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Biochemistry

Análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por electroforese em Gel azul nativo

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58369

Summary

Um protocolo para a elucidação da planta tilacoides proteína complexa organização e composição com poliacrilamida nativa azul gel eletroforese (BN-página) e 2D-SDS-PAGE é descrito. O protocolo é otimizado para a Arabidopsis thaliana, , mas pode ser usado para outras espécies de plantas com pequenas modificações.

Abstract

Cadeia de transferência de elétrons fotossintética (ETC) converte energia solar em energia química na forma de NADPH e ATP. Quatro grandes complexos de proteínas incorporado em tilacoides membrana colheita solar energia para conduzir os elétrons da água para NADP+ através de dois fotossistemas e usar o gradiente de prótons criado para a produção de ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b6f (Cyt b6f) e ATPase são todos os complexos Multiproteicos com orientação distinta e dinâmica na membrana tilacoides. Informações valiosas sobre a composição e as interações dos complexos proteína na membrana tilacoides podem ser obtidas pelo solubilizing os complexos da integridade da membrana por detergentes suaves, seguidos pelo nativo gel de separação eletroforética do complexos. Eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-página) é um método analítico usado para a separação de complexos de proteínas em sua forma nativa e funcional. O método pode ser usado para purificação de complexo de proteínas para análise estrutural mais detalhada, mas ele também fornece uma ferramenta para dissecar as interações dinâmicas entre os complexos de proteína. O método foi desenvolvido para a análise de complexos de proteína respiratória mitocondrial, mas desde então foi otimizado e melhorado para a dissecação dos complexos proteína tilacoides. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado atualizado para análise de complexos de proteínas fotossintéticas lábeis e suas interações em Arabidopsis thaliana.

Introduction

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Proteína multisubunit grandes complexos fotossistema PSI e PSII, Cyt b6f e ATPase coordenam a produção de NADPH e ATP em reações de luz fotossintéticas. Nos cloroplastos de plantas superiores, os complexos estão localizados na membrana tilacoides, que é uma estrutura de membrana estruturalmente heterogêneo, composto por grana apresso e não-apresso estroma contém. Eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-página) é um método amplamente utilizado na análise de grandes multisubunit complexos de proteínas em sua forma nativa e biologicamente ativo. O método foi criado para a dissecção da proteína de membrana mitocondrial complexos1, mas mais tarde foi personalizado para a separação dos complexos da proteína da membrana tilacoides rede3. O método é adequado (i) para a purificação de complexos de proteínas tilacoides individuais para análise estrutural, (ii) para determinar o nativas interações entre complexos de proteína e (iii) a análise da organização geral dos complexos da proteína Após alterar as sugestões ambientais.

Antes da separação, complexos da proteína são isolados da membrana com detergentes não iônicos cuidadosamente escolhidos, que são geralmente leves e preservar a estrutura nativa dos complexos da proteína. Detergentes contêm hidrofóbicos e hidrofílicos sites e micelas estável de forma acima de uma determinada concentração, chamado uma concentração crítica de micellar (CMC). Aumentando a concentração de detergente acima dos resultados CMC no rompimento das interações lipid-lipídico e a solubilização dos complexos da proteína. A escolha do detergente depende a estabilidade da proteína complexa de interesse e a capacidade de solubilização de detergente. Rotineiramente utilizados detergentes incluem α/β-dodecil-maltoside e digitonin. Após a solubilização dos complexos de proteína no seu estado nativo, material insolúvel é removido por centrifugação. Em plantas superiores, a membrana tilacoides é altamente heterogêneo em estrutura e alguns detergentes (por exemplo, digitonin) solubilizar seletivamente apenas uma fração específica da membrana3. Portanto, para caracterizar as interações entre os complexos de proteína ou proteína complexa organização, é crucial determinar sempre a capacidade de solubilização de detergente escolhido, determinando-se o teor de clorofila e a clorofila a/b relação de sobrenadante para avaliar o rendimento e o domínio representado tilacoides (sub), respectivamente, da fração solubilized. A clorofila a/b relação contém intacta de crescimento-luz acclimated plantas normalmente é em torno de 3, Considerando que a chl um / b valor de tilacoides frações enriquecidas em grana ou estroma contém cai abaixo (~ 2.5) ou superior (~ 4,5) o valor do total contém, respectivamente.

Para fornecer uma carga negativa para os complexos de proteína, a tintura de (CBB) azul brilhante de Coomassie é adicionada à amostra solubilized. Devido a mudança de carga, complexos de proteínas migram para o ânodo e são separados em um gradiente de acrilamida (AA) de acordo com sua massa molecular e a forma. Separação eficaz e de alta resolução é conseguida usando um gradiente de concentração de acrilamida linear. Durante a eletroforese, os complexos de proteína migram para o ânodo até atingirem o limite de tamanho de poro dependente do tamanho. O tamanho dos poros do gel de polyacrylamide depende (i) a acrilamida total /bis- acrilamida concentração (T) e (ii) sobre a cross-linker bis- acrilamida monômero concentração (C) em relação a monômeros total4. Após a separação com BN-página, os complexos de proteína podem ser subdivididos em suas subunidades de proteínas individuais por segunda dimensão (2D) - SDS - PAGE. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por BN-página/2D-SDS-PAGE.

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Protocol

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1. preparar BN1,2,3 do Gel

  1. Configure o rodízio de gel com placas de 8 x 10 cm (vidro retangular e placa entalhada da alumina) de acordo com as instruções do fabricante usando espaçadores de 0,75 mm.
  2. Coloque num prato de agitar um mixer gradiente e conectá-lo com a bomba peristáltica por uma tubulação. Anexar uma agulha da seringa para a outra extremidade do tubo e colocar a agulha entre a placa de vidro e alumínio. Agitador magnético do lugar para o "pesados" (H)-câmara.
  3. Preparar a 3,5% (v/v) e 12,5% (v/v), soluções de acrilamida (AA) em tubos de centrifuga conico de 15 mL para o gradiente de gel de separação (ver receitas no quadro 1). Para evitar a polimerização prematura, manter os tubos de centrífuga no gelo enquanto prepara as soluções.
    Atenção: A acrilamida é luvas e roupa protetora neurotóxico e carcinogênico, desgaste.
  4. Adicione 5% APS e TEMED direito antes de pipetagem de soluções para o mixer gradiente. A solução de 12,5% para a H-câmara de pipeta.
    1. Remova as bolhas de ar do canal ligando a "luz" (L) e H-câmara abrindo a válvula conectando as duas câmaras, permitindo que a solução entrar para a câmara de L. Feche a válvula e pipetar que os vestígios da solução de volta à câmara-H.
    2. Finalmente, pipetar a solução de 3,5% para a câmara de L.
  5. Ligue o agitador magnético (a velocidade da prisão não é crítica, mas deverá assegurar uma mistura adequada das soluções pesadas e leves), abrir as válvulas e ligar a bomba peristáltica. Permitir que o gel de soluções de fluxo entre a placa de vidro e alumínio, o caudal deve ser cerca de 0,5 mL/min. A agulha deve ser acima do líquido o tempo todo, pode ser colocado na parte superior da placa de vidro com uma fita.
  6. Quando a H-L-câmaras e ter esvaziado, preenchê-los com água ultrapura e permitir que a água delicadamente sobrepor a superfície do gel. A polimerização do gel leva cerca de 1-2 horas em RT
  7. Preparar a solução de acrilamida 3% (veja receita no quadro 1) para o empilhamento do gel em RT. Pipetar o gel de empilhamento do gel de separação polimerizado (antes de lançar o gel de empilhamento, remover a água cobrindo a superfície do gel) e colocar um pente de gel de amostra entre os vidro e alumínio placa evita bolhas de ar.
    1. Permita a polimerizar 30-60 min em RT. Remove o pente suavemente em água ultrapura. Armazene o gel no + 4 ˚ c.
      Ponto de pausa. O gel pode ser armazenado em + 4 ˚ c por alguns dias. O gel deve ser mantido em condições húmidas para evitar a secagem de poços e a superfície do gel.

2. tilacoides solubilização1,2,3

Nota: Todas etapas devem ser executadas sob luz muito fraca. Mantenha as amostras e buffers em gelo.

  1. Dilua contém isolado com buffer 25BTH20G gelada a uma concentração de clorofila final de 1 mg/mL. Para análise 2D-BN-SDS-PAGE aproximadamente 4-8 µ g de clorofila / amostra é adequada.
    Nota: A contém usado nos experimentos deve ser isolado de folhas frescas (para o protocolo de isolamento de tilacoides, ver3)
  2. Adicionar um volume igual de buffer de detergente, ou seja, 2% β-DM (p/v) ou 2% digitonin (w/v). Misture o detergente com a amostra de tilacoides suavemente com a ponta da pipeta e evitar bolhas de ar. A concentração final de detergente é 1% e a da contém 0,5 mg Chl/mL.
    1. Solubilize o contém por 2 min no gelo (β-DM) ou 10 minutos no RT com mistura suave contínua um balancim/agitador (digitonin).
      Nota: Digitonin e β-DM são geralmente utilizados para a solubilização dos complexos de proteínas de tilacoides. Se outros detergentes não-iônicos são utilizados, a concentração de detergente e o tempo de solubilização devem ser primeiro otimizados. Geralmente o intervalo de concentração de detergente de 0,5% - 5% (v/v).
      Atenção: O Digitonin é tóxico, roupas protetoras e luvas
  3. Remova o material insolubilized por centrifugação a 18.000 x g por 20 min, no + 4 ˚ c.
  4. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL e adicionar 1/10 (v/v) do buffer CBB para a amostra.
    Nota: Ao examinar a composição global as complexos de proteínas de membrana tilacoides, determinar o rendimento e o domínio de tilacoides representado da fração solubilizado é recomendado. Para determinar o rendimento do material solubilized, tirar 5 µ l do sobrenadante para um tubo novo (antes de adicionar a CBB) e medir o conteúdo de Chl e Chl um / b relação5.

3. BN-página1de,2,3

  1. Configure o gel para um sistema de eletroforese vertical (por exemplo, máquina SE 250). Encha a câmara de tampão superior com buffer de catodo azul (ver tabela 1) e despeje o buffer de ânodo para a câmara inferior do tampão.
  2. Carregar exemplo de tilacoides (por exemplo, 5 µ g de clorofila) nos poços.
  3. Começar a electroforese e aumentar gradualmente a tensão: 75 V por 30 min, 100 V por 30 min, 125 V por 30 min, 150 V por 1h e 175 V até os complexos foram separados completamente. Execute o gel à + 4˚C, usando uma sala fria ou ajustar a temperatura do gel com um sistema de refrigeração.
    Nota: Altere o buffer de catodo azul para um buffer de cátodo clara quando a frente de amostra migrou cerca de um terço do gel.
  4. Após o funcionamento electrophoretic, digitalize o gel com uma photoscanner para o arquivamento de imagem.

4. 2D-SDS-PAGE

  1. Monte o sistema de eletroforese vertical (gel de tamanho 16 cm x 20 cm). Utilize espaçadores de 1 mm.
  2. Prepare padrão do gel de SDS (12% do acrilamido, 6 M ureia, veja receita no quadro 2) com um pente-2D (único grande bem para o strip-tease e um bom padrão para marcador de peso molecular).
  3. Cortar a faixa de BN-gel e colocá-lo em um tubo (5 mL). Adicionar 2 mL de tampão de Laemmli (contendo 5% β-Mercaptoetanol) e incubar a tira por 45 min com agitação suave em RT
  4. Coloque a pista, com a ajuda de , por exemplo, um espaçador, em cima do gel, evitando bolhas de ar.
  5. Pipetar 5 µ l de marcador de peso molecular em um estreito pedaço de papel de filtro e coloque o papel com o padrão bem.
  6. Para selar a tira de BN-gel e o papel do marcador, derrame agarose de 0,5% (em reserva de marcha) em cima da faixa de gel e reserve para solidificar.
  7. Realize a eletroforese de acordo com protocolos padrão. Depois de executa o eletroforético, visualize as proteínas com por exemplo, mancha de Sypro Ruby ou prata coloração de acordo com6.

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Representative Results

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Um sistema representativo de 2D-BN/SDS-PAGE na Figura 1 demonstra a separação de digitonin e complexos de proteína β-DM-solubilizado tilacoides e sua composição de subunidade de proteína detalhadas. O padrão complexo de proteínas de digitonin solubilizado contém (gel de horizontal na parte superior no topo da figura 1A) contém a megacomplex do FSII LHCII-PSI, duas grandes razões do FSII-LHCII (sc), supercomplex PSI-LHCII, monômero PSI (m), do FSII m/Cyt b6f, frouxamente ligado (L)-trímero LHCII (figura 1A). O detergente ligeiramente mais forte, β-DM, solubiliza a membrana tilacoides inteira (gel de horizontal no topo da figura 1B), mas é incapaz de preservar as interações fracas entre complexos da proteína. Solubilização de tilacoides com β-DM normalmente produz quatro razões do FSII-LHCII (com quantidade diferente de antena LHCII anexada), dímero do FSII (d) e PSI m, ATPase, m do FSII e Cytb6f, M-LHCII, L-LHCII e LHCII monômero (figura 1B). Ao contrário de β-DM, digitonin produz apenas a menor quantidade de monômero LHCII. O padrão complexo de proteína pode diferir dependendo da exposição da planta para diferentes condições de luz e também pode diferir entre as linhas mutantes, desde que as interações complexas de proteína são dinâmicas e dependente ou seja, fosforilação de proteínas. Geles de SDS-PA abaixo as tiras de gel de nativo na Figura 1 A e B representam a composição de polipeptídeo de cada proteína complexa inicialmente solubilizada com digitonin ou β-DM.

Figure 1
Figura 1. Um bidimensional BN-página/SDS-PAGE de Arabidopsis tilacoides. Complexos de proteínas de tilacoides solubilizado com % 1 (A) digitonin e (B) 1% de β-MS e separaram primeiro por página-D 1-BN (faixa na parte superior) e posteriormente no 2D-SDS-PAGE para demonstrar a composição da proteína individual de cada complexo. Devido a incubação de BN-tiras com desnaturação buffer de Laemmli, as subunidades de proteína de cada complexo (na faixa de BN) dissociam e são separadas em uma linha vertical durante o 2D-SDS-PAGE. A identificação da proteína baseia-se na análise de espectrometria de massa, apresentada em referências7,8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Buffer de Conteúdo Comentários
3,5 gel de acrilamida (AA) BN separação de % (T) 48% AA, 1,5% bis-AA: 148 µ l
3xGel Buffer: 700 µ l
75% (p/v) glicerol: 140 µ l
Ultrapura H2O: 1092 µ l
APS 5%: 15 Μ l
TEMED 3 Μ l
Nota: A acrilamida é neurotóxica. Adicione APS e TEMED imediatamente antes do uso. A receita é suficiente para lançar um pequeno gel de BN.
12,5 gel de acrilamida (AA) BN separação de % (T) 48% AA, 1,5% bis-AA: 530 µ l
3xGel Buffer: 700 µ l
75% (p/v) glicerol: 560 µ l
Ultrapura H2O: 290 µ l
5% APS: 11 Μ l
TEMED 2ΜL
Nota: A acrilamida é neurotóxica. Adicione APS e TEMED imediatamente antes do uso. A receita é suficiente para lançar um pequeno gel de BN.
Gel de acrilamida (AA) BN empilhamento de 3% (T) 20% AA, 5% bis-AA: 180 µ l
3xGel Buffer: 500 µ l
Ultrapura H2O: 800 µ l
5% APS: 30 Μ l
TEMED 3 Μ l
Nota: A acrilamida é neurotóxica. Adicione APS e TEMED imediatamente antes do uso. A receita é suficiente para um pequeno gel de BN.
3 x amortecedor Gel 1.5 ACA DE M
BisTris/HCl (pH 7.0) de 150mM
Loja + 4 ˚ c.
Buffer de CBB 100 mM BisTris/HCl (pH 7.0) 0,5 M ACA
30% (p/v) de sacarose
Serva de 50 mg/ml azul G
Loja + 4 ˚ c
Buffer de ânodo 50 mM BisTris/HCl (pH 7.0) Loja + 4 ˚ c. Tampão pode ser preparado como solução x 10
Buffer de cátodo 50mm Tricine
15 mM BisTris
Serva de 0,01% azul G
Loja + 4 ˚ c. Buffer pode ser preparado como 10 x solução-mãe, adicionar o corante para a solução de 1 x
25BTH20G 25 mM BisTris/HCl (pH 7.0)
glicerol 20% (p/v)
0,25 mg/ml Pefabloc (adicionar recentemente)
10mm NaF (adicionar recentemente)
Reserva pode ser preparada como 2 X solução estoque (loja + 4 ˚ c), mas adicionar Pefabloc e NaF recentemente
Buffer de detergente 2% β-dodecil maltoside/Digitonin (p/v)
25 mM BisTris/HCl (pH 7.0)
20% (p/v) glicerol e
0,25 mg/ml Pefabloc (adicionar recentemente a partir da solução estoque)
10mm NaF (adicionar recentemente)
Detergentes podem ser preparados como soluções estoque de 5-10% (em água). Se outros detergentes são utilizados, a concentração final de detergente deve ser otimizado.

Tabela 1. Buffers e soluções para a electroforese do gel nativo

Buffer de Conteúdo Comentários
Buffer de Laemmli pH de 138 mM Tris/HCL 6,8
Ureia de 6m
22,2% (v/v) glicerol
4,4% SDS
Referência: 9
12% do acrilamido, 6m ureia SDS separação gel 50% AA, 1,33% bis-AA: 10,5 mL
20% SDS: 0,7 mL
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8): 8,05 mL
Ureia: 12,6 g
MQ-H2O: mL 6,16
10% APS: 200 Μ l
TEMED 28 Μ l
Nota: A acrilamida é neurotóxica. A receita é apropriada para lançar uma grande SDS-gel.
6% do acrilamido, gel de empilhamento de ureia SDS de 6m 50% AA, 1,33% bis-AA: 1,2 mL
20% SDS: 0,2 mL
0,5 M Tris-HCl (pH 6,8): 2,5 mL
Ureia: 3,6 g
MQ-H2O: mL 3,45
10% APS: 100 Μ l
TEMED 10 Μ l
Nota: A acrilamida é neurotóxica.
Buffer de execução SDS 19 mM Tris
Glicina de 2,5 mM
0,01% SDS

Tabela 2. Amortecedores para 2D-SDS-PAGE

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Discussion

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As máquinas de conversão de energia fotossintética é composta por grandes multisubunit complexos de proteínas, que são encaixados na membrana tilacoides. Este protocolo descreve um método básico para análise dos complexos proteína vegetal tilacoides de Arabidopsis thaliana com BN-página combinada com 2D-SDS-PAGE. O protocolo é também adequado para a análise de complexos de proteínas tilacoides de tabaco e espinafre contém, mas pode precisar de pequenos ajustes.

Para a solubilização dos complexos de proteínas de membrana, detergentes não iônicos são comumente usados para a sua capacidade para preservar os complexos em sua forma nativa. Aqui, foram aplicados dois detergentes usados β-DM e digitonin. Dodecyl maltoside solubiliza complexos de proteínas individuais, Considerando que o digitonin pode ser usado para a análise de conjuntos complexos de proteína maior10. O volumoso digitonin estruturado é incapaz de caber para as partições de grana firmemente apresso e solubiliza, portanto, somente as regiões não-apresso dos tilacoides membrana3,11. É, portanto, adequado para a análise das margens de estroma contém e grana. No entanto, quando digitonin é usado junto com o Ácido aminocaproico (ACA), a combinação solubiliza a membrana tilacoides inteira, incluindo também a grana apresso contém12. Através de um mecanismo desconhecido, ACA permite digitonin ter acesso à gap partição entre camadas de membrana adjacente grana. Importante, digitonin preserva lábil interações entre complexos de proteínas e, portanto, pode ser usado para a análise da proteína lábil super e megacomplexes, que são mais abundantes em regiões não-apresso tilacoides8. Deve-se notar que detergentes sempre interferem com algumas das interações entre os complexos de proteína lábil e, portanto, não é possível isolar completamente intacto rede de complexos de proteínas. Alguns dos complexos são produtos de dissociação que foi desconectados maiores associações complexas de proteína durante a solubilização de tilacoides e a eletroforese. A qualidade da separação BN-página depende não só sobre a preparação da amostra (solubilização de complexos de proteína), mas também sobre a qualidade do isolamento de tilacoides, que deve ser feito de folhas frescas. Se não tomado especial cuidado, as razões do FSII-LHCII degradam normalmente durante a solubilização de β-DM.

BN-página mantém a integridade dos complexos proteína solubilizado. A capacidade de separação do gel BN depende do gradiente de acrilamida e o gradiente deve ser otimizado baseia os complexos da proteína de interesse. O tamanho dos poros do gel de polyacrylamide pode ser modificado alterando o gradiente de concentração (concentração de acrilamida total, T) ou ajustando a concentração de acrilamida - bis(C) em relação a quantidade total de acrilamida monômeros4. O gradiente de gel de BN-PA usado aqui é otimizado e adequado para a análise de proteína grande supere megacomplexes3. Importante, tamanho dos poros do gel de empilhamento deve ser grande para permitir que todos os complexos entrar para o gel de separação. Depois da proteína complexa separação com BN-página, a composição ou estrutura de cada banda de complexo de proteínas individuais pode ser mais analisada. Para análise estrutural da proteína devem ser eluído complexos turísticos do gel e mais lábil complexos podem ser destruídos durante a eluição. Portanto, gradiente de densidade de sacarose é mais frequentemente usado para a purificação de proteínas complexas para análise estrutural. Para a análise das propriedades espectroscópicas dos complexos proteína no gel, a página de clear-nativo deve ser usada em vez de BN-página, desde que o corante Coomassie interfere com tais medições. Para análise da composição dos complexos proteína subunidade, um desnaturação 2D-SDS-PAGE é descrito aqui. As subunidades de cada complexo são separadas em uma linha vertical e podem ser facilmente identificadas. Deve notar-se que várias proteínas podem estar presentes em um único ponto e as subunidades na mesma linha vertical podem pertencer para separar complexos co migrando na BN-página.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada financeiramente pela Academia da Finlândia (números do projeto 307335 e 303757) e Energia Solar no acordo de subvenção de biomassa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). O protocolo é baseado na referência3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-aminocaproic acid (ACA) Sigma-Aldrich A2504
BisTris Sigma-Aldrich B4429
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Acrylamide (AA) Sigma-Aldrich A9099 Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside Sigma-Aldrich D4641
Tricine Sigma-Aldrich T0377
Tris Sigma-Aldrich T1503
SDS VWR 442444H
Urea VWR 28877.292
Glycerol J.T. Baker 7044
Sodium Fluoride (NaF) J.T. Baker 3688
EDTA disodium salt J.T. Baker 1073
Digitonin Calbiochem 300410 Caution:Toxic!
Pefabloc SC Roche 11585916001
Serva Coomassie Blue G Serva 35050
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
APS (Ammonium persulfate) Bio-Rad 161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine) Bio-Rad 1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide Omnipur 2610
Glycine Fisher G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) New England Biolabs P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml Corning 352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates Hoefer SE215
Gradient maker SG5 Hoefer
0.75 mm T-spacers Hoefer SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm Hoefer SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system Hoefer SE250
IPC-pump Ismatec
Power supply, PowerPac HV Bio-Rad 164-5097
Centrifuge Eppendorf 5424R
Rocker-Shaker Biosan BS-010130-AAI

PROTEAN II xi Cell
Bio-Rad 1651813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
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  3. Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
  4. Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
  5. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 384-394 (1989).
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  7. Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
  8. Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
  11. Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
  12. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
Análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por electroforese em Gel azul nativo
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Cite this Article

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).More

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).

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