Identificatie en karakterisering van het histologische dissectie van de prostaat lobben van de muis voor In Vitro 3D sferoïde cultuur modellen

Summary

Genetisch gemodificeerde muizen zijn nuttige modellen voor het onderzoek naar prostaatkanker mechanismen. Hier presenteren we een protocol om te identificeren en ontleden prostaat lobben van het urogenitaal systeem van een muis, onderscheiden van hen op basis van histologie, isoleren en cultuur de primaire prostaat cellen in vitro als spheroïden voor downstream analyses.

Abstract

Genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMMs) dienen als effectieve preklinische modellen voor het onderzoeken van de meeste soorten menselijke kankers, met inbegrip van prostaatkanker (PCa). Inzicht in de anatomie en de histologie van de muis prostaat is belangrijk voor het efficiënt gebruik en de juiste karakterisering van dergelijke dierlijke modellen. De muis prostaat heeft vier verschillende combinaties van de lobben, elk met hun eigen kenmerken. Dit artikel demonstreert de juiste methode van dissectie en identificatie van de prostaat lobben muis voor analyse van de ziekte. Na dissectie, de prostaat cellen kunnen verder worden gekweekt in vitro voor mechanistische begrip. Sinds de muis prostaat primaire cellen de neiging om te verliezen hun normale kenmerken wanneer gekweekt in vitro, duidelijk naar voren komt hier een methode voor het isoleren van de cellen en groeien ze als 3D sferoïde culturen, die is effectief voor het behoud van de fysiologische kenmerken van de cellen. Deze 3D culturen kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de morfologie van de cel en gedrag in in de buurt van de fysiologische omstandigheden, onderzoeken gewijzigd niveaus en lokalisaties van belangrijke eiwitten en trajecten die betrokken zijn bij de ontwikkeling en de vooruitgang van een ziekte, en kijken Reacties op behandelingen van de drug.

Introduction

De wetenschappelijke gemeenschap heeft geprobeerd het ophelderen van het complex mechanisme van de ontwikkeling van de menselijke kanker voor decennia. Overwegende dat de identificatie van potentiële hoofdrolspelers en drug doelen begint met patiënt cellen en weefsel studies, vereist de translationeel toepassing van dergelijke bevindingen vaak het gebruik van preklinische diermodellen. Het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen modellen (GEMMs) met model menselijke kanker is gestaag gestegen sinds de oprichting van de muis modellen van menselijke kankers Consortium (NCI-MMHCC), een comité dat getracht te beschrijven en verenigen van de kenmerken van de muis kanker modellen voor wetenschappers wereldwijd^1,2. Muismodellen voldoen aan de behoefte voor mechanistische studies in pre-klinische studies van de meeste vormen van kanker, voor inzicht in de ontwikkeling, progressie, reactie op de behandelingen, en verworven weerstand³.

Prostaatkanker is de meest voorkomende kanker bij mannen, die meer dan 160.000 mannen elk jaar⁴. Agressieve vormen van de ziekte beweren tienduizenden levens per jaar. Echter, het mechanisme van de progressie van de ziekte is nog steeds slecht begrepen. Dit resulteert in een ernstig gebrek aan effectieve behandelingsopties voor geavanceerde en uitgezaaide prostaatkanker, zoals blijkt uit het hoge sterftecijfer in geavanceerde prostaatkanker patiënten⁴. Vandaar, is er een groeiende behoefte aan pre-klinische modellen om te studeren van prostaatkanker. Echter, als gevolg van de inherente verschillen tussen de muis en het menselijke prostaat, modellering van prostaatkanker bij GEMMs kreeg niet populariteit totdat het classificatiesysteem van Bar Harbor werd geïntroduceerd in 2004, die geschetst van histopathologische veranderingen in de muis prostaat bij genetische manipulatie, identificatie van neoplastische veranderingen en hun relatie tot de stadia van progressie van kanker in de mens⁵. Een belangrijk kenmerk van de muis prostaat, die moet worden meegenomen tijdens het bestuderen van ieder prostaat GEMM model is de aanwezigheid van vier verschillende combinaties van kwabben: anterieure, laterale ventrale en dorsale. De lobben vertonen aanzienlijke verschillen in de histopathologie en gen expressie patroon⁶. Probasin eiwit-expressiepatroon kan variëren tussen de lobben in jonge na puberteit muizen⁷, die moet worden beschouwd aangezien Cre gebaseerde GEMM modellen zijn meestal ontworpen met behulp van een probasin gebaseerde promotor genaamd Pb-Cre4⁷. De resulterende ruimtelijke en temporele verschillen in Cre expressie vaak leiden tot verschillen in de tumor initiatie en progressie tijdlijnen evenals verschillen in neoplastische veranderingen tussen de lobben. Dus, het is belangrijk om goed voor dergelijke verschillen terwijl het bestuderen van de ontwikkeling van de tumor in de prostaat GEMMs, en de individuele lobben kunnen moeten afzonderlijk worden beoordeeld om reproduceerbare resultaten te bereiken. Het eerste deel van dit artikel beschrijft de juiste methoden ontleden een muis prostaat, identificeren en elke kwab scheiden en herkennen de histologische verschillen tussen de lobben.

Terwijl de analyse van tumorgroei en histopathologisch onderzoek waardevolle verwerven in de ontwikkeling van tumor inzicht kan, bieden ze niet veel informatie over moleculaire mechanismen. Het mechanisme van de ontwikkeling van de tumor en de progressie te studeren, is het vaak nuttig om te analyseren de tumor cellen in vitro. Verschillende methoden hebben gesuggereerd door de jaren heen waarbij culturen van deze cellen, met inbegrip van opschorting culturen, 3D culturen⁸ en onlangs, regelmatige 2D⁹culturen. Overwegende dat de meeste van deze methoden leiden tot goede cel overleving en proliferatie tarieven, bieden de 3D culturen een omgeving die zich het dichtst bij de fysiologische omstandigheden. In 3D of sferoïde culturen geteeld in een kelder membraan extracellulaire matrix (ECM), zijn de volledig gedifferentieerde luminal cellen meestal zeer laag overlevingspercentage; echter, de basale en tussenliggende cellen (voornamelijk stamcellen) kunnen uitdragen en produceren van cel clusters genaamd spheroïden¹⁰. Dit maakt het geschikt voor de studie van een kanker omdat epitheliale kankers worden verondersteld te zijn afkomstig uit de cellen van de stam (volksmond bekend als de cellen van de stam van kanker)¹¹. Het tweede deel van dit protocol beschrijft een methode voor het kweken van de prostaat cellen van de muis in 3D culturen. De resulterende sferen kunnen worden gebruikt voor verschillende soorten downstream analyses, met inbegrip van de studie van de organoid morfologie en gedrag door levende cel imaging, immunofluorescentie kleuring voor verschillende eiwitten, en de studie van reacties op chemotherapeutische behandelingen.

Globaal, is het doel van dit protocol te schetsen van optimale methoden voor het gebruik van Muismodellen in prostaatkanker door het beschrijven van de anatomie en dissectie technieken van de prostaat van de muis en de verwerking van het weefsel voor sferoïde culturen en in vitro analyse .

Protocol

Alle muis experimenten die hier beschreven werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren in de institutionele IACUC goedgekeurde protocollen SUNY Upstate medische universiteit.

1. de dissectie van urogenitaal systeem (UGS)

Opmerking: Het schema wordt weergegeven in Figuur 1.

1. Een 3-maanden oude mannelijke C57BL/6 muis met de CO-₂ respiratoire euthanasie-methode of een andere goedgekeurde techniek euthanaseren.
   Opmerking: Muizen tussen de leeftijden van 3 en 12 maanden kunnen worden gebruikt met succes voor het experiment. Oudere muizen (> 6 maanden) zal waarschijnlijk hebben meer vet rond de UGS, die moet worden gewist. Identificatie en scheiding van de kwabben is vaak moeilijk in muizen jonger dan 3 maanden. Andere spanningen kunnen worden gebruikt voor het experiment, als goed.
2. Plaats de muis op de rug en beveiligen van de benen met pinnen, zodat de ventrale zijde van het dier wordt blootgesteld.
3. 70% ethanol spray op de buik van de muis en maak deze schoon.
   Opmerking: Scheren het haar buik voordat dissectie niet vereist is.
4. Til de huid van de buik, samen met de spier laag, met een paar middelgrote botte pincet en maak een omgekeerde Y-vormige insnijding op de buik met behulp van schaar.
   1. Controleer eerst een rechte snede met een scherpe schaar van net boven de penis naar het borstbeen (Figuur 2a).
   2. Gesneden uit de basis van de incisie naar elke teen, tot de dijen (Figuur 2b). Vouw terug de huid aan beide zijden en aan de onderkant te bekijken van de gehele buikstreek (Figuur 2 c-e).
      Opmerking: De gesneden grootte varieert afhankelijk van de leeftijd van de muis en de grootte. De grootte van de oorspronkelijke rechte snede kan variëren van 1,5 tot 4 cm, afhankelijk van de grootte van de muis.
5. Beweeg over de andere organen om de UGS bloot te stellen. Tillen en verplaatsen van de bruin-geel darmen (figuur 2f). Pak de buik vet pads (het ondoorzichtige witte sponsachtige weefsel) met een tang en verplaats ze naar de zijkanten (Figuur 2 g).
   Opmerking: De UGS bestaat uit de zaadblaasjes, de urethra, de prostaat, de ductus deferens (zaadleider) en de urineblaas. Het kan worden geïdentificeerd door de karakteristieke combinatie van ondoorzichtige witte halfronde bogen (die de zaadblaasjes), met de vloeistof gevulde blaas sac gekoppeld aan de base. Het doorschijnend weefsel bevindt zich recht onder de zaadblaasjes is de prostaat.
6. Zoek de UGS, stevig houdt de urineblaas met een botte Tang en til de hele UGS omhoog uit de buik van de muis.
   Opmerking: Als de blaas vol is, afvoer het eerst met een kleine injectiespuit op een betere grip voorzien van de verlostang en verminderen het risico van het bezwijken van de blaas.
7. Verder optrekken op de blaas, dia een paar van schaar onder de blaas en prostaat helemaal aan de wervelkolom, en maken een cut. Eventuele resterende verbindingen naar de buikholte (Figuur 2 h en 2i) doorsnijden. Wees voorzichtig niet te dicht op de UGS om te voorkomen dat per ongeluk doorsnijden een prostaat weefsel gesneden.
   Opmerking: Tijdens het maken van de snede onder de UGS, de schaar moet worden ingevoegd helemaal aan de achterkant van de muis, zodat de cut snaps evenals de wervelkolom. Deze methode resulteert in het versnijden van bijna alle van de verbindingen tussen de UGS en de buikholte in een knipsel, verminderen de tijd die nodig is om uit te pakken van het weefsel van de muis.
8. Verwijder de UGS en plaats het in 2-6 mL (genoeg ter dekking van het weefsel) van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of Dulbecco van bewerkt Eagle medium (DMEM, hoge glucose) in een 6 cm petrischaal (figuur 2j en 2 k) en verplaats het naar een dissectie Microscoop (10 X vergroting).
   Opmerking: Wijzig de ontleden media zoals vereist in de resterende stappen.

2. de ontrafeling van de prostaat

1. Schakel al het vet uit de dorsale en ventrale weerszijden met een paar fijne pincet en microdissection schaar (Figuur 3a). Soortgelijke chirurgische instrumenten voor de rest van de dissectie-protocol gebruiken.
   Opmerking: Het vet is vaak nauw verweven met de UGS (kan worden geïdentificeerd door zijn witte sponsachtige verschijning); deze stap moet dus zorgvuldig worden uitgevoerd om te voorkomen dat per ongeluk uit een prostaat weefsel Knipprogramma. Het kan duren maximaal 10-15 min om al het vet.
2. Houden en trekken van de blaas met de pincet en snip het aan de basis met de schaar (Figuur 3b).
3. Plaats de resterende weefsel ventrale zijde omhoog. Houd één ductus deferens met pincet, traceren naar de basis met een schaar, en het (Figuur 3 c) snip, dan Herhaal aan de andere kant. Verwijderen van de ductus deferens, nu verlaten achter de prostaat (doorschijnend en verminous), zaadblaasjes (ondoorzichtig en witte, halfronde) en urethra (roze-rood en ondoorzichtige buis) (figuur 3d en 3e).
4. Invoegen pincet tussen de binnenste boog van de zaadblaasjes en prostaat weefsel anterior lobben. Wrikken uit elkaar de zaadblaasjes en prostaat en eventuele bindweefsel als nodig (figuur 3f) snip. Traceert de zaadblaasjes naar hun basis in de urethra en verwijderen (Figuur 3 g en 3 h). Wees voorzichtig niet om hen doorprikken.
5. Gaan ontleden uit de individuele prostaat lobben.

3. bruto anatomie van de prostaat en individuele Lobe Microdissection (cijfers 3i-n, figuur 4)

1. Flip het weefsel met een paar van botte verlostang zodat de dorsale zijde gezichten, tonen de dorsale lobben, die zal lijken op de vleugels van een vlinder.
2. De dorsale lobben verzamelen door de kwab met een tang en Knipprogramma op het honk met een schaar (figuur 3j).
3. Flip-over het resterende weefsel aan de ventrale zijde.
4. Verzamelen van de laterale lobben, die klein zijn en meestal wikkel de plasbuis aan de kant, die zijn ingeklemd tussen de lobben anterior ventrale en dorsale (Figuur 3 k).
5. Vervolgens verzamelen de ventrale lobben, die zijn groter dan de laterale lobben en liggen op de urinebuis ventrally (Figuur 3 l).
6. Laatste, oogsten van de voorste kwab, de grootste van de vier, door snijden en de urethra (Figuur 3 m) te verwijderen.
7. De stukjes weefsel volgens experimentele behoeften te verwerken. Ga verder naar sectie 4 voor histologie, of sectie 5 voor de sferoïde cultuur.

4. lobe identificatie en morfologie van de haematoxyline en eosine gebeitste dia 's

1. Los van het prostaat weefsel en inbedden in paraffine. Doorgaan met de dia's met haematoxyline en eosine (H & E) bekijken en identificeren van verschillen in de prostaat kwabben gebaseerd op histologie, met behulp van de kenmerken geschetst door Oliveira et al.kleuring. ¹² (Figuur 5).

5. de verwerking van het weefsel voor 3D cultuur¹⁰

Opmerking: Dit is uiteengezet in Figuur 6.

1. Doorgaan met het kweken van de hele prostaat of individuele lobben volgens de experimentele behoeften. Het prostaat weefsel overbrengen in een 10 cm schotel met 2-3 mL DMEM. Gehakt met een scalpel, de prostaat tubuli als fijn en gelijkmatig mogelijk onder de Microscoop dissectie.
2. Ga verder met de overige stappen onder de motorkap van een weefselkweek, onder steriele omstandigheden.
3. De stukjes weefsel samen met de DMEM overbrengen in een tube van 15 mL en verhoog het volume tot 9 mL met DMEM. 1 mL van 10 x collagenase stockoplossing toevoegen aan de DMEM-weefsel mengsel en vortex te mengen.
   Opmerking: Collagenase stockoplossing is 10 mg/mL in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) medium, en de uiteindelijke concentratie in de tube van 15 mL is 1 mg/mL.
4. Plaats de buis op een rondgaand shaker of buis rotator gedurende 2 uur bij 37 ° C, voor de collagenase te degraderen de extracellulaire matrix.
5. Centrifugeer de buis bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
6. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 2 mL zuiver warm 0.05% trypsine-EDTA aan de cel-cel en cel-matrix verklevingen te klieven. Overdracht van de buis tot 37 ° C gedurende 5 minuten.
   Opmerking: Als de stukjes weefsel te groot zijn om goed mengen, knip het uiteinde van de pipet met een scheermesje te maken van een grotere boring.
7. Elk weefsel bosjes breken door pipetteren met een pipet P1000 8 - 10 keer en vervolgens herhalen met een pipet P200.
8. Neutraliseer de trypsine met 3 mL van volledige DMEM. Toevoegen van 500 U DNAase ik toe en meng goed.
9. Passeren een 5 mL-spuit 5 - 10 keer met een naald 18 G. Vervolgens passeren 5 keer met een naald van 20 G.
10. Herhaal de stappen 4-8 eens te meer als de oplossing nog steeds grote weefsel brokken bevat.
11. Filtreer de celsuspensie door een filter van de 40 μm geplaatst op een tube van 50 mL. Spoel de tube van 15 mL met 5 mL van DMEM en hetzelfde filter passeren. Herhaal de spoeling.
12. Negeren van de filter en centrifugeren van de buis met de doorstroming bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.

6. plating en kweken van de cellen

1. Resuspendeer de pellet in 0,5 mL van volledige prostaat epitheliale cel groeimedium (PrEGM). Tellen van de celdichtheid met behulp van een item van de cel- of hemocytometer en verdunnen van de cellen tot 5 x 10⁵ cellen/mL in volledige PrEGM.
   Opmerking: De opbrengst van een 3-maand-oude muis hele prostaat kan variëren van 3 x 10-⁵-10⁶ cellen. Daarom is het belangrijk om in eerste instantie resuspendeer de pellet in niet meer dan 0,5 mL PrEGM (zoals hierboven vermeld) zodat de gewenste celdichtheid kan worden bereikt, zelfs met lage opbrengst.
2. Mix het vereiste volume van cellen met het membraan van de kelder ECM in een 2:3 volumeverhouding (60% kelder membraan ECM en 40% celsuspensie) en plaat in een multi goed plaat of kamer dia volgens de experimentele behoeften.
   Opmerking: Voor immunokleuring, plaat op glazen-bodem platen of kamer dia's, die betrekking hebben op de gehele goed of midden van de put. Plaat rond de rand van de put als het tellen van de resulterende organoids of plaat als meerdere druppels heel goed als plating hogere volumes. Wees bewust niet om het te verspreiden te dik of te dun. Plaat van ten minste 100 µL van matrix-cel mengsel per 1 cm² van plating gebied; bijvoorbeeld, in een dia van de kamer met een 2 cm²-goed oppervlakte, 200 µL van matrix-cel mengsel met 5 x 10,⁴ cellen moeten worden verguld.
3. De plaat/dia overbrengen in een incubator van de 37 ° C met 5% CO₂ voor 30 min. voor het membraan van de kelder ECM te stollen. Dan, voeg voorverwarmde volledige PrEGM ter dekking van de put, niet te verstoren de membraan van de kelder ECM-stekker verzorgen.
4. Verwijder de helft van de media en voeg verse media elke 2-3 dagen. Groeien spheroïden voor 5-10 dagen.
5. Doorgaan met oogsten (stap 7), immunokleuring (stap 8), en/of imaging voor downstream toepassingen.

7. het oogsten van de bollen

1. Om te oogsten bollen, gecombineerd de media zorgvuldig zonder verstoring van de stekker van de kelder membraan ECM-gel en voeg 1 mL 1 mg/mL dispase oplossing in PrEGM per 100 µL van kelder membraan ECM.
   Opmerking: Het is makkelijker om te oogsten van spheroïden als ze zijn verguld in het midden van het goed of de velg (in plaats van die betrekking hebben op de hele put), om ervoor te zorgen dat een voldoende hoeveelheid van de oplossing van de dispase kan worden toegevoegd aan de put.
2. Schraap de onderkant van de plaat met een cel schraper te heffen uit de kelder membraan ECM gel in de dispase-PrEGM-oplossing.
3. Pipetteer de gehele oplossing op en neer eenmaal met een breed boring 1000 µL Pipetteer tip of 5 mL pipet te breken van de stekker van de gel in kleinere stukken.
   Opmerking: Knip het puntje van een 1000 µL pipette uiteinde met een scheermesje te maken een breed boring tip.
4. Incubeer in een incubator van de 37 ° C met 5% CO₂ voor 1-2 h totdat de kelder membraan ECM heeft volledig is opgelost.
   Opmerking: Dit kan worden bereikt door visuele inspectie van de bodem goed terwijl het kantelen van de plaat om te bevestigen dat er geen meer brokken van gel blijven.
5. Het verzamelen van de celsuspensie in een conische tube van 15 mL.
6. Centrifugeer sferen bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verder met downstream toepassingen.

8. immunokleuring van de bollen¹³

Opmerking: Nadat de gewenste hoeveelheid tijd gegroeid spheroïden, de kelder membraan ECM kan worden ontbonden en sferen kunnen worden gekleurd, zoals beschreven in Colicino et al. ¹³.

1. Kort, spoel de culturen met PBS en 4% paraformaldehyde (PFA) rechtstreeks toevoegen aan de stekker van de kelder membraan ECM-gel. Incubeer gedurende 30-90 minuten bij kamertemperatuur met langzame schudden, totdat de kelder membraan ECM volledig opgelost is, ter vervanging van verse PFA elke 30 min.
   Opmerking: De PFA zal los van de gel-stekker en positiebepaling van de spheroïden tijdens de duur van dit proces.
2. Vervolgens wassen met PBS 3 keer en voeg 50 mM ammoniumchloride gedurende 10 minuten om elke autofluorescence van de PFA quench. Herhaal voor 3 wasbeurten met PBS.
3. Permeabilize met 0,1% niet-ionogene wasmiddel voor 5 min en blok met PBSAT (PBS, 1% BSA, 0,5% Triton X-100) gedurende 30 minuten.
4. Met een primair antilichaam in PBSAT's nachts bij 4 ° C, gevolgd door 3 wasbeurten met PBSAT en een secundair antilichaam in PBSAT gedurende 2 uur bij kamertemperatuur incuberen.
5. Herhaal de wasbeurten met PBSAT en vlek met DAPI volgens protocol van de fabrikant, indien gewenst. Wassen van 3 of meer keer met PBS.
6. Toevoegen van PBS met 200 mM 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octaan (DABCO) antifade-reagens en ga naar imaging.

Representative Results

De prostaat lobben van de muis kunnen worden geïdentificeerd en ontleed met behulp van hun locaties met betrekking tot de zaadblaasjes en urethra. De muis prostaat is samengesteld uit 4 paren van kwabben dorsally gelegen en ventrally naar de zaadblaasjes en urethra. Figuur 4a en 4b (boven) weergeven de dorsale en ventrale kanten van de intact prostaat, samen met de zaadblaasjes en de urinebuis. De onderste panelen (Figuur 4 c en 4 d) tonen de verschillende lobben geschetst voor identificatie. Lobben kunnen worden losgekoppeld van de muizen niet ouder dan 3 maanden.

De verschillende prostaat lobben verschillen aanzienlijk in de histologie (Figuur 5). Alle muis prostaat lobben zijn samengesteld uit meerdere profielen van de klier bestaat uit een lumen omgeven door secretoire epitheliale cellen; echter, de vorm van de lobben, organisatie van de cellen, en de aard van de secretie variëren van kwab aan kwab. De identificerende kenmerken van H & E gebeitste muis prostates efficiënt hebben uitgestippeld door Oliveira et al. ¹², hier kort geschetst. Anterior lobben hebben matige tot grote acini met frequente infoldings en sterk eosinofiel secretie. Dorsal lobben verschijnen anterior met eosinofiel afscheiding maar hebben veel kleinere acini en minder infoldings. Laterale lobben hebben kleine tot grote acini, met karakteristiek plat luminal randen en eosinofiele secretie. Ventrale lobben zijn structureel als laterale lobben, ook met vlakke luminal randen, maar hebben een unieke bleek niet-eosinofiele luminal secretie.

Muis prostaat cellen kunnen worden gekweekt als spheroïden in het membraan van de kelder ECM en epitheliale-achtige kenmerken vertonen. Dit wordt beschreven als een schema in Figuur 6. Cellen werden geïsoleerd van de prostaat van de muis zoals beschreven hierboven en gekweekte in het membraan van de kelder ECM. De cellen gaan groeien in organoids in zo vroeg als 4 dagen van cultuur. Figuur 7 (boven) toont representatieve velden uit de 8 dagen oude culturen de organoids in de kelder membraan ECM tonen. Onder de bovengenoemde kweekomstandigheden uitgroeien allermeest naar de cellen tot solide sferen, met een fractie die met een gedeeltelijke of volledige lumen binnen. Deze organoids hebben meestal een zelfs sferische morfologie. Organoids zijn geoogst en immunostained als beschreven in Colicino et al. ¹³. Figuur 7 (onderste paneel) toont een organoid zonder een lumen (links) en met een lumen (rechts), gekleurd met phalloidin (F-actine marker, groen) en de DAPI (nucleus, blauw). Β-catenine is een cel-cel adhesie marker sterk uitgedrukt op cel interfaces in epitheliale cellen. Figuur 8 toont sterke β-catenine kleuring (groen) op de kruispunten van de cel in spheroïden die mede met F-actine (rood lokaliseren). De spheroïden express ook cytokeratin 5, cytokeratin 8, p63 en androgeen receptor eiwitten, die bewijzen dat de spheroïden inderdaad zijn afgeleid van cellen uit de prostaat¹⁰.

Figuur 1: schematische stroomdiagram demonstreren dissectie van het urogenitaal systeem van de muis en isolatie van de prostaat. Stroomschema paragraaf voor de protocol stappen beschreven 1-2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: dissectie van de muis UGS. Stapsgewijze beelden van de dissectie van de UGS van een 3-maand-oude muis: (een en b) maken de insnijdingen, (c-e) terug te trekken van de huid om de buikstreek, bloot te stellen (f) verschuiven de darmen, (g) de buik vet pads, (h en i) uitpakken de UGS verplaatsen van de buikholte, (j) de uitgepakte UGS, (k) de uitgepakte UGS met de verschillende organen en weefsels als volgt gemarkeerd: SV (geel) = zaadblaasjes; P (rood) = prostaat; F (paars) = vet; V (lichtblauw) = zaadleiders; en B (groen) = blaas. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: dissectie van de muis prostaat. Stapsgewijze beelden voor de dissectie van de prostaat van de muis van de UGS: (a) verwijderen vet, (b) het verwijderen van de urineblaas, (c) het verwijderen van de zaadleiders, (d) de ventrale weergave van de prostaat met de urethra, (e) de dorsale weergave van de prostaat met de urethra, (f-h) verwijderen van de zaadblaasjes, (i) ventrale weergave van de prostaat, ontrafeling van het (j) een dorsale kwab, (k) ontrafeling van een laterale lobe, (l) ontleden een ventral lobe, (m) ontrafeling van een voorste kwab, en (n) de ontleed prostaat lobben: anterior = AP, dorsal = DP, laterale = LP en ventrale = VP. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: Anatomie van de prostaat lobben van muis. Representatieve beelden uit 3-maand-oude muis UGS na verwijdering van het vet, de blaas en de zaadleiders. Beelden tonen lobben van de prostaat met de zaadblaasjes en urethra, met dorsale (a en c) en ventrale (b en d) uitzicht. Top panelen (een en b) geven onaangeroerd beelden, terwijl onder panelen (c en d) de lobben geschetst in het blauw (dorsal weergeven), rood (voorste), geel (ventrale) en groen (laterale). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: de verschillende prostaat lobben variëren aanzienlijk in de histologie. Hier is een H & E gebeitste hele prostaat afbeelding toont de zaadblaasjes, urinebuis en de vier prostaat lobben. Lobben zijn beschreven in oranje (voorste), blauw (dorsal), groen (laterale) en zwart (ventrale). Inzet: representatieve beelden uit elke lobe, genomen onder de doelstelling van een 10 x. Schaal staaf vertegenwoordigt 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6: schematische stroomdiagram demonstreren van de spijsvertering van de prostates en latere sferoïde culturen. Stroomschema voor de protocol stappen beschreven in secties 5 en 6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7: de prostaat cellen uitgroeien tot zelfs sferische spheroïden met of zonder een lumen. Prostaat weefsel geoogst van een wild-type 3-maand-oude muis werd gekweekt volgens het protocol. Culturen waren beeld op een plaat imager onder een 4 X doelstelling, op 8 dagen na cultuur, waaruit de vorming van spheroïden (boven). De spheroïden werden geoogst en gekleurd zoals beschreven in het protocol met een fluorescerende kleurstof-geconjugeerde phalloidin voor F-actine (groen) en DAPI voor kernen (blauw), vervolgens beeld op een draaiende schijf confocal microscoop onder een 40 X water doelstelling (onder). De sferoïde aan de rechterkant getuigt van een lumen. De staven met 50 μm schaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 8: de muis prostaat organoids Toon regulates lokalisatie van β-catenine. Spheroïden geoogst uit 6 dagen oude 3D culturen waren bevlekt, met behulp van een primair antilichaam tegen β-catenine en een fluorescerende kleurstof-geconjugeerde secundair antilichaam en beeld op een draaiende schijf confocal microscoop onder een 40 X water doelstelling. Representatieve beelden tonen immunokleuring voor β-catenine (groen, links), F-actine (rood, midden), en de DAPI (blauw). Het rechter paneel toont alle 3 kanalen samengevoegd. Schaal staaf vertegenwoordigt 20 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Dit document schetst de methoden voor dissectie van de prostaat van de muis en de identificatie van individuele lobben. Ook beschreven is het protocol voor het kweken van de prostaat cellen van de muis in een 3D-cultuur voor in vitro analyse.

Een cruciale stap in het protocol van de dissectie is (1) oogsten het hele UGS uit de muis en het scheiden van de afzonderlijke organen onder een Microscoop dissectie. Het prostaat weefsel is zeer klein en omgeven door de rest van de UGS; Dus, het is praktisch onmogelijk om te oogsten van het orgaan rechtstreeks vanuit de lichaamsholte terwijl de aanschaf van alle vier paren van lobben intact. Daarom is het belangrijk om te oogsten van de gehele UGS van de muis en gaat u verder met het uitpakken van de prostaat. Het is ook essentieel in dit protocol te (2) voert u de stappen uit in een tijdig, maar blijven nauwgezet. Tijd is van essentieel belang tijdens dissectie om te minimaliseren van de aantasting van het weefsel. De specifieke techniek die hier beschreven voor het extraheren van de UGS van de muis is sneller in vergelijking met alternatieven en wordt sterk aangeraden. De gehele dissectie en kwab isolatie procedure duurt meestal 35-40 min., die kan worden verlaagd tot 25 min met meer praktijk. De meest uitdagende deel van de dissectie is het reinigen van het vet rond de UGS, die een groot deel van de totale dissectie tijd inneemt. Het vet moet zorgvuldig worden verwijderd om ervoor te zorgen geen van het blijft met de prostaat, maar het is belangrijk om uiterst voorzichtig niet te verliezen per ongeluk een prostaat weefsel in het proces. Een andere belangrijke stap is (3) niet om de urethra vóór scheiding van de prostaat lobben. Urethra in wezen vormt de basis waarop alle vier paren van prostaat lobben zijn gerangschikt. Het is gemakkelijkst te identificeren van de lobben als ze nog zijn aangesloten op de urinebuis, gebaseerd op hun ruimtelijke distributie met betrekking tot de urinebuis.

Een cruciale stap in het sferoïde cultuur protocol is (1) hakken het weefsel goed. Hakken het prostaat weefsel met een scalpel is een vervelende stap, vooral omdat het prostaat weefsel een plakkerig karakter heeft. Het is echter noodzakelijk dat er maximale opbrengst hakken het weefsel zo klein mogelijk. Een andere belangrijke stap is (2) na trypsinebehandeling pipetteren en spuiten van de formaten passeren opgegeven post-neutralization. Beide deze stappen moeten worden uitgevoerd correct en herhaald, indien nodig, aan het bereiken van optimale cel opbrengst. Tenslotte is het belangrijk (3) niet op de plaat van de kelder membraan ECM te dik of te dun. Als de kelder membraan ECM te dun is verguld (dwz., minder dan 100 µL/cm²), cellen zal niet uitgroeien tot juiste organoids in het midden van de put, waar de gel de dunste zal zijn. Plating het te dik (dwz., meer dan 250 µL/cm²) zal resulteren in de kelder membraan ECM niet goed stollen en glijdt tijdens media wijzigingen. Beplating in het midden van de put zal bijdragen tot de meest zelfs de dikte van de gel.

Het protocol beschreven kan lichtjes worden gewijzigd volgens de experimentele behoeften. De techniek voor de winning van de UGS uit de buikholte verlangt een stevige grip op de urineblaas met een tang. In het geval dat de blaas te vol is, het is belangrijk om de afvoer van de blaas met een spuit van 1 mL en dun (26G of gelijkaardig) naald, om te zorgen voor een goede grip voordat u begint met het uitpakken van het weefsel. Het weefsel moet vochtig met PBS of DMEM tijdens de dissectie-proces worden gehouden. Met behulp van DMEM heeft de voorkeur als het weefsel gaat worden gebruikt voor sferoïde culturen. Stroom cytometry te isoleren subpopulatie van cellen voordat plating, indien gewenst, zoals beschreven door Lukacs et al.kan de geoogste celsuspensie worden gesorteerd. ¹⁰.

Histologische kenmerken van de verschillende prostaat kwabben in dit protocol hebben uitgestippeld, en moet men kunnen identificeren van de kwabben in gezonde prostaat weefsel door het volgen van deze richtlijnen. Er zijn echter bepaalde beperkingen van het proces. In geval van hyperplasie of agressieve tumoren, wordt de epitheliale morfologie verstoord, zodat het aanzienlijk moeilijker onderscheid maken tussen de lobben op basis van de H & E kleuring. In dergelijke gevallen, scheiding van lobben (zoals uiteengezet in dit protocol) voordat insluiten en verkleuring is noodzakelijk als kwab-specifieke informatie nodig is. Zelfs in gezond weefsel is het vaak noodzakelijk om te analyseren lobben apart aangezien ze breed variabiliteit in anatomie en histologie presenteren en differentiële expressie handtekeningen⁶hebben. Echter kan de translationeel relevantie van het scheiden van de kwabben in muis prostaat worden besproken, omdat de menselijke prostaat is niet verdeeld in lobben. Ondanks dit, de muis blijft het beste model voor het bestuderen PCa in vivo, en verschillende Muismodellen geweest ontwikkelde^14,15. De 3D cultuur-methode is vooral een belangrijke techniek die kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de mechanismen van de ziekte. Echter één voorbehoud voor de methode sferoïde cultuur vloeit voort uit de differentiële expressiepatroon van probasin, dat de meest gebruikte promotor voor Cre recombinase in muismodellen van prostaatkanker is. De probasin promotor is overwegend geactiveerd in luminal en tussenliggende cellen maar niet in basale cellen⁷. De hier beschreven voorwaarden van cultuur bevorderen sferoïde vorming overwegend van basale en tussenliggende cellen, maar niet van luminal cellen¹⁰. Vandaar, de resulterende culturen eigenlijk een mengsel van Cre-uitdrukken en het niet-Cre-uiten van spheroïden veroorzaken (dwz., een mix van controle en knock-out spheroïden). Dientengevolge, tijdens de analyse is het belangrijk om immunokleuring voor de proteïne van belang zijn voor het identificeren van de knock-out organoids en conclusies trekken over organoid gedrag gebaseerd op gene knock-outs.

Het belang van deze methoden ligt in de veelzijdige toepassingen van het gebruik van GEMMs in prostaatkanker studies. De beschreven methode van de dissectie heeft gedetailleerde stappen waarmee onderzoekers extraheren prostates sneller en effectiever. De volgorde van de dissectie-proces is ontworpen om ervoor te zorgen dat individuele lobben kunnen worden geïdentificeerd en, zelfs door degenen met minimale ervaring in prostaat dissecties uitgepakt. De cultuur-methode geschetst kan worden gebruikt om verder analyseren GEMM modellen van prostaatkanker. De kweekomstandigheden ruimte laten voor de groei en de overleving van zowel de controle en de tumor cellen. In onze ervaring, hebben wij met succes GEMM prostates die mPIN^{16 vertonen}gebruikt. Muis prostates met hogere rang tumoren zijn ook gebruikt voor sferoïde cultuur analyse¹⁷. De controle muis spheroïden vertonen een zelfs sferische morfologie; spheroïden afgeleid van prostaat tumorcellen kunnen echter verschillen in morfologie en gedrag als gevolg van hun neoplastische potentieel aantonen. Vandaar, studeren organoid gedrag in vitro zorgt voor een uitgebreide kijken naar de kenmerken van deze cellen, en eventueel opmerkingen van sferoïde gedrag in real-time via live-cel imaging.

Tot slot kunnen de prostaat dissectie en cultuur in dit protocol omschreven methoden worden opgenomen in verschillende soorten studies waarbij GEMMs om door te gaan met het verstrekken van informatie over prostaatkanker in alle downstream-toepassingen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Dissection microscope
RPMI medium	Thermofisher Scientific	11875093
Dissection medium (DMEM + 10%FBS)	Thermofisher Scientific	11965-084
Fetal Bovine Serum	Thermofisher Scientific	10438018
PBS (Phosphate buffered saline)	Thermofisher Scientific	10010031
Collagenase	Thermofisher Scientific	17018029	Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
DNase I	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
Syringes and Needles	Fisher Scientific
Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm	Fisher Scientific	22-363-547
PrEGM BulletKit	Lonza	CC-3166	Add all componenets, aliquot and store at -20 °C.
Matrigel membrane matrix	Thermofisher Scientific	CB-40234
Dispase II powder	Thermofisher Scientific	17105041	Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C