Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Analyse af tylakoid membran proteinkomplekser af blå indfødte gelelektroforese

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58369

Summary

En protokol til udredning af plante tylakoid protein kompleks organisation og sammensætning med blå indfødte polyacrylamid gel elektroforese (BN-side) og 2D-SDS-PAGE er beskrevet. Protokollen er optimeret til Arabidopsis thaliana, , men kan bruges til andre plantearter med mindre ændringer.

Abstract

Fotosyntetiserende elektron overførsel kæde (osv) omdanner solenergi til kemisk energi i form af NADPH og ATP. Fire store proteinkomplekser indlejret i tylakoid membran høst solenergi til at køre elektroner fra vand til NADP+ via to bannersystem, og brug den oprettede proton graduering for produktion af ATP. Photosystem PSII, PSI, cytokrom b6f (Cyt b6f) og ATPase er alle multiprotein komplekser med særskilt orientering og dynamik i tylakoid membran. Værdifulde oplysninger om sammensætning og interaktioner af proteinkomplekser i tylakoid membran kan fås ved solubilizing komplekser fra membran integriteten af milde rengøringsmidler efterfulgt af indfødte gel elektroforese adskillelse af de komplekser. Blå indfødte polyacrylamid gelelektroforese (BN-side) er en analytisk metode anvendes til adskillelse af proteinkomplekser i deres native og funktionelle form. Metoden kan bruges til protein kompleks rensning for mere detaljerede strukturel analyse, men det giver også et værktøj til at dissekere de dynamiske interaktioner mellem proteinkomplekser. Metoden har blev udviklet til analyse af mitokondriel respiratorisk proteinkomplekser, men siden blevet optimeret og forbedret for dissektion af tylakoid proteinkomplekser. Her give vi en detaljeret up-to-date protokol for analyse af labile fotosyntetiske proteinkomplekser og deres vekselvirkninger i Arabidopsis thaliana.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Store multisubunit protein komplekser photosystem PSI og PSII, Cyt b6f og ATPase koordinere produktionen af NADPH og ATP i fotosyntetiske lys reaktioner. I højere plante grønkorn ligger komplekser i tylakoid membran, der er et strukturelt heterogen membran struktur, bestående af appressed grana og ikke-appressed stroma tylakoiderne. Blå indfødte polyacrylamid gelelektroforese (BN-side) er en flittigt brugt metoden i analysen af store multisubunit proteinkomplekser i deres native og biologisk aktive form. Metoden blev etableret for dissektion af mitokondrielle membran protein komplekser1, men er senere blevet tilpasset til adskillelsen mellem proteinkomplekser tylakoid membran netværk3. Metoden er egnet (i) til rensning af individuelle tylakoid proteinkomplekser for strukturel analyse, (ii) til bestemmelse af indfødte interaktioner mellem proteinkomplekser og (iii) til analyse af overordnede organisation af proteinkomplekser efter skiftende miljø stikord.

Før adskillelse er proteinkomplekser isoleret fra membran med nøje udvalgte nonionisk rengøringsmidler, som er generelt milde og bevare den oprindelige struktur af proteinkomplekser. Vaskemidler indeholder hydrofobe og hydrofile websteder og form stabile micelles over en vis koncentration, kaldet en kritisk micellar koncentration (CMC). Øger vaskemiddel koncentrationen over CMC resultaterne i afbrydelse af lipid-lipid interaktioner og i oploesning af proteinkomplekser. Valget af vaskemiddel afhænger af stabiliteten af protein kompleks af interesse og oploesning kapacitet af vaskemiddel. Rutinemæssigt anvendes rengøringsmidler omfatter α/β-dodecyl-maltoside og digitonin. Efter oploesning af proteinkomplekser i deres hjemstat uopløselige materiale fjernes ved centrifugering. I højere planter, tylakoid membran er meget heterogenic i struktur og nogle vaskemidler (f.eks. digitonin) solubilize selektivt kun en bestemt brøkdel af membran3. For at karakterisere protein kompleks organisation eller interaktioner mellem proteinkomplekser, er det derfor afgørende at altid bestemme oploesning kapacitet af den valgte vaskemiddel ved bestemmelse af indhold af klorofyl og klorofyl a/b forholdet mellem supernatanten at vurdere udbyttet og repræsenterede tylakoid (sub) domæne, henholdsvis i den solubilized brøk. Klorofyl a/b-forhold i intakt tylakoiderne vækst-lys akklimatiseret planter er typisk omkring 3, mens chl en / b værdi af tylakoid fraktioner beriget enten i grana eller stroma tylakoiderne falder under (~ 2,5) eller overstiger (~ 4,5) værdien af samlet Tylakoider, henholdsvis.

For at give negativ ladning til proteinkomplekser, tilføjes Coomassie strålende blå (CBB) farvestof solubilized prøven. På grund af Skift afgift proteinkomplekser vandrer mod anoden og er adskilt på en acrylamid (AA) gradient ifølge deres molekylmasse og form. Effektiv og høj opløsning adskillelse er opnået ved hjælp af en lineær acrylamid koncentration gradient. Under elektroforese overflytte proteinkomplekser mod anoden, indtil de når deres størrelse-afhængige pore-størrelse grænse. Porestørrelse polyacrylamid gel afhænger af (i) den samlede acrylamid /bis- acrylamid koncentration (T) og (ii) på tværs linker bis- acrylamid monomer koncentration (C) i forhold til den samlede monomerer4. Efter separation med BN-side, kan proteinkomplekser yderligere opdeles i deres individuelle protein-underenheder af anden-dimension (2D) - SDS - PAGE. Her beskriver vi en detaljeret protokol til analyse af tylakoid membran proteinkomplekser af BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberedelse BN Gel1,2,3

  1. Oprette gel hjul med 8 cm x 10 cm plader (rektangulære glas og indskåret alumina plade) ifølge producentens anvisninger ved hjælp af 0,75 mm spacere.
  2. Placer en gradient mixer på en røre pladen og forbinde den med den peristaltiske pumpe ved en slange. Vedhæfte en sprøjte nål til anden enden af slangen og Placer nålen mellem glas og aluminium plade. Sted magnetomrører til "tungt" (H)-kammer.
  3. Forberede 3,5% (v/v) og 12,5% (v/v) acrylamid (AA) løsninger i 15 mL konisk centrifugeglas på adskillelse gel gradient (Se opskrifter i tabel 1). For at undgå utidig polymerisering, holde centrifugeglas på isen under udarbejdelsen af løsninger.
    Forsigtig: Acrylamid er neurotoksiske og kræftfremkaldende, slid beskyttende tøj og handsker.
  4. Tilføj 5% APS og TEMED lige før pipettering løsninger til den gradient mixer. Med pipette overfoeres 12,5% opløsning til H-kammer.
    1. Fjerne luftbobler fra kanalen forbinder "lys" (L) og H-kammer ved at åbne ventilen forbinder de to kamre tillader løsning at komme ind til L-kammer. Lukke ventilen og afpipetteres spor af løsning tilbage til H-kammer.
    2. Endelig, afpipetteres 3,5% løsning til L-kammer.
  5. Skifte på magnetomrøreren (hastigheden på rør er ikke kritisk, men det bør sikre korrekt blanding af tunge og lette løsninger), åbne ventilerne og tænde den peristaltiske pumpe. Tillad gel løsninger til at flyde mellem glas og aluminium plade, flowhastighed, som skal være ca 0,5 mL/min. Nålen skal være over den pågældende væske hele tiden, det kan være fastgjort til den øverste del af glasplade med et bånd.
  6. Når H - og L-afdelingerne har tømt, fylde dem med ultrarent vand og tillade vand at forsigtigt overlay gel overflade. Gel polymerisation finder omkring 1-2 timer på RT.
  7. Forbered 3% acrylamid løsning (Se opskrift i tabel 1) for den stabling gel på RT. afpipetteres stabling gelen på toppen af polymeriseret adskillelse gel (før støbning stabling gel, fjerne vandet overliggende gel overflade) og placere en prøve gel kam mellem de glas og aluminium plade undgå luftbobler.
    1. Tillad for at polymerisere 30-60 min. ved RT. Fjern kam forsigtigt under ultrarent vand. Gemme gel på + 4 ˚C.
      Pause punkt. Gelen kan opbevares ved + 4 ˚C for et par dage. Gel bør holdes under fugtige forhold at undgå udtørring af brøndene og gel overflade.

2. tylakoid oploesning1,2,3

Bemærk: Alle trin skal udføres under meget svagt lys. Holde prøver og buffere på is.

  1. Fortyndet isolerede tylakoiderne med iskold 25BTH20G buffer til en afsluttende klorofyl koncentration af 1 mg/mL. For 2D-BN-SDS-PAGE analyse omkring 4-8 µg af klorofyl / prøve er egnet.
    Bemærk: Tylakoiderne anvendes i eksperimenter skal isoleres fra friske blade (for protokollen tylakoid isolation, se3)
  2. Tilføje en tilsvarende mængde vaskemiddel buffer, dvs. 2% β-DM (w/v) eller 2% digitonin (w/v). Bland vaskemiddel til tylakoid prøve forsigtigt med pipette tip og undgå luftbobler. Den endelige koncentration af vaskemiddel er 1% og af tylakoiderne 0,5 mg Chl/mL.
    1. Solubilize tylakoiderne for 2 min på is (β-DM) eller 10 minutter på RT med kontinuerlig blide blanding på en rocker/shaker (digitonin).
      Bemærk: Digitonin og β-DM er generelt anvendes til oploesning af tylakoid proteinkomplekser. Benyttes andre nonioniske detergenter, skal vaskemiddel koncentrationen og oploesning tid først optimeres. Normalt vaskemiddel koncentration spænder fra 0,5% - 5% (v/v).
      Forsigtig: Digitonin er giftige, slid beskyttende tøj og handsker
  3. Fjern det insolubilized materiale ved centrifugering ved 18.000 x g i 20 min. ved + 4 ˚C.
  4. Overføre supernatanten til en ny 1,5 mL tube og tilføje 1/10 (v/v) af CBB buffer til prøven.
    Bemærk: Når den generelle sammensætning af tylakoid membran proteinkomplekser er undersøgt, fastsættelsen af udbyttet og repræsenterede tylakoid domæne solubilized brøkdel anbefales. For at bestemme udbyttet af den solubilized materiale, tage 5 µL af supernatanten til en ny tube (før du tilføjer CBB) og måle Chl indhold og Chl en / b forholdet5.

3. BN-side1,2,3

  1. Oprette gel til lodret elektroforese system (fx Hoefer SE 250). Fyld den øverste buffer kammer med blå katode buffer (Se tabel 1) og hæld anode buffer til buffer andetkammer.
  2. Indlæse tylakoid prøve (f.eks. 5 µg af klorofyl) i brøndene.
  3. Start elektroforese og gradvist øge spændingen: 75 V i 30 min, 100 V til 30 min, 125 V i 30 min, 150 V for 1t og 175 V indtil komplekser er blevet adskilt helt. Kør gelen på + 4˚C, enten ved hjælp af et kølerum eller justere gel temperaturen med et kølesystem.
    Bemærk: Ændre blå katode buffer til en klar katode buffer når prøven front har overført omkring en tredjedel af gelen.
  4. Efter det elektroforese run, skanne gel med en photoscanner for billede arkivering.

4. 2D-SDS-PAGE

  1. Samle lodret elektroforese system (gel størrelse 16 cm x 20 cm). Brug 1 mm spacere.
  2. Forberede standard SDS gel (12% acrylamid, 6 M urinstof, se opskrift i tabel 2) med en 2D-kam (enkelt store godt for striben og et standard godt for molekylvægt markør).
  3. Skær vognbane fra BN-gel og placere det i en (5 mL) rør. Der tilsættes 2 mL Laemmli buffer (indeholdende 5% β-mercaptoethanol), og der inkuberes strip for 45 min med blid ryster på RT.
  4. Placer lane, med hjælp fra fx en spacer, på toppen af gelen undgå luftbobler.
  5. Med pipette overfoeres 5 µL af molekylvægt markør på et smalt stykke filtrerpapir og sted papiret til den standard, der er godt.
  6. For at forsegle BN-gel strip og markør papir, hæld 0,5% Agarosen (i kører buffer) på toppen af gel strip og lad den størkne.
  7. Udføre elektroforese ifølge standardprotokoller. Efter den elektroforese køre, visualisere proteiner med fx Sypro Ruby pletten eller sølvfarvning efter6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En repræsentativ 2D-BN/SDS-PAGE system i figur 1 viser adskillelse af digitonin og β-DM-solubilized tylakoid proteinkomplekser og deres detaljerede protein-underenheder sammensætning. Protein komplekse mønster af digitonin solubilized Tylakoider (vandret gel på toppen på toppen figur 1A) indeholder PSII-LHCII-PSI megacomplex, to store PSII-LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI monomer (m), PSII m/Cyt b6f, løst bundet (L)-LHCII trimer (figur 1A). Lidt stærkere rengøringsmiddel, β-DM, solubilizes hele tylakoid membran (vandret gel på toppen figur 1B), men ikke er i stand til at bevare svage interaktioner mellem proteinkomplekser. Tylakoid oploesning med β-DM producerer typisk fire PSII-LHCII supercomplexes (med forskellige antal LHCII antenne vedlagt), PSII dimer (d) og PSI m, ATPase, PSII m og Cytb6f, M-LHCII, L-LHCII og LHCII monomer (figur 1B). I modsætning til β-DM producerer digitonin kun mindre mængde LHCII monomer. Protein komplekse mønster kan variere afhængigt af plante eksponering til forskellige lysforhold og kan også variere mellem mutant linjer, da protein komplekse interaktioner er dynamisk og afhænger af dvs protein fosforylering. SDS-PA geler nedenfor de indfødte gel strips i figur 1 A og B repræsenterer polypeptid sammensætningen af hvert protein kompleks i første omgang solubilized med digitonin eller β-DM.

Figure 1
Figur 1. En to-dimensionel BN-/ SDS side af Arabidopsis tylakoid. Tylakoid proteinkomplekser solubilized med (A) 1% digitonin og (B) 1% β-DM og adskilt først af 1D-BN-side (banerne på toppen) og efterfølgende på 2D-SDS-side at vise enkelte protein sammensætningen af hver kompleks. Inkubation af BN-strimler med denatureringen Laemmli buffer, protein-underenheder af hver kompleks (i mia-striben) tage afstand og er adskilt i en lodret linje under 2D-SDS-PAGE. Identifikationen protein er baseret på massespektrometri analyse, der præsenteres i referencer7,8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Buffer Indhold Kommentarer
3,5% (T) acrylamid (AA) BN adskillelse gel 48% AA, 1,5% bis-AA: 148 µL
3xGel Buffer: 700 µL
75% (w/v) glycerol: 140 µL
Laves H2O: 1092 µL
5% APS: 15 ΜL
TEMED 3 ΜL
Bemærk: Acrylamid er neurotoksiske. Tilføje APS og TEMED umiddelbart før brug. Opskriften er tilstrækkelig for casting en lille mia gel.
12,5% (T) acrylamid (AA) BN adskillelse gel 48% AA, 1,5% bis-AA: 530 µL
3xGel Buffer: 700 µL
75% (w/v) glycerol: 560 µL
Laves H2O: 290 µL
5% APS: 11 ΜL
TEMED 2ΜL
Bemærk: Acrylamid er neurotoksiske. Tilføje APS og TEMED umiddelbart før brug. Opskriften er tilstrækkelig for casting en lille mia gel.
3% (T) acrylamid (AA) BN stabling gel 20% AA, 5% bis-AA: 180 µL
3xGel Buffer: 500 µL
Laves H2O: 800 µL
5% APS: 30 ΜL
TEMED 3 ΜL
Bemærk: Acrylamid er neurotoksiske. Tilføje APS og TEMED umiddelbart før brug. Opskriften er tilstrækkeligt for en lille mia gel.
3 x Gel buffer 1,5 M ACA
150mM BisTris/HCl (pH 7,0)
Butik på + 4 ˚C.
CBB buffer 100 mM BisTris/HCl (pH 7,0) 0,5 M ACA
30% (w/v) saccharose
50 mg/ml Serva blå G
Butik på + 4 ˚C
Anode buffer 50 mM BisTris/HCl (pH 7,0) Butik på + 4 ˚C. Bufferen kan tilberedes som 10 x stamopløsning
Katode buffer 50 mM Tricine
15 mM BisTris
0,01% Serva blå G
Butik på + 4 ˚C. Bufferen kan forberedes som 10 x stamopløsning, Tilføj farvestof til 1 x løsning
25BTH20G 25 mM BisTris/HCl (pH 7,0)
20% (w/v) glycerol
0,25 mg/ml Pefabloc (tilføje frisk)
10 mM NaF (tilføje frisk)
Bufferen kan tilberedes som 2 X stamopløsning (butik på + 4 ˚C), men tilføjer Pefabloc og NaF frisk
Vaskemiddel buffer 2% β-dodecyl maltoside/Digitonin (w/v)
25 mM BisTris/HCl (pH 7,0)
20% (w/v) glycerol og
0,25 mg/ml Pefabloc (tilføje frisk fra stamopløsningen)
10 mM NaF (tilføje frisk)
Rengøringsmidler kan tilberedes som 5-10% stamopløsninger (i vand). Hvis andre rengøringsmidler anvendes, har den endelige vaskemiddel koncentration skal optimeres.

Tabel 1. Buffere og løsninger til native gelelektroforese

Buffer Indhold Kommentarer
Laemmli buffer 138 mM Tris/HCL pH 6,8
6M urinstof
22,2% (v/v) glycerol
4,4% SDS
Reference: 9
12% acrylamid, 6M urinstof SDS adskillelse gel 50% AA, 1,33% bis-AA: 10,5 mL
20% SDS: 0,7 mL
1,5 M Tris-HCl (pH 8,8): 8,05 mL
Urinstof: 12,6 g
MQ-H2O: 6.16 mL
10% APS: 200 ΜL
TEMED 28 ΜL
Bemærk: Acrylamid er neurotoksiske. Opskriften er egnet til casting én stor SDS-gel.
6% acrylamid, 6M urinstof SDS stabling gel 50% AA, 1,33% bis-AA: 1,2 mL
20% SDS: 0,2 mL
0,5 M Tris-HCl (pH 6,8): 2,5 mL
Urinstof: 3,6 g
MQ-H2O: 3,45 mL
10% APS: 100 ΜL
TEMED 10 ΜL
Bemærk: Acrylamid er neurotoksiske.
SDS kører buffer 19 mM Tris
2,5 mM glycin
0,01% SDS

Tabel 2. Buffere for 2D-SDS-PAGE

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fotosyntetiserende energi konvertering maskiner er sammensat af store multisubunit proteinkomplekser, som er indlejret i tylakoid membran. Denne protokol beskriver en grundlæggende metode til analyse af planten tylakoid proteinkomplekser fra Arabidopsis thaliana med BN-side kombineret med 2D-SDS-PAGE. Protokollen er også velegnet til analyse af tylakoid proteinkomplekser fra tobak og spinat tylakoiderne, men kan kræve mindre justeringer.

Til oploesning af membran proteinkomplekser, er nonionisk rengøringsmidler almindeligt anvendt til deres evne til at bevare komplekser i deres oprindelige form. Her, blev to almindeligt anvendte detergenter β-DM og digitonin anvendt. Dodecyl maltoside solubilizes individuelle proteinkomplekser, der henviser til, at digitonin kan bruges til analyse af større protein kompleks forsamlinger10. Den voluminøse struktureret digitonin er ikke i stand til at passe stramt appressed grana partitioner og derfor solubilizes kun ikke-appressed regionerne tylakoid membran3,11. Det er derfor velegnet til analyse af stroma tylakoiderne og grana margener. Men når digitonin bruges sammen med aminokapronsyre syre (ACA), kombinationen solubilizes hele tylakoid membran, herunder også appressed grana tylakoiderne12. Via en ukendt mekanisme tillader ACA digitonin at få adgang til partitionen kløften mellem tilstødende grana membran lag. Vigtigere, digitonin bevarer labile interaktioner mellem proteinkomplekser og kan derfor bruges til analyse af labile proteiner super og megacomplexes, der er mest rigelige i ikke-appressed tylakoid regioner8. Det skal bemærkes, at vaske-og rengøringsmidler altid blande sig med nogle af de labile interaktioner mellem proteinkomplekser og det er derfor ikke muligt at isolere helt intakt netværk af proteinkomplekser. Nogle af komplekser er dissociation produkter, der er blevet afbrudt fra større protein kompleks foreninger under tylakoid oploesning og elektroforese. Kvaliteten af BN-side adskillelse afhænger ikke kun på Prøveforberedelse (protein kompleks oploesning), men også på kvaliteten af isolation tylakoid skal ske fra friske blade. Hvis særlige pleje ikke er taget, forringe PSII-LHCII supercomplexes typisk i løbet af β-DM oploesning.

BN-side opretholder integriteten af solubilized proteinkomplekser. BN gel adskillelse kapacitet afhænger af acrylamid gradient, og gradient skal være optimeret baseret på proteinkomplekser af interesse. Porestørrelse af Polyacrylamiden kan ændres ved at ændre koncentrationen gradient (samlede acrylamid koncentration, T) eller ved at justere bis- acrylamid koncentration (C) i forhold til det samlede beløb af acrylamid monomerer4. BN-PA gel graduering, der benyttes her er optimeret og velegnet til analyse af store protein super- og megacomplexes3. Vigtigere, skal porestørrelse stabling gel være stor at tillade alle komplekser til at angive at den adskillelse gel. Efter protein kan komplekse separation med BN-side, sammensætning eller struktur af hver enkelt protein kompleks band analyseres yderligere. For strukturel analyse protein kompleks af interesse skal være elueres fra gel og mest labile komplekser kan være ødelagt under eluering. Derfor, saccharose tæthed farveforløb bruges oftere til protein kompleks rensning for strukturel analyse. For analyse af spektroskopiske egenskaber af proteinkomplekser i gelen, siden clear-indfødte, skal anvendes i stedet for BN-side, da Coomassie farvning forstyrrer sådanne målinger. For analyse af subunit sammensætningen af proteinkomplekser, er en denaturering 2D-SDS-siden beskrevet her. Underenheder af hvert kompleks er adskilt i en lodret linje og let kan identificeres. Det må bemærkes, at flere proteiner kan være til stede i et enkelt sted og underenheder i samme vertikale linje kan henhøre under forskellige komplekser Co overflytning i mia-side.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne forskning blev økonomisk støttet af Finlands Akademi (projektnumre 307335 og 303757) og solenergi i biomasse (SE2B) Marie Skłodowska-Curie tilskudsaftalen (675006). Protokollen er baseret på reference3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-aminocaproic acid (ACA) Sigma-Aldrich A2504
BisTris Sigma-Aldrich B4429
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Acrylamide (AA) Sigma-Aldrich A9099 Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside Sigma-Aldrich D4641
Tricine Sigma-Aldrich T0377
Tris Sigma-Aldrich T1503
SDS VWR 442444H
Urea VWR 28877.292
Glycerol J.T. Baker 7044
Sodium Fluoride (NaF) J.T. Baker 3688
EDTA disodium salt J.T. Baker 1073
Digitonin Calbiochem 300410 Caution:Toxic!
Pefabloc SC Roche 11585916001
Serva Coomassie Blue G Serva 35050
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
APS (Ammonium persulfate) Bio-Rad 161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine) Bio-Rad 1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide Omnipur 2610
Glycine Fisher G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) New England Biolabs P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml Corning 352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates Hoefer SE215
Gradient maker SG5 Hoefer
0.75 mm T-spacers Hoefer SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm Hoefer SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system Hoefer SE250
IPC-pump Ismatec
Power supply, PowerPac HV Bio-Rad 164-5097
Centrifuge Eppendorf 5424R
Rocker-Shaker Biosan BS-010130-AAI

PROTEAN II xi Cell
Bio-Rad 1651813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  2. Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
  3. Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
  4. Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
  5. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 384-394 (1989).
  6. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
  7. Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
  8. Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
  11. Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
  12. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
Analyse af tylakoid membran proteinkomplekser af blå indfødte gelelektroforese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).More

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter