Summary
עכברים מהונדסים גנטית הם מודלים שימושי עבור חוקר סרטן הערמונית מנגנונים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לזהות, לנתח אונות הערמונית ממערכת השתן העכבר, להבדיל אותם בהתבסס על היסטולוגיה, לבודד ושל תרבות את תאי הערמונית הראשית in vitro לקשרי כמו spheroids עבור ניתוחים במורד הזרם.
Abstract
מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMMs) משמשים כמודלים ניסויים פרה-קליניים יעיל על חקירת רוב סוגי סרטן אנושי, כולל סרטן הערמונית (PCa). הבנת אנטומיה, היסטולוגיה של הערמונית עכבר חשוב עבור שימוש יעיל ו נאות אפיון כזה חייתיים. הערמונית עכבר יש ארבעה זוגות ברורים של אונות, כל אחד עם תכונות משלהם. מאמר זה מדגים את השיטה הנכונה של ניתוח וזיהוי של האונות הערמונית עכבר לניתוח במחלה. לנתיחה שלאחר, תאי הערמונית יכולים להיות עוד יותר בתרבית במבחנה על ההבנה מכניסטית. מאז העכבר הערמונית ראשי תאים נוטות לאבד המאפיינים שלהם נורמלי כאשר בתרבית במבחנה, אנו מכינים כאן שיטה לבודד את התאים, גדל אותם כמו תרבויות ספרואיד 3D, אשר נמצא יעיל לשם שמירה על פיזיולוגית המאפיינים של התאים. תרבויות אלה 3D יכול לשמש עבור ניתוח תא מורפולוגיה, רמות ההתנהגות בתנאים ליד-פיזיולוגיים, חוקרת משתנה, הגרסא המקומית של חלבונים מפתח, המעורבים בהתפתחות והתקדמות של מחלה, מסתכל תגובות טיפולים תרופות.
Introduction
הקהילה המדעית מנסה להבהיר את מנגנון מורכב של התפתחות סרטן אנושי במשך עשרות שנים. ואילו זיהוי של שחקני המפתח פוטנציאליים סמים מטרות מתחיל עם החולה תאים, רקמות מחקרים, היישום translational של ממצאים כאלה לעיתים קרובות דורשת את השימוש במודלים ניסויים פרה-קליניים. השימוש של עכברים מהונדסים גנטית מודלים (GEMMs) כדי סרטן אנושיים דגם עלתה בהתמדה מאז הקמת העכבר מודלים של האדם סרטן Consortium (NCI-MMHCC), ועדה אשר ביקשו לתאר ולאחד את מאפייני העכבר סרטן מודלים עבור מדענים ברחבי העולם1,2. העכבר מודלים למלא את הצורך ללימודי מכניסטית במחקרים קליניים של רוב סוגי סרטן, להבנת התפתחות, התקדמות, מענה טיפולי, ונרכשה ההתנגדות3.
סרטן הערמונית הוא הסרטן הנפוצות אצל גברים, להשפיע על גברים מעל 160,000 בכל שנה4. צורות אגרסיבי של המחלה טוענים עשרות אלפי אנשים כל שנה. עם זאת, המנגנון של התקדמות המחלה עדיין ממעטים להבין. התוצאה היא חוסר רציני של אפשרויות טיפול יעיל עבור סרטן הערמונית מתקדם ולא גרורתי, כפי שמעידים אחוזי התמותה הגבוהים חולי סרטן הערמונית מתקדם4. לפיכך, יש צורך הולך וגדל עבור מודלים קליניים ללמוד סרטן הערמונית. עם זאת, בשל ההבדלים הטבועים בין העכבר על הערמונית אנושי, מידול של סרטן הערמונית אצל GEMMs לא לנפוצים בשימוש עד מערכת סיווג ב"באר הארבור הוצג ב-2004, אשר התווה שינויים histopathological העכבר הערמונית על מניפולציה גנטית, זיהוי של שינויים אמצעים, והקשר שלהם בשלבים של התקדמות סרטן בני5. מאפיין חשוב אחד של הערמונית עכבר שיש לקחת בחשבון תוך כדי לימוד כל דגם GEMM הערמונית הוא הנוכחות של ארבעה זוגות ברורים של אונות: קדמי, לרוחב, הגחון ו הגבי. האונות מציגים הבדלים משמעותיים ב- histopathology וג'ין ביטוי דפוס6. חלבון probasin ביטוי דפוס יכול להשתנות בין האונות ב עכברים צעירים שלאחר גיל ההתבגרות7, אשר יש לקחת בחשבון מאז מודלים מבוססי-Cre GEMM מיועדים בעיקר באמצעות promotor מבוסס על probasin שנקרא Pb-Cre47. ההבדלים יכולות וכתוצאה מכך Cre ביטוי לעיתים קרובות להוביל הבדלים בין צירי זמן, החניכה, התקדמות, גידול, כמו גם הבדלים בין אמצעים שינויים בין האונות. לפיכך, חשוב להביא בחשבון הבדלים כאלה תוך כדי לימוד התפתחות גידולים בערמונית GEMMs, האונות נפרדות ייתכן צורך להעריך בנפרד על מנת להשיג תוצאות לשחזור. החלק הראשון של מאמר זה מתאר את השיטות נכונה לנתח בלוטת ערמונית העכבר, לזהות להפריד בין האונה כל ושל לזהות את ההבדלים היסטולוגית בין האונות.
בזמן הניתוח של הגידול, histopathology יכול לספק ערך תובנות להתפתחות הגידול, הם אינם מספקים מידע רב אודות המנגנונים המולקולריים. ללמוד את המנגנון של התפתחות גידולים והתקדמות, הוא לעיתים קרובות שימושי לנתח את תאי הגידול בתוך חוץ גופית. מספר שיטות שהוצעו במהלך השנים המערבות תרביות של תאים אלה, לרבות השעיה תרבויות, תרבויות תלת-ממד8 ובתרבויות לאחרונה, 2D קבוע9. בעוד רוב השיטות האלה כתוצאה בשיעורי ההישרדות והתפשטות תאים טובה, התרבויות 3D לספק סביבה הקרובה ביותר בתנאים פיזיולוגיים. 3D או ספרואיד תרבויות גדל מטריצה חוץ-תאית קרום המרתף (ECM), התאים luminal הבדיל לחלוטין בדרך כלל יש שיעור הישרדות נמוך מאוד; עם זאת, התאים הבזליים וביניים (בעיקר תאי גזע) מסוגלים להפיץ ולייצר אשכולות תא שנקרא spheroids10. דבר זה הופך מתאימים למחקר סרטן מאז סרטן אפיתל הסברה שמקורם בתאי גזע (הידוע בכינויו תאי הגזע הסרטניים)11. החלק השני של פרוטוקול זה מתאר שיטה culturing תאי הערמונית עכבר בתרבויות תלת-ממד. הכדורים וכתוצאה מכך יכול לשמש עבור מספר סוגי ניתוחים במורד הזרם, המחקר של מורפולוגיה תא צורב והתנהגות לתא חי הדמיה, immunofluorescence מכתים חלבונים שונים, כולל המחקר של התגובות כימותרפיות טיפולים.
בסך הכל, המטרה של פרוטוקול זה היא להתוות את שיטות האופטימלי עבור באמצעות העכבר מודלים ב סרטן הערמונית על ידי המתארת את האנטומיה וטכניקות דיסקציה של הערמונית עכבר, העיבוד של הרקמה ספרואיד תרבויות וניתוח במבחנה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים העכבר המתוארים כאן בוצעו על פי הנחיות המפורטות הפרוטוקולים שאושרו על-ידי IACUC מוסדי באוניברסיטה הרפואי SUNY בצפון המדינה.
1. ניתוח מערכת השתן (UGS)
הערה: התרשים מוצג באיור1.
- בן 3 חודשים זכר C57BL/6 עכבר באמצעות שיטת המתת חסד inhalational2 CO או טכניקה שאושרו נוספת המתת חסד.
הערה: עכברים בין הגילאים 3 עד 12 חודשים יכול לשמש בהצלחה הניסוי. עכברים בוגרים (> 6 חודשים) יהיה סביר יותר שומן סביב UGS, אשר יצטרכו להיות מסומנת. זיהוי והפרדה של האונות קשה לעיתים קרובות בעכברים לגילאים 3 חודשים. זנים אחרים יכול לשמש עבור הניסוי, גם כן. - הנח את העכבר על גבו ולאבטח את הרגליים באמצעות סיכות כך הצד הבטני של החיה הוא חשוף.
- תרסיס אתנול 70% על הבטן של העכבר, תנקה את זה.
הערה: גילוח השיער בבטן לפני ניתוח אינה נדרשת. - הרם את העור מן הבטן, יחד עם השכבה שרירים, עם זוג מלקחיים בוטה בינוני, אעשה חתך בצורת Y הפוכה על הבטן בעזרת מספריים.
- ראשית, עושים חתך ישר עם זוג מספריים חדות מ מעל הפין לעצם החזה (איור 2 א).
- חותכים מהבסיס של החתך כלפי כל אצבע ברגל, עד הירכיים (איור 2b). מקפלים בחזרה את העור משני הצדדים, בתחתית כדי להציג את כל האזור בטן (איור 2 c-e).
הערה: הגודל לחתוך משתנה תלוי העכבר גיל וגודל. גודל החתך ישר ייתכן בטווח של 1.5 עד 4 ס מ, בהתאם לגודל של העכבר.
- העבר מעל האיברים האחרים כדי לחשוף את UGS. להרים ולהזיז את המעיים חום-צהוב (2f איור). לאסוף את השמן קיבוע (אטום לבן ספוגית רקמת) עם מלקחיים ולהעביר אותם לצדדים (איור 2 g).
הערה: UGS כוללת של שלפוחית הזרע, השופכה, הערמונית, והצינורות הזרע (צינור הזרע), שלפוחית השתן. זה יכול להיות מזוהה על ידי הזוג האופיינית הקשתות אטום לבן חצי עגולים (שהם שלפוחית הזרע), עם הקרום מלאות נוזל השלפוחית מחובר לבסיס. הרקמה שקוף ממוקם ממש מתחת שלפוחית הזרע היא בלוטת הערמונית. - לאתר את UGS בחוזקה להחזיק על שלפוחית השתן עם מלקחיים בוטה, הרם את UGS כולו כלפי מעלה מהבטן העכבר.
הערה: אם שלפוחית השתן מלאה, לרוקן אותו קודם עם מזרק קטן לספק אחיזה טובה יותר עם המלקחיים, להפחית את הסיכון של פקיעת שלפוחית השתן. - ממשיכות למשוך על שלפוחית השתן, שקופיות זוג מספריים מתחת שלפוחית השתן, ערמונית כל הדרך אל עמוד השדרה, ולגרום חתך. לחתוך קשרים הנותרים אל חלל הבטן (איור 2 h ו- 2i). יש להיזהר לא קרוב מדי לחתוך UGS כדי למנוע מקרי לחתוך כל רקמות הערמונית.
הערה: בעת ביצוע החתך מתחת UGS, המספריים צריך להיות מוכנס כל הדרך לחלק האחורי של העכבר, כך החתך מצמיד את עמוד השדרה גם כן. שיטה זו יוצרת ניתוק כמעט את כל הקשרים בין UGS את חלל הבטן של חיתוך אחד, צמצום הזמן הדרוש כדי לחלץ את הרקמה מן העכבר. - הסר את UGS ולמקם אותו ב- 2-6 מ"ל (מספיק כדי לכסות את הרקמה) של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) או של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM, גלוקוז גבוהות) ב- 6 ס מ פטרי (איור 2j ו 2 k) והעברתו מיקרוסקופ לנתיחה (10 X הגדלה).
הערה: לשנות את המדיה ויבתר כפי שנדרש השלבים הנותרים.
2. לנתח את הערמונית
- נקה את כל השומן בשני הצדדים הגבי ו הגחון עם זוג בסדר. מלקחיים ומספריים microdissection (איור 3 א). השתמש מכשירי ניתוח דומה למשך שארית פרוטוקול לנתיחה.
הערה: השומן הוא לעיתים קרובות מקרוב שלובים זה בזה עם UGS (ניתן לזהות על פי מראהו ספוגי לבן); לפיכך, שלב זה חייב להתבצע בקפידה כדי להימנע החיתוך בטעות את כל רקמת הערמונית. זה יכול לקחת עד 10-15 דקות כדי לנקות את כל השומן. - חכה, משוך שלפוחית השתן עם המלקחיים, דוקטור בבסיס עם המספריים (איור 3b).
- את המקום הצד הבטני נותרת רקמה. להחזיק צינור והצינורות אחת עם מלקחיים, לאתר. את הבסיס עם מספריים, ואת דוקטור (איור 3 c) ולאחר מכן חזור על הצד השני. הסר את הזרע והצינורות, עכשיו עוזב מאחורי הערמונית (שקוף ו- verminous), vesicles הזרע (אטום, לבן, בצורת חצי עיגול), השופכה (הצינור ורוד-אדום, אטום) (דמות תלת-ממד ו- 3e).
- הכנס מלקחיים בין הקשת הפנימית של שלפוחית הזרע ושל האונות הקדמיות רקמת הערמונית. לחטט לגזרים שלפוחית הזרע, הערמונית דוקטור בכל רקמת חיבור כמו הצורך (איור 3f). לאתר שלפוחית הזרע לבסיס שלהם על השופכה ולהסיר אותם (איור 3 g ו- 3 h). יש להיזהר לא לנקב אותם.
- המשך שווייץ האונות הערמונית בודדים.
3. אנטומיה של Microdissection האונה הערמונית, בודדים (דמויות 3עכשיו-n, איור 4)
- להעיף את הרקמה עם זוג מלקחיים בוטה כך הצד הגבי פונה למעלה, מציג האונות הגבי, אשר ידמה כנפיו של פרפר.
- לאסוף האונות הגבי על ידי החזקת תנוך האוזן עם מלקחיים החיתוך בבסיס עם מספריים (איור 3j).
- נהפוך את הרקמה הנותרת על הצד הבטני.
- לאסוף את האונות לרוחב, אשר הם קטנים, בדרך כלל לעטוף את השופכה בצד, אשר הם תקוע בין האונות הקדמיות, הגחון, הגבי (איור 3 k).
- בשלב הבא, לאסוף את האונות הגחון, אשר גדולים מהאונות לרוחב ולשכב על השופכה ventrally (איור 3 l).
- אתמול, לקצור האונות הקדמיות, הגדול ביותר מבין הארבעה, על ידי חיתוך ומחיקת השופכה (איור 3 מ').
- לעבד את חתיכות רקמה על פי הצרכים ניסיוני. המשך בסעיף 4 היסטולוגיה, או סעיף 5 לתרבות ספרואיד.
4. האונה וזיהוי מורפולוגיה של Hematoxylin ושקופיות שהוכתמו אאוזין
- לתקן את רקמת הערמונית, להטביע אותו פרפין. להמשיך עם מכתימה את השקופיות ועם hematoxylin אאוזין (H & E) כדי להציג ולזהות הבדלים אונות הערמונית בהתבסס על היסטולוגיה, באמצעות המאפיינים המתוארים מאת אוליביירה ואח. 12 (איור 5).
5. עיבוד הרקמה תרבות 3D10
הערה: מודגש ב איור 6.
- להמשיך עם culturing האונות כל הערמונית או בודדים לפי הצרכים ניסיוני. להעביר את רקמת הערמונית צלחת 10 ס"מ המכילה 2-3 מ"ל של DMEM. עם איזמל, מינצ את בקוריאנית הערמונית דק, אחיד ככל האפשר תחת המיקרוסקופ לנתיחה.
- המשך הפעולות הנותרות תחת ברדס תרביות רקמה, בתנאים סטריליים.
- להעביר את חתיכות רקמה יחד עם DMEM צינור 15 מ"ל, להגביר את עוצמת 9 מ עם DMEM. להוסיף 1 מ"ל של פתרון מניות collagenase x 10 DMEM-רקמה תערובת של מערבולת לערבב.
הערה: פתרון מניות Collagenase הוא 10 מ"ג/מ"ל במדיום המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI), הריכוז הסופי בצינור 15 מ"ל הוא 1 מ"ג/מ"ל. - הנח את השפופרת על מטרף gyratory או צינור מסובב עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס, עבור collagenase לבזות את מטריצה חוץ-תאית.
- Centrifuge את הצינור ב 400 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend ב 2 מיליליטר חמים 0.05% טריפסין-EDTA כדי לבקע את התא-התא, התא-מטריקס ההדבקויות. העברת הצינור 37 º C למשך 5 דקות.
הערה: אם חתיכות רקמה הם גדולים מדי כדי לערבב היטב, לחתוך את הטיפ פיפטה עם סכין גילוח כדי להפוך משעמם רחב יותר. - לשבור את כל הגושים רקמות על ידי pipetting עם פיפטה P1000 8 - 10 פעמים, ואז חוזרים עם פיפטה P200.
- לנטרל את טריפסין עם 3 מ של DMEM מלאה. להוסיף 500 U של DNAase לערבב טוב ואני.
- עוברים דרך מזרק 5 מ ל 5 - 10 פעמים עם מחט 18 גרם. ואז עוברים 5 פעמים עם מחט 20 גרם.
- חזור על שלבים 4-8 עוד פעם אם הפתרון עדיין מכיל חתיכות רקמה גדול.
- מסנן התליה תא דרך מסנן μm 40 להנחה על שפופרת 50 מ. שטוף הצינורית 15 מ"ל עם 5 מ של DMEM, עוברים אותו מסנן. חזור על רינס.
- למחוק את המסנן, centrifuge את הצינור המכיל את הזרימה דרך ב 400 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
6. ציפוי ו Culturing התאים
- Resuspend בגדר ב- 0.5 מ של שלמה הערמונית אפיתל תא מדיום הגידול (PrEGM). לספור את צפיפות התאים באמצעות תא מונה או hemocytometer, לדלל את התאים 5 x 105 תאים/מ ב- PrEGM מלאה.
הערה: התשואה של הערמונית כל העכבר בת 3 חודשים יכול לנוע בין 3 x 105-106 תאים. לפיכך, חשוב תחילה resuspend בגדר בתוך לא יותר מ- 0.5 מ"ל של PrEGM (כאמור לעיל) כך הצפיפות תא הרצויה תושג, אפילו עם תשואה נמוכה. - לערבב הנפח הנדרש של תאים עם קרום המרתף ECM יחס נפח (קרום המרתף 60% ECM ו- 40% תא השעיה) 2:3, צלחת צלחת רב טוב או שקופיות קאמרית לפי הצרכים ניסיוני.
הערה: עבור immunostaining, צלחת על לוחות זכוכית או שקופיות קאמרית, מכסה את כל טוב או האמצעי של הבאר. צלחת סביב שפת הבאר, אם סופרים את organoids וכתוצאה מכך, או צלחת וכן מספר טיפות על הבאר אם ציפוי אחסון גבוהה יותר. להיות קשובה לא להפיץ את זה עבה מדי, או רזה. צלחת µL לפחות 100 של מטריקס-תא תערובת לכל 1 ס מ2 של ציפוי באזור; לדוגמה, בשקופית קאמרית עם 2 ס מ2-טוב על פני השטח באזור, צריך להיות מצופה µL 200 של מטריקס-תא תערובת המכילה 5 x 104 תאים. - להעביר את הצלחת/השקופית חממה 37 ° C עם 5% CO2 למשך 30 דקות לקבלת קרום המרתף ECM לגבש. לאחר מכן, להוסיף PrEGM מלאה ומחוממת מראש כדי לכסות את הבאר, דואגת שלא להפריע את התקע קרום המרתף ECM.
- להסיר את מחצית התקשורת והוסף מדיה טריים כל 2-3 ימים. לגדול spheroids במשך 5-10 ימים.
- להמשיך עם הקטיף (שלב 7), immunostaining (שלב 8), ו/או הדמיה עבור יישומים במורד הזרם.
7. אקצור את הכדורים
- הקציר הספירות, תשאף התקשורת בזהירות מבלי להפריע את התקע ג'ל קרום המרתף ECM ולהוסיף 1 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל dispase פתרון ב- PrEGM לכל µL 100 של קרום המרתף ECM.
הערה: קל יותר למסוק spheroids אם הם נמצאים מצופה באמצע לבאר או החישוק (במקום מכסה הבאר שלם), על מנת להבטיח כי ניתן להוסיף כמות מספקת של הפתרון dispase הבאר. - לגרד את תחתית הצלחת עם המגרד תא כדי להמריא את הג'ל קרום המרתף ECM בתוך תמיסת dispase-PrEGM.
- פיפטה הפתרון כולו הלוך ושוב פעם עם רחב נשא 1000 µL פיפטה עצה או פיפטה 5 מ"ל כדי לשבור את התקע ג'ל לחתיכות קטנות יותר.
הערה: חותכים את קצה טיפ פיפטה 1000 µL עם סכין גילוח כדי להפוך טיפ נשא רחב. - דגירה ב חממה 37 ° C עם 5% CO2 עבור h 1-2 עד קרום המרתף ECM יש התפרקה לחלוטין.
הערה: זה יכול להיות שמחייבות בדיקה ויזואלית של התחתון טוב תוך כדי הטיית הלוח כדי לאשר כי אין עוד גושי ג'ל יישארו. - לאסוף את התליה תא צינור חרוטי 15 מ"ל.
- צנטריפוגה הספירות ב 250 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, להמשיך עם יישומים במורד הזרם.
8. Immunostaining של ספירות13
הערה: לאחר spheroids גדלו את הסכום הרצוי של זמן, יכול להיות מומס קרום המרתף ECM, יכול להיות מוכתם הספירות כפי שמתואר Colicino. et al. 13.
- בקצרה, יש לשטוף את התרבויות עם PBS ולהוסיף 4% paraformaldehyde (PFA) ישירות התקע ג'ל קרום המרתף ECM. תקופת דגירה של 30-90 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטולים איטי, עד קרום המרתף ECM מפורקת לחלוטין, החלפת PFA טריים בכל 30 דקות.
הערה: מחברים לפזר את התקע ג'ל ולתקן את spheroids בתהליך זה. - לאחר מכן, לשטוף עם PBS 3 פעמים ולהוסיף 50 מ מ אמוניום כלוריד 10 דקות להרוות את כל autofluorescence של מחברים. חזור על 3 מנקי עם PBS.
- Permeabilize עם חומר ניקוי ללא יונית 0.1% עבור 5 דקות של רחוב עם PBSAT (PBS, BSA 1%, 0.5% טריטון X-100) למשך 30 דקות.
- דגירה עם נוגדן ראשוני ב- PBSAT בין לילה ב 4 ° C, ואחריו 3 מנקי ועם PBSAT של נוגדנים משניים ב- PBSAT עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
- חזור על שוטף עם PBSAT ו הכתם עם דאפי לפי הנוהל של היצרן, אם רצונך בכך. רחץ פי 3 או יותר עם PBS.
- הוסף PBS עם 200 מ"מ אוקטן (DABCO) 1, 4-diazabicyclo [2.2.2] ריאגנט antifade והמשך הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
האונות הערמונית העכבר ניתן לזהות, גזור באמצעות את מיקומם ביחס vesicles הזרע של השופכה. הערמונית עכבר מורכב 4 זוגות של האונות הממוקם dorsally, ventrally שלפוחית הזרע, השופכה. איור 4a , 4b (למעלה) מראים את הגבי ותצוגת הגחון של הערמונית ללא פגע, יחד עם שלפוחית הזרע ו השופכה. הלוחות התחתון (איור 4 c ו- 4 d) מראים האונות שונים המתוארים לצורך זיהוי. ניתן להפריד בין האונות של עכברים צעיר כמו 3 חודשים.
האונות הערמונית שונים נבדלים באופן משמעותי היסטולוגיה (איור 5). אונות הערמונית כל של העכבר מורכבים מספר פרופילים בלוטת המורכב של לומן מוקף על ידי תאים אפיתל הפרשה; עם זאת, הצורה של האונות, ארגון של תאים, והטבע של ההפרשה משתנים lobe אונה. מאפיינים מזהים מ H & E שהוכתמו העכבר ערמונית יש כבר שתואר בצורה יעילה על ידי אוליביירה. et al. 12, בקצרה שמפורטות כאן. האונות הקדמיות יש acini בינוני וגדולים עם infoldings תכופים והפרשת דלקת חריפה. אונות הגבי מופיעים הקדמי עם הפרשת אאוזינופילית אבל acini קטן הרבה יותר ויש פחות infoldings. אונות לרוחב יש acini קטנים עד גדולים, עם גבולות שטוחים luminal האופייני של הפרשת אאוזינופילית. אונות הגחון מבנית כמו אונות לרוחב, גם עם גבולות שטוחים luminal, אבל יש ייחודי חיוור-דלקת luminal הפרשה.
תאי הערמונית עכבר יכול להיות תרבותי כמו spheroids ב קרום המרתף ECM, מייצגים מאפיינים כמו אפיתל. מודגש כמו שרטוט ב איור 6. התאים הם בודדו אותנו מהמתרחש הערמונית עכבר כמתואר לעיל, בתרבית בתוך קרום המרתף ECM. התאים הם מתחילים לגדול לתוך organoids ב מוקדם ככל 4 ימים של תרבות איור 7 (למעלה) מציג את השדות נציג מתרבויות בן יום-8 מראה organoids את קרום המרתף ECM. תחת התנאים הנ ל תרבות, רוב התאים לגדול לתוך ספירות מוצק, עם שבר שיש של לומן חלקיים או מלאים מבפנים. Organoids אלה יש בדרך כלל של מורפולוגיה אפילו כדורית. Organoids נקטפו, immunostained כפי שמתואר Colicino. et al. 13. איור 7 (פאנל התחתונה) מראה של תא צורב ללא של לומן (משמאל) ועם של לומן (מימין), ויטראז'ים עם phalloidin (F-אקטין מרקר, ירוק), דאפי (גרעין, כחול). Β-catenin הוא סמן אדהזיה תא-תא הביע חריפה-תא-תא ממשקים בתאי אפיתל. איור 8 מדגים חזקה β-catenin מכתים (ירוק) בצמתים תא-תא ב spheroids זה לשפה משותפת עם F-אקטין (אדום). Spheroids אקספרס גם cytokeratin 5, cytokeratin 8, p63 ו אנדרוגן קולטן חלבונים, אשר מספקים ראיות spheroids נגזרות אכן לתאים שמקורם הערמונית10.
איור 1: תרשים זרימה סכמטית הוכחת דיסקציה של מערכת השתן העכבר ובידוד של הערמונית. תרשים זרימה עבור פרוטוקול השלבים המתוארים סעיפים 1-2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ניתוח של העכבר UGS. תמונות שלב אחר שלב של ניתוח UGS של עכבר בת 3 חודשים: (ו- b) ביצוע החתכים, (ג-ה) מושך בחזרה את העור כדי לחשוף את אזור הבטן, הסטה (נ) המעיים, (g) להעביר את השמן קיבוע, (h ואני) מחלץ את UGS מהמקום חלל הבטן, (j) UGS שחולץ, (k) UGS שחולץ עם השונה איברים ורקמות המסומנים כדלקמן: SV (צהוב) = vesicles הזרע; P (אדום) = הערמונית; F (סגול) = שומן; V (תכלת) = צינור הזרע; ו- B (ירוק) = שלפוחית השתן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח של בלוטת הערמונית עכבר. תמונות שלב אחר שלב עבור ניתוח הערמונית עכבר מ- UGS: (א) הסרת שומן, (ב) הסרת על שלפוחית השתן, (ג) הסרת את צינור הזרע, תצוגה הגחון (ד) של הערמונית עם השופכה, תצוגה הגבי (e) של הערמונית עם השופכה, (f-h) הסרת שלפוחית הזרע, (i) נוף הגחון (j) ערמונית, לנתח האונה הגבי, (k) לנתח של האונה לרוחב, לנתח (l) האונה הגחון, (ז) לנתח של אונה קדמית, (n) הערמונית ביתור אונות: קדמי = AP, הגבי = DP, לרוחב = LP ו הגחון = סמנכ ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: אנטומיה של האונות הערמונית עכבר. תמונות נציג מכל עכבר בת 3 חודשים UGS לאחר ההסרה של שומן, שלפוחית השתן, צינור הזרע. תמונות להראות אונות הערמונית עם שלפוחית הזרע, השופכה, עם הגבי (ו- c) ונוף הגחוני / (b ו- d). טופ לוחות (ו- b) מציגים תמונות ללא פגע, בעוד התחתון (c ו- d) מראות האונות במיתאר כחול (הגבי), צהוב (קדמי), אדום (הגחוני /) וירוק (לרוחב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: האונות הערמונית שונים נבדלים באופן משמעותי היסטולוגיה. כאן הוא H & תמונה כל הערמונית שהוכתמו E מציג שלפוחית הזרע, השופכה, האונות הערמונית ארבע. אונות יוקפו בקו הכתום (קדמי), ירוק (הגבי), כחול (לרוחב) ושחור (הגחוני /). שיבוץ: להחליפן בתמונות של כל אונה, נלקח תחת מטרה 10 x. סרגל קנה מידה מייצג 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: זרימה סכמטית הוכחת העיכול של בלוטת ערמונית ותרבויות ספרואיד עוקבות. תרשים זרימה עבור פרוטוקול השלבים המתוארים בסעיפים 5 ו- 6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: תאי הערמונית תגדל אפילו כדורי spheroids עם או בלי של לומן. רקמת הערמונית שנקטפו עכבר בת 3 חודשים פראי-סוג היה תרבותי לפי הפרוטוקול. תרבויות היו עם תמונה על צלחת imager תחת יעד X 4, על פוסט-תרבות 8 ימים, מציג את היווצרות spheroids (למעלה). Spheroids שנקטפו, צבעונית כמפורט בפרוטוקול עם פלורסנט מצומדת לצבוע phalloidin F-אקטין (ירוק), דאפי עבור גרעינים (כחול), ואז עם תמונה על ספינינג דיסק מיקרוסקופ קונפוקלי תחת 40 X מים אובייקטיבי (למטה). ספרואיד מימין מראה עדויות לומן. סולם העמודות מייצגות 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: organoids הערמונית העכבר הראה לוקליזציה מהחיבור של β-catenin. Spheroids שנקטפו מתרבויות 3D בן יום-6 היו מוכתמים, באמצעות של נוגדן ראשוני נגד β-catenin של פלורסנט מצומדת צבע משני נוגדן, עם תמונה על ספינינג דיסק מיקרוסקופ קונפוקלי תחת 40 X מים המטרה. להחליפן בתמונות להראות immunostaining עבור β-catenin (ירוק, שמאל), F-אקטין (אדום, האמצעי), ודאפי (כחול). בחלונית ' נכון ' מציגה את כל הערוצים 3 התמזגה. סרגל קנה מידה מייצג 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר שיטות ניתוח הערמונית עכבר וזיהוי של האונות נפרדות. תיאר גם הוא הפרוטוקול עבור culturing בתאי הערמונית עכבר תרבות 3D לניתוח במבחנה .
שלב קריטי בפרוטוקול הקרע הוא (1) לקצור את UGS כולו מתוך העכבר הפרדת האיברים בודדים מתחת למיקרוסקופ לנתיחה. רקמת הערמונית הוא מאוד קטן, מוקף על ידי שאר UGS; לכן, זה כמעט בלתי אפשרי לקצור את האיבר ישירות מחלל הגוף תוך ברכישת כל ארבעה זוגות של אונות ללא פגע. לפיכך, חשוב לקצור את UGS כל של העכבר ולאחר מכן המשך כדי לחלץ את הערמונית. חשוב גם בפרוטוקול זה (2) לבצע את השלבים במועד אך נשארים מוקפד. הזמן הוא העיקר במהלך ניתוח על מנת למזער את רקמת השפלה. הטכניקה ספציפיים המתוארים כאן עבור חילוץ UGS את העכבר מהר יותר לעומת חלופות והיא מאוד מומלצת. ההליך הבידוד כולה, דיסקציה של האונה בדרך כלל לוקח 35-40 דקות, אשר ניתן להוריד עד 25 דקות עם להתאמן יותר. החלק המאתגר ביותר של הקרע מנקה את השומן המקיף את UGS, אשר תופס חלק גדול מהזמן הכולל ניתוח. השומן יש להסיר בקפידה כדי לוודא כי לא נותר עם הערמונית, אך, חשוב להיזהר מאוד לא תאבד בשוגג כל רקמת הערמונית בתהליך. עוד צעד קריטי הוא (3) לא להסיר את השופכה לפני הפרדה בין האונות הערמונית. השופכה טפסים למעשה את הבסיס על כל אילו ארבעה זוגות של הערמונית אונות מסודרים. . זה הכי קל לזהות האונות אם הם מחוברים עדיין השופכה, בהתבסס על התפלגות המרחבי שלהם ביחס השופכה.
שלב קריטי בפרוטוקול תרבות ספרואיד הוא (1) הא הרקמה. טוב. הא את רקמת הערמונית עם איזמל היא צעד מייגע, במיוחד מאז רקמת הערמונית יש אופי דביק. עם זאת, לקמץ קטן ככל האפשר הרקמה חיוני להשגת תשואה מקסימלית. צעד חיוני נוסף הוא pipetting אחרי trypsinization (2), עובר דרך מזרקים של הגודל שצוין post-neutralization. בשני שלבים אלה חייבים להיות שבוצעה כהלכה, חוזר על עצמו, אם נדרש, כדי להשיג תשואה אופטימלית בתא. בסופו של דבר, זה חשוב (3) אל צלחת קרום המרתף ECM עבה מדי, או רזה. אם קרום המרתף ECM הוא מצופה דלילה מדי (כלומר- פחות מ- 100 של µL ס מ2), התאים לא יגדלו לתוך organoids תקין באמצע הבאר, שבו הג'ל יהיה הדק. ציפוי זה עבה מדי (כלומר., יותר מ 250 של µL ס מ2) יביא ECM קרום המרתף לא שהשרף מתהווה כראוי, להתקלף במהלך שינויים מדיה. ציפוי באמצע הבאר יעזור להשיג ביותר אפילו ג'ל עובי.
הפרוטוקול המתואר יכול להיות שונה במקצת בהתאם לצרכים ניסיוני. הטכניקה לצורך הוצאת UGS של חלל הבטן דורש אחיזה חזקה על שלפוחית השתן עם מלקחיים. למקרה שלפוחית השתן מלא מדי, זה חשוב כדי לרוקן את שלפוחית השתן בעזרת מזרק 1 מ"ל ורזה (26 גרם או דומה) המחט, כדי להבטיח אחיזה נכונה לפני שמתחילים לחלץ את הרקמה. הרקמה צריך להישמר לח עם PBS או DMEM לאורך כל התהליך לנתיחה. השימוש DMEM הוא המועדף אם הרקמה הולך לשמש ספרואיד תרבויות. התליה תא שנקטפו ניתן למיין לפי cytometry זרימה כדי לבודד תת אוכלוסיות של תאי לפני ציפוי, אם רצונך בכך, כפי שתואר על ידי Lukacs et al. 10.
מאפייני היסטולוגית של האונות הערמונית שונים המחולקות ב פרוטוקול זה, אמור להיות מסוגל לזהות את האונות ברקמת הערמונית בריא לפי ההנחיות הבאות. עם זאת, ישנן הגבלות מסוימות של התהליך. במקרים של היפרפלזיה או גידולים אגרסיביים, המורפולוגיה אפיתל משובשת, דבר שעלול לגרום באופן משמעותי יותר קשה להבחין בין האונות בהתבסס על H & E ההכתמה. במקרים כאלה, הפרדה בין האונות (כמתואר ב פרוטוקול זה) לפני הטבעה, צביעת הכרחי אם מידע ספציפי באונה נחוצה. אפילו ברקמה בריאה, יש לעיתים קרובות צורך לנתח אונות בנפרד מאז הם מציגים השתנות רחב אנטומיה, היסטולוגיה, יש ביטוי דיפרנציאלי חתימות6. עם זאת, הרלוונטיות translational הפרדת אונות עם העכבר הערמונית יכול להיות ויכוח, מאז הערמונית האנושי אינו מחולק אונות. למרות זאת, העכבר נשאר המודל הטוב ביותר ללמוד PCa ויוו, מספר מודלים העכבר היה מפותח14,15. שיטת תרבות 3D במיוחד היא טכניקה מפתח יכול לשמש כדי לחקור מנגנונים של המחלה. עם זאת, קודם של השיטה תרבות ספרואיד נובע הדפוס ביטוי דיפרנציאלי של probasin, אשר הוא האמרגן נפוץ עבור Cre recombinase סרטן הערמונית עכבר דגמים. האמרגן probasin מופעלת בעיקר תאים luminal וביניים אך לא התאים הבזליים7. תרבות בתנאים המתוארים כאן לקדם היווצרות ספרואיד בעיקר מן התאים הבזליים ו ביניים, אך לא מן התאים luminal10. לפיכך, התרבויות וכתוצאה מכך בעצם לייצר תערובת של Cre-להביע ולבטא ללא-Cre spheroids (כלומר., תערובת של spheroids הנוק-אאוט ובקרה). כתוצאה מכך, במהלך הניתוח, חשוב immunostain עבור החלבון עניין כדי לזהות את הנוק-אאוט organoids ולהסיק מסקנות על התנהגות תא צורב בהתבסס על ג'ין טוק-outs.
המשמעות של שיטות אלה טמון היישומים ומגובש של שימוש GEMMs במחקרים סרטן הערמונית. שיטת ניתוח תיאר מפורט הצעדים אשר יאפשר לחוקרים תמצית בלוטת ערמונית מהר יותר וביעילות רבה יותר. הרצף של תהליך חיתוך נועד להבטיח כי אונות בודדים יכול להיות מזוהה, חילוץ הקבצים, אפילו על ידי אלה עם ניסיון מינימלי בניתוח הערמונית. שיטת תרבות בקווים כלליים ניתן לנתח עוד מודלים GEMM של סרטן הערמונית. התנאים תרבות צריכה לאפשר צמיחה והישרדות של תאי הגידול ובקרה. מניסיוננו, אנו משתמשים בהצלחה ערמונית GEMM כי התערוכה mPIN16. העכבר ערמונית עם גידולים כיתה גבוהה יותר גם שימשו ספרואיד תרבות ניתוח17. Spheroids העכבר הבקרה בנספח של מורפולוגיה אפילו כדורית; עם זאת, spheroids שמקורם תאים סרטניים הערמונית עלול להפגין הבדלים מורפולוגיה והתנהגות בשל הפוטנציאל שלהם אמצעים. לפיכך, לומד תא צורב התנהגות במבחנה תספק מורחבת של לבדוק את המאפיינים של תאים אלה, ואולי גם תצפיות על התנהגות ספרואיד בזמן אמת באמצעות הדמיה לחיות תאים.
לסיכום, ניתוח הערמונית ופעולות תרבות שמתואר פרוטוקול זה ניתן לשלב סוגים שונים של מחקרים שכללו GEMMs להמשיך ולספק מידע על סרטן הערמונית בכל היישומים במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המענק מ מכון הסרטן הלאומי, R01CA161018 לדבר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
- Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
- Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Society, A. C. Cancer Facts and Figures. , (2018).
- Shappell, S. B., et al. Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).
- Hofner, T., et al. Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin. Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Clarke, M. F., Fuller, M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Colicino, E. G., et al. Gravin regulates centrosome function through PLK1. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).
- Ittmann, M., et al. Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O. Mouse models of prostate cancer. Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).
- Xiong, X., et al. Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice. Oncogenesis. 1, e26 (2012).
- Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells. Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).
