Summary
Ein detailliertes Protokoll für ein sechs-Marker multiplex Immunfluoreszenz-Panel optimiert und durchgeführt ist, mit Hilfe einer automatisierten Stainer für konsistentere Ergebnisse und eine kürzere Verfahrensdauer. Dieser Ansatz kann direkt von jedem Labor für Immuno-onkologischen Studien angepasst werden.
Abstract
Weiterentwicklungen in der Immuno-Onkologie erfordert ein besseres Verständnis der Mechanismen der Krebsimmunologie. Die Immunoprofiling Analyse von Gewebeproben aus Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Biopsien ist ein wichtiges Instrument für das Verständnis der Komplexität der Tumorimmunologie und entdecken neue Prädiktive Biomarker für Krebsimmuntherapie geworden. Immunoprofiling Analyse der Gewebe erfordert die Beurteilung von kombinierten Markierungen, einschließlich der entzündlichen Zelle Subpopulationen und immun Checkpoints in den Tumor Mikroumgebung. Das Aufkommen der neuen multiplex immunhistochemischen Methoden ermöglicht eine effizientere multiparametric Analyse der einzelnen Gewebeschnitte als standard Monoplex Immunhistochemie (IHC) tut. Eine handelsübliche multiplex Immunfluoreszenz ermöglicht (IF) Methode basiert auf Tyramide-Signalverstärkung und kombiniert mit multispektralen mikroskopische Analyse eine bessere Signaltrennung der verschiedenen Markierungen im Gewebe. Diese Methodik ist kompatibel mit dem Einsatz von unconjugated primäre Antikörper, die für standard IHC an FFPE Gewebeproben optimiert wurden. Hierin beschreiben wir ausführlich eine automatisierte Protokoll, das Multiplex-ermöglicht wenn Kennzeichnung von Karzinom Gewebeproben mit einem sechs-Marker Multiplex-Antikörper-Panel bestehend aus PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 und AE1/AE3 Cytokeratin mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole als eine atomare Zelle Gegenfärbung. Das Multiplex-Panel-Protokoll ist in einem automatisierten IHC Stainer Färbung Zeit optimiert, die ist kürzer als die des manuellen Protokolls direkt angewendet und werden von jedem Labor Investigator für Immuno-Onkologie-Studien an menschlichen Gewebeproben der Proteinkinase angepasst. Ebenfalls beschrieben sind mehrere Steuerelemente und Werkzeuge, einschließlich Drop Steuerungsmethode für feine Qualitätskontrolle eines neuen Multiplex-IF-Panels, die nützlich für die Optimierung und Validierung der Technik sind.
Introduction
Immunoprofiling Analyse von Gewebeproben FFPE Tumor ist ein wesentlicher Bestandteil der Immuno-Onkologie-Studien, insbesondere für die Entdeckung und Validierung der neue Prädiktive Biomarker für Krebsimmuntherapie im Rahmen von klinischen Studien1 geworden. ,2. Chromogene IHC mit chemischen Chromogens wie Diaminobenzidine, bleibt die Standardtechnik in der diagnostischen Pathologie für die Immunolabeling der Biopsie Gewebe3. Standard IHC einsetzbar auch für Krebs-Gewebe-Immunoprofiling, einschließlich die Quantifizierung der Subpopulationen von Tumor-assoziierten Lymphozyten und die Beurteilung der Ausdruck Niveaus von immun Prüfpunkten wie programmierten Zelle Tod Liganden 1 (PD-L1)4 ,5. Standard IHC ist begrenzt, jedoch, dass nur ein Antigen pro Gewebe Abschnitt bezeichnet werden kann. Da Immunoprofiling Studien in der Regel die Analyse der kombinierten Ausdruck mehrere Markierungen erforderlich, erfordern den Einsatz von standard IHC würde die Färbung von mehreren Gewebeschnitten, die jeweils mit einer einzigen Markierung befleckt und, daher wäre wesentlich begrenzt für die Analyse von kleinen Gewebeproben wie Kern Nadel Biopsien. IHC Standardmethoden beschränken sich auch für die Bewertung von Markern, die coexpressed sind durch unterschiedliche Zellpopulationen, wie üblich mit immun Checkpoint Marker wie PD-L1, die durch Tumor-assoziierten Makrophagen und Krebszellen zum Ausdruck kommt. Diese Einschränkung wurde in, zum Beispiel die Verwendung von standard Monoplex IHC von Pathologen für die Quantitative Analyse eines IHC-Markers geäußerten unterschiedlichen Zelle Arten6berichtet. Die Entwicklung von multiplex chromogenen IHC-Techniken mit unterschiedlichen farbigen Chromogens auf die gleichen Gewebe Abschnitt stellt eine Weiterentwicklung gegenüber der standard IHC Monoplex-Methode,7 bleiben begrenzt durch die Immunolabeling von wenigen Marker und stellen auch eine wichtige technische Herausforderung für die ordnungsgemäße Bewertung der Marker in der gleichen subzelluläre Fächer die gleichen Zellpopulationen ausgedrückt.
Die genannten Vorbehalte bezüglich Gewebe Verfügbarkeit von klinischen Proben, als auch die Grenzen der multiplex chromogenen IHC Techniken, haben zu der Notwendigkeit, verbesserte Multiplex-Verfahren für Immuno-Onkologie-Studien auf der Grundlage entwickeln geführt. fluoreszierende Kennzeichnung in Verbindung mit imaging-Systemen, die effektiv die Signale von mehreren Fluorophore von derselben Folie trennen können. Eine solche Technik basiert auf Tyramide Signalverstärkung (TSA) in Kombination mit multispektralen Mikroskopie Imaging für effiziente Farbe Trennung8. Eine handelsübliche TSA-basierte Kit beschäftigt Fluorophore für multispektrale bildgebenden8 optimiert (siehe Tabelle der Materialien). Ein entscheidender Vorteil dieses Systems ist seine Kompatibilität mit den gleichen unbeschriftete primäre Antikörper, die bereits überprüft und optimiert für standard chromogenen IHC9,10,11. Dies ermöglicht nicht nur die schnellere Optimierung, sondern auch die Flexibilität in der Optimierung und Panel Modifikationen unter Einbeziehung neuer Ziele. Darüber hinaus kann die Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) TSA Methode für kommerziell erhältliche automatisierte IHC Stainer Systemen, so dass für einen einfachen Transfer vom Monoplex optimiert werden chromogenen IHC, mIF.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine mIF-Panel für Immuno-Onkologie-Studien auf der Grundlage mIF TSA Färbung automatisiert und einen multispektralen Scanner für die Bildgebung verwendet. Dieses Protokoll kann angepasst und geändert von jedem Labor-Benutzer mit Zugriff auf die beschriebenen Instrumente und Reagenzien. Das Protokoll enthält eine Gruppe von sechs primäre Antikörper für die Immunoprofiling Karzinome: PD-L1, PD-1, CD68 (als Pan-Makrophagen Marker), CD8 (zytotoxische T Zellen), Ki-67 und AE1/AE3 (Pan-Cytokeratin, verwendet als eine epitheliale Marker zur Identifizierung von Karzinomzellen). Eine aktuelle Studie beschreibt die Optimierung eines manuellen TSA-mIF-Protokolls mit chromogenen IHC als Standardwerk, um das Multiplex12Färbung zu validieren. Die hier vorgestellte aktualisierte Methode wurde entwickelt durch mit einem handelsüblichen, sieben-Farb TSA-Kit in einem automatisierten Stainer, drastisch Verkürzung der Färbung von 3 – 5 Tagen, 14 h, während gleichzeitig die Konsistenz der Färbung optimiert. Neben der detaillierten wichtigsten Protokoll hier vorgestellten enthält einen Abschnitt, Zusatzmaterialien "Drop-Control"-Methode, eine zusätzliche Qualitätskontrolle, ein neues mIF-Panel sowie technische Hinweise für die Optimierung zu bewerten, Fehlerbehebung und Entwicklung von neuen Multiplex-Platten, den Labor-Benutzer einrichten und optimieren die mIF-TSA-Methode für benutzerdefinierte mIF Panels zu helfen.
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Protocol
Hinweis: Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt das Immunoprofiling eines mIF-Panels mit TSA für sechs Antikörper durchführen (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 und AE1/AE3) auf eine automatisierte Stainer (siehe Tabelle der Materialien). Das Protokoll beschreibt auch die Drop Steuerelemente für eine Qualitätskontrolle der ein neues Panel mIF durchführen (siehe Ergänzende Materialien). In diesem Protokoll wird die Färbung mit acht ungefärbten FFPE-Folien aus menschlichen Tonsillen (Positivkontrolle) und acht ungefärbte Folien aus menschlichen Lunge Adenokarzinom durchgeführt. Die erste Folie ist für volle Multiplex Färbung mit allen sechs Markierungen, der zweiten Folie für die Isotype-Kontrolle, bei der keine primären Antikörper genutzt werden, und die verbleibenden sechs Folien für die Drop-Steuerelemente (siehe Zusatzmaterialien) verwendet. Eine zusätzliche Kontrolle für Gewebe Autofluoreszenz ist sehr zu empfehlen und sollte immer in einem Multiplex enthalten (siehe Zusatzmaterialien) zu studieren. Ermittler können jedoch andere Tumorarten und Kontrollen gemäß ihren eigenen Projektziele beschäftigen. Labor Benutzer ohne Vorkenntnisse mit den mIF TSA Methode und multispektralen Scanner Techniken sollten Multiplex IHC Development Guide lesen (verfügbar unter http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Obwohl dieses Handbuch eine manuelle Protokoll beschreibt, bietet es auch eine gute Einführung in die mIF Färbung Methode. Alle Gewebeschnitte beschäftigt in diesem Protokoll wurden anonymisiert und gemäß der Deklaration von Helsinki.
(1) Gewebeproben
- Eine Proteinkinase menschlichen Tonsillen Stichprobe mit lymphoiden Hyperplasie als Positivkontrolle und eine Proteinkinase menschlichen Lunge Adenokarzinom Probe bekannt, PD-L1 verwendet werden positiv. Überprüfen Sie die Hämatoxylin und Eosin (H & E) Folien der ausgewählten Lunge Krebs Blöcke auf das Vorhandensein eines Tumors zu bestätigen. Es ist wichtig zu Tumoren mit reichlich Nekrose zu vermeiden, da dies nicht-spezifische Hintergrundfärbung erhöhen kann.
Hinweis: Für diese Optimierung, vermeiden Sie die Verwendung der Paraffin-Blöcke, die für 10 Jahre oder länger gespeichert wurden und das Gewebe mit einem getrockneten Auftritt in der Paraffinblock (Rücksprache mit einem Techniker Histologie). - Schneiden Sie ein Mikrotom 10 aufeinander folgenden Serienschnitte von jedem Block, 4 µm dick. Montieren Sie die Abschnitte auf einem positiv geladenen Objektträger für IHC, einen Abschnitt pro Folie verwendet.
Hinweis: Abschnitte müssen perfekt flach ohne Falten, Falten Färbung Artefakte erzeugen können angebracht werden. Nummerieren Sie die Folien der Serie Abschnitte von 1 bis 10. - Bereiten Sie eine neue H & E Folie auf dem ersten Abschnitt. Gehen Sie die H & E Folie mit Hilfe von einem Pathologen, das Vorhandensein von Tonsillensteinen Gewebe oder Lunge Tumor noch in den Block zu bestätigen.
Hinweis: Dieser H & E Folie kann später bei der Auswahl der Regionen von Interesse für multispektrale Analysen und Phänotypisierung helfen. - Ungefärbte Abschnitte in einer Kunststoff-Folie-Box bei 4 ° C bis zu drei Monate lang zu speichern.
2. Schaffung einer neuen mIF Retikuläres Programm auf eine automatisierte Stainer: Registrierung der Reagenzien
Hinweis: Reagenzien müssen der Reagenz-Liste in der automatisierten Stainer-Software hinzugefügt werden, bevor sie in den Protokollen zur Verfügung stehen. Tabelle der Materialien für Informationen über die automatisierte Stainer Modell und Software-Version anzeigen.
- Klicken Sie auf die Registerkarte " Reagenzien " innerhalb der automatisierten Stainer-Software. Klicken Sie auf Hinzufügen , um ein neues Reagenz zu benennen. Geben Sie den Namen (z. B. "520 TSA Reagenz") und den abgekürzten Namen (z. B. "520 TSA"), stellt fest, dass es maximal acht Zeichen. Wählen Sie zusätzliche Drop-Down-Menü und der Lieferant. Ändern Sie nicht Beflecken Einzel/Doppel Single/SequentialDS. Legen Sie den Standard Färbeprotokoll zu Protokoll F. Das Standardprotokoll HIER auf ER1 20festgelegt.
- Speichern Sie die neue Reagenz und wiederholen Sie Schritt 2.1 für alle Reagenzien in Tabelle 1aufgeführten.
3. automatisierte Stainer: Registrierung der Container
- Schreiben Sie den Namen des Reagens auf der Seite jeder Container verwendet werden. Scannen Sie den Barcode auf der Seite. Wählen Sie im Pop-up-Fenster das richtige Reagenz aus der Liste aus. Wählen Sie ein Ablaufdatum und speichern.
- Wiederholen Sie das Verfahren in Schritt 3.1 für alle Reagenzien in Tabelle 1aufgeführt.
- Registrieren Sie das offene Forschung-Kit. Beide Barcodes auf der Seite das Kit scannen und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm. Benennen Sie das Kit "Multiplex Research Kit 1." 1 X tris (Hydroxymethyl) Aminomethane (Tris) registrieren-gepufferte Kochsalzlösung als Bestandteil dieses Kit (Tabelle 1).
4. automatisierte Stainer: Schaffung einer mIF-Protokoll-Programm
- Multiplex-Basisprotokoll ist mit dem Namen Opal 7 Multiplex auf neue automatisierte freigesprochen vorinstalliert (siehe die Modell und Software-Version in der Tabelle der Materialien). Suchen Sie das Protokoll filtern für "alle" "lieber anstatt" auf dem Bildschirm Protokoll. Wenn das Basis-Protokoll nicht vorhanden ist, aktualisieren Sie die automatisierte Stainer-Software mit Unterstützung vom Hersteller.
- Alle Änderungen sollten Kopien des ursprünglichen Protokolls durchgeführt werden. Bevor Sie Änderungen vornehmen, speichern Sie das Original und erstellen Sie eine Kopie zu, klicken auf der Registerkarte " Protokolle ", dann mit der rechten Maustaste des Opal 7 Multiplex Protokolls und Kopierenauswählen.
- Ändern Sie den Namen 7 Multiplex Protokoll Nr. 1 in dem neuen Fenster, und wählen Sie die Registerkarte mit dem richtigen Gerät (Standmodell oder Benchtop) verbunden. Entsprechen Sie das Protokoll in Ergänzenden Tabelle S1. Klicken Sie auf Hinzufügen Reagenz um 10 min Peroxidase Hemmung Schritt (nicht Bestandteil der standard-Protokoll) hinzufügen und wählen die Peroxidase-Inhibitor als Reagenz.
- Bestätigen Sie, dass die blockierende Schritte einen PKI blockierenden Puffer nutzen. Sicherstellen Sie, dass jedem Primärantikörper bezieht sich auf das entsprechende Reagenz Sekundärantikörper Schritte nutzen ein HRP-Polymer, sodass die spektrale 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) zur Verfügung gestellt mit dem multispektralen Automation Kit genutzt. Bestätigen Sie alle Entscheidungen durch die Überprüfung der Reagenzien, die für jeden jeweiligen Schritt im Drop-Down-Menü auf dem Bildschirm Protokoll benannt wurde.
5. automatische Stainer: Zugabe von Drop Steuerelemente und Isotype Control Protocol
- Kopieren der Name 7 Multiplex Protokoll 1 und 7 MultiplexProtokolls 1 CD68 DROP geändert werden. Ändern Sie das Reagenz CD68 Antikörper IgG Maus und speichern Sie das Protokoll.
- Sechs weitere neue Protokolle, eine für jedes Dropdown-Steuerelement und eine für die komplette Isotype-Kontrolle (Wechsel alle Antikörper in den entsprechenden Klassen) in der gleichen Weise zu erstellen.
6. automatisierte Stainer: Folie Vorbereitung Protokoll
- Kopieren Sie das prestaining-Protokoll * Backen und Wachsentfernung und benennen Sie dieses Protokoll multispektralen Backen und Wachsentfernung 2 h.
- Stellen Sie das Protokoll entsprechend der Reagenzien in Tabelle 2dargestellt. Backen Sie Folien für 2 h bei 60 ° C. Wachsentfernung für 30 s bei 72 ° C.
7. automatische Stainer: Vorbereitung der Reagenzien
- Bereiten Sie ein Forschung Detection Kit. Ein Reagenz muss dieses Kit dauerhaft zugeordnet werden, so füllen Sie den offenen Behälter 30 mL für 1 X Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) mit 1 X TBS markiert und suchen Sie dies in Position 1 (am weitesten von dem Griff) in der Forschung Detection Kit bezeichnet Multiplex Research Kit 1. Dieses Reagenz wird dauerhaft mit diesem Kit Forschung verknüpft und muss nicht ändern Position für eine spätere Verwendung.
- Beschriften Sie zwei 30 mL offenen Behältern Multispektralen Block und Multispektralen sekundäre. Füllen Sie den Behälter Multispektralen Block 30 mL blockierende Puffer/Antikörper aus dem multispektralen Färbung Kit Verdünnungsmittel. Füllen Sie Multispektrale sekundäre 30 mL anti-mouse/anti-rabbit Sekundärantikörper Polymer aus dem multispektralen Färbung Kit ein.
- Bereiten Sie zehn 7 mL offenen Behältern. Das erforderliche Volumen in Mikroliter beträgt 600 + (150 x [Anzahl der Folien]). Jeder Antikörper wird auf 12 Folien in diesem Fall (sechs Tonsillen und sechs Lunge) angewendet werden. Die Beschriftung und Volumen für alle Container sind in Tabelle 3bezeichnet.
- Für jedes Rohr Antikörper zuerst hinzufügen den Antikörper Verdünnungsmittel, gefolgt von den konzentrierten Primärantikörper in den Bänden, die in Tabelle 3angegeben. Durch sanfte Pipettieren mischen.
- Bereiten Sie einen offenen Behälter 7 mL für DAPI, mit vier Tropfen des DAPI Konzentrat pro Milliliter bidestilliertem Wasser; insgesamt 16 wird mit DAPI gefärbt (600 + [150 x 16] = 3.000 µL). Fügen Sie 3 mL bidestilliertem Wasser plus 12 Tropfen der spektralen DAPI in den Behälter. Bereiten Sie frische DAPI für jeden Lauf.
- Bereiten Sie einen offenen Behälter 7 mL für Peroxidase-Inhibitor. Alle 16 Dias mit Peroxidase-Hemmer behandelt werden (600 + [150 x 16] = 3.000 µL). Fügen Sie 3 mL Peroxidase Block in den Behälter.
- Aufschwemmen Sie vor der Vorbereitung arbeiten Konzentrationen des Fluors alle lyophilisierter Fluors indem jedes Fluor-Rohr vom Hersteller bereitgestellte 75 µL Dimethyl Sulfoxid hinzufügen. Mischen von pipettieren. Dies ist der TSA-Fluor-bestand. Shop bei 4 ° C.
- Bereiten Sie sechs Titration Container, eine für jede Fluor. Das erforderliche Volumen in Mikroliter beträgt 350 + (150 x [Anzahl der Folien]). Jede Fluor wird auf 16 Dias in diesem Fall (acht Tonsillen und acht Lunge) angewendet werden. Die Beschriftung und Volumen für alle Container sind in Tabelle 4bezeichnet.
- Wenn alle Reagenzien registriert und vorbereitet haben, stellen Sie jeden Behälter in jedem Ort auf einem Gestell und laden Sie alle Reagenzien auf die automatisierte Stainer. Die Sonde wird die Lautstärke jedes Reagens bestätigen.
8. automatische Stainer: Probieren Sie Setup und multispektralen Färbung
-
Klicken Sie in der automatisierten Stainer Software schieben Sie Setup am oberen Rand des Bildschirms. Klicken Sie auf Add-Studie. Füllen Sie das Popup-Fenster mit der Studie ID Studiennamen und Kommentare.
- Wählen Sie den Namen des Forschers Durchführung der Färbung Flucht aus der Dropdown-Liste. Lassen Sie die Dispensierung Volumen 150 µL. Wählen Sie multispektralen Wachsentfernung für Vorbereitung Protokoll. Klicken Sie auf "OK" und Folie Hinzufügen. Geben Sie unter Kommentare"Multiplex-1 Lunge 123ABC." Füllen Sie die folgenden Felder wie angegeben: Gewebetyp = Test Gewebe; Dispense Volumen = 150 µL; Retikuläres Modus = Single, Routine; Marker = negativ; Färbung = geben Sie "7 Multiplex-Protokoll 1"; Vorbereitung = multispektralen backen, Wachsentfernung 2 h; HIER = HIER 20 min mit ER1.
- Klicken Sie auf Folie hinzufügen und ändern Sie die Kommentare und das Protokoll hinzufügen Drop Kontrolle Folien und Isotype Steuerschieber. Wenn die Studie alle Folien hinzugefügt haben, schließen Sie das Fenster Folie hinzufügen und Drucken von Etiketten. Die Labels zum Bereich entsprechende Kennzeichnung auf jeder Folie anwenden.
- Laden Sie die Folien in Racks, Decke Fliesen in der richtigen Ausrichtung legen Sie die Regale in den automatisierten Stainer und senken Sie die Tabletts. Das Gerät scannt die Folie Etiketten.
- Wenn alle Reagenzien und Dias gescannt gemessen und haben. Der Betriebsschalter (►) wird aktiv. Wenn die Autostainer Fehler, wie z. B. unzureichende Reagenz Volumen erkennt, erscheint ein gelbes Warnsymbol durch die betroffenen Fach. Wenn ein Fehler auftritt, Rechtsklick das Warnsymbol und den Fehler zu beheben.
- Initiieren Sie Färbung sofort zu oder planen Sie einen verzögerten Start. Das Protokoll ist ca. 14 h Dauer. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass das Protokoll zu einem Zeitpunkt abgeschlossen werden wenn die Folien können sofort entfernt werden, da Exess waschen Färbung Ergebnisse auswirken könnte.
9. eindecken der multispektralen Folien
- Entfernen Sie die Folien aus der automatisierten Stainer und speichern Sie sie in einem Rack untergetaucht in 1 x TBS.
- Montieren Sie die Proben mit Nr. 1.5 Deckgläsern und 15 µL der Montage Medien (siehe Tabelle der Materialien). Entfernen Sie alle Luftblasen von leichtem Druck auf das Deckglas mit einer Pipettenspitze.
- Lassen Sie die Folien über Nacht bei Raumtemperatur auf dem Labortisch zu heilen. Noch nicht ausgehärtete Folien können sofort mit sorgsamen Umgang gescannt werden.
10. multispektralen Scanner
- Schalten Sie die multispektralen Scanner und seinem Computer (siehe Tabelle der Materialien für Modell und Software-Informationen). Die Mikroskop-Steuerungs-Software zu starten. Öffnen Sie die Vordertür des multispektralen Scanners durch berührungsempfindliche Taste auf der Vorderseite des Geräts. Jeder gefederte Träger im Scanner hält vier Dias. Laden Sie alle Folien in Träger und aufnehmen der Bestellung bevor Sie die Träger in das Gerät laden.
- Wählen Sie Bearbeiten-Protokoll , und klicken Sie auf neu...; Erstellen Sie dann den Protokollnamen Multiplex Panel 1 und Drop Steuerelemente. Erstellen Sie Studiennamen Multiplex Panel-Entwicklungzu, klicken Sie auf Protokoll erstellen, und geben Sie Übersicht Scannen Filter DAPI; Wählen Sie dann Ganze Dia Scannen und Pixelauflösung 0,50 µm (20 X). Alle Filter und Bänder sollten vertreten sein. Ist dies nicht der Fall, klicken Sie auf Filter bearbeiten und Bands, wählen Sie alle fünf Filter (DAPI, FITC CY3, Texas Red und CY5) und klicken Sie auf Bearbeiten Belichtungen.
- Laden Sie den Träger durch die Auswahl des Trägers mit der vollen Multiplex der Lunge Adenokarzinom. Wählen Sie die richtige Folie mithilfe der grafischen Benutzeroberfläche. Das Gewebe zu konzentrieren, entweder manuell oder durch mit dem Autofokus. Navigieren Sie zu einem Bereich mit akzeptablen DAPI-Färbung und klicken Sie auf Auto-Expose zur Einstellung der Belichtung in Millisekunden (0 – 2.000 ms).
- Wiederholen Sie den Vorgang für alle fünf Filter-Sets in Spalten ganze scannen und MSI-Region. Achten Sie darauf, navigieren zu einem Gebiet mit akzeptablen Färbung und das Mikroskop vor Einstellen der Belichtung je nach Filter und Vergrößerung zu konzentrieren. Auto-Expose für alle fünf Filter in ein 20 x insgesamt Scan und 20 x multispektralen imaging (MSI) multispektralen Regionen. Wählen Sie eine Pixelauflösung von 0,50 µm (20 X). Speichern Sie das Protokoll, und klicken Sie auf zurück , um dem home-Bildschirm der Vectra Software zurückzukehren; Klicken Sie auf Scannen Dias.
- Öffnen Sie die Schnittstelle für jede Folie und Aufgabe zu Scannen. Studie auf Multiplex-Panel-Entwicklung, Protokoll auf Multiplex-Platte 1 und Drop Steuerelementefestgelegt, und festgelegt Folien-ID Multiplex Lunge ABC123, Multiplex CD68 Drop Lunge ABC123, etc. . Wenn alle Folien beschriftet und Aufgaben festgelegt sind, klicken Sie auf Scan. Die automatisierte multispektrale Scanner wird voll-Dia-Scans aller Folien verwenden alle fünf Filter durchführen.
11. die multispektralen Scanner: Multispektralen Imaging
- Sobald die Scans abgeschlossen sind, öffnen Sie die QPTIFF -Software ("Phenochart") und klicken Sie auf Last schieben in der oberen linken Ecke. Dadurch wird ein QPTIFF geöffnet, ist ein fünf-Filter ganz-Dia-Scan. Jede Schicht enthält Informationen von mehr als einem Fluor, damit das Dienstprogramm beschränkt, sondern die Gewebestruktur und breiten Expressionsmuster sind offensichtlich und können verwendet werden, um Bereiche für MSI-Datei auswählen.
- Navigieren Sie zu und öffnen Sie die richtige Folie in der Studie mithilfe der Drop-Down-Struktur auf der linken Seite. Melden Sie sich mit Benutzerinitialen (oben rechts).
- Wählen Sie aus fünf Regionen für MSI mit dem Stempel -Werkzeug am oberen Rand des Bildschirms. Ein Pathologe zu konsultieren, wenn eine verfügbar ist. Wählen Sie unter Wählen Sie für Erwerb; Wählen Sie unter Größe in Felder 1 x 1; und wählen Sie unter Feld Beschränkung, 0,5 µm (20 X). Basierend auf Cytokeratin (CK) Färbung (vor allem in Cy5), wählen Sie mehrere Regionen mit Tumor (CK +) und Stroma (CK-), aus dem gesamten Scan abgebildet werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Folie.
- Sobald alle MSI-Dateien ausgewählt sind, schließen Sie die Phenochart -Software und die Vectra -Software wieder. Ändern Sie die Aufgabe von Scannen auf MSI für jede Folie und klicken Sie auf Scan erneut, um die MSI-Sammlung durchführen.
12. spektrale Entmischung
Hinweis: Der spectral unmixing Schritt ist erforderlich für die Kanaltrennung und Bildanalyse der Folien. Bevor spektrale Entmischung in der InForm-Software ausgeführt wird, muss die spektrale Bibliothek mit Lungenkrebs Adenokarzinom Dias befleckt mit jeder Fluor, allein und mit DAPI allein erstellt werden. Dieses Verfahren wird auch in den oben genannten Multiplex IHC Assay Development Guide beschrieben.
- Wenn die MSI-Übernahme abgeschlossen ist, verwenden Sie die spectral unmixing ("InForm") Software zum Öffnen von Dateien im Ordner " MSI ". Diese Dateien landen in der .im3-Datei-Typ-Erweiterung.
- Wählen Sie unter Bildformat Multispectral; Wählen Sie unter Sampleformat Fluoreszenz; und wählen Sie unter spektralen Bibliothek Quelle, InForm.
- Um Fluors auszuwählen, wählen Sie und laden Sie alle sechs Fluors und DAPI aus der Bibliothek mit der Lunge Adenokarzinom Bibliothek Folien gebaut. Klicken Sie auf Alle vorbereiten (unten links). Spectral unmixing Software führt spectral unmixing auf alle Bilder öffnen, mithilfe der bereitgestellten spektrale Profile.
- Bewerten Sie mit einem Pathologen die Färbung Muster gegen chromogenen einzelne Flecken des gleichen Ziels in sequentiellen Folien des gleichen Gewebes.
13. Auswertung der Fluoreszenzintensität und Signaldämpfung
Hinweis: Die Grafen-Tool, das als ein Pfeil mit einem braunen Kästchen angezeigt wird, ist das wichtigste Werkzeug für Multiplex-Optimierung und sollte häufig verwendet werden (siehe Ergänzende Materialien). Mit dem Grafen-Werkzeug in der spectral unmixing Software bewerten Sie das Signal-Rausch-Verhältnis, das mindestens 10:1 überschreiten sollte (siehe Zusatzmaterialien für die Fehlersuche und für die Bewertung des Multiplex Färbung mit der Drop-Steuerung).
- 13.1. mit einem Bild in der spectral unmixing Software geöffnet die Grafen Werkzeug zu engagieren und Umfrage Bilder zu beurteilen, die Fluoreszenzintensität für jeden Kanal. Die Ziel-Intensität im Lungengewebe ist zwischen 10 und 20 normalisierte Zählern. Das normalisierte zählt-Tool ist in Abbildung 1dargestellt.
- Schließen Sie Folien mit maximalen Signal Grafen von weniger als 10 oder normalen Signal Bereich Grafen von weniger als fünf für jede Markierung aus, sodass Autofluoreszenz und Ziel-Färbung mit dem authentischen Signal nicht konkurrieren.
- Exclude Folien mit Maximum zählt größer als 30 für jeden Kanal, spektrale Blutungen oder ineffiziente spektrale Entmischung zu vermeiden.
- Adresse normalisiert, hoch oder niedrig zählt durch die TSA-Konzentration einstellen.
14. Multispektrale Bildanalyse
- Öffnen Sie ein oder mehrere MSI in der spectral unmixing Software und nur ausgewählte Fluors für entmischen, die in mindestens einem geöffneten Bild vertreten sind. Klicken Sie auf Alle bereiten unmix alle aktuell geöffneten Farbbilder spektral ungemischte Bilder ergeben.
- Wählen Sie das Grafen Werkzeug zählt über jedes Bild zu vermessen, indem Sie den Cursor über die Gebiete von Interesse.
- Wählen Sie das Augensymbol, um die Ansicht-Editor zu öffnen. Wählen Sie und passen Sie die Anzeigeintensität für jeden Kanal unabhängig.
- Wählen Sie konfigurieren , die Gewebe-Segmentierung, Zelle Segmentierung Phänotypisierung und scoring-Module zu öffnen. Diese Tools sind erforderlich für die objektive Auswertung von Multiplex Färbung gegen chromogenen einzelne Flecken und können verwendet werden, um quantitative Phenoptic Daten (Abbildung S1) zu generieren.
- Verwenden Sie die Registerkarte " exportieren ", Graustufen, fluoreszierende speichern, Pfadansicht-Stil unkomprimierte TIFF und Datendateien aus der Phenoptic-Analyse-Module für weitere Analyse, Archivierung und Präsentationen (Abbildung S1).
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Representative Results
Das hier beschriebene Protokoll liefern Ergebnisse wie in Abbildung 2gezeigt. Beginnen Sie mit einer Bewertung der Färbung in der Tonsillen-Steuerung, beginnend mit der Oberfläche Plattenepithelkarzinome Epithel. Die Histologie der Tonsillen Probe findest du mit einem Pathologen, die H & E Folie als Referenz verwenden. Wenn chromogene IHC Abschnitte mit den gleichen Markierungen auf dem gleichen Gewebe-Block ausgeführt werden, können diese verwendet werden, die Dichte und die Verteilung der einzelnen Marker auf der mIF-Folie zu bestätigen. Wie in Abbildung 2Agezeigt, das Gewebe der Tonsillen sollen klar definierte AE1/AE3 Cytokeratin Färbung in den Tonsillen Oberfläche Plattenepithel (Abbildung 2A; gekennzeichnet als rote Pseudofarben), ohne Hintergrund in die lymphatischen Gewebe. Die Färbung zytoplasmatischen, gelegentlich mit Membran Akzentuierung werden sollte, und die Kerne müssen negativ sein. Die netzartige Epithel in den Krypten sollte für Cytokeratin (rot) und PD-L1 (Abbildung 2A; grüne Pseudofarben) positiv sein. Die follikulären germinal Zentren der Tonsillen sollte, dann identifiziert werden. Die germinal Center sollte sollte leicht erkennbar sein und reich an Ki-67-positiven Lymphozyten (Abbildung 2A; gelb Pseudofarben). Ki-67 Färbung sollte immer nukleare. Die Makrophagen in der germinal Zentren präsent sollte auch leicht zu erkennen, manchmal als größere Zellen (auch genannt "tingible Bodies"). Sie zeigen positive Färbung für CD68 als eine granulare zytoplasmatischen Fleck (Abbildung 2A; orange Pseudofarben). Ein variabler Anteil der CD68 Zellen außerhalb der germinal Center ist auch zu erwarten. Makrophagen können Membran für PD-L1 Färbung zeigen. Dies ist in der Regel blasser in der Intensität als Färbung für PD-L1 in der netzförmigen Epithel. Es dürfen keine nukleare CD68 Färbung. CD8 Lymphozyten mit einer T-Zell-Verteilung beflecken sollte (weniger in die germinal Center und einen größeren Anteil im Bereich interfollikulären; siehe Abbildung 2A, Cyan Pseudofarben). CD8 + Lymphozyten sind in der Regel kleine Zellen mit wenig Zytoplasma, so ist es praktisch unmöglich, Membran gegen Zytoplasma in den Lymphozyten zu unterscheiden. PD-1 färbt stark kleinen Lymphozyten im Bereich germinal Center, in der Regel an der Peripherie der germinal Center (Abbildung 2A; Magenta Pseudofarben) gruppierten als auch verstreut Lymphozyten in der interfollikulären Region, in der Regel zeigt eine geringere Intensität der Färbung als die in dem Viertel germinal Center. Wie bei CD8, ist es nicht möglich, Membran und zytoplasmatischen Färbung in kleinen Lymphozyten gebeizt mit PD-1 klar zu unterscheiden. Denn ein variabler Anteil der CD8-Zellen coexpress PD-1, empfiehlt es sich für Qualitätskontrolle Zwecke, dass die Färbung Muster und Verteilung der einzelnen Marker, die im gleichen Gewebe befleckt ist mit chromogenen IHC Referenz Folien, wie vorgeschlagen verglichen werden in zuvor veröffentlichten Protokolle12.
Nachdem das erwartete Färbung Muster in den Tonsillen Gewebekontrolle bestätigt wurde, fahren Sie mit der Färbung in der Lunge-Krebs-Probe (Abbildung 2B) zu bewerten. Da Tumorgewebe eine Variable und heterogene Ausdruck der Marker aufweisen dürften, ist es sehr wichtig bei der Optimierung eines neuen mIF-Panels, die Färbung Muster für jeden einzelnen Marker beobachtet in der mIF-Methode und deren Ausdruck zu vergleichen in der chromogenen IHC Standardfolie, Bewertung der Menge und Verteilung der positiven Zellen als zuvor beschriebenen12beobachtet. Dennoch, das Grundmuster Färbung beibehalten werden sollte; zum Beispiel sind Cytokeratin im Zytoplasma der Epithelzellen und nie in einem Kern zu beachten; CD68 erscheint als granulare zytoplasmatischen Färbung in Makrophagen, etc.. Wichtiger ist, kann einige Marker die Intensität der Färbung aus der Tonsillen-Steuerelement, das Krebsgewebe ändern; zum Beispiel können PD-1 und PD-L1 niedriger Intensität im Tumorgewebe im Vergleich zu den sehr hohen Ausdruck beobachtet Tonsillen Kontrolle Färbung zeigen. Deshalb ist es wichtig, die Bewertung und Optimierung mit dem Grafen-Werkzeug in der InForm-Software anhand von Beispielen von Tumorgewebe, anstatt die Tonsillen-Kontrollen durchzuführen.
Zu guter Letzt Isotype-Negative Kontrollen und Drop Steuerelemente müssen bewertet werden, nicht nur für die Erkennung von Hintergrund und Autofluoreszenz, sondern auch für Dach-Effekte und spektrale bluten (Abbildung 3 und Abbildung 4). Isotype Kontrollen sollten keine Immunostaining über der Folie zeigen; Wenn Färbung beobachtet wird, muss die Bildgebung oder Färbeverfahren überprüft werden. Drop Steuerelemente sind wichtig, um mögliche Artefakte in der Färbung, wie z. B. spektrale bluten oder Regenschirm Effekte aufgrund der mIF-Methode bei der Optimierung einer neuen Multiplex-Platte zu bewerten (siehe Abbildung 5, Ergänzende Abbildung S2, Zusätzliche Abbildung S3, und ergänzenden Materialien). Fluoreszierende Monoplex- and -Drop Steuerelemente sollten ausgewertet und verglichen mit dem vollen Multiplex-Panel. Jedes Dropdown-Steuerelement sollte die gleiche Färbung Muster außer den einzelnen primären Antikörper zeigen, die auf jede spezifische Steuerung entfernt werden soll. Weitere Details sind unter " Ergänzende Materialien " zur Verfügung gestellt.
Abbildung 1 : Tool zählt zu informieren. Das InForm-Software zählt Werkzeug aktiviert durch Auswahl des Symbols Beige Kasten. Normalisierte Zählungen werden für die Bit-Tiefe, Belichtungszeit, Verstärkung und binning korrigiert. Die Bilder wurden bei 20 X Vergrößerung; die Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Repräsentative Ergebnisse. Tonsillen (A) und (B) Nonsmall-Zelle Lungenkarzinom wurden gefärbt mit PD-L1 (520 TSA, grün), CD8 (540 TSA, Cyan), Ki67 (570 TSA, gelb), CD68 (620 TSA, Orange), Cytokeratin (650 TSA, rot), und PD-1 (690 TSA, Magenta). Einzelne Kanäle werden separat unter in kleinen Platten dargestellt. Die Markierung wird in der oberen rechten Ecke eines jeden Bildes angezeigt. Die Bilder wurden bei 20 X Vergrößerung; Maßstabsleiste = 50 (oder 250 µm). In Gruppe A sind 1 angegeben) lymphoide Follikel, 2) germinal Center, 3) interfollikulären, und (4) geschichtete Plattenepithel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : TSA blockieren/Regenschirm Effekt. Dies ist ein Beispiel für 690 TSA hinterlegt mit einem PD-1 Antikörper blockieren CD3 Signal in gewissem Sinne hängt die Höhe der TSA vorhanden. Das hellste 690 TSA-Signal blockiert das 620 TSA-Signal am effektivsten (Nonsmall-Zelle Lungenkarzinom gebeizt mit Anti-PD-1 D4W2J für 30 min bei 0,52 µg/mL oder Isotype, gefolgt von einer 10 min 690 TSA-Erkennung bei 1: 100; dann Anti-CD3-F7.2.38 für 30 min bei 0,14 µg/mL gefolgt von einer 10 min. 620 TSA-Erkennung bei 1: 100). Die Bilder wurden bei 20 X Vergrößerung; die Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Spektrale bluten. Nonsmall-Zell Karzinom Lungengewebe war mit der Ki-67 Drop-Control Protokoll (komplette multiplex mit Ki-67-Antikörper weggelassen) gefärbt. Die 540 TSA (CD8) und 570 TSA Kanal (Ki-67) werden angezeigt. Keine nukleare Färbung Muster ergibt sich jedoch eine verminderte Kopie der CD8 Färbung Muster in den 570 TSA-Kanal eingehalten wird. Dies wird am besten durch Gewährleistung vergleichbare Färbung Intensitäten in allen Kanälen behoben. In diesem Fall wird die Zugabe eines robusten Ki-67-Signals (normalisierte zählt zwischen 10 und 20) der spektrale bluten korrigieren. Die Bilder wurden bei 20 X Vergrößerung; die Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Drop Steuerelemente. Diese Abbildung zeigt ein zusammengesetztes Bild eines Multiplex-verglichen mit der gleichen Region von sequentiellen Dias eines Adenokarzinoms der Lunge gebeizt mit Drop Steuerelemente, in denen die angegebenen Primärantikörper weggelassen wurde. Die Bilder wurden bei 20 X Vergrößerung; Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Name | Abk. Name | Typ | Container | Gruppe |
| PKI-Blocking-Puffer | OPALBLOK | Nebenkosten | 30 mL zu öffnen | Allgemeine |
| Opal-Polymer HRP | OPAL 2AB | Nebenkosten | 30 mL zu öffnen | Allgemeine |
| OPAL 1 X TBS | OPAL1TBS | Nebenkosten | 30 mL zu öffnen | Detective Kit |
| CD68 0,30 µg/mL PG-M1 Mus | OPALCD68 | Nebenkosten | Geöffnet 7 mL | Allgemeine |
| Ki67 0,61 µg/mL MIB-1 Mus | OPALki67 | Nebenkosten | Geöffnet 7 mL | Allgemeine |
| PD-L1 0,20 µg/mL SP263 Rab | OPALPDL1 | Nebenkosten | Geöffnet 7 mL | Allgemeine |
| PD-1 0.52 µg/mL D4W2J Rab | OPAL-PD1 | Nebenkosten | Geöffnet 7 mL | Allgemeine |
| CD8 0,70 µg/mL SP239 Rab | OPAL CD8 | Nebenkosten | Geöffnet 7 mL | Allgemeine |
| CK 0,24 µg/mL AE1/AE3 Mus | OPAL-CK | Nebenkosten | Geöffnet 7 mL | Allgemeine |
| Maus IgG | OPAL-MUS | Nebenkosten | Geöffnet 7 mL | Allgemeine |
| Kaninchen-IgG | OPAL-RAB | Nebenkosten | Geöffnet 7 mL | Allgemeine |
| OPAL Peroxidase Block | OPALPERX | Nebenkosten | Geöffnet 7 mL | Allgemeine |
| Spektrale DAPI | OPALDAPI | Nebenkosten | Titration 6 mL | Allgemeine |
| Opal 520 Reagenz | OPAL 520 | Nebenkosten | Titration 6 mL | Allgemeine |
| Opal 540 Reagenz | OPAL 540 | Nebenkosten | Titration 6 mL | Allgemeine |
| Opal 570 Reagenz | OPAL 570 | Nebenkosten | Titration 6 mL | Allgemeine |
| Opal 620 Reagenz | OPAL 620 | Nebenkosten | Titration 6 mL | Allgemeine |
| Opal 650 Reagenz | OPAL 650 | Nebenkosten | Titration 6 mL | Allgemeine |
| Opal 690 Reagenz | OPAL 690 | Nebenkosten | Titration 6 mL | Allgemeine |
Tabelle 1: Leica Bond RX Protokoll, Opal Reagenzien
| Reagenz | Zeit (h) | Temperatur (° c) | |
| 1 | Keine Reagenzien | 120:00 | 60 |
| 2 | Bond Wachsentfernung Lösung | 0:30 | 72 |
| 3 | Bond Wachsentfernung Lösung | 0:00 Uhr | 72 |
| 4 | Bond Wachsentfernung Lösung | 0:00 Uhr | Ambient (Raumtemperatur) |
Tabelle 2: OPAL-Vorbereitung-Protokoll
| Ziel | µg/mL | Klon | Quelle | Viele | Lager µg/mL | µL Verdünnungsmittel | ΜL AB |
| CD68 | 0,3 | PG-M1 | DAKO | 20043031 | 30 | 2376 | 24 |
| Ki67 | 0,61 | MIB-1 | DAKO | 20049476 | 46 | 2368.17 | 31,83 |
| PD-L1 | 0,2 | SP263 | Vent. | F09591 | 1,61 | 2101.86 | 298.14 |
| PD-1 | 0,52 | D4W2J | CST | 1 | 100 | 2387.52 | 12.48 |
| CD8 | 0,7 | SP239 | Ventana | 160318 | 70 | 2376 | 24 |
| CK | 0,24 | AE1/AE3 | DAKO | 10129428 | 179,5 | 2396.79 | 3.21 |
| Mus IgG | 0,61 | ||||||
| Rab IgG | 0,7 |
Tabelle 3: Primärantikörper Vorbereitung.
| Opal-Fluor | Folien | Verdünnung | µL Verdünnungsmittel | µL Opal Fluor |
| Opal 520 | 16 | 1: 200 | 2736.3 | 13.8 |
| Opal 540 | 16 | 1:700 | 2746.1 | 3.9 |
| Opal 570 | 16 | 1: 150 | 2731.7 | 18.3 |
| Opal 620 | 16 | 1: 100 | 2722.5 | 27.5 |
| Opal 650 | 16 | 1: 350 | 2742.1 | 7.9 |
| Opal 690 | 16 | 1: 150 | 2731.7 | 18.3 |
Tabelle 4: OPAL Fluor Vorbereitung.
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Ergänzende Abbildung 1: Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.
Ergänzende Abbildung 2: Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.
Ergänzende Abbildung 3: Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.
Zusätzliche Tabelle 1: Leica Bond RX Opal Multiplex Protokoll. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Zusätzliche Tabelle 2: Zusammenfassung und Vergleich der volle Multiplex, Drop Steuerelemente und volle Isotype Kontrollen. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Die laufenden Krebs-Immuntherapie-Revolution ist Eröffnung Roman und vielversprechende Therapieoptionen für Krebs-Patienten-13. Fortschritte auf dem Gebiet der Immuno-Onkologie erfordert mehr wissen von der entzündlichen Tumor Mikroumgebung, nicht nur, die Biologie der Karzinogenese immunologische Mechanismen zu verstehen, sondern auch für neue Prädiktive Biomarker zu finden Immuntherapie-Behandlungen1,2. Aufgrund der komplexen Biologie der Krebsimmunologie ist Verhör von Gewebeproben der Tumor in der Regel erforderlich, um einer wachsenden Liste von immun-Marker zu entwickeln, die miteinander interagieren und sind häufig von unterschiedlichen Zellpopulationen im Gewebe1 coexpressed ,2,5. Klinische Studien beschäftigen in der Regel kleine Biopsien, wie Kern Nadel oder endoskopische Biopsien, die an verschiedenen Punkten der Therapie zu bewerten und zu überwachen Patienten gesammelt werden. Diese Biopsien bieten begrenzte Mengen von Gewebe, was wiederum die Anzahl der Gewebeschnitte begrenzt, die für Krebs Immunoprofiling eingesetzt werden können. Diese Einschränkung ist besonders belastend, wenn traditionelle Techniken, wie z. B. standard Monoplex IHC, verwendet werden. Daher gibt es eine klare muss nach neuen Methoden für Krebs Immunoprofiling, aus denen verwenden Multiplex-Techniken mit der Kapazität, gleichzeitig die Coexpression von verschiedenen Biomarker bewerten und wertvolle Gewebemustern effizienter zu nutzen.
Im Multiplex-Färbung und multispektralen bildgebenden Verfahren im Detail hier beschrieben wird eine mIF-Panel für Immuno-Onkologie-Studien über FFPE Gewebe wie Biopsien aus einer klinischen Studie verwendet. Diese Methode hat bereits beschrieben, validiert und erfolgreich angewendet, Krebs Immunoprofiling8,9,10,11,12,14, 15. zuvor veröffentlichten Protokolle haben ähnliche Färbung Methoden mit TSA-basierten Systemen, wie z. B. das sieben-Farb-Kit, das ist zeitaufwändig und erfordert ca. 4 Tage Arbeit durch eine dedizierte Labor Wissenschaftler12 mIF beschrieben ,15. In Reaktion auf diese Mängel wurde dieses Protokoll optimiert mithilfe eines handelsüblichen automatisierte Stainer, drastisch verkürzen die Zeit bis 14 h beflecken und Beseitigung der Variabilität von manuellen Operatoren eingeführt. Bildgebung erfolgt auf einem multispektralen Scanner in der Lage, die Spektren der sieben oder mehr fluoreszierende Signale in den Multiplex-Folien, einschließlich Autofluoreszenz, die effizient entfernt werden können, ohne dass die Qualität des Signals zu trennen. Dieses Protokoll kann repliziert, geändert und von jedem Labor-Benutzer mit Zugriff auf die Instrumente und Reagenzien in der Tabelle der Materialiendetailliert ausgeführt werden.
Wichtige Schritte in diesem Protokoll sind Abschnitte 7, 10, 11, 12. Abschnitt 7 bezieht sich auf die Vorbereitung der Reagenzien. Eine sorgfältige Vorbereitung der Reagenzien für Multiplex-Färbung ist unerlässlich, erfordern die Aufmerksamkeit von einem Labor Wissenschaftler oder Techniker, Operator-abhängige Variation zu vermeiden. Zum Beispiel ist eines der großen Probleme mit dem Multiplex-Verfahren Variabilität, Färbung, die durch die sorgfältige Vorbereitung der Verdünnungen der Reagenzien, speziell die TSA Farbstoffe reduziert werden können. Abschnitte 10 und 11 beziehen sich auf Bildaufnahme. Ein wichtiger Risikofaktor ist die Überbelichtung oder Übersättigung an die Bilder, die zu spektralen bluten, ein Artefakt führen kann, stört das Signal von einem anderen Kanal den Kanal abgebildet wird (siehe Ergänzende Materialien). Sorgfältig reguliert die Belichtungszeiten kann helfen, um Übersättigung und spektrale bluten zu verhindern. Spektrale Entmischung erfolgt in Abschnitt 12. Diese stützt sich auf die Vorbereitung der spektralen Bibliothek (beschrieben in den Multiplex-IHC-Assay Development Guide, verfügbar online). In diesem Schritt ist die InForm-Software "trainiert", speziell die Farben für jede TSA-Farbe zu erkennen. Die spektrale Bibliothek ist mit Abschnitten von einer Kontrollgewebe, wie menschlichen Tonsillen erstellt, gebeizt mit einem einheitlich geäußerten Marker wie CD20, gepaart mit jeder einzelnen TSA Farbstoff auf einzelnen Folien. Darüber hinaus werden die Autofluoreszenz Folien (auch in den Multiplex-IHC-Assay Development Guide beschrieben) bilden die InForm-Software zu erkennen und zu subtrahieren Gewebe Autofluoreszenz. Autofluoreszenz Kontrolle Folien sollten mithilfe von Proben aus dem gleichen Gewebe untersucht (z. B. Lungenkrebs usw.)bereit, auf die gleiche Weise wie die mIF-Folien behandelt und inkubiert mit primären und sekundären Antikörper aber ohne den TSA-Farbstoff. Nur ein einziges Autofluoreszenz spektrale Profil kann ausgewählt werden, so muss darauf geachtet werden, um eine Darstellung der beobachtbaren Autofluoreszenz auszuwählen, die aus Kollagen, Fibrose, rote Blutkörperchen, endogene Pigmente und anderen Quellen stammen können. Erstellen einer neuen spektralen Bibliothek zu Beginn jedes neuen Projekts und eine Autofluoreszenz Spektrum repräsentativ für die Untersuchung von Gewebeproben sowie die gleichen Gewebe Blöcke als Positivkontrolle für jede Charge innerhalb desselben Projekts ausgeführt, wertvolle methodische Schritte, die dazu beitragen werden, verbessern Sie die Konsistenz von der spektralen sind über verschiedene Proben innerhalb desselben Projekts entmischen.
In diesem Protokoll beschriebene Multiplex-Verfahren bietet mehrere Tools zur Problembehandlung, einschließlich einen Signal-Rausch-Evaluator (Grafen Tool), Drop Steuerelemente (Zusatzmaterialien) und eine Pathologie-Ansicht für die Qualitätskontrolle der Färbung. Das zählt-Tool hilft, um die Intensität der Färbung und der Hintergrund zu bewerten. Wenn die Intensität bzw. Hintergrund-Niveaus hoch sind, ist der erste Ansatz, die Verdünnung der TSA-Farbstoff zu reduzieren. Wenn das Problem weiterhin besteht, sollten die chromogenen IHC-Folien für die Optimierung der, dass bestimmte Marker verwendet mit einem Pathologen, auf der Suche nach der Anwesenheit von Hintergrund überprüft werden. Die Pathologie-Ansicht wird durch die InForm-Software, mit einer Diaminobenzidine erinnernde Pseudofarben Darstellung der Fluoreszenz von der TSA-linked Fluor sowie eine faux Hämatoxylin-Darstellung aus alle fluoreszierenden Signale, einschließlich DAPI generiert erzeugt. . Bilder aus der Pathologie helfen bei der visuellen Auswertung der Färbung Muster von einem Pathologen für verbesserte Färbung. Diese Werkzeuge sollten immer bei der Optimierung eines neuen Panels sowie Qualitätskontrolle Schritte während der Färbung des Workflows eingesetzt werden.
Die mIF-Methode erfordert die Verwendung der primären Antikörper, die ordnungsgemäß validiert und optimiert für standard chromogenen IHC auf Formalin fixiert Gewebe. Zum Beispiel ist einer der großen Vorteile der mIF-TSA-Methode die Kompatibilität mit dem Einsatz von primären Antikörper, die in die anatomische Pathologielabor für klinische Anwendung12optimiert und validiert wurden. Dieser Vorteil bedeutet, dass die Multiplex-Platten von der Labor-Benutzer für bestimmte Krebs Immunologie Fragen ohne preconjugated Antikörper, die Bereitstellung von schnellen und dynamischen Panel Entwicklung angepasst werden können. In dieser Hinsicht beginnt die tatsächliche Workflow für die Optimierung eines neuen Panels mit der Validierung und Optimierung der Antikörper mit standard chromogenen IHC, auf der Suche nach den besten Verdünnung und Färbung Bedingungen, die zur Verfügung stellt, saubere und einheitliche Färbung. Der nächste Schritt, mit dem gleichen Verdünnungen für IHC, optimiert ist, übertragen die Färbung mit TSA Fluors statt Diaminobenzidine und vergleichen Sie die Ergebnisse der Monoplex immunofluorescent TSA mit chromogenen IHC als Referenz. Schließlich können die Antikörper in mIF Färbung, kombiniert werden, immer mit der chromogenen IHC beflecken Muster als eine Referenz, die mIF TSA Färbung, vor allem die TSA Farbstoff Verdünnungen und die Färbung Reihenfolge Parameter. Während dieses Prozesses ist die Zusammenarbeit mit einem Pathologen instrumental zur Bewertung der Qualität der Färbung.
Grenzen dieser Technik sind der Zeit- und Arbeitsaufwand für die Optimierung und Validierung der neuen Gremien und die Immunphänotypisierung Analyse von mIF-Panels. Das Hauptanliegen ist jedoch die richtige Validierung von mIF-Methoden. Der Mangel an richtigen Validierung dieser Techniken birgt die Gefahr von generieren ungültige Ergebnisse, die der Literatur, dadurch zu behindern versuchen, ein besseres Verständnis der Biologie der Krebs Immunologie16verwirrende Daten hinzufügen können. Obliegt es, daher die Ermittler zu bemühen, Multiplex-Methoden, einschließlich der Sicherstellung enge Teilnahme und Bewertung von Pathologen mit Ausbildung und Erfahrung in der Validierung und Bewertung von Gewebe richtig validieren Histopathologie und IHC-basierte Techniken17,18,19,20. Die hier vorgestellten Protokoll umfasst einige der Tools, die mit der Validierung eines neuen Multiplex-Panels, einschließlich der Bewertung der Pathologie der H & E Folien vor Fleckenbildung und Analyse, die Verwendung von chromogenen IHC als einen Verweis auf die mIF TSA optimieren helfen können Färbung, die Drop-Control-Methode für die Qualitätskontrolle eines neuen multiplex-Panel und die Verwendung von Isotype, Autofluoreszenz, & drop Steuerelemente. Trotz der technischen Komplexität der mIF Methoden eröffnen Technologien wie z. B. multispektralen Bildgebung mit spectral unmixing sowie andere neuartige multiplex-Plattformen eine neue Ära für die Analyse von Gewebeproben von Patienten und die Generierung neuer Formen Daten, die mit standard IHC allein nicht möglich ist. Daher werden die Entwicklung und Anwendung von Techniken, mIF weiter wachsen, werden leistungsfähige Werkzeuge für die Krebs-Immunoprofiling der Biopsien für klinische Studien und hilft, neue multiparametric Prädiktive Biomarker für Immuntherapie zu identifizieren, profitieren vor allem Krebspatienten.
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Disclosures
Diese Arbeit wurde von MedImmune, die globale Biologics R & D Arm von AstraZeneca unterstützt. C.w., k.r. und C.C.H. sind Mitarbeiter von Perkin Elmer, die Reagenzien (TSA Kit) produziert und multispektralen Scannern, die in dieser Arbeit verwendet wurden. M.s., k.d., A.H., W.Z., C. Bagnall, C. Braun, j.c., A.L., k.s., m.r., und J.R.C. sind Mitarbeiter von MedImmune mit Aktienbesitz und/oder Lager Interessen oder Optionen in AstraZeneca.
Acknowledgments
Redaktionelle Betreuung wurde von Deborah Shuman von MedImmune bereitgestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
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