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Biochemistry

ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58369

Summary

プロトコル植物の解明のためチラコイドのタンパク質の複雑な組織と組成ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲルとゲルの電気泳動 (BN-PAGE) と 2 D SDS ページの説明。プロトコルは、シロイヌナズナ、最適です、マイナーな修正と他の植物種に使用できます。

Abstract

光合成電子伝達鎖 (など) は、NADPH および ATP の形で化学エネルギーに太陽エネルギーを変換します。4 つの大きい蛋白質の複合体は、チラコイド膜の収穫 NADP+ 経由で2 ダメージを与えるに水から電子をドライブし、ATP の生産のために作成したプロトンの勾配を使用するための太陽エネルギーに埋め込まれます。光化学系 II 光化学系 PSI、チトクローム b6f (チトクローム b6f) および atp アーゼは、異なる方向とチラコイド膜ダイナミクスと多蛋白質複合体すべてです。ネイティブのゲルの電気泳動分離に続く穏やかな洗剤によって、複合体膜の完全性を可で組成、チラコイド膜蛋白質の複合体の相互作用に関する貴重な情報を得ることが、複合体。ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (BN-PAGE) は、ネイティブと機能的な形で蛋白質の複合体の分離に使用される手法です。詳細な構造解析のための蛋白質の複雑な浄化の方法を使用できますが、タンパク質複合体の動的相互作用を分析するためのツールも用意されています。メソッド、ミトコンドリア呼吸系膜タンパク質の解析用に開発されたが、以来最適化、チラコイドのタンパク質複合体の解離のために改善します。ここでは、不安定な光合成タンパク質複合体とシロイヌナズナにおけるそれらの相互作用の分析の詳しい最新のプロトコルを提供します。

Introduction

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大規模な multisubunit 蛋白質複合体の光化学系 PSI と PSII、Cyt b6f と ATPase 光合成の明反応で NADPH および ATP の生産を調整します。高等植物葉緑体密着グラナを有し、非密着の実質チラコイド構造的に異種の膜構造は、チラコイド膜の複合体があります。ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (BN-PAGE) は、ネイティブおよび生物学的にアクティブな形で大規模な multisubunit 蛋白質複合体の解析に広く使用された方法です。メソッドは、ミトコンドリア膜タンパク質複合体1の解剖のために設立されましたが、チラコイド膜ネットワーク3からの蛋白質の複合体の分離の後でカスタマイズされています。(I) の構造解析、タンパク質複合体のネイティブ相互作用を決定するためには (ii) と (iii) 蛋白質複合体の全体的な組織の分析のための個々 のチラコイドのタンパク質複合体の精製方法が適してください。環境のキューを変更します。

分離前に蛋白質の複合体は一般に軽度し、蛋白質の複合体のネイティブ構造を維持する厳選された非イオン性洗剤膜から分離されます。洗剤を含んで疎水性と親水性のサイト特定濃度は, 上記フォーム安定するミセルと呼ばれる臨界ミセル濃度 (CMC)。脂質脂質の相互作用の中断と蛋白質の複合体の可溶化 CMC 結果上記洗剤の濃度を増加させます。洗剤の選択には、興味の複雑な蛋白質の安定性と洗剤の可溶化能力によって異なります。日常的に使用されている洗剤には、α/β-ドデシル-maltoside とジギトニンが含まれます。次の天然状態の膜タンパク質の可溶化、不溶性物質が遠心分離によって削除されます。高等植物におけるチラコイド膜が構造で高いというヘテロなといくつかの洗剤 (例えばジギトニン) が選択的に膜3の特定の一部分だけを可溶化します。したがって、それは常に葉緑素含量とクロロフィル a/b を決定することにより選択した洗剤の可溶化能力を決定する重要な蛋白質の複雑な組織または蛋白質の複合体間の相互作用を特徴付ける、可溶化画分の収量および表されたチラコイド (サブ) ドメインをそれぞれ評価する上清の比率。そのままチラコイド成長光順化植物のクロロフィル a/b 比は、通常約 3 chl、チラコイド画分の b 値を豊かにグラナのいずれか/または実質チラコイドを下回る (2.5 ~) (~ 4.5) の合計の値を超えるかチラコイド、それぞれ。

タンパク質複合体に負の電荷を提供するには、Coomassie ブリリアント ブルー (CBB) 染料は可溶化されたサンプルに追加されます。電荷移動による蛋白質の複合体は陽極の方に移行、その分子の質量と形状によるとアクリルアミド (AA) グラデーションに区切られます。効果的かつ高分解能の分離は、線形アクリルアミド濃度勾配を使用して実現されます。自分サイズに依存した細孔サイズ制限に達するまで、電気泳動中に蛋白質複合体を陽極に向かって移行します。ポリアクリルアミドのゲルの細孔径によって異なります (i) 総アクリルアミド/ビス- アクリルアミド濃度 (T) と (ii) 架橋剤bis- アクリルアミド モノマー濃度 (C) 合計モノマー4を基準にして。BN ページと分離後、タンパク質複合体はさらに 2 番目の次元 (2 D) - SDS のページでに個々 のタンパク質サブユニットに分割できます。ここでは、BN-ページ/2 D-SDS-PAGE によるチラコイド膜蛋白質複合体の分析のための詳しいプロトコルについて述べる。

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Protocol

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1 BN を準備するゲルの1,2,3

  1. 8 cm × 10 cm プレート (矩形ガラスとアルミナの切欠きプレート) 0.75 mm スペーサーを使用して製造元の指示に従ってゲル キャスターを設定します。
  2. 撹拌プレート上グラデーション ミキサーを置き、ペリスタルティック ポンプ チューブで接続します。注射針をチューブのもう一方の端に接続し、ガラスとアルミのプレート間針を配置します。「重い」(H) に場所マグネチックスターラーの商工会議所。
  3. 分離ゲル グラデーションの 3.5% (v/v)、12.5% (v/v) 15 mL コニカル遠沈管にアクリルアミド (AA) ソリューションを準備 (表 1のレシピを参照してください)。早すぎる重合を防ぐためには、ソリューションを準備している間氷上遠沈管を保ちます。
    注意: アクリルアミドは神経毒性や発癌性、摩耗防護服と手袋です。
  4. グラデーションのミキサーにソリューションをピペッティングする前に 5 %temed と AP の権利を追加します。H チャンバーに 12.5% 溶液をピペットで移しなさい。
    1. ソリューション L チャンバーへの入力を許可する 2 つの部屋をつなぐ弁を開くことによって「光」(L) と H 室を接続するチャネルから空気の泡を削除します。ソリューションのトレース バック H 室にバルブとピペットを閉じます。
    2. 最後に、ピペット L チャンバーに 3.5% ソリューション。
  5. 磁性攪拌器のスイッチ (撹拌速度が、重要ではありませんが、それは重いと光ソリューションの適切な混合を確認してください)、バルブを開き、蠕動ポンプのスイッチします。ガラスとアルミのプレートの間をフローするゲル ソリューションを許可する、流量は約 0.5 mL/min をする必要があります。針は液体の上すべての時間をする必要があります、それはテープでガラス板の上部に付けることができます。
  6. H と L チャンバーを空にして、超純水でそれらを埋める、水ゲルの表面を優しくオーバーレイするようにします。ゲルの重合は、室温約 1-2 時間を取る
  7. 3% アクリルアミド溶液を準備 (表 1のレシピを参照してください) したピペットでゲル、スタッキングのための重合分離ゲルの上にスタッキングのゲル (スタッキングのゲルを鋳造する前に削除ゲルの表面を覆う水) サンプル ゲル櫛を配置し、間、ガラスとアルミ プレート回避気泡。
    1. 削除した純水の下でそっと櫛で 30-60 分を重合することができます。+4 ° C でゲルを格納します。
      一時停止ポイント。ゲルは +4 ° C で数日間保存できます。井戸とゲルの表面の乾燥を防ぐため湿潤ゲルすべき。

2 チラコイドの可溶化1,2,3

注: すべての手順は非常に薄暗い光の下で行わなければなりません。サンプルおよび氷の上のバッファーを維持します。

  1. 最終的なクロロフィル濃度 1 mg/mL の冷たい 25BTH20G バッファーを分離チラコイドを希釈します。クロロフィルの 2 D BN SDS-PAGE 分析約 4-8 μ g の/サンプルが適しています。
    注: 実験に用いたチラコイド (を参照してください3チラコイド分離のプロトコル) の新鮮な葉から分離する必要があります。
  2. 洗浄バッファー、すなわち2% β-DM (w/v) または 2% の等量を追加ジギトニン (w/v)。ピペット先端部に優しくチラコイド サンプルに洗剤を混合し、空気の泡を避けます。洗剤の最終濃度が 1%、チラコイド 0.5 mg/mL のクロロフィルの。
    1. 氷 (β-DM) やロッカー/シェーカー (ジギトニン) の連続的な穏やかな混合常温 10 分 2 分チラコイドを可溶化します。
      注: ジギトニンと β DM 一般的にチラコイド膜タンパク質の可溶化に使用されます。その他の非イオン性洗剤を使用する場合洗剤の濃度と可溶化時間する必要があります最初最適化。通常洗剤濃度範囲 0.5%-5% (v/v) から。
      注意: ジギトニンは毒性・保護服・手袋です。
  3. +4 ° C で 20 分間 18,000 × g で遠心分離によって不溶性物質を削除します。
  4. 上清を新しい 1.5 mL チューブに転送し、CBB バッファーの 1/10 (v/v) をサンプルに追加します。
    注: チラコイド膜蛋白質複合体の全体の構成を調べたところ、収量および可溶性画分の表されたチラコイド ドメインを決定する勧めします。可溶化された材料の降伏を決定する (CBB を追加する) 前に、新しいチューブに上清の 5 μ L を取るし、クロロフィル コンテンツとクロロフィル測定、/b 比5

3. BN-PAGE-1,2,3

  1. 垂直電気泳動システム (例えば、プラント SE 250) にゲルを設定します。青い陰極バッファーとチャンバー上部バッファー (表 1参照) と陽極バッファー バッファー下院を注ぐ。
  2. 井戸にチラコイド サンプル (クロロフィルの例えば5 μ g) をロードします。
  3. 電気泳動を開始し、徐々 に電圧を増加: 75 V で 30 分間、30 分間 100 V、30 分 125 V、150 V の 1 h および複合体まで 175 V が完全に分離されています。ゲル + 4˚C、寒い部屋を使用するか、冷却装置がゲルの温度を調整するを実行します。
    注: は、サンプル フロントがゲルの約 3 分の 1 を移行したとき明確な陰極バッファーに青い陰極バッファーを変更します。
  4. 電気泳動の実行後画像のアーカイブ photoscanner とゲルをスキャンします。

4. 2 D SDS ページ

  1. 垂直電気泳動システム (ゲルのサイズ 16 cm × 20 cm) を組み立てます。1 mm のスペーサーを使用します。
  2. 2 D 櫛 (1 つのストリップの分子量マーカーの 1 つの標準的な井戸も大きな) と標準の SDS ゲル (12% アクリルアミド、6 M 尿素、表 2のレシピを参照してください) を準備します。
  3. BN ゲルから車線を切断し、(5 mL) チューブでそれを置きます。2 mL の塩化物イオンとバッファー (5% β-メルカプトエタノールを含む) を追加し、室温穏やかな揺れで 45 分のためのストリップを孵化させなさい
  4. 例えば空気の泡を回避するゲルの上に、スペーサーの助けを借りて、レーンを配置します。
  5. ピペット 5 μ L フィルター紙と場所も標準に紙の狭い部分の分子量マーカーの。
  6. BN-ゲルのストリップとマーカー紙をシールするには、ゲルのストリップの上に (実行バッファー) に 0.5% の agarose を注ぎ、固化することができます。
  7. 標準的なプロトコルによると電気泳動を行います。後、電気泳動の実行など可視ルビー汚れが付いている蛋白質または6によると染色銀を視覚化します。

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Representative Results

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図 1に代表的な 2 D/BN-PAGE SDS システムは、ジギトニンと β DM 可溶化チラコイド膜タンパク質の分離や詳細な蛋白質サブユニット組成を示します。可溶化ジギトニン チラコイド (図 1 aの上部に上水平ゲル) の蛋白質の複雑なパターンは、PSII LHCII PSI の megacomplex、2 つの大きな PSII LHCII の supercomplexes (sc)、PSI LHCII とらえ超複合体、PSI 単量体 (m)、PSII m/Cyt 含まれています。b6f、疎結合 (L)-LHCII 三量体 (図 1 a)。少し強い洗剤、β-DM、全体チラコイド膜 (図 1 bの上に水平のゲル)、可溶性しますが、蛋白質の複合体間の弱い相互作用を維持することはできなかった。Β DM とチラコイドを可溶化は通常 4 つの (量の異なる LHCII アンテナ) と PSII LHCII supercomplexes、PSII ダイマー (d) および PSI m、atp アーゼ、PSII m を生成および Cytb6f、M-LHCII L LHCII と LHCII モノマー (図 1 b)。Β-DM とは異なりジギトニン LHCII モノマーのマイナーな量だけが生成されます。タンパク質の複雑なパターンは異なる光条件に植物の暴露に応じて異なる場合があります、蛋白質の複雑な相互作用が動的、すなわち蛋白質のリン酸化に依存しているので、突然変異系統間も異なる場合があります。図 1 A と B でネイティブのゲルのストリップの下の SDS PA ゲルは最初ジギトニンまたは β DM 可溶化各蛋白質の複合体のポリペプチド組成を表しています。

Figure 1
図 1。二次元 BN-/SDS ページ シロイヌナズナ チラコイドの。チラコイド膜タンパク質可溶化 (A) 1% ジギトニンと (B) 1% β-DM と区切られた最初 1 D BN ページ (上レーン) とそれぞれの複合体の個々 の蛋白質組成を示すその後の 2次元 SDS ページ。塩化物イオンとバッファーの変化と BN ストリップの孵化、ため (BN ストリップ) の各複合体の蛋白質の亜単位を切り離して、2 D SDS ページの中に縦の線で区切ら。タンパク質の同定は、質量分析参照78に記載されてに基づいています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

バッファー コンテンツ コメント
3.5% (T) アクリルアミド (AA) BN 分離ゲル 48 %aa、1.5% ビス AA: 148 μ L
3xGel バッファー: 700 μ L
75% (w/v) グリセロール: 140 μ L
超純水の H2o: 1092 μ L
5 %AP: 15 Μ L
TEMED 3 Μ L
注: アクリルアミドは神経毒性です。使用直前に TEMED と AP を追加します。レシピは 1 つ小さな BN ゲルを鋳造のために十分です。
12.5% (T) アクリルアミド (AA) BN 分離ゲル 48 %aa、1, 5% ビス AA: 530 μ L
3xGel バッファー: 700 μ L
75% (w/v) グリセロール: 560 μ L
超純水の H2o: 290 μ L
5 %AP: 11 Μ L
TEMED 2 Μ L
注: アクリルアミドは神経毒性です。使用直前に TEMED と AP を追加します。レシピは 1 つ小さな BN ゲルを鋳造のために十分です。
3% (T) アクリルアミド (AA) BN スタッキングのゲル 20 %aa、5% ビス AA: 180 μ L
3xGel バッファー: 500 μ L
超純水の H2o: 800 μ L
5 %AP: 30 Μ L
TEMED 3 Μ L
注: アクリルアミドは神経毒性です。使用直前に TEMED と AP を追加します。レシピは 1 つ小さな BN ゲルのために十分です。
ゲルのバッファー x 3 1.5 M ACA
150 mM BisTris/塩酸 (pH 7.0)
店で + 4 ° C。
CBB バッファー 100 mM BisTris/塩酸 (pH 7.0) 0.5 M ACA
30% (w/v) ショ糖
50 mg/ml に Serva ブルー G
店で + 4 ° C
陽極バッファー 50 mM BisTris/塩酸 (pH 7.0) 店で + 4 ° C。10 倍原液としてバッファーを準備すること
陰極バッファー 50 mM トリシン
15 mM BisTris
0.01 %serva ブルー G
店で + 4 ° C。バッファーは 10 x 貯蔵液の準備、染料を 1 x ソリューションに追加
25BTH20G 25 mM BisTris/塩酸 (pH 7.0)
20% (w/v) グリセロール
0.25 mg/ml Pefabloc (たてを追加)
10 mM NaF (たてを追加)
2 X の原液 (で店 + 4 ° C) が新鮮な Pefabloc とフッ化ナトリウムを追加バッファーを準備することができます。
洗浄バッファー 2% β-n-ドデシル maltoside ジギトニン (w/v)
25 mM BisTris/塩酸 (pH 7.0)
20% (w/v) グリセロールと
0.25 mg/ml Pefabloc (原液から挽きたてを追加)
10 mM NaF (たてを追加)
(水) の 5-10% 原液として洗剤を用意できます。その他の洗剤を使用している場合、最終の洗剤濃度は最適化するようにしました。

表 1。バッファーとネイティブ電気泳動のためのソリューション

バッファー コンテンツ コメント
塩化物イオンとバッファー 138 mM トリス/塩酸 pH 6.8
6 M 尿素
22.2% (v/v) グリセロール
4.4% SDS
参照: 9
12% アクリルアミド、6 M 尿素 SDS 分離ゲル 1, 33% ビス AA 50 %aa: 10.5 mL
20 %sds: 0.7 mL
1.5 M トリス-HCl (pH 8.8): 8.05 mL
尿素: 12.6 g
MQ H2o: 6.16 mL
10 %AP: 200 Μ L
TEMED 28 Μ L
注: アクリルアミドは神経毒性です。レシピは、1 つの大きな SDS ゲルを鋳造に適しています。
6% アクリルアミド、6 M 尿素 SDS スタッキングのゲル 50 %aa、1.33% ビス AA: 1.2 mL
20 %sds: 0.2 mL
0.5 M トリス-HCl (Ph6.8): 2.5 mL
尿素: 3.6 g
MQ H2o: 3.45 mL
10 %AP: 100 Μ L
TEMED 10 Μ L
注: アクリルアミドは神経毒性です。
SDS 実行バッファー 19 mM トリス
2.5 mM グリシン
0.01% SDS

表 2。2 D SDS ページのバッファー

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Discussion

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光合成エネルギー変換機構は、大規模な multisubunit 蛋白質複合体は、チラコイド膜に埋め込まれているので構成されます。このプロトコルでは、BN-PAGE-2D SDS-PAGE と組み合わせるとシロイヌナズナから植物チラコイドのタンパク質複合体の分析のための基本的な方法について説明します。プロトコルはタバコとほうれん草のチラコイドからチラコイド膜タンパク質の解析にも最適ですが、微調整が必要な場合があります。

非イオン性洗剤、膜蛋白質複合体の可溶化のため、そのままの形で複合体を維持するためには彼らの能力のため使用されます。ここでは、2 つの一般的に使用される洗剤 β-DM とジギトニンが適用されました。ジギトニンは大きい蛋白質複雑なアセンブリ10の分析のため使用できるに対し、ドデシル maltoside 可溶性個々 の蛋白質の複合体です。かさばる構造ジギトニンはしっかりと密着グラナのパーティションに収めることができる、したがって可溶性チラコイド膜3,11の非密着の地域のみ。したがって、実質チラコイドやグラナ マージンの解析に適しています。ただし、ジギトニン アミノカプロン酸 (ACA) とともに使用する場合組み合わせ可溶性密着グラナ チラコイド12も含む全体のチラコイド膜です。未知のメカニズムでは、ACA はジギトニンが隣接するグラナ膜層間のパーティション ギャップにアクセス可能します。重要なは、ジギトニン不安定な相互作用タンパク質複合体を保持し、不安定なタンパク質の解析のため、ことができますスーパーと megacomplexes は、非密着のチラコイド地域8に最も多い。それは洗剤が、不安定な相互作用蛋白質の複合体のいくつかの常に妨げる、従って蛋白質の複合体の完全にそのままネットワークを分離することは注意しなければなりません。いくつかの複合体は、チラコイドの可溶化により大きい蛋白質の複雑な連合および電気泳動から切断されている解離製品です。BN-PAGE - 分離の品質はサンプル準備 (蛋白質複雑な可溶) のみならず、新鮮な葉から行う必要がありますチラコイドの分離の品質にも依存します。特別な注意が取られなかった場合、PSII LHCII supercomplexes は通常 β DM 可溶化時に低下します。

BN-PAGE-は、可溶性蛋白質の複合体の整合性を維持します。BN のゲルの分離容量によって異なりますアクリルアミド グラデーションとグラデーションは、興味の蛋白質の複合体に基づいて最適化する必要があります。ポリアクリルアミド ゲルの細孔径は、濃度勾配 (合計アクリルアミド濃度、T) を変更することによってまたはアクリルアミド単量体4の合計額を基準にしてbis- アクリルアミド濃度 (C) を調整することによって変更できます。ここで使用する BN PA ゲル グラデーションは最適化し、大きい蛋白質スーパー ・ megacomplexes3の解析に適しています。重要なは、スタッキングのゲルの細孔径はすべて錯体の分離ゲルへの入力を許可するように大きなする必要があります。蛋白質の後は、BN ページ、構成または複雑なバンドごと個々 のタンパク質の構造を持つ複雑な分離をさらに分析できます。ゲルから溶出する必要があります興味の複合体の構造解析蛋白質と最も不安定中間体は、溶出の間に破壊される可能性があります。したがって、ショ糖密度勾配が多く構造解析のための蛋白質の複雑な浄化のために使用されます。ゲル蛋白質の複合体の分光学的特性の解析、Coomassie 染料はそのような測定と干渉するので、クリア ネイティブ ページは BN-ページの代わりに使用して必要があります。タンパク質複合体のサブユニット組成の分析、変化 2 D SDS-PAGE が記載されています。各複合体のサブユニットの縦線で区切られ、容易に識別することができます。いくつかのタンパク質は、単一の場所であるかもしれないあり同じ縦線のサブユニットが BN ページに移行する共同の複合体を分離する属していることに注意する必要があります。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この研究の財政上支えられるフィンランド アカデミー (プロジェクト番号 307335 と 303757) および太陽エネルギーによってバイオマス (SE2B) - キュリー ・ スクウォドフスカ助成契約を締結 (675006)。プロトコルは、参考3に基づいています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-aminocaproic acid (ACA) Sigma-Aldrich A2504
BisTris Sigma-Aldrich B4429
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Acrylamide (AA) Sigma-Aldrich A9099 Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside Sigma-Aldrich D4641
Tricine Sigma-Aldrich T0377
Tris Sigma-Aldrich T1503
SDS VWR 442444H
Urea VWR 28877.292
Glycerol J.T. Baker 7044
Sodium Fluoride (NaF) J.T. Baker 3688
EDTA disodium salt J.T. Baker 1073
Digitonin Calbiochem 300410 Caution:Toxic!
Pefabloc SC Roche 11585916001
Serva Coomassie Blue G Serva 35050
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
APS (Ammonium persulfate) Bio-Rad 161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine) Bio-Rad 1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide Omnipur 2610
Glycine Fisher G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) New England Biolabs P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml Corning 352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates Hoefer SE215
Gradient maker SG5 Hoefer
0.75 mm T-spacers Hoefer SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm Hoefer SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system Hoefer SE250
IPC-pump Ismatec
Power supply, PowerPac HV Bio-Rad 164-5097
Centrifuge Eppendorf 5424R
Rocker-Shaker Biosan BS-010130-AAI

PROTEAN II xi Cell
Bio-Rad 1651813

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References

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Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).More

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).

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