Automated panneau Multiplex Immunofluorescence pour des études sur des échantillons de tissus fixés au formol carcinome Immuno-oncologie

Summary

Un protocole détaillé pour un panel de six-marqueur immunofluorescence multiplex est optimisé et réalisé, en utilisant une passoire automatisé pour des résultats plus uniformes et une courte procédure. Cette approche peut être directement adaptée par tout laboratoire d’études immuno-oncologie.

Abstract

L’évolution continue en immuno-oncologie nécessite une compréhension accrue des mécanismes de l’immunologie du cancer. L’analyse d’immunoprofiling des échantillons de tissus de biopsies (FFIP) fixés au formol, paraffine est devenu un outil essentiel pour comprendre la complexité de l’immunologie des tumeurs et la découverte de nouveaux biomarqueurs prédictifs pour l’immunothérapie contre le cancer. Immunoprofiling analyse des tissus nécessite l’évaluation de marqueurs combinés, y compris les sous-populations de cellules inflammatoires et immunitaires points de contrôle, dans le microenvironnement tumoral. L’avènement des méthodes immunohistochimiques multiplex roman permet une analyse multiparamétrique plus efficace des sections de tissu unique que ne monoplex standard immunohistochimie (IHC). Une immunofluorescence multiplex disponible dans le commerce (si) méthode est basée sur l’amplification du signal-tyramide et, combinée à une analyse microscopique multispectrale, permet une meilleure séparation du signal de divers marqueurs dans les tissus. Cette méthode est compatible avec l’utilisation de l’anticorps primaires qui ont été optimisés pour IHC standard sur des échantillons de tissu FFPE. Ici nous décrivons en détail un protocole automatisé qui permet multiplex si l’étiquetage des échantillons de tissus de carcinome avec un panel de six-marqueur anticorps multiplex comprenant PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 et AE1/AE3 cytokératines au 4′, 6-diamidino-2-phénylindole comme contre-colorant cellule nucléaire. Le protocole de panneau multiplex est optimisé dans une passoire IHC automatisé pour un temps de coloration qui est plus courte que celle du protocole manuel et peut être directement appliqué et adapté par n’importe quel enquêteur de laboratoire pour les études sur des échantillons de tissu FFPE humains immuno-oncologie. Également décrites sont plusieurs commandes et outils, notamment une méthode de la goutte-contrôle pour contrôle de la qualité fine d’un nouveau panneau multiplex de IF, qui sont utiles pour l’optimisation et la validation de la technique.

Introduction

Immunoprofiling analyse des échantillons de tissu de tumeur FFPE est devenue une composante essentielle des études immuno-oncologie, en particulier pour la découverte et la validation de nouveaux biomarqueurs prédictifs pour l’immunothérapie contre le cancer dans le cadre d’essais cliniques^{1 ,2}. Épreuve à développement chromogène IHC, aide chimiques chromogènes tels que diaminobenzidine, reste la technique standard en pathologie diagnostique pour l’immunomarquage de biopsie tissulaire³. IHC standard peut également être utilisé pour le cancer des tissus immunoprofiling, y compris la quantification des sous-populations de lymphocytes associées à la tumeur et l’évaluation des niveaux d’expression de points de contrôle immunitaires comme ligand de mort cellulaire programmée 1 (PD-L1)^{4 ,},⁵. IHC standard est limitée, cependant, en ce que qu’un seul antigène peut être étiqueté par section de tissu. Parce que les études d’immunoprofiling exigent généralement l’analyse de l’expression combinée de plusieurs marqueurs, l’utilisation de l’IHC standard nécessiterait la coloration des coupes de tissus multiples, chacun colorées avec un seul marqueur et, par conséquent, serait considérablement limité pour l’analyse des échantillons de tissus petit comme les biopsies à l’aiguille centrale. Méthodes IHC standard sont aussi limitées pour l’évaluation des marqueurs qui sont co-exprimés par les populations de diverses cellules, comme c’est souvent avec des marqueurs de point de contrôle immunitaire tels que PD-L1, qui s’exprime par les macrophages associées à la tumeur et les cellules cancéreuses. Cette limitation a été signalée dans, par exemple, l’utilisation du standard monoplex IHC de pathologistes pour l’analyse quantitative d’un marqueur d’IHC exprimée par diverses cellules types⁶. Le développement de multiplex chromogène IHC techniques employant divers chromogènes colorées sur le même tissu section représente un développement ultérieur au cours de la méthode standard de monoplex IHC,⁷ bien qu’ils restent limités par l’immunomarquage de peu marqueurs et présentent également un défi technique important pour une évaluation appropriée des marqueurs exprimés dans les compartiments subcellulaires mêmes des mêmes populations cellulaires.

Les mises en garde susmentionnées concernant la disponibilité de tissus d’échantillons cliniques, ainsi que les limites des techniques IHC chromogène multiplexes, ont donné lieu à la nécessité d’élaborer des méthodes améliorées de multiplexes pour les études immuno-oncologie basées sur marquage fluorescent combinée avec les systèmes qui peuvent effectivement séparer les signaux des fluorophores multiples de la même lame d’imagerie. Une telle technique est basée sur l’amplification de signal de tyramide (TSA) combinée avec l’imagerie multispectrale microscopie pour couleur efficace séparation⁸. Un kit disponible dans le commerce axée sur les TSA emploie fluorophores optimisés pour imagerie multispectrale⁸ (voir la Table des matières). Un avantage essentiel de ce système est sa compatibilité avec les mêmes anticorps primaires non étiquetés qui ont déjà été validés et optimisé pour la norme chromogène IHC^9,10,11. Cela permet non seulement une optimisation plus rapide, mais aussi souplesse dans les modifications d’optimisation et panneau incorporant de nouvelles cibles. En outre, la méthode TSA multiplex immunofluorescence (mIF) peut être optimisée pour commercialement disponible IHC stainer des systèmes automatisés, afin de permettre un transfert simple de monoplex IHC chromogène au mIF.

Nous présentons ici un protocole pour un tableau de mIF pour les études immuno-oncologie basée sur automatisé mIF TSA coloration et utilise un scanner multispectral pour l’imagerie. Ce protocole peut être adapté et modifié par n’importe quel utilisateur de laboratoire ayant accès à des instruments décrits et les réactifs. Le protocole inclut un panel de six anticorps primaires pour l’immunoprofiling des carcinomes : PD-L1, PD-1, CD68 (comme un marqueur de pan-macrophage), CD8 (cellules T cytotoxiques), Ki-67 et AE1/AE3 (pan-cytokératine, utilisé comme un marqueur épithélial pour l’identification des cellules de carcinome). Une étude récente décrit l’optimisation d’un protocole de mIF TSA manuelle en utilisant IHC chromogène comme un standard de référence pour valider le multiplex¹²de coloration. La méthode de mise à jour présentée ici a été développée en utilisant un kit TSA commercialement disponible, sept couleurs optimisé dans une passoire automatisé, raccourcir considérablement le temps de coloration de 3 à 5 jours à 14 h, tout en améliorant la cohérence de la coloration. Outre le protocole principal détaillé présenté ici, une section de Matériaux supplémentaires comprend la méthode « goutte-control », un processus de contrôle de qualité supplémentaire pour évaluer un nouveau panneau de mIF, ainsi que des notes techniques pour l’optimisation, dépannage et le développement de nouveaux panneaux multiplex pour aider l’utilisateur de laboratoire mis en place et optimiser le procédé TSA mIF de mIF personnalisés panneaux.

Protocol

Remarque : Le protocole présenté ici décrit comment effectuer des immunoprofiling d’un panneau de mIF à l’aide de TSA pour six anticorps (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 et AE1/AE3) sur une coloration automatisée (voir Table des matières). Le protocole décrit également comment effectuer les contrôles de chute pour un contrôle de la qualité d’un nouveau panneau de mIF (voir Documentation supplémentaire). Dans ce protocole, la coloration est effectuée avec huit non-colorées FFIP diapositives de l’amygdale humaine (contrôle positif) et huit lames colorées ou non de l’adénocarcinome du poumon humain. La première diapositive est utilisée pour multiplex pleine coloration avec tous les six marqueurs, la deuxième diapositive pour le contrôle de l’isotype dans lesquelles aucun anticorps primaires ne sont utilisées et les autres six diapositives pour les contrôles de la goutte (voir Documentation supplémentaire). Un contrôle supplémentaire pour tissus autofluorescence est fortement recommandé et doit toujours être inclus dans un multiplexe étudier (voir Documentation supplémentaire). Toutefois, les enquêteurs peuvent employer des autres types de tumeurs et les contrôles selon leurs propres objectifs de projet. Utilisateurs de laboratoire sans expérience antérieure avec la mIF TSA méthode et les techniques de multispectraux devraient lire le Guide de développement d’IHC Multiplex (disponible en ligne à http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Bien que ce guide décrit un protocole manuel, il fournit également une bonne introduction à la mIF méthode de coloration. Toutes les coupes de tissus utilisés dans le présent protocole ont été anonymisés et approuvées conformément à la déclaration d’Helsinki.

1. des échantillons de tissus

1. Sélectionner un échantillon d’amygdale humaine FFIP contenant une hyperplasie lymphoïde pour être utilisé comme témoin positif et un échantillon d’adénocarcinome du poumon humain FFIP connus pour être PD-L1 positive. Consulter les diapositives de l’hématoxyline et éosine (H & E) des blocs de cancer du poumon sélectionnés pour confirmer la présence d’une tumeur. Il est important d’éviter les tumeurs avec nombreuses zones de nécrose car cela peut augmenter la coloration de fond non spécifique.
   Remarque : Pour cette optimisation, évitez d’utiliser des blocs de paraffine qui ont été entreposés pendant 10 ans ou plus et les tissus avec une apparence sèche dans le bloc de paraffine (consulter un technicien histologie).
2. À l’aide d’un microtome, couper 10 consécutifs coupes sériées de chaque bloc, 4 µm d’épaisseur. Monter les sections sur une lame de verre chargée positivement utilisée pour IHC, une section par diapositive.
   Remarque : Sections doivent être montées parfaitement plat sans rides, comme rides peuvent générer des artefacts de coloration. Numéroter les diapositives des coupes sériées de 1 à 10.
3. Préparer une nouvelle diapositive H & E sur la première section. Revoir la diapositive H & E à l’aide d’un pathologiste pour confirmer la présence de tumeur des tissus ou du poumon amygdale, restant dans le bloc.
   Remarque : Cette diapositive H & E peut aider, plus tard, avec la sélection des régions d’intérêt pour l’analyse multispectrale et phénotypage.
4. Stocker les coupes non colorées dans une boîte en plastique de glissière à 4 ° C pendant trois mois.

2. création d’un nouveau mIF programme de coloration sur une coloration automatisé : enregistrement des réactifs

Remarque : Réactifs doivent être ajoutés à la liste de réactif dans le logiciel automatisé stainer, avant qu’ils soient disponibles pour une utilisation dans les protocoles. Voir la Table des matières pour plus d’informations sur la version de modèle et les logiciels automatisés de stainer.

1. Cliquez sur l’onglet de réactifs dans le logiciel automatisé stainer. Cliquez sur Add pour désigner un nouveau réactif. Entrez le nom (par exemple, « 520 TSA réactif ») et le nom abrégé (par exemple, « TSA 520 »), notant qu’il y a un maximum de huit caractères. Sélectionnez accessoires dans le menu déroulant et définissez la supplier. Ne changez pas la Simple/Double tache de Single/séquentielle DS. La valeur par défaut souillant le protocole Protocolef. Ajustez le protocole de HIER par défaut à 20 ER1.
2. Enregistrez le nouveau réactif et répétez l’étape 2.1 pour tous les réactifs énumérés au tableau 1.

3. automatisé Stainer : Enregistrement des conteneurs

1. Écrivez le nom de réactif à utiliser sur le côté de chaque conteneur. Scannez le code barre sur le côté. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez le réactif approprié dans la liste. Sélectionnez une date d’expiration et enregistrez.
2. Répétez la procédure à l’étape 3.1 pour tous les réactifs énumérée au tableau 1.
3. Enregistrer le Kit Open Research. Analyser les deux codes à barres sur le côté de la trousse et suivez les invites à l’écran. Nommez le kit « Recherche Multiplex Kit 1. » S’inscrire à la 1 x tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris)-solution saline tamponnée dans le cadre de ce kit (tableau 1).

4. automatisé Stainer : Création d’un programme protocole de mIF

1. Le protocole de base multiplex est préchargé avec le nom Opale 7 Multiplex sur nouvelles des automates (voir la modèle et version logicielle dans la Table des matières). Localiser le protocole en filtrant pour « tous » au lieu de « préféré » sur l’écran du protocole. Si le protocole de base n’est pas présent, puis mettez à jour le logiciel automatisé stainer avec l’assistance du fabricant.
2. Toutes les modifications doivent être réalisées sur des copies de l’original du protocole. Avant d’effectuer les modifications, enregistrez l’original et créer une copie en cliquant sur l’onglet protocoles , puis un clic droit sur le protocole Opal 7 Multiplex et sélectionner l’option copie.
3. Changer le nom de protocole Multiplex 7 1 dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez l’onglet associé à l’appareil (modèle de plancher ou sur table). Faire correspondre le protocole supplémentaire tableauS1. Cliquez sur Ajouter réactif pour ajouter une étape de l’inhibition de la peroxydase 10 min (qui ne fait pas partie du protocole standard) et sélectionner l’inhibiteur de la peroxydase comme réactif.
4. Confirmer que les mesures de blocage utilisent un tampon de blocage de PKI. Veiller à ce que chaque anticorps primaire se réfère au réactif approprié, que pas d’anticorps secondaire utilisent un polymère HRP et que spectral 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) fourni avec le kit d’automatisation multispectral sert. Confirmer tous les choix en vérifiant le réactif qui a été désigné pour chaque étape respective dans le menu déroulant sur l’écran du protocole.

5. automatisé Stainer : Ajout de protocole de contrôle de l’Isotype et contrôles de goutte

1. Copier le nom de protocole Multiplex 7 1 et remplacez-la par 7 protocole Multiplex 1 CD68 DROP. Remplacez le réactif CD68 anticorps IgG de souris et de sauver le protocole.
2. Créer six nouveaux protocoles plus, une pour chaque contrôle de baisse et une pour le contrôle de l’isotype complète (changement tous les anticorps pour les isotypes approprié) de la même manière.

6. Stainer automatisé : Protocole de préparation de glissière

1. Copiez le protocole prestaining * cuire et déparaffinage et renommez ce protocole cuire multispectrale et déparaffinage 2 h.
2. Ajustez le protocole pour faire correspondre les réactifs indiquées au tableau 2. Diapositives de la cuisson au four pendant 2 h à 60 ° C. Déparaffinage pendant 30 s à 72 ° C.

7. automatisé Stainer : Préparation des réactifs

1. Préparer un kit de détection de recherche. Un réactif doit être en permanence associé à ce kit, donc remplir le récipient ouvert 30 mL pour 1 x Tris salin (SCT) a marqué avec 1 x TBS et trouver cela en position 1 (plus éloigné de la poignée) dans le kit de détection de recherche désigné Multiplex Kit de recherche 1. ce réactif sera définitivement associé à ce kit de recherche et ne doit pas changer de position pour une utilisation future.
2. Deux conteneurs ouverts du 30 mL Bloc multispectrale et Multispectrale secondairede l’étiquette. Remplissez le réservoir de Bloc Multispectral avec 30 mL de tampon/anticorps bloquant diluant du kit coloration multispectral. Remplir le récipient Multispectrale secondaire avec 30 mL de polymère anti-mouse/anti-rabbit anticorps secondaire du kit coloration multispectral.
3. Préparer dix conteneurs ouverts de 7 mL. Le volume requis en microlitres est 600 + (150 x [nombre de diapositives]). Chaque anticorps s’appliquera à 12 diapositives de cette affaire (amygdale six et six poumons). L’étiquetage et les volumes pour tous les conteneurs sont indiquées dans le tableau 3.
4. Pour chaque tube d’anticorps, ajoutez d’abord l’anticorps diluant, suivie par l’anticorps primaire concentré dans les volumes indiqués dans le tableau 3. La composition de pipetage doux.
5. Préparer un récipient ouvert 7 mL DAPI, utilisant quatre gouttes du concentré DAPI par millilitre d’eau bidistillée ; un total de 16 va être coloré au DAPI (600 + [150 x 16] = 3 000 µL). Ajouter 3 mL d’eau bidistillée plus 12 gouttes de DAPI spectral dans le récipient. Préparer DAPI frais pour chaque série.
6. Préparer un récipient ouvert 7 mL d’inhibiteur de la peroxydase. Toutes les 16 diapositives seront traités avec inhibiteur de la peroxydase (600 + [150 x 16] = 3 000 µL). Ajouter 3 mL du bloc de la peroxydase dans le récipient.
7. Avant de préparer le travail des concentrations de fluors, resuspendre tous les fluors lyophilisées en ajoutant 75 µL de diméthylsulfoxyde dans chaque tube de fluor fournie par le fabricant. La composition de pipetage. C’est le stock de fluor TSA. Conserver à 4 ° C.
8. Préparer six conteneurs de titrage, un pour chaque fluor. Le volume requis en microlitres s’élève à 350 + (150 x [nombre de diapositives]). Chaque fluor s’appliquera à 16 diapositives de cette affaire (amygdale huit et huit du poumon). L’étiquetage et les volumes pour tous les conteneurs sont indiquées dans le tableau 4.
9. Lorsque tous les réactifs ont été enregistrés et préparés, placez chaque conteneur dans n’importe quel endroit sur une grille et charger tous les réactifs sur la coloration automatisée. La sonde confirmera le volume de chaque réactif.

8. automatisé Stainer : Échantillon Setup et coloration Multispectral

1. Dans le logiciel automatisé stainer, cliquez sur configuration de glisser en haut de l’écran. Cliquez sur Add étude. Remplir la fenêtre pop-up avec l’étude ID, nom de l’étude et les commentaires.
   1. Sélectionnez le nom du chercheur menant la course de coloration dans la liste déroulante. Quittez le volume distribué à 150 µL. Sélectionnez Multispectral déparaffinage pour le protocole de préparation. Cliquez sur OK et ajouter diapositive. Sous commentaires, tapez « Multiplex 1 poumon 123ABC. » Complétez les champs suivants, comme il est indiqué : Type de tissu = tissu de Test ; Volume distribué = 150 µL ; Mode de coloration = simple routine ; Marqueur = négatif ; La coloration = tapez « 7 Multiplex protocole 1 » ; Préparation = Bake Multispectral, déparaffinage 2 h ; HIER = HIER 20 min avec ER1.
2. Cliquez sur la diapositive ajouter et modifier les commentaires et le protocole pour ajouter les voies de guidage de goutte et tiroir de réglage d’isotype. Lorsque toutes les diapositives ont été ajoutées à l’étude, fermer la fenêtre ajouter diapositive et imprimer des étiquettes. Placer les étiquettes à l’endroit approprié sur chaque diapositive.
3. Charger les lames en racks, appliquent la dalle de couverture dans le bon sens, insérer les grilles dans le passoire automatisé et abaisser les plateaux. L’appareil va scanner les étiquettes de la diapositive.
4. Lorsque toutes les lames et les réactifs ont été analysés et mesurées. Le bouton exécuter (►) devient actif. Si l’appareil détecte des erreurs, comme le volume de réactif insuffisante, un symbole d’avertissement jaune s’affiche par le plateau touché. Si une erreur survient, faites un clic droit sur le symbole de la prudence et remédier à l’erreur.
5. Initier une coloration immédiatement ou programmer un départ différé. Le protocole est d’environ 14 h dans la durée. Remarque : S’assurer que le protocole va terminer à un moment où les diapositives peuvent être retirés immédiatement car exess lavage pourrait avoir des répercussions résultats de coloration.

9. recouvrement des diapositives Multispectral

1. Supprimer les diapositives de la coloration automatisée et stockez-les dans un rack submergé dans 1 x directives du SCT.
2. Monter les échantillons avec lamelles no 1,5 et 15 µL des supports de montage (voir Table des matières). Éliminez les bulles en appuyant doucement sur la lamelle avec un embout de la pipette.
3. Laisser les lames guérir du jour au lendemain à la température ambiante sur le banc de laboratoire. Diapositives non durcis peuvent être numérisés immédiatement avec prudence.

10. Multispectraux

1. Allumez le scanneur multibande et son ordinateur (voir Table des matières pour plus d’informations de modèle et logiciel). Démarrez le logiciel de contrôle de microscope. Ouvrez la porte avant du scanner multispectral en appuyant sur le bouton tactile sur le devant de l’appareil. Chaque transporteur à ressort dans le scanner détient quatre diapositives. Charger toutes les diapositives en porteurs et enregistrer l’ordre avant de charger les transporteurs dans l’appareil.
2. Sélectionnez le Protocole à modifier , puis cliquez sur nouveau...; Créez ensuite le nom du protocole Multiplex panneau 1 et laisser tomber les contrôles. Créer le nom d’étude Multiplex panneau développement, cliquez sur Créer de protocoleet tapez Aperçu Scan filtre DAPI; Ensuite, sélectionnez Toute diapositive scanner et pixels 0.50 µm (20 X). Tous les filtres et les bandes devraient être représentés. Sinon, cliquez sur modifier les filtres et groupes, sélectionnez tous les cinq filtres (DAPI, FITC, CY3, Texas Red et CY5) et puis cliquez sur Modifier les expositions.
3. Charger le transporteur en sélectionnant le transporteur avec le multiplex complet de l’adénocarcinome du poumon. Sélectionnez la diapositive correcte à l’aide de l’interface utilisateur graphique. Concentrer le tissu manuellement ou en utilisant l’autofocus. Accédez à une zone acceptable de coloration DAPI et cliquez sur Auto-exposer pour régler l’exposition en millisecondes (0 – 2 000 ms).
4. Répétez la même procédure pour tous les jeux de filtres cinq colonnes le Scan entier et région de MSI. N’oubliez pas de naviguer dans une zone acceptable de coloration et de recentrer le microscope avant de régler l’exposition pour chaque niveau de filtre et de grossissement. Auto-exposer pour tous les cinq filtres dans un 20 x analyse globale et 20 x multispectrales d’imagerie régions de multispectrales (MSI). Sélectionnez une résolution des pixel de 0.50 µm (x 20). Sauver le protocole, puis cliquez sur retour pour revenir à l’écran d’accueil du logiciel Vectra ; puis, cliquez sur Numériser diapositives.
5. Ouvrez l’interface pour chaque diapositive, puis affectez-lui le Scan tâche . Étude la valeur Multiplex panneau développementvaleur protocole Multiplex panneau 1 et laisser tomber les contrôleset la valeur ID de diapositive Multiplex poumon ABC123, Multiplex CD68 Drop poumon ABC123, etc. . Lorsque toutes les diapositives ont été étiquetés et tâches sont définies, cliquez sur numériser. Les scanneurs multispectraux automatisé vont effectuer des analyses de pleine-glissière de toutes les diapositives à l’aide de tous les filtres de cinq.

11. Multispectraux : Imagerie multispectrale

1. Une fois que les scans sont terminées, ouvrez le logiciel QPTIFF (« Phenochart ») et cliquez sur Load glisser en haut à gauche. Ceci ouvrira une QPTIFF, qui est une analyse d’ensemble-slide cinq-filtre. Chaque couche contient des informations de plus d’un fluor, si l’utilité est limitée, mais la structure des tissus et les modèles d’expression large sont apparentes et peuvent être utilisés pour sélectionner les régions pour MSI.
2. Recherchez et ouvrez la diapositive correcte dans l’étude à l’aide de l’arborescence du menu déroulant sur la gauche. Connectez-vous (en haut à droite) avec les initiales de l’utilisateur.
3. Sélectionnez les cinq régions pour MSI à l’aide de l’outil tampon en haut de l’écran. Consulter un orthophoniste si elle est disponible. Sous sélectionner, sélectionnez Acquisition; sous taille de champs, sélectionnez 1 x 1; et sous restriction de champ, sélectionnez 0,5 µm (x 20). Issu des cytokératines (CK), coloration (principalement en Cy5), sélectionner plusieurs régions à la fois de tumeur (CK +) et de stroma (CK-) à être photographié de l’analyse globale. Répétez cette procédure pour chaque diapositive.
4. Une fois que tous les fichiers MSI sont sélectionnées, fermez le logiciel Phenochart et retourner au logiciel Vectra . Modifier la tâche de numérisation à MSI pour chaque diapositive et, ensuite, cliquez sur numériser à nouveau pour effectuer la collecte de MSI.

12. spectrale déconvolution

Remarque : L’étape de déconvolution spectrale est nécessaire pour la séparation des canaux et analyse d’image des diapositives. Avant que la déconvolution spectrale est effectuée dans le logiciel inForm, la bibliothèque spectrale doit être construite à l’aide de diapositives d’adénocarcinome pulmonaire colorées avec chaque fluor seul et avec DAPI seuls. Cette procédure est également décrite dans le Guide de développement de test de IHC Multiplex susmentionnés.

1. Lorsque l’acquisition de MSI est terminée, utilisez déconvolution spectrale (« informer ») logiciel pour ouvrir les fichiers dans le dossier MSI . Ces fichiers se terminent par l’extension de fichier de type .im3.
2. Sous format d’Image, sélectionnez Multispectraux; sous modèle, sélectionnez Fluorescence; et en vertu de la source de la bibliothèque spectrale, sélectionnez InForm.
3. Pour sélectionner des fluors, sélectionner et charger tous les fluors six et DAPI de la bibliothèque construite avec les diapositives de bibliothèque adénocarcinome pulmonaire. Cliquez sur Préparer tous (en bas à gauche). Logiciel de déconvolution spectrale interprétera la déconvolution spectrale sur toutes les images ouvertes, en utilisant les profils spectraux fournis.
4. Avec un pathologiste, évaluer le modèle de coloration contre les chromogènes taches unique de la même cible dans les diapositives séquentielles du même tissu.

13. évaluation de l’intensité de Fluorescence et d’atténuation du Signal

Remarque : L’outil de chefs d’accusation, qui apparaît comme une flèche avec une petite boîte brune, est l’outil le plus important pour l’optimisation des multiplex et devraient être utilisé fréquemment (voir Documentation supplémentaire). En utilisant l’outil de chefs d’accusation dans le logiciel de déconvolution spectral, évaluer le rapport signal-bruit, qui, à tout le moins, devrait dépasser 10:1 (voir Documentation supplémentaire pour le dépannage et l’évaluation du multiplex coloration avec les contrôles de goutte).

1. 13.1. une image ouverte dans le logiciel de déconvolution spectral, l’outil compte attaquer et enquête sur les images pour évaluer l’intensité de la fluorescence de chaque canal. L’intensité de la cible dans les tissus pulmonaires est entre 10 et 20 chefs d’accusation normalisées. L’outil normalisé des comtes est illustré à la Figure 1.
2. Exclure les diapositives de chefs de signal maximal d’unités d’aire de signal inférieur à 10 ou normale de moins de cinq pour n’importe quel marqueur afin que l’autofluorescence et coloration hors cible ne concurrencent pas le signal de l’authentique.
3. Exclure des diapositives avec maximum compte supérieur à 30 pour n’importe quel canal éviter les saignements spectrale ou inefficace de déconvolution spectrale.
4. Adresse haute ou basse normalisée comtes en ajustant la concentration de la TSA.

14. multispectral Image Analysis

1. Ouvrez un ou plusieurs MSI dans le logiciel de déconvolution spectrale et seulement sélectionner fluors de déconvolution qui sont représentés dans au moins une image ouverte. Cliquez sur Préparer tous pour unmix toutes les images actuellement ouvertes couleur pour produire des images spectralement non mélangés.
2. Sélectionnez l’outil comptes d’arpenter des chefs d’accusation à travers chaque image en plaçant le curseur sur l’ou les domaines d’intérêt.
3. Sélectionnez l’icône "oeil" pour ouvrir l’éditeur de vue. Sélectionnez et réglez l’intensité de l’affichage de chaque canal indépendant.
4. Sélectionnez configurer pour ouvrir le tissu segmentation, segmentation cellulaire, phénotypage et modules de notation. Ces outils sont nécessaires pour la validation objective des multiplex coloration contre les taches unique épreuve à développement chromogène et peuvent être utilisés pour générer des données quantitatives phenoptic (Figure S1).
5. Utilisez l’onglet Export pour enregistrer des niveaux de gris, fluorescent, TIFF non compressé de style pathview et fichiers de données parmi les modules d’analyse de phenoptic pour une analyse, d’archivage et présentations (Figure S1).

Representative Results

Le protocole décrit ici donnera des résultats comme celui illustré à la Figure 2. Commencer par une évaluation de la coloration dans le contrôle de l’amygdale, commençant par l’épithélium de surface de cellules squameuses. L’histologie de l’échantillon de l’amygdale peut être examiné par un pathologiste, en prenant comme référence la diapositive H & E. Si chromogène sections IHC sont exécutées avec les mêmes marqueurs sur le même bloc de tissu, alors ils peuvent servir à confirmer la densité et la distribution de chaque marqueur sur la diapositive de la mIF. Comme illustré à la Figure 2A, le tissu de l’amygdale devrait fournir clairement définis AE1/AE3 cytokératines, coloration à la surface un épithélium pavimenteux amygdale (Figure 2A; étiqueté comme pseudo-couleur rouge), sans fond dans les lymphoïdes tissus. La coloration doit être cytoplasmique, parfois avec l’accentuation de la membrane et le noyau doit être négatif. L’épithélium réticulée dans les cryptes devrait être positif pour les cytokératines (rouges) et PD-L1 (Figure 2A; pseudo-couleur vert). Les centres germinatifs folliculaires de l’amygdale devraient, ensuite, être identifiés. Les centres germinatifs doivent être facilement reconnaissables et devraient être riches en lymphocytes positifs Ki-67 (Figure 2A; pseudo-couleur jaune). Ki-67 coloration doit toujours être nucléaire. Les macrophages présents dans les centres germinatifs devraient également être facilement reconnaissables, parfois comme des cellules plus grandes (également appelés « colorables bodies »). Ils montreront coloration pour CD68 comme une souillure cytoplasmique granulaire (Figure 2A; pseudo-couleur orange) positives. Une proportion variable de cellules CD68 dehors les centres germinatifs est également à prévoir. Les macrophages peuvent montrer membrane coloration pour PD-L1. Il s’agit généralement plus pâle en intensité que la coloration pour PD-L1 dans l’épithélium réticulé. Il ne devrait y avoir aucun CD68 nucléaire coloration. CD8 devrait tacher avec une distribution de lymphocytes T, les lymphocytes (moins dans les centres germinatifs et une plus grande proportion dans les zones interfolliculaires ; voir la Figure 2A, pseudo-couleur cyan). Les lymphocytes CD8 + sont généralement de petites cellules à cytoplasme peu, donc il est pratiquement impossible de distinguer la membrane contre cytoplasme dans les lymphocytes. PD-1 se tachera fortement de petits lymphocytes dans la région de centre germinatif, généralement groupées à la périphérie des centres germinaux (Figure 2A; pseudo-couleur magenta), ainsi que dispersés lymphocytes dans la région interfolliculaire, habituellement montrant une plus faible intensité de coloration que ceux dans la région de centre germinatif. Comme pour les CD8, il n’est pas possible de distinguer clairement la membrane et une coloration cytoplasmique à petits lymphocytes colorées avec PD-1. Parce qu’une proportion variable de cellules CD8 coexpriment PD-1, il est recommandé à des fins de contrôle de la qualité que le modèle de coloration et la distribution de chaque marqueur qui est teinté dans les mêmes tissus être comparées avec IHC chromogène diapositives de référence, comme l’a suggéré dans¹²de protocoles précédemment publiés.

Après que le modèle de coloration attendu a été confirmé dans le contrôle de tissus d’amygdales, entreprend d’évaluer la coloration de l’échantillon de cancer du poumon (Figure 2B). Parce que les tissus tumoraux sont censés avoir une expression variable et hétérogène des marqueurs, il est très important au cours de l’optimisation d’un nouveau panneau de mIF à comparer le modèle de coloration pour chaque marqueur individuel observée dans la méthode de la mIF et son expression observé dans la diapositive standard d’IHC chromogène, évaluer la quantité et la répartition des cellules positives comme décrit précédemment¹². Néanmoins, le patron de coloration base doit être préservé ; par exemple, les cytokératines doivent être observés dans le cytoplasme des cellules épithéliales et jamais dans un noyau ; CD68 doit apparaître comme une coloration cytoplasmique granulaire dans les macrophages, etc.. Ce qui est important, certains marqueurs, l’intensité de la coloration peut changer du contrôle de l’amygdale au tissu du cancer ; par exemple, PD-1 et PD-L1 peuvent montrer faible intensité de coloration dans le tissu de la tumeur par rapport à l’expression très élevé observé dans le contrôle de l’amygdale. Il est donc important d’effectuer l’évaluation et l’optimisation avec l’outil de chefs d’accusation dans le logiciel inForm, en utilisant des exemples de tissus tumoraux plutôt que les contrôles de l’amygdale.

Enfin, contrôles négatifs isotype et goutte doivent être évalués, non seulement pour la détection du fond et autofluorescence, mais aussi pour des effets de parapluie et purge spectrale (Figure 3 et Figure 4). Isotype contrôles ne devraient pas démontrer tout immunomarquage à travers la diapositive ; Si aucune coloration est observée, puis l’imagerie ou la procédure de marquage doit être réexaminée. Contrôles de goutte sont importantes évaluer les éventuels artefacts dans la souillure, comme les effets de fond perdu ou de parapluie spectrales, en raison de la méthode de mIF au cours de l’optimisation d’un nouveau panneau multiplex (voir la Figure 5, Supplémentaire Figure S2, Figure supplémentaire S3et du matériel supplémentaire). Fluorescents contrôles monoplex et drop devraient seront évaluées et comparées avec le panneau plein multiplex. Chaque contrôle de goutte doit montrer le même patron de coloration à l’exception de l’anticorps primaire unique, qui devraient être supprimées sur chaque contrôle spécifique. Plus de détails sont fournis dans la section Matériel supplémentaire .

Figure 1 : informer l’outil compte. L’outil de comtes inForm logiciel est activé en sélectionnant l’icône de boîte beige. Comtes normalisés ont été corrigés pour profondeur de bit, temps de pose, gain et binning. Les images ont été prises à un grossissement de X 20 ; la barre d’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Résultats représentatifs. Carcinome du poumon cellules nonsmall amygdale (A) et (B) ont été colorées avec PD-L1 (520 TSA, vert), CD8 (540 TSA, cyan), Ki67 (570 TSA, jaune), CD68 (620 TSA, orange), cytokératine (650 TSA, rouge) et PD-1 (690 TSA, magenta). Les canaux individuels sont représentés séparément ci-dessous en petits panneaux. Le marqueur est indiqué en haut à droite de chaque image. Les images ont été prises à un grossissement de X 20 ; Echelle = 50 (ou 250 µm). Indiqué dans le panneau A sont 1) follicule lymphoïde, centre 2) germinal, zone 3) interfolliculaire et 4) stratifié épithélium pavimenteux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Effet de blocage/parapluie TSA. Il s’agit d’un exemple de 690 TSA déposés par un PD-1 bloquant les anticorps CD3 signal d’une manière dépendante de la quantité de TSA présent. Le signal TSA 690 plus brillants bloque le signal TSA 620 plus efficacement (carcinome du poumon nonsmall cellules colorées avec anti-PD-1 D4W2J pendant 30 min à 0,52 µg/mL ou isotype suivie d’une détection de TSA 10 min 690 à 1/100 ; puis, anti-CD3 F7.2.38 pendant 30 minutes à 0,14 µg/mL suivie d’une détection de TSA 620 10 min à 1/100). Les images ont été prises à un grossissement de X 20 ; la barre d’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Purge spectrale. Tissu de carcinome de cellules nonsmall pulmonaire était taché avec le protocole de goutte-contrôle de Ki-67 (protocole multiplex complet avec l’anticorps de Ki-67 omis). Le canal TSA 540 (CD8) et le canal TSA 570 (Ki-67) sont indiquées. Aucun motif de coloration nucléaire n’est apparent, mais une copie réduite de le CD8 modèle de marquage est observée dans le chenal TSA 570. C’est mieux traitée en s’assurant que les intensités de coloration comparables dans tous les canaux. Dans ce cas, l’ajout d’un signal robuste de Ki-67 (normalisé compte entre 10 et 20) corrigera la purge spectrale. Les images ont été prises à un grossissement de X 20 ; la barre d’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Drop contrôles. Cette figure montre une image composite d’un plein multiplex par rapport à la même région de diapositives séquentielles de l’adénocarcinome pulmonaire colorées avec contrôles de goutte dans lesquelles l’anticorps primaire indiqué a été omis. Les images ont été prises à un grossissement de x 20 ; Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Nom	Nom en abrégé	Type de	Conteneur	Groupe
Tampon de blocage de PKI	OPALBLOK	Accessoires	Ouvrir 30 mL	Générales
Opale polymère HRP	OPALE 2AB	Accessoires	Ouvrir 30 mL	Générales
OPAL 1 x TBS	OPAL1TBS	Accessoires	Ouvrir 30 mL	Kit de détective
CD68 0,30 µg/mL PG-M1 Mus	OPALCD68	Accessoires	Ouvert 7 mL	Générales
Ki67 0,61 µg/mL MIB-1 Mus	OPALki67	Accessoires	Ouvert 7 mL	Générales
PD-L1 0,20 µg/mL SP263 Rab	OPALPDL1	Accessoires	Ouvert 7 mL	Générales
PD-1 0,52 µg/mL D4W2J Rab	OPALE PD1	Accessoires	Ouvert 7 mL	Générales
CD8 0,70 µg/mL SP239 Rab	OPALE CD8	Accessoires	Ouvert 7 mL	Générales
CK 0,24 µg/mL AE1/AE3 Mus	OPALE CK	Accessoires	Ouvert 7 mL	Générales
IgG de souris	OPALE MUS	Accessoires	Ouvert 7 mL	Générales
IgG de lapin	OPALE RAB	Accessoires	Ouvert 7 mL	Générales
OPALE de la peroxydase du bloc	OPALPERX	Accessoires	Ouvert 7 mL	Générales
DAPI spectral	OPALDAPI	Accessoires	Titrage 6 mL	Générales
Opale 520 réactif	OPALE 520	Accessoires	Titrage 6 mL	Générales
Opale 540 réactif	OPALE 540	Accessoires	Titrage 6 mL	Générales
Opale 570 réactif	OPALE 570	Accessoires	Titrage 6 mL	Générales
Opal 620 réactif	OPAL 620	Accessoires	Titrage 6 mL	Générales
Opale 650 réactif	OPALE 650	Accessoires	Titrage 6 mL	Générales
Opale 690 réactif	OPALE 690	Accessoires	Titrage 6 mL	Générales

Tableau 1 : Protocole de RX Leica Bond, opale réactifs

	Réactif	Temps (h)	Température (degré Celsius)
1	Aucun réactif	120:00	60
2	Bond déparaffinage Solution	0:30	72
3	Bond déparaffinage Solution	0:00	72
4	Bond déparaffinage Solution	0:00	Ambiante (température ambiante)

Tableau 2 : Protocole de préparation opale

Objectif	µg/mL	Clone	Source	Lot	Stock µg/mL	Diluant µL	ΜL AB
CD68	0,3	PG-M1	Dako	20043031	30	2376	24
Ki67	0,61	MIB-1	Dako	20049476	46	2368.17	31.83
PD-L1	0,2	SP263	Évent.	F09591	1.61	2101.86	298.14
PD-1	0,52	D4W2J	CST	1	100	2387.52	12.48
CD8	0,7	SP239	Ventana	160318	70	2376	24
CK	0,24	AE1/AE3	Dako	10129428	179,5	2396.79	3.21
Mus IgG	0,61
Rab IgG	0,7

Tableau 3 : Préparation d’anticorps primaires.

Opale Fluor	Diapositives	Dilution	Diluant µL	Fluor opale µL
Opale 520	16	1 : 200	2736.3	13,8
Opale 540	16	1:700	2746.1	3.9
Opale 570	16	1 : 150	2731.7	18.3
Opal 620	16	1/100	2722.5	27,5
Opale 650	16	1:350	2742.1	7.9
Opale 690	16	1 : 150	2731.7	18.3

Tableau 4 : Opale préparation de Fluor.

Document Word de matériel supplémentaire : S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce document.

Supplémentaire Figure 1 : S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Supplémentaire Figure 2 : S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Supplémentaire Figure 3 : S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

La Table 1 : Leica Bond RX opale Multiplex protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

Supplémentaire tableau 2 : résumé et comparaison de multiplex complet, chute de contrôles et plein d’isotype contrôles. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

La révolution de l’immunothérapie du cancer en cours est ouverture roman et en promettant des options thérapeutiques pour les patients de cancer¹³. Avancées dans le domaine de l’immuno-oncologie nécessitera une connaissance accrue du microenvironnement tumeur inflammatoire, non seulement pour comprendre la biologie des mécanismes immunologiques impliqués dans la carcinogenèse mais aussi pour trouver des biomarqueurs prédictifs pour neuf traitements immunothérapie^1,2. En raison de la biologie complexe de l’immunologie du cancer, interrogatoire des échantillons de tissu de tumeur est généralement tenu d’élaborer une liste croissante de marqueurs immunitaires, qui interagissent entre eux et sont fréquemment coexpriment par les populations de diverses cellules dans le tissu^{1 ,2,5}. Essais cliniques emploient généralement des petites biopsies, tels qu’aiguille du noyau ou les biopsies endoscopiques, qui sont recueillies à différents moments de la thérapie pour évaluer et contrôler la réponse du patient. Ces biopsies offrent une quantité limitée de tissus, qui à son tour limite le nombre de coupes de tissus qui peuvent être utilisés pour le cancer du immunoprofiling. Cette limitation est particulièrement onéreuse lorsqu’on utilise des techniques traditionnelles, telles que standard monoplex IHC. Il est donc absolument besoin de nouvelles méthodes pour le cancer du immunoprofiling qui font usage de multiplexes techniques avec la capacité à évaluer simultanément la coexpression de différents biomarqueurs et faire une utilisation plus efficace des échantillons de tissus précieux.

Dans le multiplex de la coloration et les méthodes d’imagerie multispectrales décrits en détail ici, un panneau de mIF est utilisé pour les études immuno-oncologie sur tissus FFPE comme les biopsies d’un essai clinique. Cette méthode a été décrite précédemment, validée et appliquée avec succès à cancer immunoprofiling^{8,9,10,11,12,14, 15}. protocoles précédemment publiés ont décrit mIF semblable souillure des méthodes avec des systèmes axés sur les TSA, tel que le kit de sept couleurs, ce qui prend du temps et nécessite environ 4 jours de travail par un chercheur de laboratoire dédié^{12 ,15}. En réponse à ces insuffisances, ce protocole a été optimisé en utilisant un stainer automatisé disponible dans le commerce, raccourcissant considérablement la coloration temps à 14 h et éliminer la variabilité introduite par opérateurs manuels. L’imagerie est réalisée sur un scanner multispectral capable de séparer les spectres des signaux fluorescents sept ou plus dans les diapositives multiplexes, y compris autofluorescence, qui s’éliminent efficacement sans dégrader la qualité du signal. Ce protocole peut répliquer, modifié et interprété par tout utilisateur de laboratoire ayant accès aux instruments et réactifs décrits dans la Table des matières.

Des étapes cruciales dans le présent protocole sont les articles 7, 10, 11, 12. L’article 7 porte sur la préparation des réactifs. Une préparation minutieuse des réactifs pour la coloration multiplex est essentielle, nécessitant l’attention ciblée d’un laboratoire scientifique ou un technicien pour éviter la variation de l’opérateur-dépendant. Par exemple, l’un des problèmes majeurs avec la méthode multiplexe est coloration variabilité, qui peut être réduite par la préparation minutieuse des dilutions des réactifs, spécifiquement les colorants de la TSA. Les articles 10 et 11 sont liés à l’acquisition d’images. Un risque important est la surexposition ou la sursaturation des images, qui peuvent conduire à saigner spectrale, un artefact dans laquelle le signal d’un autre canal interfère avec le canal étant imagé (voir Documentation supplémentaire). Soigneusement réglementant les temps d’exposition peut aider à empêcher la sursaturation et saigner spectrale. Déconvolution spectrale est réalisée à l’article 12. Celle-ci repose sur la préparation de la bibliothèque spectrale (décrite dans le Multiplex IHC Assay Development Guide, disponible en ligne). Dans cette étape, le logiciel inForm est « formé » de reconnaître spécifiquement les couleurs pour chaque colorant TSA. La bibliothèque spectrale est créée à l’aide de sections d’un tissu de contrôle, telles que l’amygdale humaine, colorée avec un marqueur exprimé uniformément, comme CD20, couplée avec chaque colorant TSA individuel sur des diapositives individuelles. En outre, autofluorescence diapositives (également décrits dans le Guide de développement de test IHC Multiplex) sont nécessaires pour former le logiciel inForm à reconnaître et à soustraire les tissus autofluorescence. Autofluorescence lames de contrôle devraient être préparées en utilisant des échantillons prélevés dans les mêmes tissus étudiés (par exemple cancer du poumon, etc.), traités de la même manière que les diapositives de la mIF et incubées avec l’anticorps primaires et secondaires, mais sans la teinture TSA. Seulement un profil spectral autofluorescence unique peut être sélectionné, donc il faut faire attention de choisir une représentation de l’autofluorescence observable qui peut-être provenir de collagène, fibrose, globules rouges, les pigments endogènes et d’autres sources. Création d’une nouvelle bibliothèque spectrale au début de chaque nouveau projet et à l’aide d’un spectre d’autofluorescence représentative de l’étude des échantillons de tissus, ainsi que les mêmes blocs de tissus en cours d’exécution comme contrôle positif pour chaque lot d’un même projet, sont les étapes méthodologiques précieux qui contribueront à améliorer la cohérence de la spectrale exsolution à travers différents échantillons d’un même projet.

La méthode multiplexe décrite dans le présent protocole vous propose plusieurs outils de dépannage, notamment un évaluateur de signal-bruit (outil de chefs d’accusation), chute de contrôles (Matériaux supplémentaires) et une vue de la pathologie pour contrôle de la qualité de la coloration. L’outil de chefs d’accusation permet d’évaluer l’intensité de la coloration et le niveau du fond. Si l’intensité et/ou les niveaux ambiants sont élevés, la première approche est de réduire la dilution de la teinture TSA. Si le problème persiste, les diapositives IHC chromogène utilisés pour l’optimisation de marqueur particulier doivent être examinés avec un pathologiste, cherchez la présence d’arrière-plan. La vue de la pathologie est générée par le logiciel inForm, en utilisant une représentation pseudo-couleur diaminobenzidine comme de la fluorescence du fluor lié à TSA, ainsi qu’une représentation de l’hématoxyline faux provenant de tous les signaux fluorescents, y compris le DAPI . Images de la vue de la pathologie aident à l’évaluation visuelle des colorations par un pathologiste pour coloration améliorée. Ces outils devraient toujours être employées pendant l’optimisation d’un nouveau panneau et que des mesures de contrôle de la qualité durant le workflow de coloration.

La méthode mIF nécessite l’utilisation d’anticorps primaires qui ont été correctement validée et optimisé pour les IHC chromogène standard sur les tissus fixés au formol. Par exemple, un des principaux avantages de la méthode TSA mIF est sa compatibilité avec l’utilisation d’anticorps primaires qui ont été validés et optimisé en pathologie anatomique pour utilisation clinique¹². Cet avantage signifie que les panneaux multiplexes peuvent être personnalisés par l’utilisateur de laboratoire pour répondre aux questions d’immunologie cancer spécifique sans la nécessité pour les anticorps preconjugated, fournissant le développement rapide et dynamique de groupe. À cet égard, le flux de travail réel pour l’optimisation d’un nouveau panneau commence par la validation et l’optimisation des anticorps avec standard IHC chromogène, vous cherchez la meilleure dilution et conditions qui fourniront une coloration propre et uniforme la coloration. L’étape suivante, en utilisant les mêmes dilutions optimisées pour IHC, est de transférer la coloration à l’aide de fluors TSA au lieu de diaminobenzidine et comparer les résultats obtenus par monoplex TSA par immunofluorescence avec l’IHC chromogène comme référence. Enfin, les anticorps peuvent être combinés dans la coloration de mIF, toujours à l’aide de l’IHC chromogène modèle de marquage comme une référence de commande pour ajuster les mIF TSA coloration paramètres, principalement les dilutions de colorant TSA et la séquence de coloration. Au cours de ce processus, collaboration avec une orthophoniste est déterminant pour évaluer la qualité de la coloration.

Limites de cette technique sont le temps et l’effort requis pour l’optimisation et la validation de nouveaux panneaux et l’analyse de l’immunophénotypage des panneaux de la mIF. La principale préoccupation, cependant, est la validation correcte des méthodes mIF. L’absence d’une validation appropriée de ces techniques comporte le risque de générer des résultats non valides, ce qui peuvent ajouter à la littérature, en diminuant les tentatives pour acquérir une meilleure compréhension de la biologie du cancer immunology¹⁶données confuses. Il incombe, par conséquent, l’enquêteur de faire tout son possible pour valider les méthodes multiplexes, notamment en assurant la participation étroite et évaluation par les pathologistes avec formation et expérience dans la validation et l’évaluation des tissus histopathologie et techniques basées sur l’IHC^17,18,19,20. Le protocole présenté ici comprend certains des outils qui peuvent aider à la validation d’un nouveau panneau multiplex, y compris l’évaluation de la pathologie des lames H & E avant la coloration et l’analyse, l’utilisation de l’IHC chromogène comme référence pour optimiser la mIF TSA la coloration, la méthode drop de contrôle pour le contrôle de la qualité d’un nouveau multiplex panneau et l’utilisation d’isotype, autofluorescence et déposez les contrôles. Malgré la complexité technique des méthodes de la mIF, les technologies comme l’imagerie multispectrale déconvolution spectrale, ainsi que d’autres nouvelles plateformes multiplexes, ouvrent une nouvelle ère pour l’analyse des échantillons de tissus provenant de patients et la génération de nouvelles formes des données qui ne sont pas possibles avec le seul standard IHC. Par conséquent, le développement et l’application des techniques de mIF vont continuer à croître, devenir des outils puissants pour l’immunoprofiling du cancer de biopsies pour essais cliniques et d’aider à identifier de nouveaux biomarqueurs prédictifs multiparamétriques pour l’immunothérapie, bénéficiant, par dessus tout, le patient atteint de cancer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
"InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis	PerkinElmer	CLS151066	Called "spectral unmixing software" in text
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing	PerkinElmer	CLS151067	Called "QPTIFF software" in text
#1.5 Coverslips	Sigma Aldrich	2975246
200 Proof Ethanol	Koptec	V1001
20x Tris-Buffered Saline	VWR	J640-4L
Antibody Diluent	DAKO	S2203
Anti-CD68 Mouse Monoclonal	DAKO	M087601-2	Clone PG-M1
Anti-CD8 Rabbit Monoclonal	Ventana	M5392	Clone SP239
Anti-CK Mouse Monoclonal	DAKO	M351501-2	Clone AE1/AE3
Anti-ki67 Mouse Monoclonal	DAKO	M724001-2	Clone MIB-1
Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal	Cell Signaling	#86163	Clone D4W2J
Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal	Ventana	790-4905	Clone SP263
Bond Dewax Solution	Leica	AR9222	Called "dewax solution" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 1	Leica	AR9961	Called "ER1" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 2	Leica	AR9640	Called "ER2" in text
Bond Open Containers, 30 mL	Leica	OP309700	Called "30 mL open containers" in text
Bond Open Containers, 7 mL	Leica	OP79193	Called "7 mL open containers" in text
Bond Polymer Refine Detection	Leica	DS9800	Called "chromogenic detection kit" in text
Bond Research Detection Kit	Leica	DS9455	Called "research detection kit" in text
Bond Titration Kit	Leica	OPT9049	Called "titration kit" in text
Bond Universal Covertile Novocastra	Leica	S21.2001	Called "covertiles" in text
Bond Wash Solution 10X Concentrate	Leica	AR9590	Called "10x wash solution" in text
BondRX Autostainer	Leica		Called "automated stainer" in text
BondRX Software Version 5.2.1.204	Leica		Called "automated stainer software" in text
Opal 7-Color Automation IHC Kit	PerkinElmer	NEL801001KT	Called "multispectral staining kit" in text
Peroxidase Block	Leica	RE7101
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo	P36965	Called "slide mountant" in text
Starfrost Slides	Fisher	15-183-51
Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control	PerkinElmer	CLS143455	Called "microscope control software" in text