Summary
詳細なプロトコル 6 マーカー多重蛍光パネルの最適化し、実行より一貫した結果と手続き時間の短縮のため自動着色剤を使用しています。このアプローチは、腫瘍免疫研究のあらゆる研究室で直接対応できます。
Abstract
免疫腫瘍で継続的な発展には、癌免疫学のメカニズムの理解は深まるが必要があります。ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 生検から組織サンプルの immunoprofiling 解析は、腫瘍免疫の複雑さを理解し、がん免疫療法の新規予測バイオ マーカーの発見のための重要なツールになりました。組織の Immunoprofiling 解析では、腫瘍微小環境における炎症性細胞の亜集団と免疫チェックポイントを含む結合のマーカーの評価が必要です。新規多重免疫組織化学的手法の出現 1 つティッシュ セクションのより効率的な役立つ multiparametric 分析標準 monoplex 免疫染色 (IHC) よりもできます。1 市販多重蛍光抗体法 (IF) 法はパスチラミドシグナル信号増幅に基づくし、マルチ スペクトル顕微鏡による分析と組み合わせる組織における多様なマーカーの良い信号分離できます。この方法は、標準の IHC FFPE 組織サンプルでの最適化された非標識一次抗体の使用と互換性があります。ここ述べる多重ができる自動プロトコル PD L1 で構成される 6 マーカー多重抗体パネルと癌組織サンプルのラベルする場合 PD 1、CD68、CD8、Ki 67、および 4 ' と AE1/AE3 サイトケラチン 6-diamidino-2-phenylindoleとして細胞核対比染色。多重パネル プロトコルは染色時間が手動の議定書のより短いと直接適用でき、人間 FFPE 組織サンプルでの腫瘍免疫研究のすべての研究室捜査官適応自動 IHC 着色に最適です。いくつかのコントロールと最適化と手法の検証に役立つ新しい多重の場合パネルの細かい品質制御ドロップ コントロール メソッドを含むツールがまた説明されます。
Introduction
免疫腫瘍学研究、特に発見と臨床試験1 のコンテキストでの癌免疫療法の新規予測バイオ マーカーの検証のために不可欠なコンポーネントとなっている FFPE 腫瘍組織サンプルの Immunoprofiling 分析 ,2。ジアミノベンジジンなど化学色原体を使用して、発色の IHC 病理生検組織3の反応の標準的な手法のままです。標準 IHC はがん組織 immunoprofiling、腫瘍関連リンパ球のサブポピュレーションとプログラムされた細胞死配位子 1 など免疫チェックポイントの発現レベルの評価 (PD L1)4 の定量などにも使用できます。 ,5。標準 IHC は限られた、しかし、ティッシュ セクションごとに 1 つだけ抗原のラベル付けできます。Immunoprofiling 研究は、通常いくつかのマーカーの組み合わせの式の解析を必要とするため複数の組織切片の染色標準 IHC の使用が必要になります, 各単一のマーカーの染色し、したがって、コア針生検など小さい組織サンプルの解析に大幅に制限されます。標準 IHC 法または PD L1、腫瘍関連マクロファージおよび癌細胞によって表現されるなど免疫チェックポイント マーカーよくの多様な細胞集団で行ったマーカーの評価のために制限されます。この制限は、標準 monoplex IHC の使用などのさまざまな細胞タイプ6によって表される IHC マーカーの定量分析のための病理学者によって報告されています。ちょうど少数の反応によって制限されているものの、標準 IHC monoplex 方法、7以上同じティッシュ セクションを表すの多様な塗装色原体の進歩を用いた多重発色 IHC 技術の開発マーカーも同じ細胞集団の同じ細胞内コンパートメントに発現するタンパク質の適切な評価のための重要な技術的な課題を提示。
多重の発色 IHC 法の制限と同様、臨床サンプルから組織の可用性に関する上記の注意事項は、腫瘍免疫研究に基づく多重化法の改良を開発する必要性に上昇を与えています。蛍光標識は、同じスライドから複数の同時の信号を分離することができます効果的にシステムをイメージングと組み合わせます。このような手法の 1 つは、効率的な色分離8のマルチ スペクトル顕微鏡イメージングと組み合わせるパスチラミドシグナル信号増幅 (TSA) に基づいています。市販の TSA ベース キット採用 fluorophores マルチ スペクトル イメージング8用に最適化 (材料の表を参照してください)。このシステムの重要な利点は、検証および標準的な発色 IHC9,10,11用に最適化された同じ非標識一次抗体との互換性です。これは、新しいターゲットを組み込む最適化とパネルの変更で高速化だけでなく、柔軟性をことができます。Monoplex からの簡単な転送を可能にする、自動化された市販の IHC 着色システムのための多重蛍光 (mIF) TSA メソッドの最適化さらに、mIF に発色 IHC。
ここで腫瘍免疫研究に基づいている mIF パネル自動 mIF TSA 染色とイメージングのための多重分光スキャナーを使用してプロトコルを提案します。このプロトコルは、適応および記述されている計測・試薬へのアクセスを持つ研究室ユーザで変更できます。プロトコルには、癌の immunoprofiling の六つの一次抗体のパネルが含まれています: PD-L1、PD 1、CD68 (パン ・ マクロファージ マーカー) として、CD8 (T 細胞傷害性細胞)、キ-67 と AE1/AE3 の同定に上皮性マーカーとして使用 (汎サイトケラチン、癌細胞)。最近の研究では、染色12多重化を検証するための標準の参照として発色 IHC を使用して手動 TSA mIF プロトコルの最適化について説明します。自動着色剤、また染色の一貫性を向上させながら 14 時間 3-5 日から染色時間を飛躍的に短縮で最適化された市販の七色の TSA キットを使用して更新されたメソッドここで紹介をしました。ここで示した詳細な主なプロトコル、に加えて補足資料セクションには「ドロップ コントロール」法、最適化ためのテクニカル ノートと同様、新しい mIF パネルを評価する追加の品質管理プロセスが含まれていますトラブルシューティング、およびセットアップおよびカスタマイズされた mIF パネルの mIF TSA メソッドを最適化する研究所ユーザーを支援する新しい多重パネルの開発。
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Protocol
注:ここで提示されたプロトコル 6 抗体の TSA を使用して mIF パネルの immunoprofiling を実行する方法を説明します (キ67、CD68 PD L1、PD 1、CD8、AE1/AE3) 自動着色に (材料の表を参照してください)。プロトコルも新しい mIF パネルの品質管理のコントロールをドロップを実行する方法を説明します (補足資料を参照してください)。このプロトコルでは、ヒト扁桃 (肯定的な制御) から 8 つの無染色 FFPE スライドとひと肺腺癌からの 8 つの無染色スライド染色が行われます。最初のスライドは、すべての六つのマーカー、一次抗体が利用されていません、アイソタイプ コントロールの 2 番目のスライド (補足資料参照) ドロップ コントロールの残りの 6 つのスライドと染色完全多重化に使用されます。組織の自家蛍光の追加コントロールを強く推奨し、多重で常に含まれる必要があります研究 (補足資料を参照してください)。ただし、捜査官は、他の腫瘍のタイプと自分のプロジェクトの目標によるとコントロールを使用できます。MIF TSA 法と多重分光スキャナー技術以前の経験のない研究室ユーザーの多重 IHC 開発ガイドを参照 (利用できるオンラインで http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp)。このガイドでは、手動のプロトコルについて説明します、染色法 mIF へのよい紹介もあります。このプロトコルで採用されているすべての組織切片は、匿名化され、ヘルシンキ宣言に従って承認されました。
1. 組織サンプル
- ヒト扁桃の FFPE サンプル肯定的な制御および PD L1 知られている FFPE ひと肺腺癌サンプルとして使用されるリンパ様過形成を含むを選択正。腫瘍の存在を確認する選択した肺がんブロックのヘマトキシリンとエオシン (H & E) スライドを確認します。これは非特異染色を高める可能性があります、腫瘍壊死の豊富な地域を避けるために重要です。
注:この最適化のため 10 年以上保存されているパラフィン ブロックを使わないとパラフィン ブロック (組織の技術者と相談) で乾燥した外観を持つ組織。 - 各ブロックからの 10 の連続した連続切片、厚み 4 μ m カット、ミクロトームを使用しています。IHC、スライドごとに 1 つのセクションに対して使用する正荷電ガラス スライド上のセクションをマウントします。
注:しわは、染色のアーティファクトを生成する可能性がありますので、しわがなく完全に平坦のセクションをマウントしなければなりません。番号を 1 から 10 まで連続切片のスライド。 - 最初のセクションに新しい H & E スライドを準備します。残りのブロックで扁桃組織や肺腫瘍の存在を確認する病理学者の助けを借りて、H & E のスライドを確認します。
注:その後、マルチ スペクトル解析と表現型解析のための関心領域の選択と、この H & E のスライドができます。 - 3ヶ月までの 4 ° C でプラスチック製のスライド ボックスで無染色のセクションを保存します。
2. 新しい mIF 自動着色に染色プログラムの作成: 試薬の登録
注:試薬は、プロトコルで使用できる前に自動着色ソフトウェアで試薬リストに追加する必要があります。自動着色モデルおよびソフトウェアのバージョンについては材料の表を参照してください。
- 自動着色ソフトウェア内で試薬] タブをクリックします。新しい試薬を指定する追加をクリックします。名 (など、「520 TSA 試薬」) と最大 8 個の文字があることを指摘し省略名 (例えば、"520 TSA") を入力します。ドロップ ダウン メニューから補助的な選択し、仕入先を設定します。シングル/シーケンシャル DSから、シングル/ダブル染色を変更しないでください。汚損のプロトコルプロトコル Fにデフォルトを設定します。ER120 デフォルト HIER のプロトコルを設定します。
- 新しい試薬と手順 2.1 すべて試薬の表 1に記載されている節約します。
3. 自動着色: コンテナーの登録
- 各コンテナーの側に使用する試薬の名前を書きます。側のバーコードをスキャンします。ポップアップ ウィンドウで、リストから正しい試薬を選択します。有効期限の日付を選択し、保存します。
- 表 1に示すすべての試薬の 3.1 の手順で手順を繰り返します。
- オープンな研究キットを登録します。キットの側面両方のバーコードをスキャンし、に従って、画面に表示されます。名前のキット「多重の研究キット 1.」1 x tris (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) の登録-このキット (表 1) の一部として緩衝生理食塩水。
4. 自動着色: mIF プロトコル ・ プログラムの作成
- 基本多重プロトコルは新しい自動方向づける (テーブルの材料モデルとソフトウェアのバージョンを参照してください) にオパール 7 多重名前でプリロード済です。プロトコル画面に「推奨」の代わりに「すべての」フィルター プロトコルを探します。基本プロトコルが存在しない場合は、製造元に問い合わせると自動着色ソフトウェアを更新します。
- すべての変更は、元のプロトコルのコピーで行われなければなりません。変更を行う前にオリジナルを保存し、[プロトコル] タブをクリックすると、[オパール 7 多重プロトコルを右クリックし、コピーを選択してコピーを作成します。
- 7 多重プロトコル 1新しいウィンドウで名前を変更し、正しいデバイス (床のモデルまたは卓上型) に関連付けられているタブを選択します。補足テーブル S1のプロトコルと一致します。追加試薬10 分ペルオキシダーゼ阻害ステップ (標準プロトコルの一部ではない) を追加し、試薬としてペルオキシダーゼ阻害剤を選択するをクリックします。
- ブロックの手順が PKI のブロック バッファーを利用することを確認します。二次抗体の手順利用 HRP ポリマーとそのスペクトル 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) マルチ スペクトル オートメーション キットに付属の利用、各一次抗体が適切な試薬を指すことを確認します。プロトコル画面のドロップ ダウン メニューの各それぞれステップに指定されている試薬をチェックしてすべての選択肢を確認します。
5. 自動着色: ドロップ コントロール、およびアイソタイプ コントロール プロトコルの追加
- 名前7 多重プロトコルの 1をコピーし、 1 CD68 ドロップ 7 多重プロトコルに変更します。マウス IgGにCD68 抗体試薬を変更し、プロトコルを保存します。
- 同じ方法で、各ドロップ コントロールのと (適切なアイソタイプに全ての抗体を変更) 完全なアイソタイプ コントロール用の六つのより多くの新しいプロトコルを作成します。
6. 自動着色: スライドの準備のプロトコル
- Prestaining プロトコルをコピー * 焼くし、Dewax マルチ スペクトルを焼くと Dewax 2 hこのプロトコルの名前を変更します。
- 表 2に示す試薬を一致するようにプロトコルを調整します。60 ° C で 2 時間焼くスライド30 dewax s 72 ° C で
7. 自動着色: 試薬の調製
- 1 つの研究の検出キットを準備します。1 試薬の塗り 30 mL オープン コンテナー 1 x TBS と 1 x 含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS) のマークし、この研究検出キット指定研究用マルチプレックス キット (ハンドル) から最も遠い位置 1 で見つけるのでこのキットに恒久的に関連付けられてある必要があります。1. この試薬研究キットに恒久的に関連付けられるし、将来使用するための位置を変更する必要があります。
- 30 mL の 2 つのオープン コンテナーマルチ スペクトルのブロックおよびマルチ スペクトル セカンダリにラベルを付けます。30 ml のブロック バッファー/抗体希釈マルチ スペクトルの染色キットからのスペクトルのブロックコンテナーを入力します。30 ml のマルチ スペクトルの染色キットからアンチ mouse/抗うさぎ抗体ポリマーのスペクトル セカンダリコンテナーを入力します。
- 10 7 mL オープン容器を準備します。マイクロリットルの必要量は 600 + (150 × [スライド番号])。それぞれの抗体は、この場合 (6 扁桃および六つの肺) で 12 枚のスライドに適用されます。ラベル付けとボリュームのすべてのコンテナーは、表 3に示されます。
- 各抗体チューブ最初追加抗体希釈のボリュームに集中して一次抗体に続いて、表 3に示されています。穏やかなピペッティングで混ぜます。
- DAPI、ダブル蒸留水の 1 ミリリットルあたり DAPI 集中の 4 滴を使っての 7 mL オープン コンテナーを準備します。16 の合計は DAPI で染色される (600 + [150 x 16] = 3,000 μ L)。コンテナーに二重蒸留水 3 mL プラス スペクトル DAPI の 12 滴を追加します。新鮮な DAPI を実行するたびに備えます。
- ペルオキシダーゼ阻害剤を 7 mL オープン コンテナーを準備します。すべての 16 のスライドはペルオキシダーゼ阻害剤と扱われます (600 + [150 x 16] = 3,000 μ L)。ペルオキシダーゼ ブロックの 3 mL をコンテナーに追加します。
- Fluors の作業濃度を準備する前に、製造元から提供された各蛍光管にジメチルスルホキシドの 75 μ L を追加することによってすべての凍結乾燥 fluors を再懸濁します。ピペッティングで混ぜます。これは TSA 蛍光株式です。4 ° C でのストア
- 6 滴定の容器があり、各フローの 1 つを準備します。マイクロリットルの必要量は 350 + (150 × [スライド番号])。それぞれの蛍光は、この場合 (8 扁桃および 8 つの肺) の 16 のスライドに適用されます。ラベル付けとボリュームのすべてのコンテナーは、表 4に示されます。
- すべての試薬が登録されて、準備、ラックの任意の位置に各コンテナーを配置し、自動着色にすべての試薬を読み込みます。プローブは、各試薬の量を確認します。
8. 自動着色: サンプル セットアップとマルチ スペクトル染色
-
自動着色ソフトウェアで、画面の上部にスライド セットアップをクリックします。追加研究をクリックします。検査の ID、試験名、コメントとポップアップ ウィンドウを作成します。
- ドロップ ダウン リストから染色の実行を行う研究者の名前を選択します。150 μ Lでディスペンス ボリュームを残します。選択マルチ スペクトル Dewax の準備のプロトコルのため。[Ok] 追加のスライドをクリックします。下のコメント、入力「123 abc 肺 1 多重化」。示されているように、以下のフィールドを完了:組織の種類= テスト組織;ディスペンス ボリューム= 150 μ L;染色モード= 単一ルーチン;マーカー = ネガティブ染色=「7 多重プロトコル 1」; を入力準備= マルチ スペクトル焼く Dewax 2 h;HIER = HIER ER1 で 20 分。
- 追加スライドをクリックし、コメントやドロップ コントロールのスライドと、アイソタイプ コントロール スライドを追加するプロトコルを変更します。研究にすべてのスライドを追加すると、追加のスライドウィンドウを閉じるし、ラベルを印刷します。各スライド上の適切なラベル領域にラベルを適用されます。
- 自動着色にラックを挿入し、トレイを下げる、正しい向きでカバー タイルを適用、ラックにスライドをロードします。デバイスのスライドのラベルをスキャンします。
- ときすべてのスライドと試薬がスキャンされ、測定します。実行ボタン (►) がアクティブになります。オスミウムは、不十分な試薬の分注量などのエラーを検出した場合、黄色の警告シンボルが影響を受けるトレイで表示されます。エラーが発生すると、警告の記号を右クリックし、エラーを解決します。
- すぐに染色を開始またはスケジュール遅延開始。プロトコルは、期間約 14 時間です。注:プロトコルが染色の結果に影響を与える可能性過剰洗浄としてスライドをすぐに削除することができるときに完了を確認します。
9. マルチ スペクトルのスライドの Coverslipping
- 自動着色からスライドを削除し、1 で冠水したラックに保管 TBS. x
- 第 1.5 coverslips とマウント メディア (材料表を参照してください) の 15 μ L のサンプルをマウントします。ピペット チップの coverslip の優しく押すことによって任意の泡を削除します。
- 研究室のベンチに室温で一晩治すためスライドを許可します。未硬化のスライドは、慎重な取り扱いをすぐにスキャンできます。
10. 多重分光スキャナー
- 多重分光スキャナーとコンピューターの電源を入れます (モデルとソフトウェア情報の材料表を参照)。顕微鏡制御ソフトウエアを起動します。デバイスの前面にタッチ センサー式ボタンを押すことによって多重分光スキャナーの前面ドアを開きます。スキャナー内の各バネ付きキャリアは、4 つのスライドを保持しています。キャリアにすべてのスライドをロードし、デバイスにキャリアをロードする前に順序を記録します。
- プロトコル フィルターを編集を選択し、[新規]; をクリックしてくださいその後、多重パネル 1 とドロップ コントロールのプロトコル名を作成します。研究名多重パネル開発を作成し、プロトコルの作成をクリックします。概要スキャン フィルター DAPI;全体スライドをスキャンし、ピクセルの解像度 0.50 μ m (20 X)を選択します。すべてのフィルターとバンドを表現する必要があります。そうでない場合は、[フィルターの編集とバンド(DAPI、FITC、CY3、テキサス赤および cy5 の組合せ) の 5 つのフィルターをすべて選択、エクスポー ジャーの編集をクリックします。
- 肺腺癌における多重化とキャリアを選択することによってキャリアをロードします。グラフィック ユーザー インターフェイスを使用して正しいスライドを選択します。手動またはオート フォーカスを使用して、組織の焦点を当てます。許容可能な DAPI 染色の任意の領域に移動し、ミリ秒単位で露出を設定する自動公開をクリックして (0-2,000 ミリ秒)。
- 全体スキャンと MSI 地域の両方の列内のすべての 5 つのフィルター セットに同じ手順を繰り返します。必ず許容染色領域に移動し、フィルターと倍率ごとに露出を設定する前に、顕微鏡の焦点します。全体的なスキャン x 20 およびマルチ スペクトル イメージング (MSI) マルチ スペクトル領域 x 20 のすべての 5 つのフィルターの自動公開します。0.50 μ m (20 倍) のピクセルの解像度を選択します。プロトコルを保存し、戻ってベクトラ ソフトウェアのホーム画面に戻るをクリックしてくださいスライドのスキャンをクリックします。
- 各スライドのインターフェイスを開き、スキャンするタスクを設定します。多重パネル開発に研究を設定、多重パネル 1 とドロップ コントロール、プロトコルを設定、スライド IDを多重肺 ABC123、多重 CD68 ドロップ肺 ABC123など、.すべてのスライドがラベル付けされているし、タスク設定、スキャンをクリックします。自動多重分光スキャナーはすべて 5 つのフィルターを使用してすべてのスライドのスライドのスキャンを実行します。
11. 多重分光スキャナー: マルチ スペクトル イメージング
- スキャンが完了したら、 QPTIFFソフトウェア ("Phenochart") を開き、左上に負荷のスライド] をクリックします。5 フィルター全体スライド スキャンである、QPTIFF が表示されます。ユーティリティは限られているが、ティッシュの構造および広範な発現パターンが明らかと MSI の領域を選択する使用することができますので、各レイヤーは 1 つ以上の蛍光の情報を含みます。
- 移動し、左側のドロップ ダウン ツリーを使用して研究の正しいスライドを開きます。ログイン ユーザーの頭文字 (右上)。
- 画面の上部にスタンプツールを使用して、MSI の 5 つの領域を選択します。1 つが利用可能な場合は、病理医を参照してください。選択を、[選択取得;[フィールド サイズ] 選択1 x 1フィールド制限、 0.5 μ m (20 倍)を選択します。サイトケラチン (CK) (主に Cy5) 染色に基づいて、腫瘍 (CK +) と質 (CK-) 全体的なスキャンからイメージを作成するいくつかの領域を選択します。スライドごとにこの手順を繰り返します。
- すべての Msi を選んだら、 Phenochartソフトウェアを閉じ、ベクトラソフトウェアに戻ります。各スライドのスキャンからMSIにタスクを変更し、MSI のコレクションを実行するもう一度スキャンをクリックします。
12. スペクトル分離
注:スペクトルの分離手順チャネルセパレーションとスライドの画像解析のため必要です。通知ソフトウェアのスペクトル分離を実行すると、前に、スペクトル ライブラリは染色各弗素 DAPI と単独で肺腺癌のスライドを使用して構築する必要があります。この手順は、前述のマルチプレックス IHC アッセイ開発ガイドに説明されています。
- MSI の取得が完了したら、 MSIフォルダーのファイルを開くにスペクトルの分離 (「お知らせ」) ソフトウェアを使用します。これらのファイルは、.im3 のファイル種類の拡張子で終わる。
- [イメージ形式] 選択マルチ スペクトル;[サンプル形式、選択蛍光;スペクトル ライブラリのソースの下で通知を選択します。
- Fluors を選択するには、選択して搭載し肺腺癌ライブラリ スライド ライブラリからすべての六つの fluors と DAPI を読み込みます。すべての準備(左下) をクリックします。スペクトル分離ソフトウェアは提供したスペクトルのプロファイルを使用して、すべての開いている画像のスペクトル分離を実行します。
- 病理学者と同じ組織の連続スライドで同じターゲットの発色の単一汚れに対して染色パターンを評価します。
13. 蛍光強度と信号減衰の評価
注:小さな茶色のボックスを矢印として表示され、カウント ツール多重最適化のための最も重要なツールは、頻繁に使用する必要があります (補足資料を参照してください)。スペクトル分離ソフトウェアでカウント ツールを使用して、少なくとも 10:1 (トラブルシューティングやドロップ コントロールを使った染色多重の評価の補足資料を参照してください) を超えない信号対雑音比を評価します。
- 13.1、スペクトル分離ソフトウェアで開いているイメージのカウント ツールを従事し、各チャンネルの蛍光強度を評価するためにイメージを調査します。肺組織における目標強度は、10 と 20 の正規化数の間です。正規化されたカウント ツール、図 1に示します。
- 自家蛍光特性とターゲットを離れて染色が本格的な信号と競合しないように、任意のマーカーが 5 未満 10 未満か、通常信号領域数の最大信号数を持つスライドを除外します。
- 除外してスライドの最大カウント スペクトルからの出血や非効率的なスペクトル分離を避けるためには、チャネルの 30 を超える。
- アドレス ハイまたはローは、TSA の濃度を調整することによって数を正規化します。
14. マルチ スペクトル画像解析
- 1 つ以上の MSI をスペクトル分離ソフトウェアで開き、分離するためのみの fluors が少なくとも 1 つ開いているイメージで表されます。準備すべてスペクトル混じり気のない画像を生成するためのすべての現在開いているカラー画像を unmix をクリックします。
- 関心の領域を越えて舞うことによって各画像間で数を調査するためのカウント ツールを選択します。
- ビューのエディターを開くには目のアイコンを選択します。選択し、独立した各チャンネルのディスプレイの明るさを調整します。
- 構成組織分割、セル分割、表現、およびスコアリング モジュールを開くを選択します。これらのツールは、多重染色発色の単一汚れに対しての客観的検証に必要なし、定量的 phenoptic データ (図 S1) を生成する使用ことができます。
- さらに分析、アーカイブ、およびプレゼンテーション (図 S1) のグレースケール、蛍光を保存して [エクスポート] タブ、pathview スタイルの非圧縮 TIFF、および phenoptic 分析モジュールからデータ ファイルを使用します。
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Representative Results
ここで説明されているプロトコルは、図 2に示すような結果になります。表面扁平上皮で始まるへんとう腺コントロールの染色性を評価を開始します。扁桃サンプルの組織は、H & E のスライドを参考にして、病理医に確認できます。同じ組織ブロックの同じマーカーで発色 IHC セクションを実行すると場合、これらは密度と mIF のスライドの各マーカーの分布を確認する使用できます。扁桃組織が明確に定義された AE1/AE3 サイトケラチン染色扁桃表面扁平上皮を提供する必要があります図 2Aのように、(図 2A; 赤擬似カラーとしてラベル付け)、リンパで背景なし組織。染色すべき膜のアクセントと時折、細胞質と核を負の値にする必要があります。陰窩に単層上皮はサイトケラチン (赤) の PD L1 (図 2; 緑 pseudocolor) 肯定的なする必要があります。扁桃濾胞の胚中心を識別し、必要があります。胚中心は簡単に認識する必要があり、Ki 67 陽性リンパ球 (図 2; 黄色 pseudocolor) 豊富なはず。Ki 67 を汚す、常に核。大食細胞、濾胞に存在は、時に大きなセル (「核機関」とも呼ばれる) として、簡単に認識できる必要があります。それらは CD68 の粒状の細胞質染色 (図 2; オレンジ pseudocolor) として陽性表示されます。CD68 細胞胚の中心の外の変数の割合はまた予想されます。マクロファージは、染色法による PD L1 の膜を表示ことがあります。これは通常単層上皮における PD L1 の染色よりも強度で薄いです。そこに核 CD68 べきである染色します。CD8 リンパ球 T 細胞の分布を染色する必要があります (胚中心と胞間のエリアで大きい割合の少ないシアン pseudocolorA図 2を参照)。Cd8 陽性リンパ球は、通常、小さい細胞はリンパ球の細胞質と膜を区別するために実質的に不可能です。PD 1 (図 2; マゼンタ pseudocolor), 胚中心の周囲に通常クラスター化胚中心地区小リンパ球を強く染色し、同様、通常胞間領域におけるリンパ球に散在胚中心地域のそれらより低い染色強度を示します。CD8, と同様、膜と PD 1 に染まった小リンパ球の細胞質染色を明確に区別することが可能がないです。品質管理目的のために染色パターンと同じ組織で染まっている各マーカーの分布は、提案として、発色の IHC 参照スライドと比較される CD8 細胞の可変割合 coexpress PD 1、ためにお勧め以前に発行されたプロトコル12。
扁桃組織コントロールの予期された染色パターンが確認された後は、肺の癌のサンプル (図 2B) で染色を評価に進みます。変数と異種発現マーカーの腫瘍組織が期待された、のでそれが mIF メソッドとその表現にみられる各マーカーの染色パターンと比較する新しい mIF パネルの最適化中に大事です。標準的な発色 IHC のスライドは、数量および前述12陽性細胞の分布の評価で観察。それにもかかわらず、基本的な染色パターンを保持する必要があります;上皮細胞の細胞質と核でのサイトケラチンの観察などCD68 がマクロファージ、顆粒細胞質染色として表示されますなど.重要なは、いくつかのマーカーの染色強度がコントロールから変更、扁桃腫瘍;たとえば、PD 1 と PD L1 は、低強度のへんとう腺コントロールにおいて非常に高い式と比較して, 腫瘍組織の染色を表示できます。したがって、扁桃のコントロールではなく、腫瘍組織の例を使用して、通知ソフトウェアの評価とカウント ツールで最適化を実行することが重要です。
最後に、負のアイソタイプ コントロールとコントロールをドロップは背景と蛍光の検出のみならず傘効果とスペクトルの出血 (図 3および図 4) のために評価する必要があります。アイソタイプ コントロール必要があります。 スライドにわたって任意の染色を示しません任意の染色が観察されるイメージングまたは汚損プロシージャを再訪する必要があります。ドロップ コントロールが重要な染色、mIF による新しい多重パネルの最適化の間、スペクトルの出血または傘効果などの潜在的な成果物を評価する (図 5、補足図 S2を参照してください。補足図 S3、および補足資料)。蛍光 monoplex アンド ドロップ コントロールを評価され、完全な多重パネルと比較する必要があります。各ドロップ コントロールは、各特定のコントロールを削除する必要があります 1 つの一次抗体を除いて同じ染色パターンを表示します。詳細については、補足資料のセクションで提供されます。
図 1: カウント ツールを通知します。通知ソフトウェア カウント ツールをアクティブするには、ベージュ色のボックスのアイコンを選択します。正規化された数、ビット深度、露出時間、ゲイン、およびビニングの修正しました。20 X 倍率で画像が撮影されました。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 代表結果。扁桃 (A) と (B) の肺小細胞癌が CD8 PD L1 (520 TSA ・緑) で染色した (540 TSA、シアン)、キ67 (570 TSA、黄色)、CD68 (620 TSA、オレンジ)、サイトケラチン (赤 650 TSA) と PD-1 (690 TSA、マゼンタ)。個々 のチャンネルは、小さなパネルで下に別々 に表示されます。マーカーは、各画像の右上に表示されます。20 X 倍率で画像が撮影されました。スケールバー = 50 (または 250 μ m)。Aが 1 パネルに示された) リンパ濾胞、2) 胚中心、3) 胞間領域、および 4) 重層扁平上皮です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: TSA ブロック/傘効果。これは、690 TSA TSA の存在量に依存した方法で、PD 1 抗体ブロッキングの CD3 信号による堆積の例です。明るい 690 TSA 信号は 620 の TSA 信号を最も効果的にブロック (0.52 μ g/mL または 1: 100; その後、抗 CD3 F7.2.38 0.14 μ g/mL で 30 分の間で 10 分 690 TSA 検出続くアイソタイプで 30 分間アンチ PD 1 D4W2J で染色肺小細胞癌の 1 例1: 100 で 10 分 620 TSA 検出が続く)。20 X 倍率で画像が撮影されました。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: スペクトル ブリードします。肺小細胞癌組織は、Ki 67 ドロップ制御プロトコル (Ki 67 抗体を省略すると、完全な多重プロトコル) で染まっていた。540 TSA チャネル (CD8) と 570 の TSA チャネル (キ-67) が表示されます。核の染色パターンがないのに、まだ染色 CD8 の減少したコピーは 570 の TSA チャネルで観察されます。これは最高のすべてのチャネルに匹敵する染色強度を確保することによって扱われます。この場合、堅牢な Ki 67 信号 (10 と 20 の間正規化数) の追加はスペクトルのブリードを修正します。20 X 倍率で画像が撮影されました。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: コントロールをドロップします。この図は完全の合成画像多重示された一次抗体が省略されたドロップ コントロールを使った染色肺腺癌の連続スライドの同じ領域と比較しています。20 x 倍率で画像が撮影されました。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 名 | 確率的名 | タイプ | コンテナー | グループ |
| PKI のブロック バッファー | OPALBLOK | 補助的な | オープン 30 mL | 一般的です |
| オパール ポリマー HRP | オパール 2 AB | 補助的な | オープン 30 mL | 一般的です |
| オパール 1 x TBS | OPAL1TBS | 補助的な | オープン 30 mL | Det. キット |
| CD68 0.30 μ G/ml PG M1 Mu | OPALCD68 | 補助的な | オープン 7 mL | 一般的です |
| キ67 0.61 μ G/ml MIB 1 Mu | OPALki67 | 補助的な | オープン 7 mL | 一般的です |
| PD L1 0.20 μ G/ml SP263 ラブ | OPALPDL1 | 補助的な | オープン 7 mL | 一般的です |
| PD 1 0.52 μ G/ml D4W2J ラブ | オパール PD1 | 補助的な | オープン 7 mL | 一般的です |
| CD8 0.70 μ G/ml SP239 ラブ | オパール CD8 | 補助的な | オープン 7 mL | 一般的です |
| CK 0.24 μ G/ml AE1/AE3 Mu | オパール CK | 補助的な | オープン 7 mL | 一般的です |
| マウス IgG します。 | オパール MU | 補助的な | オープン 7 mL | 一般的です |
| ウサギ IgG します。 | オパール ラブ | 補助的な | オープン 7 mL | 一般的です |
| オパール ペルオキシダーゼ ブロック | OPALPERX | 補助的な | オープン 7 mL | 一般的です |
| スペクトル DAPI | OPALDAPI | 補助的な | 滴定 6 mL | 一般的です |
| オパール 520 試薬 | オパール 520 | 補助的な | 滴定 6 mL | 一般的です |
| オパール 540 試薬 | オパール 540 | 補助的な | 滴定 6 mL | 一般的です |
| オパール 570 試薬 | オパール 570 | 補助的な | 滴定 6 mL | 一般的です |
| オパール 620 試薬 | オパール 620 | 補助的な | 滴定 6 mL | 一般的です |
| オパール 650 試薬 | オパール 650 | 補助的な | 滴定 6 mL | 一般的です |
| オパール 690 試薬 | オパール 690 | 補助的な | 滴定 6 mL | 一般的です |
表 1: ライカ ボンド RX プロトコル、オパール試薬
| 試薬 | 時間 (h) | 温度 (摂氏) | |
| 1 | ない試薬 | 120:00 | 60 |
| 2 | ボンド Dewax ソリューション | 0:30 | 72 |
| 3 | ボンド Dewax ソリューション | 0:00 | 72 |
| 4 | ボンド Dewax ソリューション | 0:00 | アンビエント (室温) |
表 2: オパールの準備のプロトコル
| ターゲット | μ G/ml | クローン | ソース | たくさん | ストック μ G/ml | Μ L の希釈液 | Μ L AB |
| CD68 | 0.3 | PG M1 | 関連 | 20043031 | 30 | 2376 | 24 |
| キ67 | 0.61 | MIB 1 | 関連 | 20049476 | 46 | 2368.17 | 31.83 |
| PD L1 | 0.2 | SP263 | ベントです。 | F09591 | 1.61 | 2101.86 | 298.14 |
| PD 1 | 0.52 | D4W2J | CST | 1 | 100 | 2387.52 | 12.48 |
| CD8 | 0.7 | SP239 | ベンタナ | 160318 | 70 | 2376 | 24 |
| CK | 0.24 | AE1/AE3 | 関連 | 10129428 | 179.5 | 2396.79 | 3.21 |
| Mu IgG します。 | 0.61 | ||||||
| ラブ IgG します。 | 0.7 |
表 3: 一次抗体作製。
| オパール蛍光 | スライド | 希釈 | Μ L の希釈液 | Μ オパール蛍光 |
| オパール 520 | 16 | 1: 200 | 2736.3 | 13.8 |
| オパール 540 | 16 | 1:700 | 2746.1 | 3.9 |
| オパール 570 | 16 | 1: 150 | 2731.7 | 18.3 |
| オパール 620 | 16 | 1: 100 | 2722.5 | 27.5 |
| オパール 650 | 16 | 1:350 | 2742.1 | 7.9 |
| オパール 690 | 16 | 1: 150 | 2731.7 | 18.3 |
表 4: オパール蛍光準備。
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補足テーブル 2: 完全多重化、ドロップ コントロール、および完全のアイソタイプ コントロールの概要と比較します。この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
継続的な癌免疫療法革命は開口部小説と有望な治療方法がん患者13。免疫腫瘍学の分野の進歩の炎症性の腫瘍微小環境、発癌に関与する免疫学的メカニズムの生物学を理解するだけでなく、新しい予測バイオ マーカーを見つけることも増加の知識が必要になります免疫療法を用いた治療法1,2。がん免疫の複雑な生物学による腫瘍組織サンプルの尋問は通常互いに相互作用し、1 体内の多様な細胞集団でよく行ったが、免疫マーカーの成長のリストを開発する必要 ,2,5。臨床試験は、通常コア針などを評価し、患者の応答を監視する療法のさまざまなポイントで収集された内視鏡下生検の結果、小さな生検を採用しています。このような生検組織数がん immunoprofiling を用いることができるティッシュ セクションの数が制限の限られた量を提供します。標準 monoplex IHC などの伝統的な技術を使用する場合、この制限は特に面倒です。明確には、したがって、必要がありますがんのための新しい方法を作る immunoprofiling を使用容量の多重技術の異なるバイオ マーカーの共発現を同時に評価し、貴重な組織標本のより効率的に使用します。
多重染色とマルチ スペクトル イメージング方法詳細はここで説明されている、臨床試験からのバイオプシーのよう FFPE 組織の腫瘍免疫研究の mIF パネルが使用されます。このメソッドは前述の検証、およびがん immunoprofiling8,9,10、11,12,14,を用いて15. 以前に公開されたプロトコルは染色法など 7 色のキットは、時間がかかり、必要な作業の約 4 日間専用の実験室の科学者12 の TSA ベースのシステムに類似した mIF を説明しています。、15。これらの欠点に対し、劇的に短縮時間を 14 h を染色とマニュアルの演算子によって導入された変動を排除する市販の自動着色を使用してこのプロトコルを最適化されています。蛍光は、信号の品質を低下させることがなく効率的に削除することができますを含む多重のスライドで 7 つ以上の蛍光信号のスペクトルを分離することができる多重分光スキャナーのイメージングを行ったこのプロトコルは、複製、変更、および機器と試薬材料表の詳細へのアクセスを持つ研究室ユーザで実行できます。
このプロトコルの重要なステップは、セクション 7、10、11、12 です。セクション 7 は、試薬の調製に関係します。多重染色試薬の入念な準備は不可欠であり、演算子に依存した変動を避けるために研究所の科学者や技術者の注目を必要とします。例えば、具体的に TSA の染料の試薬の希釈の入念な準備によって減らすことができる変動の汚損は多重方式の主要な問題の 1 つ。セクション 10 および 11 は、画像の取得に関連しています。重要なリスクは、露出オーバーまたはスペクトル ブリード、別のチャンネルからの信号がイメージを作成されているチャネルに干渉するアイテムにつながる可能性がありますイメージの過飽和 (補足資料を参照してください)。慎重に露光時間を調整は、過飽和とスペクトルの出血を防ぐために助けることができます。スペクトル分離は、12 のセクションで行われます。これは (多重 IHC アッセイ開発ガイドで利用可能なオンライン説明) スペクトル ライブラリの準備に依存します。この手順で通知ソフトウェアは「訓練」具体的に各 TSA の染料の色を認識します。スペクトル ライブラリはヒト扁桃などの管理組織からのセクションを使用して作成された、均一に発現マーカー CD20 などで染色、個々 のスライドのそれぞれ個々 の TSA 色素と結合します。さらに、認識し、組織の自家蛍光を引く通知ソフトウェアを訓練する蛍光スライド (また多重 IHC アッセイ開発ガイドで説明します) が必要です。蛍光コントロール スライドは (肺癌等)など検討されている同じ組織からのサンプルを使用して準備、mIF のスライドと同じように扱わ、TSA 色素ではなく第一次および二次抗体の孵化する必要があります。コラーゲン、線維症、赤血球、内因性顔料、他のソースから来るかもしれない観察可能な自発の表現を選択する注意する必要がありますので、単一の蛍光スペクトル プロファイルのみを選択できます。同じプロジェクト内の各バッチの肯定的な制御として同じティッシュのブロックを実行するの他に、それぞれの新しいプロジェクトの初めに新しいスペクトル ライブラリの作成と組織研究標本の代表である蛍光スペクトルを用いたスペクトルの一貫性を改善するために役立つ貴重な方法論的手順は、同じプロジェクト内の異なるサンプル間で分離します。
このプロトコルで記述されている多重方式では、信号対雑音エバリュエーター (カウント ツール)、ドロップ コントロール (補足資料) は、染色の品質管理のための病理学ビューなど、いくつかのトラブルシューティング ツールをご利用いただけます。カウント ツールは、染色の強さとバック グラウンドのレベルを評価するのに役立ちます。強度および/またはバック グラウンド レベルが高い場合、最初のアプローチは、TSA 色素の希釈を減らすことです。問題が解決しない場合、その特定のマーカーの最適化に使用される発色 IHC スライドは病理学者、背景の存在を探していると見直す必要があります。DAPI を含むすべての蛍光信号から生成された偽ヘマトキシリン表現だけでなく、TSA リンク蛍光から蛍光のジアミノベンジジンのような擬似カラー表現を使用して、通知ソフトウェアによって病理学ビューの生成します。.病理学ビューからの画像は、改良された染色の病理学者によって染色パターンの視覚的評価とヘルプします。これらのツールは、染色のワークフローの中に新しいパネルと品質管理手順の最適化中に常に採用する必要があります。
MIF メソッド正しく検証と、ホルマリン固定組織で標準的な発色 IHC 用に最適化されている一次抗体が必要です。例えば、mIF TSA 法の主要な利点の 1 つは検証と臨床使用12の解剖学的病理学研究室で最適化されている一次抗体の使用との互換性です。この利点は、迅速かつダイナミックなパネル開発を提供する preconjugated の抗体を必要とせず特定の癌免疫学質問に答える研究所ユーザーによって多重パネルをカスタマイズできることを意味します。この点では、新しいパネルの最適化のための実際のワークフローから標準的な発色の IHC、最高希釈を探して、クリーンで一貫性のあるを提供する条件を染色と抗体の最適化と検証始まる染色。IHC、最適同じ希釈を使用して、次のステップはジアミノベンジジン代わりに TSA fluors を使用して染色を転送して monoplex の結果を比較する参照として発色 IHC と蛍光 TSA。最後に、抗体結合できます mIF が染色で常にコントロールの参照として染色発色 IHC を使用してパラメーターを調整する mIF TSA 染色、主に TSA の染料の希釈液と染色のシーケンス。このプロセス中に病理医とのコラボレーションは、染色の品質を評価する役立ちます。
この技法の制限には、時間と労力を最適化し、新しいパネルの検証と mIF パネルの診療分析に必要なが含まれます。主な関心事は、mIF メソッドの適切な検証です。これらのテクニックの適切な検証の欠如は、それによって癌免疫学16の生物学のよりよい理解を得るために試みを妨げ、文学に紛らわしいデータを追加可能性があります無効な結果を生成するリスクを伴います。それは、したがって、近い参加とトレーニングと検証の経験を持つ病理医による評価と組織の評価を確保するなど、多重方法を正しく検証するためあらゆる努力を治験責任医師の義務病理組織学的そして IHC ベース テクニック17,18,19,20。ここで提示されたプロトコルが含まれていますいくつかの染色と分析、発色 IHC を mIF TSA を最適化への参照として使用する前に H & E のスライドの病理学的評価を含む新しい多重パネルの検証に役立つツール染色、新しい品質管理のドロップ コントロール法多重パネルと蛍光、アイソタイプの使用、コントロールをドロップします。MIF の方法の技術的な複雑さにもかかわらずスペクトル分離、その他新規の多重プラットフォームだけでなく、マルチ スペクトル イメージングなどの技術は採取した患者の分析と新しいフォームの生成のための新しい時代を開いています。データを標準 IHC だけでは不可能です。したがって、mIF 技術の開発と成長を続けるだろう、臨床試験や新しい免疫療法、多重予測バイオ マーカーを識別するために助けるのための生検の癌 immunoprofiling のための強力なツールになります。恩恵を受けて、とりわけ、癌患者に。
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Disclosures
この作品は、MedImmune、グローバル バイオ医薬品 R & D アストラゼネカの腕によって支えられました。プレゼントをもらった、韓、c. w. パーキン エルマー試薬 (TSA キット) を生成してこの作品で使用されたマルチ スペクトルのスキャナーの従業員であります。修士課程修了、中啓、a. h. w. Z. C. バグナル、C ・ ブラウン、j. c.、アダムローリー、k. s.、原産地、J.R.C.、MedImmune の従業員持ち株会やストック利益またはアストラゼネカのオプション。
Acknowledgments
編集のサポートは、MedImmune のデボラ シュマンによって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
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