Summary
En detaljert protokoll for en seks-markør multiplex immunofluorescence panel er optimalisert og utført, med en automatisert fargemaskin for mer enhetlige resultater og kortere prosedyre tid. Denne tilnærmingen kan tilpasses direkte av noen laboratorium for immuno-onkologi studier.
Abstract
Videre utviklingen i immuno-onkologi krever en økt forståelse av mekanismer for kreft immunologi. Immunoprofiling analyse av vevsprøver fra formalin-fast, parafin-embedded (FFPE) biopsier har blitt et viktig verktøy for forstå kompleksiteten i svulst immunologi og oppdage romanen prediktiv biomarkers for kreft immunterapi. Immunoprofiling analyse av vev krever evaluering av kombinerte markører, inkludert inflammatorisk celle subpopulasjoner og immun sjekkpunkter, svulst microenvironment. Ankomsten av romanen multiplex immunohistochemical metoder gir en mer effektiv multiparametric analyse av enkelt vev enn standard monoplex immunohistochemistry (IHC). En kommersielt tilgjengelig multiplex immunofluorescence gir (hvis) metoden er basert på tyramide-signal forsterkning og kombinert med multispectral mikroskopisk analyse, en bedre signal separasjon av ulike markører i vev. Denne metodikken er kompatibel med bruk av unconjugated primære antistoffer som er optimalisert for standard IHC på FFPE vevsprøver. Her vi beskrive i detalj en automatisert protokoll som tillater multiplex hvis merking av karsinom med en seks-markør multiplex antistoff panel bestående av PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 og AE1/AE3 cytokeratins med 4, 6-diamidino-2-phenylindole som en kjernefysisk celle counterstain. Multiplex panelet protokollen er optimalisert i en automatisert IHC fargemaskin for gangen flekker som er kortere enn manuell protokollen og kan direkte brukes og tilpasset av noen laboratorium etterforsker for immuno-onkologi studier av menneskelig FFPE vevsprøver. Også beskrevet er flere kontroller og verktøy, inkludert en slipp-kontroll metoden for fine kvalitetskontroll av en ny multiplex hvis panel, som er nyttig for optimalisering og validering av teknikken.
Introduction
Immunoprofiling analyse av FFPE svulst er blitt en viktig del av immuno-onkologi studier, spesielt for oppdagelsen og validering av romanen prediktiv biomarkers for kreft immunterapi i sammenheng med kliniske forsøk1 ,2. Kromogent IHC, bruker kjemiske chromogens som diaminobenzidine, forblir standard teknikken i diagnostiske patologi for immunolabeling biopsi vev3. Standard IHC kan også brukes for kreft vev immunoprofiling, inkludert kvantifisering av subpopulasjoner av svulst-assosiert lymfocytter og vurdering av uttrykket immun sjekkpunkter som programmert celle død ligand 1 (PD-L1)4 ,5. Standard IHC er begrenset, men som eneste antigen kan merkes per vev delen. Fordi immunoprofiling studier vanligvis kreve analyse av kombinerte uttrykk for flere indikatorer, bruk av standard IHC ville kreve den flekker av vev inndelingene, hver farget med en enkelt penn, og vil derfor være betydelig begrenset for analyse av små vevsprøver som kjernen nål biopsier. Standard IHC metoder er også begrenset for vurdering av markører som er coexpressed av ulike celle populasjoner, som er vanlig med immun checkpoint indikatorer som PD-L1, som er uttrykt ved både svulst-assosiert makrofager og kreftceller. Denne begrensningen er rapportert i, for eksempel bruk av standard monoplex IHC av patologer for kvantitativ analyse av en IHC markør uttrykt av ulike cellen typer6. Utvikling av multiplex kromogent IHC teknikker ansette forskjellige fargede chromogens på samme vev delen representerer en fremgang over IHC monoplex standardmetoden,7 selv om de er begrenset av immunolabeling av noen markører og også presentere en viktig teknisk utfordring for riktig vurdering av markører i de samme subcellular deler av de samme celle populasjonene.
De nevnte begrensningene vev tilgjengeligheten fra klinisk prøver, i tillegg til begrensningene til multiplex kromogent IHC teknikker, har gitt opphav til behovet for å utvikle bedre multiplex metoder for immuno-onkologi studier basert på fluorescerende merking kombinert med imaging systemer som kan effektivt skille signaler om flere fluorophores fra samme lysbilde. En slik teknikk basert på tyramide signalforsterkning (TSA) kombinert med multispectral mikroskopi bildebehandling for effektiv farge separasjon8. En kommersielt tilgjengelig TSA-baserte kit benytter fluorophores optimalisert for multispectral tenkelig8 (se Tabell for materiale). En viktig fordel med dette systemet er kompatibilitet med samme umerkede primære antistoffer som allerede er validert og optimalisert for standard kromogent IHC9,10,11. Dette gir ikke bare raskere optimalisering, men også fleksibilitet i optimalisering og panel endringene omfatter nye mål. Videre multiplex immunofluorescence (mIF) TSA metoden kan optimaliseres for kommersielt tilgjengelig automatisert IHC fargemaskin systemer, slik at for en enkel overføring fra monoplex kromogent IHC til mIF.
Her presenterer vi en protokoll for en mIF panel for immuno-onkologi studier som er basert på automatiserte mIF TSA flekker og bruker en multispectral skanner for bildebehandling. Denne protokollen kan være tilpasset og endret av laboratoriet brukere med tilgang til beskrevet instrumentering og reagenser. Protokollen inneholder et panel av seks primære antistoffer for immunoprofiling av kreftsvulster: PD-L1, PD-1, CD68 (som en pan-macrophage markør), CD8 (cytotoksisk T celler), Ki-67 og AE1/AE3 (pan-cytokeratin, brukes som en epithelial markør for identifikasjon av karsinom celler). En fersk studie beskriver optimalisering av en manuell TSA mIF protokoll med kromogent IHC som en standard referanse for å validere multipleks flekker12. Oppdatert metoden som presenteres her er utviklet ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig, syv farger TSA kit optimalisert i en automatisert fargemaskin, drastisk redusere flekker tiden fra 3-5 dager til 14 h, samtidig forbedre konsistensen av den flekker. I tillegg til detaljert viktigste protokollen presenteres her, omfatter en Supplerende materiale delen metoden "slipp-kontroll", en ekstra kvalitetskontroll prosessen å vurdere en ny mIF-panel, i tillegg til tekniske merknader for optimalisering, feilsøking og utvikling av nye multiplex paneler å laboratorium brukeren konfigurere og optimalisere metoden mIF TSA for tilpassede mIF paneler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Protokollen presenteres her beskriver hvordan du utfører immunoprofiling en mIF-panelet med TSA for seks antistoffer (CD68, ki67, PD-L1, PD-1 og CD8 AE1/AE3) på en automatisert fargemaskin (se Tabell for materiale). Protokollen beskriver også hvordan du utfører slipp kontrollene for kvalitetskontroll av en ny mIF-panel (se Supplerende materiale). I denne protokollen utføres farging med åtte unstained kvinne FFPE lysbilder fra menneskelige mandel (positiv kontroll) og åtte unstained kvinne lysbilder fra menneskelige lunge adenocarcinoma. Det første lysbildet brukes til full multipleks flekker med alle seks markører, det andre lysbildet i kontrollen isotype der ingen primære antistoffer er utnyttet og de resterende seks lysbildene slipp kontroller (se Supplerende materiale). En ekstra kontroll for vev autofluorescence anbefales, og bør alltid inngå i en multipleks studere (se Supplerende materiale). Men kan etterforskerne ansette andre svulst typer og kontroller etter egne prosjektmål. Laboratoriet brukere uten tidligere erfaring med mIF TSA metoden og multispectral skanner teknikker bør lese Multiplex IHC utvikling Guide (tilgjengelig på http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Selv om denne håndboken beskriver en manuell protokoll, gir det også en god introduksjon til mIF flekker metoden. Alle vev deler ansatt i denne protokollen var anonymisert og godkjent i henhold til erklæringen i Helsinki.
1. vevsprøver
- Velg et FFPE menneskelige mandel utvalg som inneholder lymfoide hyperplasia som en positiv kontroll og en FFPE menneskelig lunge adenocarcinoma sample kjent for å være PD-L1 positiv. Se gjennom hematoxylin og eosin (H & E) lysbilder av valgte lunge kreft blokker for å bekrefte tilstedeværelse av en svulst. Det er viktig å unngå svulster med rikelig områder av nekrose som dette kan øke uspesifisert bakgrunn flekker.
Merk: For dette optimalisering, unngå å bruke parafin blokker som har vært lagret i 10 år eller mer og vev med en tørket opptreden i parafin blokken (kontakt med en histology tekniker). - Bruker en mikrotom, cut 10 sammenhengende føljetong inndelinger fra hver blokk, 4 µm tykk. Montere delene på en positivt ladet objektglass brukes for IHC, ett avsnitt per lysbilde.
Merk: Deler må monteres helt flatt uten rynker, rynker kan generere flekker gjenstander. Nummer lysbilder av føljetong fra 1 til 10. - Klargjør en nye H & E lysbildet på den første delen. Se H & E lysbildet ved hjelp av en patologen å bekrefte tilstedeværelse av mandel vev eller lunge svulst i blokken.
Merk: H & E lysbildet kan hjelpe, senere, med valg av regionene rundt for multispectral analyse og phenotyping. - Lagre unstained kvinne inndelinger i en plast slide boks 4 ° C i opptil tre måneder.
2. opprettelsen av en ny mIF Beising Program på en automatisert fargemaskin: registrering av reagensene
Merk: Reagenser må legges til reagenslisten i programmet automatisk før de er tilgjengelig for bruk i protokoller. Se Tabellen for materiale for informasjon på automatisk modell og programvare versjon.
- Klikk på fanen reagenser i programmet automatisk. Klikk Legg til for å angi en ny reagens. Angi navnet på (f.eks "520 TSA reagens") og det forkortede navnet (f.eks "520 TSA"), å merke seg at det er maksimalt åtte tegn. Velg hjelpeutstyr fra det miste-ned menyen og angi leverandør. Ikke endre Dobbeltrom flekker fra Single/sekvensiell DS. Angi standard flekker protokollen til Protokollen F. Angi standard HIER protokoll til ER1 20.
- Lagre den nye reagensen og gjenta trinn 2.1 for reagenser i tabell 1.
3. automatisert fargemaskin: Registrering av beholdere
- Skriv navnet på reagensen som skal brukes på siden av hver beholder. Skann strekkoden på siden. I popup-vinduet velger du riktig reagens i listen. Velg en utløpsdato og lagre.
- Gjenta denne fremgangsmåten i trinn 3.1 for reagenser i tabell 1.
- Registrere åpne forskning Kit. Skanne både strekkoder på siden av settet og følge på skjermen. Navnet kit "Multiplex forskning Kit 1." Registrere 1 x tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)-bufret saline som en del av dette settet (tabell 1).
4. automatiske fargemaskin: Etablering av en mIF protokollen Program
- Base multiplex protokollen er forhåndslastet med navnet Opal 7 Multiplex nye automatiserte stainers (se modell og programvare versjon i Tabellen for materiale). Finn protokollen ved å filtrere på "alle" i stedet for "foretrukket" på skjermbildet protokollen. Hvis base protokollen ikke finnes, så oppdatere programmet automatisk med assistanse fra produsenten.
- Alle endringer skal utføres på kopier av den originale protokollen. Før du gjør endringer, lagre opprinnelige og lage en kopi ved å klikke kategorien protokoller , deretter høyreklikke Opal 7 Multiplex protokollen og velge Kopier.
- Endre navnet til 7 Multiplex protokollen 1 i det nye vinduet, og velg kategorien knyttet til riktig enhet (gulvmodell eller Borstemmaskin). Samsvar med protokollen i Supplerende tabellen S1. Klikk Legg til reagens for å legge til et 10 min peroxidase hemming trinn (ikke del av standard-protokoll) og velge den peroxidase inhibitor som reagensen.
- Bekreft at punktene som blokkering benytte en PKI blokkerer buffer. Kontroller at hver primære antistoff refererer til riktig reagens, at sekundære antistoff skritt benytter en HRP polymer, og at spectral 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) med multispectral automatisering kit benyttes. Bekrefte alle valg ved å sjekke reagensen som er angitt for hvert respektive trinn i drop-down menyen på skjermbildet protokollen.
5. automatisert fargemaskin: Tillegg slipp kontroller og Isotype kontrollprotokoll
- Kopier navn 7 Multiplex protokollen 1 og endre den til 7 Multiplex protokollen 1 CD68 SLIPPE. Endre reagensen CD68 antistoffer til Musen IgG og lagre protokollen.
- Opprette seks nye protokoller, én for hver dråpe kontroll og én for komplett isotype kontrollen (endre alle antistoffer til den aktuelle isotypes) på samme måte.
6. automatisert fargemaskin: Lysbildet forberedelse protokollen
- Kopiere prestaining protokollen * Bake og Dewax og gi nytt navn denne protokollen Multispectral Bake og Dewax 2 h.
- Justere protokollen for å matche reagensene vist i tabell 2. Bake lysbilder for 2t på 60 ° C. Dewax for 30 s ved 72 ° C.
7. automatisert fargemaskin: Forberedelse av reagenser
- Forberede en forskning oppdagelsen utstyr. En reagens må være permanent tilknyttet denne kit, så fylle 30 mL åpen container merket for 1 x Tris-bufret saltvann (TB) med 1 x TBS og Finn denne i posisjon 1 (lengst håndtaket) i forskning oppdagelsen kit utpekt Multiplex forskning Kit 1. denne reagensen blir permanent knyttet kittet forskning og må ikke endre posisjon for fremtidig bruk.
- Merk to 30 mL åpne beholdere Multispectral blokk og Multispectral sekundære. Fyll beholderen Multispectral blokk med 30 mL blokkerer buffer/antistoff fortynningsmiddel fra multispectral flekker kit. Multispectral sekundære beholderen fylles med 30 mL av anti-mouse/anti-rabbit sekundære antistoff polymer fra multispectral flekker kit.
- Forberede ti 7 mL åpne containere. Et bestemt volum i microliters er 600 + (150 x [antall lysbilder]). Hver antistoff brukes til 12 lysbilder i dette tilfellet (seks mandel og seks lunge). Merking og volumer for alle beholdere vises i tabell 3.
- For hver antistoff rør, først legge antistoffer fortynningsmiddel, etterfulgt av konsentrert primære antistoffer i volumer som er angitt i tabell 3. Bland ved mild pipettering.
- Forberede en 7 mL åpen beholder DAPI, med fire dråper DAPI konsentrat per milliliter dobbel-destillert vann; totalt 16 vil være farget med DAPI (600 + [150 x 16] = 3000 µL). Legge 3 mL dobbel-destillert vann pluss 12 dråper spectral DAPI i beholderen. Forberede frisk DAPI for hvert løp.
- Forberede en 7 mL åpen container peroxidase inhibitor. Alle 16 lysbildene blir behandlet med peroxidase hemmer (600 + [150 x 16] = 3000 µL). Legge til 3 mL peroxidase blokk i beholderen.
- Før forberede arbeider konsentrasjoner av fluors, resuspend alle lyofilisert fluors ved å legge til 75 µL av dimethyl sulfoxide hver fluor rør fra produsenten. Bland ved pipettering. Dette er TSA fluor aksjen. Butikken på 4 ° C.
- Forberede seks titrering beholdere, en for hver fluor. Et bestemt volum i microliters er 350 + (150 x [antall lysbilder]). Hver fluor brukes på 16 lysbilder i dette tilfellet (åtte mandel og åtte lunge). Merking og volumer for alle beholdere vises i Tabell 4.
- Når alle reagenser som er registrert og forberedt, plassere hver beholder hvor som helst på et stativ og laste reagenser til den automatiserte fargemaskin. Sonden vil bekrefte volumet av hver reagens.
8. automatisert fargemaskin: Prøve oppsett og Multispectral flekker
-
I programvaren automatisk, klikker du Skyv oppsett på toppen av skjermen. Klikk Legg til studie. Fyll ut forgrunnsvinduet med studie ID, studie navn og kommentarer.
- Velg navnet på forskeren gjennomføre flekker flukt fra det miste-ned listen. La dispense volumet på 150 µL. Velg Multispectral Dewax for forberedelse-protokollen. Klikk OK og Legg til lysbildet. Under kommentarerSkriv "Multiplex 1 lunge 123ABC." Fullføre følgende felt som angitt: Vev Type = Test vev; Dispense volum = 150 µL; Beising modus = Single, rutinemessig; Markør = negativ; Farging = Skriv "7 Multiplex protokollen 1"; Forberedelse = Multispectral Bake, Dewax 2t; HIER = HIER 20 min med ER1.
- Klikk Legg til lysbildet og endre kommentarer og protokollen til slipp kontroll lysbilder og isotype kontroll lysbildet. Når alle lysbildene er lagt til studiet, Lukk vinduet Add lysbilde og skrive ut etiketter. Bruke etikettene riktige kommentarområdet hvert lysbilde.
- Laste inn lysbildene i rack, bruke dekke fliser i riktig retning, stativer inn den automatiserte fargemaskin og lavere skuffene. Enheten vil skanne lysbildet etikettene.
- Når alle lysbilder og reagenser har blitt skannet og målt. Løpe knapp (veiledning) blir aktiv. Hvis autostainer oppdager feil, som utilstrekkelig reagensvolum, vises en gul advarsel symbol av berørte skuffen. Hvis det oppstår feil, høyreklikk forsiktig symbolet og rette feilen.
- Starte flekker umiddelbart eller planlegge en forsinket start. Protokollen er ca 14 h varighet. Merk: Sikre protokollen fullføres samtidig når lysbildene kan fjernes umiddelbart som exess vask kan påvirke flekker resultater.
9. Coverslipping Multispectral lysbildene
- Fjerne lysbildene fra den automatiserte fargemaskin og lagre dem i et rack neddykket i 1 x TBS.
- Montere prøvene med nei 1,5 coverslips og 15 µL av montering media (se Tabell for materiale). Fjerne bobler ved å trykke forsiktig på dekkglassvæske med en pipette tips.
- Gi lysbildene herdes natten i romtemperatur på laboratoriebenken. Uherdet lysbilder kan skannes umiddelbart med forsiktig håndtering.
10. multispectral skanner
- Multispectral skanneren og datamaskinen sin (se Tabell for materiale for modell og programvare). Start mikroskop kontroll programvare. Åpne frontdekselet på multispectral skanneren ved å trykke knappen berøring-følsom på forsiden av enheten. Hver fjærbelastet bærer i skanneren har fire lysbilder. Laste inn alle lysbildene i bærere og registrere bestillingen før du legger operatører i enheten.
- Velg Rediger protokoll , og klikk ny...; deretter Opprett protokollnavnet Multiplex Panel 1 og slipp kontroller. Opprett studie navnet Multiplex panelet utvikling, deretter Opprette protokoll, og Skriv Oversikt skanne Filter DAPI; Velg Hele Skyv skanne og Pixel Resolution 0,50 µm (20 X). Alle filtre og band skal representeres. Hvis ikke, klikker du Rediger filter og band, velger alle fem filtre (DAPI, FITC, CY3, Texas rød og CY5) og klikk deretter Redigere eksponeringer.
- Lastestativ ved å velge transportøren med full multipleks av lunge adenocarcinoma. Velg riktig lysbildet ved hjelp av det grafiske brukergrensesnittet. Fokusere vevet enten manuelt eller ved hjelp av autofokus. Naviger til alle områder med akseptabel DAPI flekker og klikk Auto-utsett angir eksponeringen i millisekunder (0-2000 ms).
- Gjenta den samme fremgangsmåten for alle fem filteret sett i både hele skanne og MSI regionen kolonner. Sørg for å navigere til et område med akseptabel flekker og refokusere mikroskopet før eksponering for hvert filter og forstørrelse nivå. Auto-utsettes for alle fem filtre i en 20 x samlede skanning og 20 x multispectral imaging (MSI) multispectral regioner. Velg en pikslers oppløsning på 0,50 µm (20 x). Lagre protokollen og klikk tilbake for å gå tilbake til Hjem-skjermen av Vectra programvaren; Klikk deretter Skanne lysbilder.
- Åpne grensesnittet for hvert lysbilde og oppgave å skanne. Angi studie Multiplex paneletutvikling, angi protokollen Multiplex Panel 1og slipp kontroller og satt Lysbildet ID til Multiplex lunge ABC123, Multiplex CD68 Drop lunge ABC123, etc . Når alle lysbildene er merket, og aktiviteter er satt, klikker du Skann. Automatisert multispectral skanneren utfører full-slide skanner alle lysbilder med alle fem filtre.
11. multispectral skanner: Multispectral Imaging
- Når skanner er fullført, åpne programmet QPTIFF ("Phenochart") og klikk Last Skyv øverst til venstre. Dette vil åpne en QPTIFF, som er en fem-filter hele lysbildet skanning. Hvert lag inneholder informasjon fra flere fluor, slik at verktøyet er begrenset, men vevet struktur og bredt uttrykk mønstre er tydelige og kan brukes til å velge plasseringer for MSI.
- Navigere og åpne det riktige lysbildet i studien ved hjelp av rullegardinlisten treet til venstre. Logg på (øverst til høyre) med brukeren initialer.
- Velge fem regioner for MSI stempelverktøyet på toppen av skjermen. Konsultere en patologen hvis det finnes. Under Velg forVelg oppkjøpet; under størrelse i felt, velg 1 x 1; og under feltet begrensning, 0,5 µm (20 x). Basert på cytokeratin (CK) flekker (hovedsakelig i Cy5), Velg flere regioner med både svulst (CK +) og stroma (CK-) til å avbildes fra generelle søket. Gjenta dette for hvert lysbilde.
- Når alle MSIer er valgt, lukke programmet Phenochart og tilbake til Vectra programvaren. Endre oppgaven fra skanne til MSI for hvert lysbilde, og klikk deretter Skann nytt for å utføre samlingen MSI.
12. spectral Unmixing
Merk: Spectral unmixing trinnet er nødvendig for Kanalseparasjon og bildeanalyse lysbildene. Før spectral unmixing utføres i informere programvaren, må spectral biblioteket være bygd ved hjelp av lunge adenocarcinoma lysbilder beiset med hver fluor alene og DAPI alene. Denne fremgangsmåten er også beskrevet i nevnte Multiplex IHC analysen utvikling Guide.
- Når MSI oppkjøpet er fullført, kan du bruke spectral unmixing ("informere") programvaren for å åpne filene i MSI -mappen. Disse filene ender i .im3 filtype filtypen.
- Under bildeformat, velg Multispectral; under samplingsformatVelg fluorescens; og under Spectral biblioteket kilde, informere.
- For å velge fluors, velger du og legger alle seks fluors og DAPI fra biblioteket bygget med lunge adenocarcinoma biblioteket lysbildene. Klikk Forberede alle . (nede til venstre). Spectral unmixing programvaren vil utføre spectral unmixing på alle åpne bilder, med medfølgende spectral profiler.
- Med en patologen, vurdere flekker mønsteret mot kromogent enkelt flekker med samme mål i sekvensielle lysbilder av samme vev.
13. evaluering av fluorescens intensitet og Signal demping
Merk: Verktøyet teller som vises som en pil med en liten, brun boks, er det viktigste verktøyet for multiplex optimalisering og bør brukes ofte (se Supplerende materiale). Bruke verktøyet teller i spectral unmixing programvaren, vurdere signal-til-støy-forhold, som et minimum bør overstige 10:1 (se Supplerende materiale for feilsøking og for evaluering av multipleks flekker med slipp kontroller).
- 13.1. med et bilde åpent i spectral unmixing programvaren, engasjere verktøyet teller og undersøkelse bilder å vurdere fluorescens intensiteten av hver kanal. Målet intensiteten i lungevev er mellom 10 og 20 normalisert teller. Verktøyet normalisert teller er vist i figur 1.
- Ekskludere lysbilder med maksimal signalkvalitet antall mindre enn 10 eller vanlig signal området teller for mindre enn fem for noen markør slik at autofluorescence og off-målet flekker ikke konkurrere med autentisk signalet.
- Ekskluder lysbilder med maksimum teller større enn 30 for en kanal å unngå spectral blødning eller ineffektiv spectral unmixing.
- Ta høy eller lav normalisert teller ved å justere TSA konsentrasjonen.
14. multispectral bildeanalyser
- Åpne én eller flere MSI i spectral unmixing programvare og bare velge fluors for unmixing som er representert i minst ett åpent bilde. Klikk Forberede alle for å unmix alle åpne fargebilder å gi spectrally ublandet bilder.
- Velg teller for å kartlegge teller over hvert bilde av svever over området eller områdene rundt.
- Velg øyeikonet åpne visningsredigeringsprogrammet for. Velge og justere skjermen intensiteten av hver uavhengige kanal.
- Velg Konfigurer for å åpne vev segmentering, celle segmentering, phenotyping og scoring moduler. Disse verktøyene er nødvendig for objektiv valideringen av multipleks flekker mot kromogent enkelt flekker og kan brukes til å generere kvantitative phenoptic data (Figur S1).
- Bruke eksportere kategorien lagre gråtoner, lysrør, pathview-stil ukomprimert TIFF og datafiler fra phenoptic analyse modulene for ytterligere analyse, arkivering og presentasjoner (Figur S1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet her vil gi resultater som vises i figur 2. Start med en evaluering av den flekker i kontrollen mandel, begynner med overflaten squamous celle epitel. Histology av mandel utvalget kan ses med en patologen, med H & E lysbildet som referanse. Hvis kromogent IHC deler utføres med samme markører på samme vev blokk, kan disse brukes til å bekrefte tetthet og distribusjon av hver merketråd på mIF lysbildet. Som vist i figur 2A, mandel vevet bør gi klart definerte AE1/AE3 cytokeratin farging i mandel overflaten plateepitel epitel (figur 2A; merket som røde pseudofarger, det vil), uten bakgrunn i den lymfoide vev. Den flekker bør være cytoplasmatiske, noen ganger med membran betoning kjerner må være negativt. Reticulated epitel i crypts skal være positivt for både cytokeratins (rød) og PD-L1 (figur 2A; grønne pseudofarger, det vil). Follicular germinal sentre i mandel, deretter identifieres. Germinal sentre bør være lett gjenkjennelig, og skal være rik i Ki-67-positiv lymfocytter (figur 2A; gule pseudofarger, det vil). KI-67 flekker bør alltid være kjernefysiske. Makrofager i germinal sentre bør også være lett gjenkjennelig, noen ganger som større celler (også kalt "tingible organer"). De vil vise positive flekker for CD68 som en detaljert cytoplasmatiske flekk (figur 2A; oransje pseudofarger, det vil). Det er også en variabel andel CD68 celler utenfor germinal sentre må forventes. Makrofager kan vise membran flekker for PD-L1. Dette er vanligvis blekere intensitet enn farging for PD-L1 i reticulated epitel. Det skal ingen kjernefysiske CD68 flekker. CD8 skulle besudle lymfocytter med en T-celle fordeling (færre i germinal sentre og en større andel i interfollicular områder, se figur 2A, cyan pseudofarger, det vil). CD8 + lymfocytter er vanligvis små celler med snaut cytoplasma, så det er praktisk talt umulig å skille membran versus cytoplasma i lymfocyttene. PD-1 vil sterkt flekken små lymfocytter i germinal sentrum området vanligvis gruppert i utkanten av germinal sentre (figur 2A; magenta pseudofarger, det vil), i tillegg til spredt lymfocytter i regionen interfollicular, vanligvis viser en lavere flekker intensitet enn i området germinal sentrum. Som med CD8, er det ikke mulig å tydelig skille membran og cytoplasma flekker i små lymfocytter med PD-1. Fordi et variabelt antall CD8 celler coexpress PD-1, er det anbefalt for kvalitetskontroll formål at flekker mønster og distribusjon av hver indikator er farget i samme vev sammenlignes med kromogent IHC referanse lysbilder, som foreslått i tidligere publiserte protokoller12.
Etter den forventede flekker mønsteret er bekreftet i kontrollen mandel vev, fortsette å evaluere den flekker i lunge kreft utvalget (figur 2B). Fordi tumor vev er ventet å vise en variabel og heterogene uttrykk for markører, er det svært viktig i optimalisering av en ny mIF panel sammenligne flekker mønsteret for hver individuelle indikator i metoden mIF og det tilhørende uttrykket observert i standard kromogent IHC lysbildet, vurdere mengden og distribusjon av positiv cellene som beskrevet tidligere12. Likevel skal flekker mønsteret være bevart; for eksempel bør cytokeratins overholdes i cytoplasma av epitelceller og aldri i en kjerne; CD68 skal vises som detaljert cytoplasma flekker i makrofager, etc. Viktigere, i noen markører, kan farging intensiteten endres fra kontrollen mandel til kreft vev; for eksempel kan PD-1 og PD-L1 vise lavere intensitet flekker i tumor vev sammenlignet med svært høy uttrykket i mandel kontroll. Derfor er det viktig å utføre evaluering og optimalisering med verktøyet teller i informere programvaren bruker eksempler på tumor vev i stedet for mandel kontrollene.
Endelig må isotype-negativ kontroller og slipp kontroller vurderes, ikke bare for påvisning av bakgrunn og autofluorescence, men også for paraply effekter og spectral blø (Figur 3 og Figur 4). Isotype kontroller vise ikke alle immunostaining i lysbildet. Hvis noen flekker er observert, må deretter avbilding eller flekker prosedyren bli revisited. Slipp kontroller er viktig å vurdere potensielle gjenstander i farging, som spectral utfallende eller paraply effekter, på grunn av mIF metoden under optimalisering av en ny multiplex panel (se figur 5, Utfyllende figur S2, Supplerende figur S3, og tilleggsresultater materialer). Fluorescerende monoplex og slipp kontroller burde bli evaluert og sammenlignet med full multiplex panelet. Hver dråpe kontroll skal vise samme flekker mønster unntatt én primær antistoffer, som må fjernes på hver bestemt kontroll. Ytterligere detaljer finnes i delen Supplerende materiale .
Figur 1 : informere teller Tool. Verktøyet informere programvaren teller aktiveres ved å velge ikonet beige-boksen. Normalisert teller er korrigert for bitdybde, eksponeringstid, forsterkning og binning. Bildene ble tatt på 20 X forstørrelse; baren skala = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant resultater. (A) mandel og (B) nonsmall-celle lunge karsinom var farget med PD-L1 (520 TSA, grønn) CD8 (540 TSA, cyan), Ki67 (570 TSA, gul), CD68 (620 TSA, oransje), cytokeratin (650 TSA, rød), og PD-1 (690 TSA, magenta). Enkeltkanaler vises separat nedenfor i små paneler. Markøren er angitt øverst til høyre på hvert bilde. Bildene ble tatt på 20 X forstørrelse; Skala bar = 50 (eller 250 µm). Angitt i panelet A er 1) lymfoide hårsekken, 2) germinal sentrum, 3) interfollicular området og 4) lagdelt plateepitel epitel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : TSA blokkerer/paraply effekt. Dette er et eksempel på 690 TSA avsatt av en PD-1 antistoff-blokkerende CD3 signal på en måte avhengig av mengden av TSA stede. Smarteste 690 TSA signalet blokkerer 620 TSA signalet mest effektivt (nonsmall-celle lunge karsinom beiset med anti-PD-1 D4W2J i 30 min 0.52 µg/mL eller isotype etterfulgt av en 10 min 690 TSA gjenkjenning på 1: 100, da, anti-CD3 F7.2.38 i 30 min på 0,14 µg/mL etterfulgt av en 10 min 620 TSA gjenkjenning på 1: 100). Bildene ble tatt på 20 X forstørrelse; baren skala = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Spectral utfallende. Nonsmall-celle carcinoma lungevev var farget med Ki-67 slipp-kontrollprotokollen (komplett multiplex protokoll med Ki-67 antistoff utelatt). 540 TSA kanalen (CD8) og 570 TSA kanalen (Ki-67) vises. Ingen kjernefysiske flekker mønster er tydelig, men en redusert kopi av CD8 flekker mønster er observert i 570 TSA kanalen. Dette behandles best ved sammenlignbare flekker intensitet i alle kanaler. I dette tilfellet korrigerer tillegg av et robust Ki-67 signal (normalisert teller mellom 10 og 20) spectral bleed. Bildene ble tatt på 20 X forstørrelse; baren skala = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Slipp kontroller. Denne illustrasjonen viser et sammensatt bilde av en full multiplex sammenlignet med den samme regionen i sekvensielle lysbilder av lunge adenocarcinoma med slipp kontroller der det angitte primære antistoffet ble utelatt. Bildene ble tatt på 20 x forstørrelse; Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| navn | En navn | Type | Beholder | Gruppe |
| PKI blokkerer Buffer | OPALBLOK | Hjelpeutstyr | Åpne 30 mL | Generelt |
| Opal Polymer HRP | OPAL 2AB | Hjelpeutstyr | Åpne 30 mL | Generelt |
| OPAL 1 x TBS | OPAL1TBS | Hjelpeutstyr | Åpne 30 mL | Det. Kit |
| CD68 0,30 µg/mL PG-M1 Mus | OPALCD68 | Hjelpeutstyr | Åpne 7 mL | Generelt |
| Ki67 0,61 µg/mL MIB-1 Mus | OPALki67 | Hjelpeutstyr | Åpne 7 mL | Generelt |
| PD-L1 0,20 µg/mL SP263 Rab | OPALPDL1 | Hjelpeutstyr | Åpne 7 mL | Generelt |
| PD-1 0.52 µg/mL D4W2J Rab | OPAL PD1 | Hjelpeutstyr | Åpne 7 mL | Generelt |
| CD8 0,70 µg/mL SP239 Rab | OPAL CD8 | Hjelpeutstyr | Åpne 7 mL | Generelt |
| CK 0,24 µg/mL AE1/AE3 Mus | OPAL CK | Hjelpeutstyr | Åpne 7 mL | Generelt |
| Musen IgG | OPAL MUS | Hjelpeutstyr | Åpne 7 mL | Generelt |
| Kanin IgG | OPAL RAB | Hjelpeutstyr | Åpne 7 mL | Generelt |
| OPAL Peroxidase blokk | OPALPERX | Hjelpeutstyr | Åpne 7 mL | Generelt |
| Spectral DAPI | OPALDAPI | Hjelpeutstyr | Titrering 6 mL | Generelt |
| Opal 520 reagens | OPAL 520 | Hjelpeutstyr | Titrering 6 mL | Generelt |
| Opal 540 reagens | OPAL 540 | Hjelpeutstyr | Titrering 6 mL | Generelt |
| Opal 570 reagens | OPAL 570 | Hjelpeutstyr | Titrering 6 mL | Generelt |
| Opal 620 reagens | OPAL 620 | Hjelpeutstyr | Titrering 6 mL | Generelt |
| Opal 650 reagens | OPAL 650 | Hjelpeutstyr | Titrering 6 mL | Generelt |
| Opal 690 reagens | OPAL 690 | Hjelpeutstyr | Titrering 6 mL | Generelt |
Tabell 1: Leica Bond RX protokollen, Opal reagenser
| Reagens | Tid (h) | Temperatur (grader) | |
| 1 | Ikke reagens | 120:00 | 60 |
| 2 | Bond Dewax løsning | 0:30 | 72 |
| 3 | Bond Dewax løsning | 0:00 | 72 |
| 4 | Bond Dewax løsning | 0:00 | Ambient (romtemperatur) |
Tabell 2: OPAL forberedelse protokollen
| Mål | µg/mL | Klone | Kilde | Mye | Lager µg/mL | µL fortynner | ΜL AB |
| CD68 | 0,3 | PG-M1 | Dako | 20043031 | 30 | 2376 | 24 |
| Ki67 | 0,61 | MIB-1 | Dako | 20049476 | 46 | 2368.17 | 31.83 |
| PD-L1 | 0,2 | SP263 | Vent. | F09591 | 1,61 | 2101.86 | 298.14 |
| PD-1 | 0.52 | D4W2J | CST | 1 | 100 | 2387.52 | 12.48 |
| CD8 | 0,7 | SP239 | Ventana | 160318 | 70 | 2376 | 24 |
| CK | 0.24 | AE1/AE3 | Dako | 10129428 | 179.5 | 2396.79 | 3.21 |
| Mus IgG | 0,61 | ||||||
| Rab IgG | 0,7 |
Tabell 3: Primær antistoffer forberedelse.
| Opal Fluor | Lysbilder | Fortynning | µL fortynner | µL opal Fluor |
| Opal 520 | 16 | 1:200 | 2736.3 | 13.8 |
| Opal 540 | 16 | 1:700 | 2746.1 | 3.9 |
| Opal 570 | 16 | 1:150 | 2731.7 | 18.3 |
| Opal 620 | 16 | 1: 100 | 2722.5 | 27.5 |
| Opal 650 | 16 | 1:350 | 2742.1 | 7.9 |
| Opal 690 | 16 | 1:150 | 2731.7 | 18.3 |
Tabell 4: OPAL Fluor forberedelse.
Supplerende materiale dokumentet: Klikk her for å laste ned dokumentet.
Ekstra figur 1: Klikk her for å laste ned dette tallet.
Ekstra figur 2: Klikk her for å laste ned dette tallet.
Ekstra figur 3: Klikk her for å laste ned dette tallet.
Ekstra tabell 1: Leica Bond RX Opal Multiplex protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabell.
Ekstra tabell 2: Sammendrag og sammenligning av full multipleks, slipp kontroller og full isotype kontroller. Klikk her for å laste ned denne tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pågående kreft immunterapi revolusjonen er åpning romanen og lovende behandlingsalternativer for kreft pasienter13. Fremskritt innen immuno-onkologi krever økt kunnskap om den inflammatoriske svulst microenvironment, ikke bare å forstå biologi immunologiske mekanismer involvert i kreft, men også å finne prediktiv biomarkers for nye immunterapi-baserte behandlinger1,2. På grunn av den komplekse biologien kreft immunologi, er avhør av svulst vanligvis nødvendig for å utvikle en voksende liste av immun markører, som samhandler med hverandre og er ofte coexpressed av ulike celle populasjoner i vevet1 ,2,5. Kliniske studier vanligvis benytter små biopsier, som kjernen nål eller endoskopisk biopsier, som er samlet på ulike tidspunkter i terapi for å evaluere og overvåke pasient svar. Slike biopsier gi begrensede mengder av vev, som i sin tur begrenser antall vev deler som kan benyttes for kreft immunoprofiling. Denne begrensningen er spesielt byrdefull når tradisjonelle teknikker, som standard monoplex IHC, brukes. Det er derfor et klart må for nye metoder for kreft immunoprofiling som gjør bruk av multiplex teknikker med kapasitet samtidig vurdere coexpression av forskjellige biomarkers og gjøre mer effektiv bruk av verdifulle vevsprøver.
I multiplex flekker og multispectral tenkelig metodene som er beskrevet i detalj her, brukes en mIF panel for immuno-onkologi studier på FFPE vev som biopsier fra en klinisk studie. Denne metoden har blitt beskrevet tidligere, godkjent og aktivert for kreft immunoprofiling8,9,10,11,12,14, 15. publisert tidligere protokoller har beskrevet lignende mIF flekker metoder med TSA-baserte systemer, som i syv farger kit, som er tidkrevende og krever ca 4 dager med arbeid med en dedikert laboratorium forsker12 ,15. Svar på disse svakhetene, er denne protokollen optimalisert ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig automatisert fargemaskin, dramatisk forkorte flekker tid til 14 h og fjerne variasjon introdusert av manuell operatører. Imaging er gjennomført på en multispectral skanner i stand til å skille spektra av sju eller flere fluorescerende signalene i multiplex lysbildene, inkludert autofluorescence, som effektivt kan fjernes uten nedverdigende signalkvaliteten. Denne protokollen kan replikeres, endres, og utført av laboratoriet brukere med tilgang til instrumenter og reagenser i Tabellen for materiale.
Avgjørende skritt i denne protokollen er deler 7 10, 11, 12. Punkt 7 gjelder forberedelse av reagenser. En forsiktig forberedelse av reagenser til multiplex farging er viktig, som krever fokusert oppmerksomhet en laboratorium vitenskapsmann eller tekniker å unngå operatøravhengig variasjon. For eksempel, er en av de store problemene med metoden multiplex flekker variasjon, som kan reduseres ved forsiktig utarbeidelse av fortynninger av reagenser, spesielt de TSA fargestoffer. Avsnitt 10 og 11 er knyttet til bildeopptak. En viktig risiko er overeksponering eller oversaturation av bildene, som kan føre til spectral blør, en gjenstand som signalet fra en annen kanal forstyrrer kanalen blir fotografert (se Supplerende materiale). Nøye regulere eksponeringstider kan bidra til å forhindre oversaturation og spectral blø. Spectral unmixing gjennomføres i delen 12. Dette er avhengig av utarbeidelse av spectral biblioteket (beskrevet i Multiplex IHC analysen utvikling Guide tilgjengelig online). I dette trinnet er informere programvaren "utdannet" å spesifikt gjenkjenne fargene for hver TSA fargestoff. Spectral biblioteket er opprettet ved hjelp av inndelinger fra en kontroll vev, som menneskelige mandel, beiset med merketråd jevnt uttrykt som CD20, kombinert med hver individuelle TSA fargestoff på enkeltlysbilder. I tillegg for autofluorescence lysbilder (også beskrevet i Multiplex IHC analysen utvikling Guide) å trene informere programvaren gjenkjenner og trekke vev autofluorescence. Autofluorescence kontroll lysbilder bør bruke eksempler fra samme vev blir studert (som lungekreft, etc.), behandles på samme måte som mIF lysbildene og inkubert med primære og sekundære antistoffer men uten TSA fargestoff. Bare en enkelt autofluorescence spectral profil kan velges, så forsiktighet må utvises velge en representasjon av den observerbare autofluorescence som kan komme fra kollagen, fibrose, røde blodlegemer, endogen pigmenter og andre kilder. Opprette en ny spectral bibliotek i begynnelsen av hvert nytt prosjekt og bruker en autofluorescence spekteret som er representant for studien vevsprøver, samt kjører samme vev blokkene som positive kontrollen for hver gruppe i samme prosjekt, verdifulle metodologiske tiltak som vil bidra til å forbedre konsistensen av spektral er unmixing over forskjellige prøver i samme prosjekt.
Multiplex metoden beskrevet i denne protokollen gir flere feilsøkingsverktøy, inkludert en signal-til-støy evaluator (teller verktøyet), slipp kontroller (Tilleggsresultater materialer) og patologi utsikt for kvalitetskontroll av den flekker. Teller verktøyet hjelper for å evaluere intensiteten av den flekker og nivået på bakgrunnen. Hvis intensitet og/eller bakgrunn nivåer er høy, er første tilnærmingen å redusere fortynning av TSA fargestoffet. Hvis problemet vedvarer, bør kromogent IHC lysbildene brukes for optimalisering av at bestemt markøren gjennomgås med en patologen, ser etter bakgrunn. Visningen patologi genereres av informere programvaren, bruke en diaminobenzidine-lignende pseudofarger, det vil representasjon av fluorescens fra fluor TSA-tilknyttet en faux hematoxylin representasjon fra alle fluorescerende signaler, inkludert DAPI . Bilder fra visningen patologi hjelp med visuelle evalueringen av flekker mønstrene av en patologen for forbedret flekker. Disse verktøyene bør alltid være ansatt under optimalisering av et nytt panel og kvalitetskontroll trinnene under farging arbeidsflyten.
MIF metoden krever bruk av primære antistoffer som er riktig validert og optimalisert for standard kromogent IHC på formalin-fast vev. For eksempel, er en av de store fordelene med metoden mIF TSA kompatibilitet med bruk av primære antistoffer som er godkjent og optimalisert i anatomisk patologi laboratorium for klinisk bruk12. Denne fordelen betyr at multiplex panelene kan tilpasses av laboratoriet brukeren å svare på spesifikke kreft immunologi spørsmål uten behov for preconjugated antistoffer, gir rask og dynamisk utvikling. I denne forbindelse begynner faktiske arbeidsflyten for optimalisering av et nytt panel med validering og optimalisering av antistoffer med standard kromogent IHC, leter etter den beste fortynning og flekker som vil gi ren og konsekvent flekker. Det neste trinnet, bruker de samme fortynninger optimalisert for IHC, er å overføre den flekker med TSA fluors i stedet for diaminobenzidine og sammenligne resultatene av monoplex immunofluorescent TSA med den kromogent IHC som referanse. Til slutt, antistoffer kan kombineres i mIF flekker, alltid bruker den kromogent IHC flekker mønster som kontrollreferanse for å justere mIF TSA flekker parametre, hovedsakelig TSA fargestoff fortynninger og flekker rekkefølgen. Under denne prosessen er samarbeid med en patologen medvirkende til å vurdere kvaliteten på den flekker.
Begrensninger av denne teknikken inkluderer tid og krefter kreves for optimalisering og validering av nye paneler og immunophenotyping analyse av mIF paneler. Den største bekymringen, er imidlertid riktig validering av mIF metoder. Mangel på riktig validering av disse teknikkene bærer risikoen for genererer ugyldige resultater, som kan legge til forvirrende data i litteraturen, og dermed hindre forsøk på å få en bedre forståelse av biologi kreft immunologi16. Det påhviler, derfor etterforskeren å anstrenge skal validere multiplex metoder, herunder sikre tett deltakelse og evaluering av patologer med opplæring og erfaring i validering og evaluering av vev histopatologi og IHC-baserte teknikker17,18,19,20. Protokollen presenteres her inkluderer noen av verktøyene som kan hjelpe med validering av en ny multiplex panel, inkludert patologi evalueringen av H & E lysbildene før farging og analyse, bruk av kromogent IHC som en referanse til optimalisere mIF TSA flekker, slipp kontroll metoden for kvalitetskontroll av en ny multipleks panelet, og bruk av isotype, autofluorescence, og slipp kontroller. Til tross for den tekniske kompleksiteten i mIF metoder åpner teknologier som multispectral bildebehandling med spektral unmixing, samt andre romanen multiplex plattformer, en ny æra for analyse av vevsprøver fra pasienter og generering av nye skjemaer data som ikke er mulig med standard IHC alene. Derfor vil utvikling og anvendelse av mIF teknikker fortsette å vokse, bli kraftige verktøy for kreft immunoprofiling av biopsier for kliniske forsøk og bidra til å identifisere nye multiparametric prediktiv biomarkers for immunterapi, fordel fremfor alt kreft pasienten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet ble støttet av MedImmune, globale biologiske R & D arm av AstraZeneca. CW, K.R. og C.C.H. er ansatte i Perkin Elmer, som produserer reagenser (TSA kit) og multispectral skannere som ble brukt i dette arbeidet. M.S., K.D., A.H., W.Z., C. Bagnall, C. Brown, JC, Al, K.S., Mr og J.R.C. er ansatte i MedImmune med stock eierskap og/eller lager interesser eller alternativer i AstraZeneca.
Acknowledgments
Redaksjonelle støtte ble levert av Deborah Shuman av MedImmune.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
