Identificación, caracterización histológica y disección de ratón próstata lóbulos para modelos In Vitro esferoide 3D cultura

Summary

Ratones modificados genéticamente son modelos útiles para la investigación de mecanismos del cáncer de próstata. Aquí presentamos un protocolo para identificar y disecar la próstata lóbulos de un mouse del Sistema urogenital, diferenciarlas basados en la histología y aislar y cultura primaria células prostáticas en vitro como esferoides para análisis posteriores.

Abstract

Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMMs) sirven como eficaces modelos preclínicos para investigar muchos tipos de cánceres humanos, incluido el cáncer de próstata (PCa). Comprender la anatomía y la histología de la próstata del ratón es importante para el uso eficiente y adecuada caracterización de dichos modelos animales. La próstata del ratón tiene cuatro distintos pares de lóbulos, cada uno con sus propias características. Este artículo muestra el método correcto de disección e identificación de lóbulos próstata mouse para el análisis de la enfermedad. Disección posterior, las células de la próstata pueden ser más culta en vitro para comprensión mecanicista. Desde el ratón próstata células primarias tienden a perder sus características normales cuando cultivo en vitro, esbozamos aquí un método para aislar las células y crecen como cultivos 3D esferoide, que es eficaz para preservar el fisiológico características de las células. Estas culturas 3D pueden utilizarse para analizar la morfología de la célula y los niveles de comportamiento en condiciones fisiológicas cerca, investigando alterado y localizaciones de proteínas clave y vías que intervienen en el desarrollo y la progresión de una enfermedad y mirando respuestas a tratamientos farmacológicos.

Introduction

La comunidad científica ha estado tratando de aclarar el complejo mecanismo de desarrollo de cáncer en humanos por décadas. Considerando que la identificación de potenciales actores y dianas farmacológicas comienza con estudios de tejido y células del paciente, la aplicación traslacional de tales hallazgos a menudo requiere el uso de modelos animales preclínicos. El uso de ratones modificados genéticamente modelos (GEMMs) a cánceres humanos modelo ha aumentado constantemente desde el establecimiento del ratón modelos de humano cánceres consorcio (NCI-MMHCC), una Comisión que pretendía describir y unificar las características del cáncer de ratón modelos para los científicos en todo el mundo^1,2. Modelos de ratón satisfacen la necesidad de estudios mecanísticos en los estudios preclínicos de la mayoría de los tipos de cáncer, para entender el desarrollo, progresión, respuesta a tratamientos y adquirieron resistencia³.

El cáncer de próstata es el cáncer que ocurre más comúnmente en hombres, afectando a más de 160.000 hombres cada año⁴. Formas agresivas de la enfermedad dicen decenas de miles de vidas cada año. Sin embargo, el mecanismo de progresión de la enfermedad es todavía mal entendido. Esto resulta en una grave falta de opciones de tratamiento eficaz para cáncer de próstata avanzado y metastásico, como lo demuestra la alta tasa de mortalidad en pacientes de cáncer de próstata avanzado⁴. Por lo tanto, existe una creciente necesidad de modelos preclínicos estudiar el cáncer de próstata. Sin embargo, debido a las diferencias inherentes entre el ratón y el humano de la próstata, modelado del cáncer de próstata en GEMMs no ganó popularidad hasta que el sistema de clasificación de Bar Harbor fue introducido en 2004, que se describe cambios histopatológicos en el ratón próstata en manipulación genética, la identificación de cambios neoplásticos y su relación con las etapas de la progresión del cáncer en los seres humanos⁵. Una característica importante de la próstata del ratón que debe tenerse en cuenta al estudiar cualquier modelo de GEMM la próstata es la presencia de cuatro distintos pares de lóbulos: anterior, lateral, ventral y dorsal. Los lóbulos presentan diferencias significativas en la histopatología y gene expresión patrón⁶. Patrón de expresión de la proteína probasin puede variar entre los lóbulos en ratones jóvenes post pubertad⁷, que debe ser considerado ya que Cre de GEMM modelos están diseñados en su mayoría utilizando un promotor basada en probasin llamado Cre4 Pb⁷. Las diferencias espaciales y temporales resultantes en Cre expresión a menudo conducen a diferencias en los plazos de iniciación y progresión del tumor así como las diferencias en cambios neoplásicos entre los lóbulos. Por lo tanto, es importante tener en cuenta esas diferencias mientras estudiaba el desarrollo del tumor en la próstata GEMMs y los lóbulos individuales deben evaluarse por separado para lograr resultados reproducibles. La primera parte de este artículo describe los métodos apropiados para disecar una próstata de ratón, identificar y separar cada lóbulo y reconocer las diferencias histológicas entre los lóbulos.

Mientras que el análisis del crecimiento del tumor y la histopatología puede proporcionar información valiosa en el desarrollo del tumor, no brindan mucha información acerca de los mecanismos moleculares. Para estudiar el mecanismo de desarrollo del tumor y la progresión, a menudo es útil analizar el tumor las células in vitro. Varios métodos se han sugerido sobre los años que implican cultivos de estas células, incluyendo suspensión culturas, culturas 3D⁸ y recientemente, 2D regulares culturas⁹. Mientras que la mayoría de estos métodos resulta en tasas de supervivencia y proliferación celular bien, las culturas 3D proporcionan un entorno más cercano a las condiciones fisiológicas. En 3D o esferoide culturas cultivadas en una matriz extracelular (ECM) de la membrana basal, las células luminales completamente diferenciadas generalmente tienen muy baja tasa de supervivencia; sin embargo, las células basales e intermedias (sobre todo células) son capaces de difundir y producir racimos de célula llamados esferoides¹⁰. Esto hace conveniente para un estudio de cáncer ya que se creen que proceden de las células madre (popularmente conocidas como las células madre cancerosas)¹¹los cánceres epiteliales. La segunda parte de este protocolo describe un método para el cultivo de las células de próstata mouse en culturas 3D. Las esferas resultantes se pueden utilizar para varios tipos de análisis de aguas abajo, incluyendo el estudio de la morfología de organoides y el comportamiento de células vivas imágenes, inmunofluorescencia, tinción de proteínas diferentes y el estudio de las respuestas a la quimioterapia tratamientos.

En general, el objetivo de este protocolo es exponer métodos óptimos para el uso de modelos de ratón en el cáncer de próstata mediante la descripción de las técnicas de disección y anatomía de la próstata del ratón y el procesamiento del tejido para análisis en vitro y esferoide culturas .

Protocol

Todos los experimentos de ratón descritos aquí fueron realizados según las directrices descritas en los protocolos institucionales aprobado por el IACUC en SUNY Upstate Medical University.

1. la disección del Sistema Urogenital (UGS)

Nota: El esquema se presenta en la figura 1.

1. Eutanasia a un ratón C57BL/6 macho de 3 meses utilizando el método de eutanasia por inhalación de CO₂ u otra técnica aprobada.
   Nota: Ratones entre las edades de 3 y 12 meses pueden utilizarse con éxito para el experimento. Ratones más viejos (> 6 meses) más probablemente tienen más grasa alrededor de la UGS, que tendrán que ser aclarados. Identificación y separación de los lóbulos a menudo es difícil en menores de 3 meses de ratones. Otras cepas pueden utilizarse para el experimento, así.
2. Coloque el ratón en su parte posterior y fije las patas con alfileres para que quede expuesto el lado ventral del animal.
3. Rociar etanol al 70% en el abdomen del ratón y frótela para limpiarla.
   Nota: Afeitar el pelo del abdomen antes de la disección no es necesaria.
4. Levantar la piel del abdomen, junto con la capa del músculo, con un par de fórceps romos medio y hacer una incisión en forma de Y invertida en el abdomen con unas tijeras.
   1. En primer lugar, haga una incisión recta con un par de tijeras afiladas de justo encima del pene para el esternón (Figura 2a).
   2. Corte de la base de la incisión hacia cada dedo del pie, hasta los muslos (figura 2b). Pliegue la piel a ambos lados y en la parte inferior para ver toda la zona abdominal (figura 2 c-e).
      Nota: El tamaño de corte varía dependiendo en el tamaño y edad del ratón. El tamaño de la incisión recta inicial puede variar de 1,5 a 4 cm, dependiendo del tamaño del ratón.
5. Pasar sobre los otros órganos para exponer el UGS. Levantar y mover los intestinos brown-amarillo (figura 2f). Recoger las almohadillas de grasa abdominales (el tejido esponjoso blanco opaco) con pinzas y colóquelos a los lados (figura 2 g).
   Nota: El UGS consta de vesículas seminales, uretra, próstata, conducto deferente (vas deferens) y vejiga urinaria. Pueden identificarse por el característico par de opacos blanco arcos de medio punto (que son las vesículas seminales), con el saco de vejiga llena de líquido unido a la base. El tejido transparente ubicado justo debajo de las vesículas seminales está la próstata.
6. Localizar el UGS firmemente mantener la vejiga urinaria con el fórceps romos y levante el UGS todo hacia arriba del abdomen del ratón.
   Nota: Si la vejiga está llena, vaciarlo primero con una jeringa pequeña para proporcionar un mejor agarre con el fórceps y reducir el riesgo de ruptura de la vejiga.
7. Continuar jale hacia arriba la vejiga, deslice un par de tijeras por debajo de la vejiga y la próstata hacia la columna vertebral y hacer un corte. Corte a través de las conexiones restantes a la cavidad abdominal (figura 2 h y 2i). Tenga cuidado de no cortar demasiado cerca a la UGS para evitar el corte accidental a través de cualquier tejido de la próstata.
   Nota: Al hacer el corte bajo el UGS, las tijeras deben insertarse hasta la parte posterior del ratón, para que el corte ajusta la columna vertebral, así. Este método resulta en cortar casi todas las conexiones entre el UGS y la cavidad abdominal en un recorte, reducir el tiempo necesario para extraer el tejido de ratón.
8. Quitar el UGS y colocarlo en 2-6 mL (suficiente para cubrir el tejido) de fosfato tampón salino (PBS) o de Dulbecco modificado medio de Eagle (DMEM, glucosa alta) en una placa de Petri (figura 2j y 2 k) de 6 cm y a un microscopio de disección (10 X Ampliación).
   Nota: Cambiar el medio de disección como se requiere en los pasos restantes.

2. disección de la próstata

1. Eliminar toda la grasa de los lados dorsales y ventrales con un par de finas pinzas y tijeras de microdisección (figura 3a). Utilizar instrumentos quirúrgicos similares para el resto del Protocolo de disección.
   Nota: La grasa es a menudo estrechamente entrelazada con el UGS (pueden identificarse por su aspecto esponjoso blanco); por lo tanto, este paso debe realizarse cuidadosamente para evitar recortes accidentalmente de cualquier tejido de la próstata. Puede tomar hasta 10-15 min para eliminar toda la grasa.
2. Mantener y tirar de la vejiga con las pinzas y cortar la base con las tijeras (figura 3b).
3. Coloque el lado ventral del tejido restante hacia arriba. Sostener uno deferens de ductus con pinzas, trazar en la base con unas tijeras, cortarlo (Figura 3C) y repetir en el otro lado. Quitar los deferens de ductus, ahora dejando la próstata (translúcido y verminosa), vesículas seminales (opaco y blanco, semicircular) y de la uretra (tubo de color rosado a rojo y opaco) (Figura 3d y 3e).
4. Inserte las pinzas entre el arco interior de los lóbulos anterior tejido de la próstata y las vesículas seminales. Haga palanca aparte de las vesículas seminales y la próstata y cortar cualquier tejido conectivo como sea necesario (figura 3f). Seguimiento de las vesículas seminales a su base en la uretra y eliminarlos (figura 3 g y 3 h). Tenga cuidado de no pincharlos.
5. Proceda a disecar a los lóbulos individuales de la próstata.

3. anatomía macroscópica de la microdisección del lóbulo de la próstata e Individual (figura 3i-n, figura 4)

1. Voltear el tejido con un par de fórceps romos por lo que el lado dorsal quede hacia arriba, mostrando los lóbulos dorsales, que se asemejan a las alas de una mariposa.
2. Recoger los lóbulos dorsales manteniendo el lóbulo con pinzas y recortes en la base con unas tijeras (figura 3j).
3. Voltear el tejido restante al lado ventral.
4. Recoger los lóbulos laterales, que son pequeños y generalmente envuelve la uretra en el lado que está encajada entre los lóbulos anteriores, ventrales y dorsales (figura 3 k).
5. A continuación, recoger los lóbulos ventrales, que son más grandes que los lóbulos laterales y se encuentran en la uretra ventral (figura 3 l).
6. Por último, los lóbulos anteriores, el más grande de los cuatro, cortando y desechando la uretra (figura 3 m) de la cosecha.
7. Proceso de las piezas de tejido según las necesidades experimentales. Proceda a la sección 4 para histología, o a la sección 5 para la cultura del esferoide.

4. lóbulo identificación y morfología de Hematoxylin y diapositivas eosina-manchadas

1. Fijar el tejido prostático y embed en parafina. Proceder con la coloración de los portaobjetos con hematoxilina y eosina (H & E) para ver e identificar diferencias en próstata lóbulos basados en la histología, con las características descritas por Oliveira et al. ¹² (figura 5).

5. procesamiento del tejido para cultura 3D¹⁰

Nota: Esto se describe en la figura 6.

1. Proceder con los lóbulos enteros próstata o individuales según las necesidades experimentales de cultivo. Transferir el tejido de la próstata a un plato de 10 cm que contienen 2-3 mL de DMEM. Con un bisturí, pique los túbulos próstata como finalmente y uniformemente como sea posible bajo el microscopio de disección.
2. Continúe con los pasos restantes bajo una campana de cultivo de tejidos, bajo condiciones estériles.
3. Transfiera las piezas de tejido junto con el DMEM al tubo de 15 mL y aumentar el volumen a 9 mL de DMEM. Añadir 1 mL de solución stock de 10 x colagenasa para la mezcla de tejidos de DMEM y vortex para mezclar.
   Nota: Solución madre de colagenasa es de 10 mg/mL en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI), y la concentración final en el tubo de 15 mL es de 1 mg/mL.
4. Coloque el tubo en un agitador giratorio o rotor por 2 h a 37 ° C, de la colagenasa degradar la matriz extracelular del tubo.
5. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
6. Desechar el sobrenadante y resuspender en 2 mL de caliente 0.05% tripsina-EDTA hender las adhesiones célula-célula y célula-matriz. Transferir el tubo a 37 º C durante 5 minutos.
   Nota: Si son demasiado grandes para mezclar bien los trozos de tejido, corte la punta con una navaja para hacer un agujero más amplio.
7. Dispersar cualquier grumos de tejido por pipeteo con una pipeta P1000 8 - 10 veces y luego repetir con una pipeta de P200.
8. Neutralizar la tripsina con 3 mL de DMEM completo. Añadir 500 U de ADNasa I y mezcla bien.
9. Pasar a través de una jeringa de 5 mL 5 - 10 veces con una aguja de 18 G. Luego pasar 5 veces con una aguja de 20 G.
10. Repita los pasos 4-8 una vez más si la solución contiene trozos grandes de tejido.
11. Filtrar la suspensión de células a través de un filtro de 40 micras colocado sobre un tubo de 50 mL. Enjuague el tubo de 15 mL con 5 mL de DMEM y pasar a través del mismo filtro. Repita el enjuague.
12. Deseche el filtro y centrifugue el tubo que contiene el paso a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.

6. planchas y cultivo de las células

1. Resuspender el precipitado en 0,5 mL de la próstata epitelial célula crecimiento medio completo (PrEGM). Contar la densidad de células usando un contador de células o hemocitómetro y diluir las células 5 x 10⁵ células/mL en PrEGM completa.
   Nota: El rendimiento de una ratón 3 meses toda la próstata puede variar de 3 x 10⁵-10⁶ células. Por lo tanto, es importante inicialmente Resuspender el precipitado en no más de 0,5 mL de PrEGM (como se mencionó anteriormente) por lo que se logra la densidad celular deseada, incluso con bajo rendimiento.
2. Mezcla la cantidad necesaria de células con la membrana del sótano ECM en un cociente del volumen (60% membrana del sótano ECM y un 40% la suspensión de la célula) y la placa en varios pocillos placa o portaobjetos de la cámara según las necesidades experimentales de 2:3.
   Nota: Para la inmunotinción, placa en la parte inferior de cristal placas o portaobjetos de la cámara, cubriendo todo el bien o medio bien. Alrededor del borde del pozo de la placa si contando las organitas resultante, o varias gotitas en todo el pozo de la placa si mayores volúmenes de la galjanoplastia. Se debe tener cuidado para no extenderlo demasiado gruesas o demasiado delgadas. Al menos 100 μl de mezcla de la matriz celular por 1 cm² de área; de la galjanoplastia de la placa por ejemplo, en un portaobjetos de la cámara con una de 2 cm²-bien la superficie, debe ser bañado en 200 μL de la mezcla de células de la matriz que contiene las células 5 x 10⁴ .
3. Transferencia de la placa o diapositiva a una incubadora de 37 ° C con 5% CO₂ por 30 min para el ECM para solidificar la membrana del sótano. Luego, añadir precalentado PrEGM completa para cubrir el pozo, teniendo cuidado de no para disturbar el tapón de la membrana del sótano ECM.
4. Retire la mitad de los medios de comunicación y añadir medio fresco cada 2-3 días. Aumentan los esferoides de 5-10 días.
5. Continuar con la cosecha (paso 7), inmunotinción (paso 8), o la proyección de imagen para aplicaciones posteriores.

7. recolección de las esferas

1. Para cosechar las esferas, aspirar cuidadosamente los medios de comunicación sin alterar el membrana del sótano ECM gel tapón y agregue 1 mL de solución de 1 mg/mL dispase PrEGM por 100 μl de la membrana del sótano ECM.
   Nota: Es más fácil cosechar esferoides si son plateados en el borde (en lugar de cubrir bien todo), o bien para asegurar que se puede añadir una cantidad adecuada de la solución del dispase al pozo.
2. Raspe la parte inferior de la placa con un raspador celular para quitar el gel de la membrana del sótano ECM en la solución de PrEGM dispase.
3. Pipeta de la solución completa arriba y abajo de una vez con una amplia perforación punta de pipeta de 1000 μl o pipeta de 5 mL para romper el tapón de gel en trozos más pequeños.
   Nota: Cortar la punta de una pipeta de 1000 μl con una cuchilla de afeitar para hacer una punta de calibre ancho.
4. Incubar en una incubadora de 37 ° C con 5% CO₂ para 1-2 h hasta que la membrana del sótano ECM ha disuelto totalmente.
   Nota: Esto puede ser asegurado por la inspección visual de la parte inferior bien mientras se inclina la placa para confirmar que siguen siendo no más trozos de gel.
5. Recoger la suspensión de células en un tubo cónico de 15 mL.
6. Centrifugue las esferas a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente y continuar con aplicaciones posteriores.

8. el Immunostaining del esferas¹³

Nota: Después de esferoides han crecido por la cantidad de tiempo deseada, la membrana del sótano ECM puede ser disuelto y esferas pueden ser teñidas como se describe en Colicino et al. ¹³.

1. Brevemente, enjuagar las culturas con PBS y añadir 4% paraformaldehido (PFA) directamente al membrana del sótano ECM gel tapón. Incubar durante 30-90 min a temperatura ambiente con agitación lenta, hasta que la membrana del sótano ECM se haya disuelto completamente, reemplazo PDA fresco cada 30 minutos.
   Nota: El PFA disolver el tapón del gel y fijar los esferoides durante este proceso.
2. A continuación, lavar con PBS 3 veces y añadir cloruro de amonio 50 mM por 10 min calmar cualquier autofluorescence de la PFA. Repita 3 lavados con PBS.
3. Permeabilizar con 0,1% detergente no iónico por 5 min y bloque con PBSAT (PBS-BSA 1%, 0.5% Tritón X-100) durante 30 minutos.
4. Incuban con un anticuerpo primario en PBSAT durante la noche a 4 ° C, seguido de 3 lavados con PBSAT y un anticuerpo secundario en PBSAT por 2 h a temperatura ambiente.
5. Repetir los lavados con PBSAT y tinción con DAPI según protocolo del fabricante, si lo desea. Lavar 3 o más veces con PBS.
6. Añadir PBS con reactivo antifade de 200 mM 1, 4-Diazabiciclo [2.2.2] octano (DABCO) y proceder a la proyección de imagen.

Representative Results

Los lóbulos de próstata del ratón pueden ser identificados y disecaron usando sus ubicaciones con respecto a las vesículas seminales y la uretra. La próstata del ratón está compuesto por 4 pares de lóbulos situados dorsalmente y ventralmente a las vesículas seminales y la uretra. Figura 4a y 4b (arriba) muestran las vistas dorsales y ventrales de la próstata intacta, junto con las vesículas seminales y uretra. Los paneles de la parte inferior (figura 4C y 4D) muestran los diferentes lóbulos para identificación. Lóbulos se pueden separar de los ratones mayores de 3 meses.

Los lóbulos de próstata diferentes difieren significativamente en la histología (figura 5). Todos los lóbulos próstata ratón se componen de varios perfiles de glándula compuestos de un lumen rodeado por células epiteliales secretoras; sin embargo, la forma de los lóbulos, organización de las células y la naturaleza de la secreción varían de lóbulo a lóbulo. Las características de identificación de H & ratón manchado E próstata ha sido subrayado eficientemente por Oliveira et al. ¹², brevemente descrito aquí. Lóbulos anteriores tienen acinos moderado a grande con infoldings frecuentes y secreción eosinófila fuertemente. Lóbulos dorsales aparecen como la anterior con la secreción eosinófila pero tienen acinos mucho más pequeños y menos infoldings. Lóbulos laterales tienen acinos pequeños a grandes, con característica plana luminales bordes y la secreción eosinófila. Lóbulos ventrales son estructuralmente como lóbulos laterales, también con bordes planos luminales, pero tienen una secreción luminal no eosinófilo pálida única.

Células de próstata de ratón pueden ser cultivadas como esferoides en la membrana del sótano ECM y exhiben características epiteliales. Esto se perfila como un esquema en la figura 6. Se aislaron células de la próstata del ratón como se describe arriba y cultivadas en la membrana del sótano ECM. Las células comienzan a crecer en organoides en tan pronto como 4 días de la cultura. Figura 7 (superior) muestra los campos representativos de culturas 8 días de edad mostrando los organoides en la membrana del sótano ECM. Bajo las condiciones antes mencionadas de la cultura, la mayoría de las células crece en esferas sólidas, con una fracción tener un lumen parcial o completo dentro. Esos organoides tienen generalmente una morfología esférica incluso. Se cosecharon organoides y immunostained como se describe en Colicino et al. ¹³. figura 7 (panel inferior) muestra un organoide sin un lumen (izquierda) y con un lumen (derecha), manchado con phalloidin (marcador de F-actina, verde) y DAPI (núcleo, azul). Β-catenina es un marcador de adherencia de célula que se expresa fuertemente en los interfaces de la célula en las células epiteliales. Figura 8 muestra la β-catenina fuerte coloración (verde) en las ensambladuras de la célula-célula en esferoides que localización conjuntamente con F-actina (rojo). Los esferoides también expresan citoqueratina 5, citoqueratina 8, p63 y proteínas receptoras de andrógenos, que proporcionan la evidencia que los esferoides de hecho derivan de células procedentes de la próstata¹⁰.

Figura 1: Diagrama de flujo esquemático que demuestra disección del Sistema urogenital del ratón y el aislamiento de la próstata. Diagrama de flujo de los pasos del Protocolo se describen en las secciones 1-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: disección del ratón UGS. Imágenes paso a paso de la disección de la UGS de un ratón de 3 meses: (un y b) hacer las incisiones, (c-e) tirando hacia atrás la piel para dejar al descubierto la zona abdominal, (f) cambiando los intestinos, (g) pasar las almohadillas de grasa abdominales, (h e i) extracción de la UGS de la cavidad abdominal, (j) el UGS extraídos, (k) el UGS extraídos con los diferentes órganos y tejidos marcan como sigue: SV (amarillo) = vesículas seminales; P (rojo) = próstata; F (púrpura) = grasa; V (azul) = conducto deferente; y B (verde) = vejiga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: disección de la próstata del ratón. Imágenes paso a paso para la disección de la próstata del ratón de la UGS: (a) quitar grasa, (b) extracción de la vejiga urinaria (c) quitar el conducto deferente, el vista (d) ventral de la próstata con la uretra, vista (e) dorsal de la próstata con la uretra, (f-h) eliminación de las vesículas seminales, (i) vista ventral de la próstata, (j) disección un lóbulo dorsal, (k) un lóbulo lateral de la disección disección (l) un lóbulo ventral, (m) disecando un lóbulo anterior y lóbulos (n) la próstata disecada: anterior = AP, dorsal = DP, lateral = LP y ventral = VP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Anatomía de los lóbulos de próstata mouse. Imágenes representativas del ratón 3-month-old UGS después del retiro de la grasa, la vejiga y el conducto deferente. Las imágenes muestran lóbulos de la próstata con vesículas seminales y la uretra, con dorsal (a y c) y ventral (b y d). Top paneles (a y b) muestran imágenes de la Virgenes, mientras que paneles inferiores (c y d) muestran los lóbulos indica en azul (dorsal), amarillo (anterior), rojo (ventral) y verde (lateral). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: los diferentes lóbulos próstata varían significativamente en histología. Aquí es un H & E manchado todo próstata imagen mostrando los cuatro lóbulos de la próstata, las vesículas seminales y uretra. Lóbulos están señalados en naranja (anterior), verde (dorsal), azul (lateral) y negro (ventral). Recuadro: imágenes representativas de cada lóbulo, bajo un objetivo de 10 x. Barra de escala representa 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Diagrama de flujo esquemático mostrando la digestión de las próstatas y esferoide posteriores culturas. Diagrama de flujo de los pasos del Protocolo se describe en las secciones 5 y 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: las células de la próstata crecen en esferoides incluso esféricas con o sin una luz. Tejido de la próstata de un ratón de tipo salvaje 3-month-old fue cultivado según el protocolo. Culturas fueron reflejadas sobre un sensor de placa bajo un objetivo de X 4, en 8 días después la cultura, mostrando la formación de esferoides (arriba). Los esferoides fueron cosechadas y manchados como se describe en el protocolo con un fluorescente conjugado colorante phalloidin F-actina (verde) y DAPI para núcleos (azul), luego reflejada en un microscopio confocal de disco de giro bajo un 40 X objetivo de agua (parte inferior). El esferoide de la derecha muestra la evidencia de una luz. Barras de escala representan 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: el ratón próstata organitas Mostrar localización junctional de β-catenina. Esferoides de culturas 3D 6 días de edad fueron manchados, utilizando un anticuerpo primario contra la β-catenina y un anticuerpo secundario conjugado con tinte fluorescente y reflejada en un microscopio confocal de disco de giro bajo un 40 X objetivo de agua. Imágenes representativas muestran inmunotinción para β-catenina (verde, izquierda), F-actina (rojo medio) y DAPI (azul). El panel de la derecha muestra todos los 3 canales combinados. Barra de escala representa 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este documento describe los métodos de disección de la próstata del ratón e identificación de los lóbulos individuales. También se describe, es el protocolo para el cultivo de células de próstata de ratón en una cultura 3D para análisis en vitro .

Un paso crítico en el protocolo de disección es cosechar el UGS todo fuera del ratón (1) y separar los órganos individuales bajo un microscopio de disección. El tejido de la próstata es muy pequeño y rodeado por el resto de la UGS; por lo tanto, es prácticamente imposible cosechar del órgano de la cavidad del cuerpo mientras que la adquisición de los cuatro pares de lóbulos intactos. Por lo tanto, es importante el UGS todo desde el ratón de la cosecha y luego proceder a extraer la próstata. También es fundamental en este protocolo (2) realice los pasos de manera oportuna pero siendo meticuloso. Tiempo es de la esencia durante la disección con el fin de minimizar la degradación del tejido. La técnica específica que se describe aquí para la extracción de la UGS del ratón más rápido en comparación con otras alternativas y es muy recomendable. El proceso de disección y lóbulo aislamiento suele 35-40 min, que puede reducirse a 25 min con más práctica. La parte más difícil de la disección es limpiar la grasa que rodea el UGS, que toma una gran parte del tiempo total de la disección. La grasa debe eliminarse cuidadosamente para asegurarse de que ninguna de ellas se queda con la próstata, pero es importante ser extremadamente cuidadoso para no perder accidentalmente cualquier tejido de la próstata en el proceso. Otro paso crítico es (3) para no quitar la uretra antes de la separación de los lóbulos de la próstata. Esencialmente, la uretra forma la base de que los cuatro pares de próstata lóbulos están dispuestos. Es más fácil identificar los lóbulos si éstos están fijados a la uretra, basada en su distribución espacial en relación con la uretra.

Un paso crítico en el protocolo de cultura esferoide es (1) picar bien el tejido. Picar el tejido prostático con un bisturí es un paso tedioso, sobre todo porque el tejido de la próstata tiene una naturaleza pegajosa. Sin embargo, picar el tejido tan pequeño como sea posible es esencial para obtener el máximo rendimiento. Otro paso esencial es efectuado después de la tripsinización (2) y pasando por las jeringuillas de los tamaños especifican post-neutralization. Ambos estos pasos deben realizar correctamente y repetidos, si es necesario, para lograr el rendimiento óptimo de la célula. Finalmente, es importante (3) no a la placa de la membrana del sótano ECM demasiado gruesa o demasiado delgada. Si la membrana del sótano ECM es plateada muy fino (es decir., menos de 100 μl/cm²), las células no crecerá en organoides adecuada en el medio del pozo, donde será la más delgada del gel. Galjanoplastia demasiado gruesa (es decir., más de 250 μl/cm²) resultará en el ECM de la membrana del sótano no solidificar correctamente y deslizamiento durante los cambios de los medios de comunicación. Revestimiento en el pozo ayudará a lograr más incluso gel grueso.

El protocolo descrito puede ser ligeramente modificado según las necesidades experimentales. La técnica para la extracción de la UGS de la cavidad abdominal requiere un agarre firme en la vejiga urinaria con el fórceps. En caso de que la vejiga está demasiado llena, es importante vaciar la vejiga con una jeringa de 1 mL y fina (26G o similar) para asegurar un agarre correcto antes de comenzar a extraer el tejido de la aguja. El tejido debe mantenerse húmedo con PBS o DMEM durante todo el proceso de disección. Uso de DMEM se prefiere si el tejido se va a utilizar para las culturas esferoide. La suspensión de células cosechadas puede ordenarse mediante citometría de flujo para aislar a las subpoblaciones de células antes de la galjanoplastia, si lo desea, como se describe por Lukacs et al. ¹⁰.

Características histológicas de los diferentes lóbulos próstata han sido subrayadas en el presente Protocolo, y uno debe ser capaz de identificar los lóbulos de tejido sano de próstata siguiendo estas pautas. Sin embargo, hay ciertas limitaciones del proceso. En los casos de hiperplasia o tumores agresivos, se interrumpe la morfología epitelial, que puede hacer mucho más difícil distinguir entre lóbulos basados en la tinción H & E. En tales casos, separación de lóbulos (como se describe en este protocolo) antes de la inclusión y coloración es necesario si se requiere información específica del lóbulo. Incluso en tejido sano, a menudo es necesario analizar por separado los lóbulos ya que presentan gran variabilidad en la anatomía e histología y tienen expresión diferencial firmas⁶. Sin embargo, la relevancia traslacional de la separación de lóbulos de la próstata del ratón puede debatirse, ya que la próstata humana no se divide en lóbulos. A pesar de esto, el ratón sigue siendo el mejor modelo para el estudio de PCa en vivo, y varios modelos de ratón han sido desarrollados^14,15. El método de cultivo 3D especialmente es una técnica clave que puede utilizarse para investigar los mecanismos de la enfermedad. Sin embargo, una salvedad del método esferoide cultura surge el patrón de expresión diferencial de probasin, que es el promotor utilizado para recombinase de Cre en modelos de ratón de cáncer de próstata. El promotor probasin predominante es activa en las células luminales e intermedias pero no en células basales⁷. Las condiciones de cultivo descritas aquí promoción formación esferoide predominante de las células basales e intermedias, pero no de células luminales¹⁰. Por lo tanto, las culturas que realmente producen una mezcla de Cre-expresando y manifestando de Cre no esferoides (es decir., una mezcla de esferoides control y knock-out). Como resultado, durante el análisis, es importante immunostain de la proteína de interés para identificar organitas knock-out y sacar conclusiones sobre el comportamiento de organoide basado en gene knock-outs.

La importancia de estos métodos radica en las aplicaciones multi-facetas de usar GEMMs en estudios de cáncer de próstata. El método de disección descrito ha detallado los pasos que le permiten a los investigadores extraer la próstata más rápida y eficazmente. La secuencia del proceso de disección está diseñada para asegurar que lóbulos individuales pueden ser identificados y extraídos, incluso por aquellos con mínima experiencia en disecciones de próstata. El método de cultivo descrito puede utilizarse para analizar modelos GEMM de cáncer de próstata. Deben permitir las condiciones de cultivo para el crecimiento y supervivencia de las células control y tumor. En nuestra experiencia, hemos utilizado con éxito próstatas GEMM que exhiben mPIN¹⁶. Próstatas de ratón con tumores de grado alto también se han utilizado para esferoide cultura análisis¹⁷. Los esferoides de ratón de control presentan una morfología esférica incluso; sin embargo, esferoides, derivados de células de tumor de la próstata pueden demostrar diferencias en la morfología y comportamiento debido a su potencial neoplásico. Por lo tanto, estudiar comportamiento de organoide en vitro proporcionará una prolongada mirada en las características de estas células y, posiblemente, observaciones del comportamiento del esferoide en tiempo real a través de imágenes de células vivas.

En conclusión, la disección próstata y métodos de cultivo descritos en el presente Protocolo pueden ser incorporados en distintos tipos de estudios que incluyeron GEMMs para continuar proporcionando información sobre el cáncer de próstata en todos los usos aguas abajo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Dissection microscope
RPMI medium	Thermofisher Scientific	11875093
Dissection medium (DMEM + 10%FBS)	Thermofisher Scientific	11965-084
Fetal Bovine Serum	Thermofisher Scientific	10438018
PBS (Phosphate buffered saline)	Thermofisher Scientific	10010031
Collagenase	Thermofisher Scientific	17018029	Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
DNase I	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
Syringes and Needles	Fisher Scientific
Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm	Fisher Scientific	22-363-547
PrEGM BulletKit	Lonza	CC-3166	Add all componenets, aliquot and store at -20 °C.
Matrigel membrane matrix	Thermofisher Scientific	CB-40234
Dispase II powder	Thermofisher Scientific	17105041	Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C