات للتحليل الهيكلي، (الثاني) لتحديد التفاعلات الأصلي بين مجمعات البروتين و (ثالثا) لتحليل التنظيم العام للبروتين المجمعات عند تغيير منبهات بيئية.

قبل الانفصال، البروتين المجمعات المعزولة من الغشاء مع المنظفات النطاق يتم اختيارها بعناية، وعموما معتدل والمحافظة على البنية الأصلية للبروتين المجمعات. المنظفات تحتوي على عمود المصباح ومواقع ماء والمذيلات مستقرة النموذج أعلاه تركيز معينة، دعا إلى تركيز micellar حرجة (CMC). زيادة تركيز المنظفات أعلى نتائج اللجنة العسكرية المركزية في اضطراب التفاعلات الدهنية الدهن وفي سولوبيليزاتيون من البروتين المجمعات. ويتوقف اختيار المنظفات على استقرار البروتين المعقدة للفائدة وعلى القدرة سولوبيليزيشن لمواد التنظيف. وتشمل المنظفات المستخدمة بشكل روتيني α/β-دوديسيل-مالتوسيدي وديجيتونين. بعد solubilization مجمعات البروتين في دولته الأصلية، يتم إزالة المواد غير قابلة للذوبان بالطرد المركزي. في النباتات العليا، الغشاء ثايلاكويد اختلاف كبير في هيكل وبعض المنظفات (مثلاً، ديجيتونين) بشكل انتقائي جعل سوى جزء محدد من الغشاء3. ولذلك، تميز المنظمة البروتين المعقدة أو التفاعلات بين مجمعات البروتين، من الأهمية بمكان لتحديد قدرة solubilization المنظفات المختار دائماً بتحديد محتوى الكلوروفيل والكلوروفيل/b نسبة من المادة طافية لتقييم العائد والمجال ثايلاكويد ممثلة (الفرعية)، على التوالي، في كسر solubilized. نسبة الكلوروفيل/b في ثيلاكويدس سليمة للنمو-الضوء تأقلم النباتات هي عادة حوالي 3، بينما شيلي قيمة ب الكسور ثايلاكويد أثري أما في وجرانة أو ثيلاكويدس ستروما يقع أسفل (~ 2.5) أو تجاوز قيمة الإجمالي (~ 4.5) ثيلاكويدس، على التوالي.

تقديم شحنة سالبة لمجمعات البروتين، يتم إضافة صبغ (مصرف البحرين المركزي) الزرقاء الرائعة أخذ العينة solubilized. سبب تحول التهمة، ترحيل نحو اﻷنود مجمعات البروتين ويتم فصل على تدرج اكريلاميد (أإ) حسب الكتلة الجزيئية والشكل. ويتحقق الفصل فعالة وعالية الدقة باستخدام تدرج تركيز اكريلاميد خطي. أثناء التفريد، ترحيل مجمعات البروتين نحو اﻷنود حتى تصل إلى حد حجم المسام تعتمد على الحجم. حجم المسام من جل polyacrylamide يعتمد على الاكريلاميد (ط) مجموع/مكررا-اكريلاميد تركيز (T) و (ثانيا) على كروسلينكير مكررا-اكريلاميد مونومر تركيز (ج) بالنسبة إلى مجموع مونومرات4. بعد الانفصال مع صفحة الجبهة الوطنية، مجمعات البروتين يمكن كذلك تقسيم إلى تلك المفارز البروتين الفردية بالبعد الثاني (2D)-الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل لتحليل ثايلاكويد غشاء البروتين المجمعات من BN-صفحة/2D--الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد BN جل1،،من23

  1. إعداد الناعم هلام مع لوحات 8 × 10 سم (زجاج مستطيلة ولوح مسنن الألومينا) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة باستخدام الفواصل 0.75 ملم.
  2. خلاط تدرج على طبق من إثارة والاتصال مع مضخة تمعجية من أنابيب. إرفاق إبرة حقنه للنهاية الأخرى للأنبوب والإبرة بين لوحة الزجاج والألومنيوم. مكان محرض المغناطيسي إلى "الثقيلة" (ح)-الدائرة.
  3. إعداد 3.5% (v/v) و 12.5% (v/v) الحلول اكريلاميد (أإ) في أنابيب الطرد المركزي المخروطية 15 مل للتدرج اللوني هلام فصل (انظر وصفات في الجدول 1). لمنع حدوث بلمرة المفاجئة، تبقى أنابيب الطرد المركزي على الجليد بينما كان يستعد الحلول.
    تنبيه: هو الاكريلاميد الأعصاب ومسببة للسرطان، ارتداء ملابس واقية وقفازات.
  4. إضافة 5% APS وتيميد الحق قبل بيبيتينج الحلول لخالط التدرج. بيبيت الحل 12.5 في المائة إلى ح-الدائرة.
    1. إزالة فقاعات الهواء من قناة الاتصال "النور" (ل) وحاء-الدائرة عن طريق فتح صمام توصيل دائرتي يسمح الحل للدخول إلى قاعة ل. إغلاق صمام وبيبيت آثار حل مرة أخرى إلى ح-الدائرة.
    2. وأخيراً، بيبيت الحل 3.5 في المائة للأم-الدائرة.
  5. التبديل على محرض المغناطيسي (سرعة إثارة ليست حاسمة، ولكن ينبغي لها أن تضمن خلط السليم من الحلول الثقيلة والخفيفة)، فتح الصمامات والتبديل على مضخة تمعجية. تسمح الحلول هلام التي تتدفق بين لوحة الزجاج والألومنيوم، وينبغي فلووراتي تقريبا 0.5 مل/دقيقة. يجب أن تكون الإبرة فوق السائل طوال الوقت، فإنه يمكن تركيبها على الجزء العلوي من لوحة زجاج مع شريط.
  6. عندما قد أفرغت ح-ولالدوائر، ملئها بالماء عالي النقاوة وتسمح للماء بلطف تراكب سطح هلام. بلمرة جل يستغرق حوالي 1-2 ساعة في الرايت
  7. إعداد الحل الاكريلاميد 3% (انظر وصفه في الجدول 1) التراص هلام في الرايت بيبيت هلام التراص على رأس جل فصل مبلمرة (قبل صب جل التراص، إزالة الماء فوق السطح جل) ووضع مشط جل عينة بين الزجاج والألومنيوم لوحة تجنب فقاعات الهواء.
    1. واسمحوا أن بلمرة 30-60 دقيقة في إزالة الرايت المشط بلطف تحت ماء عالي النقاوة. تخزين الهلام في ˚C + 4.
      نقطة توقف. ويمكن تخزين الهلام في ˚C + 4 لبضعة أيام. ينبغي أن يوضع الجل في ظروف رطبة لتجنب تجفيف الآبار وسطح هلام.

2-ثايلاكويد Solubilization1،،من23

ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات تحت ضوء خافت جداً. الاحتفاظ بعينات والمخازن المؤقتة على الجليد.

  1. تمييع ثيلاكويدس معزولة مع المخزن المؤقت 25BTH20G المثلج إلى تركيز الكلوروفيل نهائي 1 ملغ/مل. لتحليل 2D--الجبهة الوطنية-الحزب الديمقراطي الصربي-صفحة تقريبا 4-8 ميكروغرام للكلوروفيل هو نموذج مناسب.
    ملاحظة: يجب أن يكون ثيلاكويدس المستخدمة في التجارب المعزولة من الأوراق الطازجة (للبروتوكول ثايلاكويد العزلة، انظر3)
  2. إضافة وحدة تخزين متساوية من المخزن المؤقت للمنظفات، أي 2% β مارك ألماني (w/v) أو 2% ديجيتونين (w/v). خلط مواد التنظيف إلى عينة ثايلاكويد برفق مع نصيحة بيبيت وتجنب الوقوع في فقاعات الهواء. تركيز مواد التنظيف النهائي هو 1%، ومن ثيلاكويدس 0.5 ملغ شيلي/مل.
    1. جعل ثيلاكويدس لمدة 2 دقيقة على الجليد (β-مارك ألماني) أو 10 دقائق في الرايت مع خلط لطيف المستمر على الكرسي الهزاز/شاكر (ديجيتونين).
      ملاحظة: تستخدم عموما ديجيتونين و β-مارك ألماني ل solubilization ثايلاكويد البروتين المجمعات. إذا كان يتم استخدام المنظفات غير الأيونية الأخرى، تركيز المنظفات والوقت سولوبيليزيشن يجب أن يكون أولاً الأمثل. عادة المنظفات تركيز يتراوح من 0.5%-5% (v/v).
      تنبيه: هو ديجيتونين السامة وارتداء ملابس واقية وقفازات
  3. إزالة المواد إينسولوبيليزيد بالطرد المركزي في 18,000 س ز لمدة 20 دقيقة، في ˚C + 4.
  4. نقل المادة طافية إلى أنبوب 1.5 مل جديدة وإضافة 1/10 (v/v) من المخزن المؤقت لمصرف البحرين المركزي للعينة.
    ملاحظة: عند النظر في التشكيل العام لمجمعات البروتين غشاء ثايلاكويد، تحديد العائد والمجال ثايلاكويد تمثيل الكسر solubilized المستحسن. لتحديد عائد المواد سولوبيليزيد، تأخذ 5 ميليلتر من المادة طافية على أنبوب جديد (قبل إضافة مصرف البحرين المركزي) وقياس محتوى شيلي وشيلي/ب نسبة5.

3-الجبهة الوطنية-الصفحة1،،من23

  1. إعداد الجل إلى نظام التفريد عمودي (مثلاً 250 SE هوفر). ملء قاعة المخزن العلوي مع المخزن المؤقت كاثود الأزرق (انظر الجدول 1) وصب اﻷنود المخزن المؤقت إلى المخزن المؤقت لمجلس النواب.
  2. تحميل نموذج ثايلاكويد (مثلاً، 5 ميكروغرام للكلوروفيل) في الآبار.
  3. ابدأ التفريد وتدريجيا بزيادة الجهد: تم فصل 75 الخامس لمدة 30 دقيقة، 100 الخامس لمدة 30 دقيقة، 125 الخامس لمدة 30 دقيقة، 150 الخامس ح 1 و 175 الخامس حتى المجمعات تماما. تشغيل جل في + 4˚C، أما باستخدام غرفة باردة أو ضبط درجة الحرارة هلام مع نظام تبريد.
    ملاحظة: تغيير كاثود الأزرق المخزن المؤقت إلى المخزن مؤقت كاثود واضحة عند الجبهة عينة تم ترحيل حوالي ثلث الهلام.
  4. بعد تشغيل الغرواني الكهربي، تفحص الجل مع فوتوسكانير لحفظ الصورة.

4-2D-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة

  1. تجميع النظام الكهربائي العمودي (جل حجم 16 × 20 سم). استخدام الفواصل 1 مم.
  2. إعداد معيار الحزب الديمقراطي الصربي هلام (12% الاكريلاميد، 6 م اليوريا، وصفه انظر الجدول2) مع 2D-مشط (واحدة كبيرة أيضا لقطاع غزة، وكذلك معيار واحد لعلامة الوزن الجزيئي).
  3. قص حارة من BN-جل ووضعه في أنبوب (5 مل). إضافة 2 مل لايملي المخزن المؤقت (الذي يحتوي على 5% β-ميركابتوثانول) واحتضان قطاع لمدة 45 دقيقة مع الهز لطيف في الرايت
  4. ضع لين، مع مساعدة من مثل فاصل، على رأس جل تجنب فقاعات الهواء.
  5. بيبيت 5 ميليلتر من الوزن الجزيئي علامة على قطعة ضيقة من ورق الترشيح ومكان الورقة في مستوى جيدا.
  6. لختم قطاع BN-جل وورقة ماركر، صب 0.5% [اغروس] (في تشغيل المخزن المؤقت) على رأس قطاع جل والسماح لترسيخ.
  7. إجراء التفريد وفقا للبروتوكولات القياسية. بعد تشغيل الغرواني الكهربي، تصور البروتينات مع مثلاً، وصمة عار روبي سيبرو أو الفضة تلطيخ وفقا6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نظام 2D-الجبهة الوطنية/الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ممثل في الشكل 1 يوضح الفصل بين ديجيتونين ومجمعات البروتين بيتا-مارك ألماني-solubilized ثايلاكويد وتركيبتها وحدة فرعية تفصيلية البروتين. نمط معقد البروتين ديجيتونين سولوبيليزيد ثيلاكويدس (جل الأفقي في أعلى على رأس الشكل 1A) يحتوي على ميجاكومبليكس بسيي-لهسيي-المبادرة، اثنين كبيرة بسيي-لهسيي سوبيركومبليكسيس (sc)، سوبيركومبليكس لهسيي هذه المبادرة، المبادرة مونومر (m)، بسيي م/سيت ب و6، فضفاضة ملزمة (L)-لهسيي تريمير (الشكل 1A). المنظفات أقوى قليلاً، β-مارك ألماني، سولوبيليزيس الغشاء ثايلاكويد كامل (جل الأفقي العلوي من الشكل 1B)، ولكن غير قادر على الحفاظ على التفاعلات الضعيفة بين مجمعات البروتين. Solubilization ثايلاكويد مع β مارك ألماني ينتج عادة أربعة سوبيركومبليكسيس بسيي-لهسيي (مع عدد مختلف من هوائي لهسيي المرفقة)، بسيي ديمر (د) والمبادرة م، أتباسي، بسيي م وسيتب6و، م-لهسيي، لهسيي ل ولهسيي مونومر (الشكل 1B). على عكس β-مارك ألماني، ديجيتونين تنتج كمية طفيفة فقط من مونومر لهسيي. نمط معقد البروتين قد تختلف تبعاً للنبات التعرض لمختلف ظروف الإضاءة، وقد تختلف أيضا بين خطوط متحولة، نظراً للتفاعلات المعقدة بين البروتين الحيوية وتعتمد على أي البروتين الفسفرة. الحزب الديمقراطي الصربي والسلطة الفلسطينية الجل أدناه الشرائط جل الأصلي في الشكل 1 A و B تمثل تكوين ببتيد كل البروتين معقدة في البداية سولوبيليزيد مع ديجيتونين أو β مارك ألماني.

Figure 1
الشكل 1. ثنائي الأبعاد BN-/الحزب الديمقراطي الصربي صفحة من نبات ثايلاكويد. سولوبيليزيد مع (أ) 1% ديجيتونين، و (ب) 1% β مارك ألماني ثايلاكويد البروتين المجمعات ومفصولة أولاً د 1-BN-صفحة (الممرات في الأعلى) وفيما بعد في 2D-الحزب الديمقراطي الصربي-صفحة لإثبات تكوين البروتين الفردية لكل مجمع. سبب الحضانة BN-شرائط مع يشوه لايمملي المخزن المؤقت، ننأى بمفارز البروتين لكل مجمع (في قطاع الجبهة الوطنية) ومفصولة بخط عمودي خلال 2D-الحزب الديمقراطي الصربي الصفحة. تحديد البروتين يستند إلى تحليل الطيف الكتلي في المراجع7،8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المخزن المؤقت المحتوى تعليقات
3.5 هلام "فصل BN اكريلاميد" (أإ) ٪ (T) AA 48%، 1.5% مكررا-AA: 148 ميليلتر
المخزن المؤقت 3xGel: 700 ميليلتر
والغليسيرول 75% (w/v): 140 ميليلتر
ح عالي النقاوة2ميليلتر o: 1092
وكالة الأنباء الجزائرية 5%: 15 ميليلتر
ميليلتر تيميد 3
ملاحظة: اكريلاميد الأعصاب. إضافة وكالة الأنباء الجزائرية وتيميد فورا قبل الاستخدام. الوصفة كافية لصب جل BN صغير واحد.
12.5 هلام فصل BN اكريلاميد (أإ) في المائة (T) AA 48%، 1.5% مكررا-AA: 530 ميليلتر
المخزن المؤقت 3xGel: 700 ميليلتر
والغليسيرول 75% (w/v): 560 ميليلتر
ح عالي النقاوة2ميليلتر o: 290
وكالة الأنباء الجزائرية 5%: ميليلتر 11
تيميد 2ΜL
ملاحظة: اكريلاميد الأعصاب. إضافة وكالة الأنباء الجزائرية وتيميد فورا قبل الاستخدام. الوصفة كافية لصب جل BN صغير واحد.
هلام "التراص BN اكريلاميد" (أإ) % 3 (T) AA 20%، 5% مكررا-AA: ميليلتر 180
المخزن المؤقت 3xGel: 500 ميليلتر
ح عالي النقاوة2o: 800 ميليلتر
وكالة الأنباء الجزائرية 5%: 30 ميليلتر
ميليلتر تيميد 3
ملاحظة: اكريلاميد الأعصاب. إضافة وكالة الأنباء الجزائرية وتيميد فورا قبل الاستخدام. الوصفة كافية لجل BN صغير واحد.
3 x جل المخزن المؤقت 1.5 م هيئة مكافحة الفساد
150 مم بسترس/HCl (pH 7.0)
مخزن في + 4 ˚C.
المخزن المؤقت لمصرف البحرين المركزي 100 مم بسترس/HCl (pH 7.0) 0.5 م هيئة مكافحة الفساد
محلول السكروز 30% (w/v)
50 ملغ/مل Serva الأزرق ز
مخزن في + 4 ˚C
المخزن المؤقت اﻷنود 50 مم بسترس/HCl (pH 7.0) مخزن في + 4 ˚C. يمكن إعداد المخزن المؤقت كحل الأسهم x 10
المخزن المؤقت الكاثود 50 مم تريسيني
15 ملم بسترس
أزرق Serva 0.01 ٪ ز
مخزن في + 4 ˚C. المخزن المؤقت يمكن أن تكون مستعدة ك 10 × الحل الأسهم، إضافة الصبغة إلى الحل 1 x
25BTH20G 25 مم بسترس/HCl (pH 7.0)
والغليسيرول 20% (w/v)
0.25 مغ/مل بيفابلوك (أضيف حديثا)
10 ملم NaF (أضيف حديثا)
يمكن إعداد المخزن المؤقت 2 X حل الأسهم (مخزن في + 4 ˚C)، ولكن إضافة بيفابلوك و NaF طازجة
المخزن المؤقت للمنظفات 2% β-دوديسيل مالتوسيدي/ديجيتونين (w/v)
25 مم بسترس/HCl (pH 7.0)
والغليسيرول 20% (w/v) و
0.25 مغ/مل بيفابلوك (إضافة طازجة من الحل الأسهم)
10 ملم NaF (أضيف حديثا)
يمكن إعداد المنظفات كحلول الأسهم 5-10 ٪ (في المياه). إذا كان يتم استخدام المنظفات الأخرى، تركيز المنظفات النهائي له ليكون الأمثل.

الجدول 1. المخازن المؤقتة والحلول للتفريد جل أصلي

المخزن المؤقت المحتوى تعليقات
لايملي المخزن المؤقت 138 مم تريس/HCL الأس الهيدروجيني 6.8
اليوريا م 6
22.2 والغليسيرول % (v/v)
4.4 الحزب الديمقراطي الصربي في المائة
المرجع: 9
12% الاكريلاميد، وهلام الفصل 6 م اليوريا مخزونات النشر الاستراتيجي AA 50%، 1,33% مكررا-AA: 10.5 مل
20 في المائة من مخزونات النشر الاستراتيجي: 0.7 مل
1.5 م تريس-HCl (pH 8.8): مل 8.05
اليوريا: ز 12.6
MQ-H2o: مل 6.16
وكالة الأنباء الجزائرية 10%: 200 ميليلتر
ميليلتر تيميد 28
ملاحظة: اكريلاميد الأعصاب. والوصفة مناسبة لصب جل مخزونات النشر الاستراتيجي الكبير واحد.
6% الاكريلاميد، وجل تجميع اليوريا الحزب الديمقراطي الصربي م 6 AA 50%، 1.33% مكررا-AA: 1.2 مل
20 في المائة من مخزونات النشر الاستراتيجي: 0.2 مل
0.5 M تريس-HCl (الرقم الهيدروجيني 6.8): 2.5 مل
اليوريا: ز 3.6
MQ-H2o: 3.45 مل
وكالة الأنباء الجزائرية 10 ٪: 100 ميليلتر
تيميد 10 ميليلتر
ملاحظة: اكريلاميد الأعصاب.
الحزب الديمقراطي الصربي بتشغيل المخزن المؤقت 19 مم تريس
2.5 مم جليكاين
الحزب الديمقراطي الصربي 0.01 ٪

الجدول 2. المخازن المؤقتة ل 2D-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

إليه تحويل الطاقة الضوئي يتكون من مجمعات البروتين مولتيسوبونيت الكبيرة، التي يتم تضمينها في الغشاء ثايلاكويد. ويصف هذا البروتوكول طريقة أساسية لتحليل ثايلاكويد مصنع البروتين المجمعات من نبات التمويل مع صفحة الجبهة الوطنية جنبا إلى جنب مع 2D-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. البروتوكول هو أيضا مناسبة لتحليل ثايلاكويد البروتين المجمعات من التبغ والسبانخ ثيلاكويدس، ولكن قد تحتاج إلى تعديلات بسيطة.

سولوبيليزيشن من الغشاء البروتين المجمعات، تستخدم عادة المنظفات النطاق لقدرتها على الحفاظ على المجمعات في شكلها الأصلي. هنا، وقد طبقت المنظفات استخداماً هما β-مارك ألماني وديجيتونين. سولوبيليزيس مالتوسيدي دوديسيل مجمعات البروتين الفردية، بينما يمكن استخدام ديجيتونين للتحليل ل جمعيات معقدة البروتين أكبر10. ديجيتونين منظم ضخمة غير قادر على يصلح للأقسام وجرانة محكم أبريسيد وذلك سولوبيليزيس فقط في المناطق غير أبريسيد3،غشاء ثايلاكويد11. ولذلك فإنه مناسب لتحليل الهوامش ستروما ثيلاكويدس ووجرانه. ومع ذلك، عندما يتم استخدام ديجيتونين جنبا إلى جنب مع حمض أمينوكابرويك (ACA)، سولوبيليزيس التركيبة الغشاء ثايلاكويد كاملة، بما في ذلك أيضا ثيلاكويدس وجرانة أبريسيد12. من خلال إليه غير معروفة، هيئة مكافحة الفساد يسمح ديجيتونين للوصول إلى القسم الفجوة بين طبقات غشاء وجرانة المجاورة. الأهم من ذلك، يحتفظ مجا التفاعلات بين مجمعات البروتين ديجيتونين وذلك يمكن استخدامها لتحليل البروتين مجا سوبر وميجاكومبليكسيس، والأكثر وفرة في المناطق غير أبريسيد ثايلاكويد8. تجدر الإشارة إلى أن المنظفات دائماً تتداخل مع بعض التفاعلات مجا بين مجمعات البروتين و ولذلك فإنه لا يمكن عزل شبكة سليمة تماما من البروتين المجمعات. بعض المجمعات هي الانفصال من المنتجات التي قد تم قطع اتصاله من أكبر الجمعيات المعقدة البروتين خلال solubilization ثايلاكويد والتفريد. جودة فصل BN-الصفحة يعتمد على إعداد نموذج (بروتين سولوبيليزيشن المعقدة)، بل أيضا على نوعية عزل ثايلاكويد، الذي يجب أن يتم من الأوراق الطازجة. إذا لم تتخذ الرعاية الخاصة، عادة ما تتحلل سوبيركومبليكسيس بسيي-لهسيي أثناء سولوبيليزاتيون β-مارك ألماني.

BN-صفحة يحافظ على وحدة المجمعات البروتين سولوبيليزيد. قدرة فصل من جل BN يعتمد على التدرج الاكريلاميد، والتدرج ينبغي أن يكون الأمثل استناداً إلى مجمعات البروتين من الفائدة. يمكن تعديل حجم المسام من جل بولياكريلاميدي عن طريق تغيير التدرج التركيز (تركيز الاكريلاميد مجموع, T) أو بضبط تركيز مادة اكريلاميد- مكررا(ج) بالنسبة إلى المبلغ الإجمالي لمادة اكريلاميد مونومرات4. BN-PA جل التدرج المستخدم هنا هو الأمثل، ومناسبة تماما لتحليل البروتين الكبيرة سوبر--وميجاكومبليكسيس3. الأهم من ذلك، يجب أن يكون حجم المسام من جل التراص كبيرة للسماح لجميع مجمعات للدخول إلى هلام الانفصال. بعد البروتين يمكن تحليلها الفصل المعقدة مع BN-الصفحة أو تكوين هيكل كل الفرقة معقد البروتين الفردية كذلك. التحليل الهيكلي البروتين يجب التيد معقدة فائدة من الجل وقد دمرت معظم مجمعات مجا خلال شطف. ولذلك، أكثر في كثير من الأحيان يستخدم السكروز الكثافة المتدرجة لتنقية البروتين معقدة للتحليل الهيكلي. لتحليل الخصائص الطيفية للبروتين المجمعات في الهلام، يجب استخدام الصفحة الأصلية واضحة بدلاً من صفحة الجبهة الوطنية، حيث أخذ صبغ يتداخل مع هذه القياسات. لمزيد من التحليل لتشكيل وحدة فرعية من المجمعات البروتين، يتم وصف يشوه 2D--الحزب الديمقراطي الصربي-صفحة هنا. الوحدات الفرعية لكل مجمع مفصولة بخط عمودي ويمكن تحديدها بسهولة. قد تجدر الإشارة إلى أن البروتينات عدة قد تكون موجودة في مكان واحد، وقد تنتمي الوحدات الفرعية في نفس الخط الرأسي لفصل مجمعات ترحيل شارك في الجبهة الوطنية-الصفحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا البحث كان دعم مالي من أكاديمية فنلندا (أرقام المشاريع 307335 و 303757) والطاقة الشمسية في الكتلة الحيوية (SE2B) ماري Skłodowska-كوري المنحة (675006). البروتوكول يستند على مرجع3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-aminocaproic acid (ACA) Sigma-Aldrich A2504
BisTris Sigma-Aldrich B4429
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Acrylamide (AA) Sigma-Aldrich A9099 Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside Sigma-Aldrich D4641
Tricine Sigma-Aldrich T0377
Tris Sigma-Aldrich T1503
SDS VWR 442444H
Urea VWR 28877.292
Glycerol J.T. Baker 7044
Sodium Fluoride (NaF) J.T. Baker 3688
EDTA disodium salt J.T. Baker 1073
Digitonin Calbiochem 300410 Caution:Toxic!
Pefabloc SC Roche 11585916001
Serva Coomassie Blue G Serva 35050
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
APS (Ammonium persulfate) Bio-Rad 161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine) Bio-Rad 1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide Omnipur 2610
Glycine Fisher G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) New England Biolabs P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml Corning 352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates Hoefer SE215
Gradient maker SG5 Hoefer
0.75 mm T-spacers Hoefer SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm Hoefer SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system Hoefer SE250
IPC-pump Ismatec
Power supply, PowerPac HV Bio-Rad 164-5097
Centrifuge Eppendorf 5424R
Rocker-Shaker Biosan BS-010130-AAI

PROTEAN II xi Cell
Bio-Rad 1651813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  2. Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
  3. Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
  4. Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
  5. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 384-394 (1989).
  6. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
  7. Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
  8. Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
  11. Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
  12. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
تحليل الغشاء ثايلاكويد البروتين المجمعات بالتفريد جل الأصلي الأزرق
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).More

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter