Summary
基因工程鼠是研究前列腺癌机制的有用模型。在这里, 我们提出了一个协议, 以识别和解剖小鼠泌尿生殖系统前列腺裂片, 区分他们的组织学, 并分离和培养的原发性前列腺细胞体外作为球体的下游分析。
Abstract
基因工程鼠模型 (GEMMs) 是研究大多数类型的人癌症, 包括前列腺癌 (PCa) 的有效的前临床模型。了解小鼠前列腺的解剖和组织学, 对于有效使用和正确描述这种动物模型是很重要的。小鼠前列腺有四不同的裂片, 各有各自的特点。本文对小鼠前列腺叶的解剖和鉴定方法进行了分析。解剖后, 前列腺细胞可以进一步培养,在体外为机械的理解。由于小鼠前列腺原代细胞在体外培养时往往失去正常的特征, 我们在此概述了一种分离细胞并将其生长为3D 球形培养的方法, 这对保持生理细胞的特征。这些3D 文化可用于分析近生理条件下的细胞形态和行为, 调查在疾病发展和进展过程中所涉及的关键蛋白质和通路的变化水平和定位, 并观察对药物治疗的反应。
Introduction
科学界一直在试图阐明几十年来人类癌症发展的复杂机制。虽然潜在的关键参与者和药物靶点的识别始于患者细胞和组织研究, 但这种发现的转化应用往往需要使用临床前动物模型。自从建立了人类癌症联盟 (MMHCC) 的老鼠模型, 一个试图描述和统一小鼠癌症特征的委员会以来, 利用基因工程小鼠模型 (GEMMs) 来建模人类癌症的模型已经稳步上升。模型为全世界科学家1,2。老鼠模型满足了机械研究的需要, 在临床前研究的大多数类型的癌症, 了解的发展, 进展, 反应治疗和后天抵抗3。
前列腺癌是男性最常见的癌症, 影响超过16万人, 每年4。这种疾病的侵袭性形式每年要求数以万计的生命。然而, 疾病进展的机制仍然是不清楚的。这导致严重缺乏有效的治疗方案的晚期和转移性前列腺癌, 这证明了高死亡率的高级前列腺癌患者4。因此, 研究前列腺癌的临床前模型越来越需要。然而, 由于老鼠和人前列腺之间的内在差异, GEMMs 的前列腺癌的建模直到2004年引入了酒吧港口分类系统, 才获得普及, 其中概述了小鼠的组织病理学变化。前列腺在基因操作, 肿瘤变化的鉴定和他们的关系到癌症进展的阶段在人5。在研究任何前列腺 GEMM 模型时, 必须考虑到小鼠前列腺的一个重要特征, 那就是存在四种截然不同的裂片: 前、侧、腹和背。叶在组织病理学和基因表达模式上存在显著差异6。Probasin 蛋白表达模式可以不同的裂片之间的年轻后青春期小鼠7, 这必须考虑, 因为基于 GEMM 模型主要是设计使用一个 Probasin 的助剂称为 Pb-Cre47。由此产生的空间和时间差异, 在创新表达往往导致差异的肿瘤启动和进展时限, 以及差异的癌症变化之间的裂片。因此, 在研究前列腺 GEMMs 肿瘤的发展时, 必须考虑到这种差异, 而个别的裂片可能需要单独评估以获得可重现的结果。本文的第一部分介绍了解剖小鼠前列腺的正确方法, 识别和分离每个裂片, 并识别出裂片之间的组织学差异。
而肿瘤生长和组织病理学的分析可以为肿瘤的发展提供有价值的见解, 但并没有提供关于分子机制的大量信息。为了研究肿瘤的发展和进展机制, 对肿瘤细胞的体外分析往往是有益的。多年来, 有几种方法涉及这些细胞的文化, 包括悬浮培养, 3D 文化8和最近, 正规2D 文化9。虽然这些方法中的大多数导致细胞存活率和增殖率很好, 但3D 的文化提供了一个最接近生理条件的环境。在基底膜细胞外基质 (ECM) 中生长的3D 或球形培养中, 完全分化的腔内细胞通常具有极低的生存率;然而, 基底和中间细胞 (主要是干细胞) 能够繁殖和产生细胞簇称为球体10。这使得它适合于癌症研究, 因为上皮癌被认为是来源于干细胞 (俗称癌症干细胞)11。本议定书的第二部分描述了在3D 培养中培养小鼠前列腺细胞的方法。所产生的球体可用于几种下游分析, 包括通过活细胞成像、免疫荧光染色、不同蛋白的 organoid 形态学和行为研究, 以及对化疗反应的研究。治疗。
总体而言, 本协议的目标是通过描述小鼠前列腺的解剖和解剖技术以及球形培养的组织处理和体外分析, 勾勒出在前列腺癌中使用小鼠模型的最佳方法。.
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Protocol
这里描述的所有鼠标实验都是根据 IACUC 州立大学北部医学院的机构批准的协议中所概述的指导原则进行的。
1. 泌尿生殖系统 (UGS) 解剖
注意: 示意图显示在图 1中。
- 弄死3月大的雄性 C57BL/6 鼠使用2吸入安乐死方法或另一种批准的技术。
注: 在3岁至12月之间的老鼠可以成功地用于实验。年长的老鼠 (> 6 月) 最有可能在 UGS 周围有更多的脂肪, 这将需要清除。在小于3月的小鼠中, 叶的鉴别和分离往往是困难的。其他菌株也可用于实验。 - 将鼠标放在背部, 用别针固定腿, 使动物的腹侧暴露。
- 在老鼠的腹部喷洒70% 乙醇, 擦拭干净。
注意: 不需要在解剖前剃掉腹部毛发。 - 从腹部抬起皮肤, 连同肌肉层, 用一对中等钝钳, 用剪刀在腹部上做一个倒置的 Y 形切口。
- 首先, 用一把锋利的剪刀从小弟弟上方到胸骨上做一个直切口 (图 2a)。
- 从切口的底部切向每个脚趾, 直至大腿 (图 2b)。折叠背部两侧和底部的皮肤查看整个腹部区域 (图 2c-e)。
注意: 切割尺寸的变化取决于鼠标的年龄和大小。初始直切口的大小可能从1.5 到4厘米不等, 这取决于鼠标的大小。
- 移过其他器官以暴露 UGS。提起并移动棕色黄色的肠道 (图 2f)。用镊子拿起腹部脂肪垫 (不透明的白色海绵组织) 并将其移动到两侧 (图 2g)。
注: UGS 包括精囊、尿道、前列腺、输精管 (输精管) 和膀胱。它可以识别的特点对不透明的白色半圆拱 (即精囊), 与液体填充膀胱囊附着在基地。位于精囊下的半透明组织为前列腺。 - 定位 UGS, 用钝钳牢牢地抓住膀胱, 从小鼠腹部向上提起整个 UGS。
注: 如果膀胱已满, 先用小注射器将其排出, 以提供更好的抓钳和减少膀胱破裂的危险。 - 继续拉上膀胱, 在膀胱和前列腺下面滑动一把剪刀到脊柱, 并作出削减。切断与腹腔的任何剩余连接 (图 2h和2i)。小心不要切断太靠近 UGS, 以避免意外切割通过任何前列腺组织。
注: 在 UGS 下进行切割时, 剪刀应插入到鼠标的后端, 这样切口也会对椎体柱进行切割。这种方法的结果是切断几乎所有的连接之间的 UGS 和腹腔在一个剪, 减少了需要的时间, 从老鼠提取的组织。 - 移除 UGS 并将其放在2-6 毫升 (足以覆盖组织) 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 或 Dulbecco 的修饰鹰培养基 (DMEM, 高葡萄糖) 在6厘米培养皿 (图 2j和2k), 并将其移动到解剖显微镜 (10X放大)。
注意: 根据需要在其余步骤中更改解剖介质。
2. 解剖前列腺
- 用一对细钳和显微切割剪刀清除背部和腹侧两侧的脂肪 (图 3a)。在解剖协议的其余部分使用类似的手术器械。
注: 脂肪通常与 UGS 紧密交织 (可由其白色海绵状外观识别);因此, 这一步骤必须小心地执行, 以避免意外地切断任何前列腺组织。清除所有的脂肪可能需要10-15 分钟。 - 用镊子按住并拔出膀胱, 用剪刀将其剪下 (图 3b)。
- 将其余的组织腹侧放置。用镊子按住一输精管, 用剪刀把它追踪到底座上, 剪掉 (图 3c), 然后在另一侧重复。切除输精管, 现在留下前列腺 (半透明和 verminous), 精囊 (不透明和白色, 半圆) 和尿道 (粉红色-红色和不透明管) (图 3d和3e)。
- 在精囊内拱与前列腺组织前叶之间插入镊子。撬除精囊和前列腺, 并根据需要剪去任何结缔组织 (图 3f)。在尿道中追踪精囊, 并取出它们 (图 3g和3h)。小心不要刺穿他们。
- 开始解剖个别的前列腺裂片。
3. 前列腺及个别裂片显微解剖 (图 3 i.)
- 用一对钝钳翻转组织, 使背部侧面朝上, 显示背叶, 这将像蝴蝶的翅膀。
- 用剪刀把耳垂和钳夹在底座上收集背叶 (图 3j)。
- 将剩余的组织翻转到腹侧。
- 收集的侧面裂片, 这是小的, 通常包在一侧的尿道, 这是楔形之间的前, 腹, 和背叶 (图 3k)。
- 接下来, 收集腹叶, 这是大于侧面裂片和躺在尿道腹部 (图 3l)。
- 最后, 通过切割和丢弃尿道 (图 3m), 收获前叶, 最大的四。
- 根据实验需要处理组织件。进入4节进行组织学, 或5节的球体培养。
4. 由苏木精和红红染色的幻灯片的裂片鉴定和形态学
- 修复前列腺组织并将其嵌入石蜡切片。用苏木精和伊红 (H & E) 进行染色, 根据奥利维拉的特点, 根据组织学观察和鉴别前列腺裂片的差异. 12 (图 5)。
5. 加工3D 培养的组织10
注:图 6中概述了这一点。
- 根据实验需要, 进行整个前列腺或单个裂片的培养。将前列腺组织转移到含有2-3 毫升 DMEM 的10厘米皿中。用手术刀, 在解剖显微镜下, 尽可能细和均匀地将前列腺小管切碎。
- 在无菌条件下, 在组织培养罩下继续余下的步骤。
- 将组织件连同 DMEM 转移到15毫升管, 并将 DMEM 的体积增加到9毫升。加入1毫升的10x 胶原酶溶液, DMEM 组织混合物和涡流混合。
注: 胶原酶的溶液是10毫克/毫升在罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 培养基, 最后集中在15毫升管是1毫克/毫升。 - 将管放在旋转振动筛或管转子上2小时, 在37摄氏度, 用于胶原酶降解细胞外基质。
- 在室温下离心管在 400 x g 处5分钟。
- 在2毫升的温0.05% 胰蛋白酶-EDTA 中去掉上清和并用重悬, 以切割细胞细胞和细胞基质粘连。把管子转到37摄氏度, 5 分钟。
注: 如果组织块太大, 不能混合好, 用剃刀刀片切开吸管尖端, 使其更宽的孔。 - 用一 P1000 吸管将吹打的组织团簇分解8-10 次, 然后用 P200 吸管重复。
- 用3毫升完整的 DMEM 中和胰蛋白酶。添加 500 U 的 DNAase 和混合好。
- 通过一个5毫升注射器5-10 倍, 18 克针。然后用20克针穿过5次。
- 如果解决方案仍包含大的组织块, 请再次重复步骤4-8。
- 通过放置在50毫升管上的40微米过滤器过滤细胞悬浮。冲洗15毫升管与5毫升的 DMEM, 并通过相同的过滤器。重复冲洗。
- 在室温下, 丢弃过滤器和离心机, 该管包含流经在 400 x g 处的5分钟。
6. 细胞的电镀和培养
- 并用重悬0.5 毫升完全前列腺上皮细胞生长培养基 (PrEGM) 中的颗粒。使用细胞计数器或 hemocytometer 计数细胞密度, 并将细胞稀释至 5 x 105细胞/毫升, 完全 PrEGM。
注: 3 月大的老鼠全前列腺的产量可从 3 x 105-106细胞不等。因此, 重要的是最初并用重悬颗粒在不超过0.5 毫升的 PrEGM (如上所述), 以便达到所需的细胞密度, 即使低产量。 - 根据实验需要, 将所需的细胞与基底膜 ecm 在2:3 体积比 (60% 基底膜 ecm 和40% 细胞悬浮液) 和板在多孔板或室滑动中混合。
注: 用于染色, 板在玻璃底板或会议厅幻灯片, 覆盖整个井或中间的井。板块周围的井边如果计数产生的 organoids, 或板块作为几个水滴在井中, 如果电镀更高的容量。注意不要把它涂得太厚或太薄。板材至少100µL 的基质细胞混合物每1厘米2的电镀面积;例如, 在具有2厘米2井表面积的腔内滑动中, 应镀上200µL, 其中含有 5 x 104细胞的基质细胞混合物。 - 将板/滑块转移到一个37°c 孵化器与 5% CO2为30分钟为地下室膜 ECM 巩固。然后, 添加预热完整的 PrEGM 盖好, 注意不要打扰地下室膜 ECM 插头。
- 删除一半的媒体, 并添加新鲜的媒体每2-3 天。长球体5-10 天。
- 继续收割 (步骤 7), 染色 (步骤 8), 和/或成像的下游应用。
7. 收割球体
- 要收获球体, 小心地吸入介质, 而不干扰基底膜 ecm 凝胶插头, 并在基底膜 ecm PrEGM 每100µL 中加入1毫升的1毫克/毫升酶溶液。
注: 如果在井边或边缘 (而不是覆盖整个井) 中镀球体, 以确保能将足够数量的酶溶液添加到井中, 就更容易收获。 - 用细胞刮板刮下底板, 将基底膜 ECM 凝胶酶-PrEGM 溶液中。
- 用宽口径1000µL 吸管尖或5毫升吸管将整个溶液一次上下移一次, 将凝胶塞分解成较小的部分。
注: 用剃刀刀片切下1000µL 吸管尖端的尖端, 使之成为宽口径的尖端。 - 孵化在一个37°c 孵化器与 5% CO2 1-2 小时, 直到地下室膜 ECM 完全溶解。
注意: 这可以通过目视检查井底, 同时倾斜板, 以确认没有更多的凝胶块保持。 - 在15毫升锥形管中收集细胞悬浮液。
- 离心机球体在室温下为 250 x 克5分钟, 并继续下游应用。
8. 球形的染色13
注: 球体在所需的时间内生长后, 基底膜 ECM 可以溶解, 球体可以被染色, 如 Colicino等所述。13。
- 简要地, 冲洗的文化与 PBS 和添加4% 多聚甲醛 (粉煤灰) 直接到地下室膜 ECM 凝胶插头。室温下孵育30-90 分钟, 缓慢晃动, 直到基底膜 ECM 完全溶解, 每30分钟更换新鲜的粉煤灰。
注: 在这个过程中, 粉煤灰会溶解凝胶插头并修复球体。 - 接下来, 用 PBS 清洗3次, 加入50毫米氯化铵10分钟, 从粉煤灰中淬火任何自体荧光。重复3与 PBS 清洗。
- Permeabilize 与0.1% 非离子洗涤剂5分钟和块与 PBSAT (PBS, 1% BSA, 0.5% 海卫 X-100) 为30分钟。
- 在 PBSAT 中以一夜间4摄氏度孵育一个主抗体, 其次是 3 PBSAT 和 PBSAT 中的二级抗体, 室温下为2小时。
- 如果需要, 按照制造商的协议, 重复清洗与 PBSAT 和染色 DAPI。用 PBS 清洗3次以上。
- 添加 PBS 与200毫米14杂双环 [2.2. 2] 辛烷 (DABCO) antifade 试剂, 并进行成像。
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Representative Results
小鼠前列腺裂片可以被辨认和解剖使用他们的位置关于精囊和尿道。小鼠前列腺由4对背和腹部的裂片组成, 用于精囊和尿道。图 4a和4b (顶部) 显示完整的前列腺的背部和腹部的看法, 连同精囊和尿道。底部的面板 (图 4c和4d) 显示了不同的裂片概述的标识。裂片可与小鼠分离3月。
不同的前列腺裂片在组织学上有显著差异 (图 5)。所有小鼠前列腺叶均由由分泌上皮细胞包围的腔组成的多腺体剖面组成;然而, 叶的形状, 细胞的组织, 和分泌物的性质是不同的从裂片到裂片。从 H & E 染色小鼠前列腺的识别特性得到了奥利维拉等的有效概述。12, 简要概述这里。前叶有中等到大腺泡细胞与频繁内褶和强烈嗜酸性细胞分泌。背叶看起来像前部嗜酸性细胞分泌物, 但有更小的腺泡细胞和较少的内褶。侧裂片有小到大腺泡细胞, 具特征扁平的腔内边界和嗜酸性的分泌物。腹叶的结构像侧裂片, 也有扁平的腔内边界, 但有一个独特的苍白非嗜酸性腔内分泌。
小鼠前列腺细胞可以培养为球体在基底膜 ECM 和表现上皮样特征。这在图 6中被概括为示意图。细胞与上述的小鼠前列腺隔绝, 在基底膜 ECM 中培养。早在4天的文化中, 细胞就开始成长为 organoids。图 7(顶部) 显示8天的传统文化的代表性领域显示 organoids 在地下室膜 ECM。在上述的文化条件下, 大多数细胞生长成固体球体, 其中一小部分有部分或全腔内。这些 organoids 通常有一个均匀的球形形态。Organoids 的收获和 immunostained 的描述 Colicino 等 。13.图 7 (底部面板) 显示一个 organoid 没有流明 (左) 和腔 (右), 染色与罗丹明 (F 肌动蛋白标记, 绿色) 和 DAPI (核, 蓝色)。β-连环是细胞细胞黏附标记强烈表达在细胞细胞界面在上皮细胞。图 8显示了强β-连环染色 (绿色) 在球体细胞结与 F 肌动蛋白 (红色) 共同本地化。球体还表达角蛋白 5, 角细胞 8, p63 和雄激素受体蛋白质, 这提供了证据表明, 球体确实来源于来自前列腺的细胞10。
图 1: 示意图演示了小鼠泌尿生殖系统解剖和前列腺的分离.1-2 节中描述的协议步骤的流程图。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 小鼠 UGS 的解剖.从3月大的鼠标 UGS 解剖中分步进行的图像: (a 和 b) 做切口, (c e) 拉回皮肤暴露腹部区域, (f) 转移肠道, (g) 移动腹部脂肪垫, (h 和 i) 从 UGS 提取腹腔, (j) 提取的 UGS, (k) 提取的 UGS 与不同的器官和组织标记如下: SV (黄) = 精囊;P (红色) = 前列腺;F (紫色) = 脂肪;V (浅蓝色) = 输精管;和 B (绿色) = 膀胱。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 小鼠前列腺的解剖.UGS 小鼠前列腺解剖的分步图像: (a) 除去脂肪, (b) 除去膀胱, (c) 切除输精管, (d) 前列腺与尿道的腹侧视野, (e) 前列腺与尿道的背侧视 (f h)除去精囊, (i) 前列腺的腹侧视野, (j) 解剖背叶, (k) 解剖侧裂片, (l) 解剖腹叶, (m) 解剖前叶, (n) 解剖的前列腺裂片: 前 = AP, 背部 = DP, 侧向 = LP和腹侧 = 副总裁。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 小鼠前列腺裂片的解剖.3月大的老鼠 UGS 后, 取出脂肪, 膀胱和输精管的代表性图像。图像显示有精囊和尿道的前列腺裂片, 背 (a 和 c) 和腹侧 (b 和 d) 视图。顶部面板 (a 和 b) 显示未接触的图像, 而底部面板 (c 和 d) 显示的裂片, 以蓝色 (背), 红色 (前), 黄色 (腹) 和绿色 (侧面)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 不同的前列腺裂片在组织学上有显著差异.这是一个 H & E 染色的全前列腺图像显示的精囊, 尿道和四前列腺裂片。裂片的轮廓为橙色 (前), 蓝色 (背部), 绿色 (侧面), 和黑色 (腹侧)。插图: 来自每个裂片的代表性图像, 根据10x 目标拍摄。缩放栏代表100µm.请点击这里查看这个数字的大版本。
图 6: 显示前列腺和随后球体文化消化的示意图.5和6节中描述的协议步骤的流程图。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 前列腺细胞生长成均匀的球形球体, 有或没有流明.从一只野生型3月大的老鼠身上收获的前列腺组织按照该协议培养。在4X 的目标下, 在8天后文化中, 在一个平板成像仪上拍摄了一些文化, 显示了球体 (顶端) 的形成。球体的收获和染色的协议中描述的荧光染料共轭罗丹明的 F 肌动蛋白 (绿色) 和 DAPI 的核 (蓝色), 然后在一个旋转磁盘共聚焦显微镜下成像40X 水目标 (底部)。右边的球体显示出流明的证据。刻度条代表50微米。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: 小鼠前列腺 organoids 显示连环的交界定位.从6天的3D 文化中收获的球体被染色, 使用的主要抗体对β-连环和荧光染料共轭二级抗体, 并在一个旋转盘共聚焦显微镜下的40X 水目标成像。有代表性的图像显示染色为β连环 (绿色, 左), F 肌动蛋白 (红色, 中间), 和 DAPI (蓝色)。右面板显示所有3通道已合并。刻度条代表20微米。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本文概述了小鼠前列腺的解剖方法和单个裂片的鉴定。还描述了在3D 培养中培养小鼠前列腺细胞的方法, 用于体外分析。
解剖协议的一个关键步骤是 (1) 从鼠标中采集整个 UGS, 并在解剖显微镜下分离各个器官。前列腺组织非常小, 周围的 UGS 的其余部分;因此, 在获取所有四对裂片完好无损的情况下, 从体腔直接收割器官几乎是不可能的。因此, 重要的是从老鼠身上收获整个 UGS, 然后开始提取前列腺。在本议定书中, (2) 及时执行这些步骤并保持细致是非常重要的。在解剖过程中, 时间是最基本的, 以减少组织的退化。此处描述的用于从鼠标中提取 UGS 的特定技术比替代方法更快, 并且非常推荐。整个解剖和裂片隔离程序通常采取35-40 分钟, 可以降低到25分钟, 以更多的实践。解剖的最具挑战性的部分是清理周围的脂肪 UGS, 占整个解剖时间的一个很大一部分。脂肪必须精心清除, 以确保没有任何它留在前列腺, 但重要的是要非常小心, 不要意外失去任何前列腺组织的过程中。另一关键步骤是 (3) 在分离前列腺裂片之前, 不要取出尿道。尿道基本上形成的基础上, 所有四对前列腺裂片的安排。它是最容易辨认的裂片, 如果他们仍然附有尿道, 根据他们的空间分布关于尿道。
球体培养协议的一个关键步骤是 (1) 切碎组织良好。用手术刀切碎前列腺组织是一个繁琐的步骤, 特别是因为前列腺组织有粘性的性质。然而, 切碎的组织尽可能小, 是必不可少的, 以获得最大的产量。另一重要步骤是 (2) 吹打后 trypsinization 和通过注射器的大小指定后中和。这两个步骤必须正确地执行和重复, 如果需要的话, 以达到最佳的细胞产量。最后, 重要的是 (3) 不要将基底膜电解质太厚或太薄。如果基底膜 ECM 镀得太薄 (i., 小于100µL/厘米2), 细胞将不会生长成适当的 organoids 在井中, 其中凝胶将是最薄的。电镀它太厚 (i., 超过250µL/厘米2) 将导致基底膜 ECM 没有正确固化, 并在介质变化过程中滑动。在井中间电镀将有助于达到最均匀的凝胶厚度。
所描述的协议可以根据实验需要稍加修改。从腹腔提取 UGS 的技术需要用镊子牢牢抓住膀胱。如果膀胱太饱, 重要的是用1毫升注射器和薄 (26G 或类似的) 针头排泄膀胱, 以确保在开始提取组织之前有适当的抓地力。组织应保持湿润的 PBS 或 DMEM 贯穿整个解剖过程。如果组织将用于球体培养, 使用 DMEM 是首选。通过流式细胞仪可以对所收获的细胞悬浮物进行分类, 以便在电镀前分离细胞的亚群, 如果需要的话, 请按照卢卡奇和al的描述。10。
本议定书概述了不同前列腺叶的组织学特征, 并根据这些指导原则, 应能够识别健康前列腺组织中的裂片。但是, 这一过程存在一定的局限性。在增生或侵袭性肿瘤的情况下, 上皮形态被破坏, 这可以使其更难以区分裂片的基础上的 H & E 染色。在这种情况下, 如果需要特定于叶的信息, 则在嵌入和染色前分离裂片 (如本协议中所述) 是必要的。即使在健康的组织中, 也常常需要分别分析裂片, 因为它们在解剖和组织学上呈现出广泛的变异, 并且有差异表达特征6。然而, 在小鼠前列腺中分离裂片的平移相关性可能被争论, 因为人的前列腺不被划分成裂片。尽管如此, 老鼠仍然是在体内研究 PCa 的最好的模型, 并且已经开发出了14,15的老鼠模型。3D 培养法是一种可用于研究疾病发病机制的关键技术。然而, 球形培养方法的一个警示是来自 probasin 的差异表达模式, 它是前列腺癌小鼠模型中 recombinase 的常用促进剂。probasin 促进剂主要被激活在腔内和中间细胞, 但不在基底细胞7。这里描述的文化条件主要地促进球形形成从基底和中间细胞, 但不从腔内细胞10。因此, 由此产生的文化实际上产生了一种混合的球体表达和非表现出的表达 (i. e, 混合控制和淘汰球体)。因此, 在分析过程中, immunostain 对感兴趣的蛋白质进行识别, 确定 organoids, 并得出基于基因敲除的 organoid 行为的结论是很重要的。
这些方法的意义在于在前列腺癌研究中使用 GEMMs 的多层面应用。所描述的解剖方法有详细的步骤, 这将使研究人员能够更快、更有效地提取前列腺。解剖过程的顺序是为了确保单个的裂片可以辨认和提取, 即使是在前列腺解剖经验最少的人。所概述的培养方法可用于进一步分析前列腺癌的 GEMM 模型。培养条件应允许控制和肿瘤细胞的生长和存活。在我们的经验中, 我们成功地使用了 GEMM 前列腺, 展出 mPIN16。小鼠前列腺与高等级肿瘤也被用于球形培养分析17。控制鼠标球体展示均匀球形形态学;然而, 来自前列腺肿瘤细胞的球体可能表现出不同的形态学和行为, 由于其肿瘤的潜力。因此, 研究 organoid 的体外行为将提供对这些细胞的特征的扩展研究, 并可能通过活细胞成像实时观察球体行为。
总之, 本议定书所描述的前列腺解剖和培养方法可以纳入到涉及 GEMMs 的各种类型的研究中, 以继续提供所有下游应用中的前列腺癌的信息。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的财政利益。
Acknowledgments
这项工作得到了国家癌症研究所 R01CA161018 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
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