Summary
Gensplejsede mus er nyttige modeller for at undersøge prostatakræft mekanismer. Her præsenterer vi en protokol for at identificere og dissekere prostata lapper fra en mus urogenitale system, differentiere dem baseret på histologi, og isolere og kultur primære prostata celler in vitro- som spheroids for downstream analyser.
Abstract
Gensplejsede musemodeller (GEMMs) fungerer som effektiv prækliniske modeller for at undersøge de fleste typer af menneskelige kræftformer, herunder prostatakræft (PCa). Forståelse af anatomi og histologi af musen prostata er vigtigt for effektiv brug og ordentlig karakterisering af sådanne animal modeller. Musen prostata har fire særskilte par kamre, hver med deres egne karakteristika. Denne artikel viser den korrekte metode til dissektion og identifikation af musen prostata lapper for sygdom analyse. Efter dissektion, prostata celler kan være yderligere kultiveret in vitro- for mekanistisk forståelse. Da musen prostata primærelementer tendens til at miste deres normale egenskaber når kulturperler i vitro, vi skitsere her en metode til at isolere cellerne og voksende dem som 3D klumpformet kulturer, som er effektiv for at bevare den fysiologiske Karakteristik af cellerne. Disse 3D kulturer kan bruges til at analysere celle morfologi og adfærd i nær-fysiologiske tilstande, undersøger ændrede niveauer og lokaliseringer af vigtige proteiner og veje er involveret i udviklingen og progression af en sygdom, og ser på svar til medicinsk behandling.
Introduction
Det videnskabelige samfund har forsøgt at belyse den komplekse mekanisme af udviklingen af menneskelige kræft i årtier. Identifikation af mulige nøgleaktører og narkotika mål begynder med patientens celler og væv undersøgelser, kræver translationel anvendelsen af sådanne resultater ofte brug af prækliniske dyremodeller. Brugen af gensplejsede mus modeller (GEMMs) til model menneskelige kræftformer steget støt siden oprettelsen af mus modeller af menneskelige kræftformer konsortiet (NCI-MMHCC), et udvalg, der søgte at beskrive og forene Karakteristik af musen kræft modeller for forskere over hele verden1,2. Musemodeller opfylde behovet for Mekanistiske undersøgelser i prækliniske studier af de fleste typer af kræft, for at forstå udviklingen, progression, svar på behandlinger, og erhvervet modstand3.
Prostatakræft er den hyppigst forekommende kræftform hos mænd, der berører mere end 160.000 mænd hvert år4. Aggressive former af sygdommen hævder tusindvis af liv hvert år. Men mekanismen af sygdomsprogression er stadig dårligt forstået. Dette resulterer i en alvorlig mangel på effektive behandlingsmuligheder for avancerede og metastatisk prostatakræft, som det fremgår af den høje dødelighed i fremskreden prostatacancer patienter4. Derfor, er der et voksende behov for prækliniske modeller at studere prostatakræft. Men på grund af de iboende forskelle mellem mus og menneskelig prostata, modellering af prostatakræft i GEMMs ikke vinde popularitet indtil Bar Harbor klassificeringssystem, som blev indført i 2004, som skitserede histopatologiske forandringer i mus prostata ved genmanipulation, identifikation af neoplastiske forandringer og deres relation til stadier af kræft progression i mennesker5. En vigtig egenskab ved musen prostata, der skal tages i betragtning samtidig studerer enhver prostata CLAUSS model er tilstedeværelsen af fire særskilte par lapper: anterior, laterale, ventrale og dorsale. Lapper præsentere væsentlige forskelle i histopatologi og gen udtryk mønster6. Probasin protein udtryk mønster kan variere mellem lapper i unge efter puberteten mus7, der må betragtes da Cre-baserede CLAUSS modeller er for det meste konstrueret ved hjælp af en probasin-baseret promotor kaldet Pb-Cre47. De resulterende rumlige og tidsmæssige forskelle i Cre udtryk ofte føre til forskelle i tumor indledningen og progression tidslinjer samt forskelle i neoplastiske forandringer mellem lapper. Derfor er det vigtigt at tage højde for sådanne forskelle samtidig studerer tumor udvikling i prostata GEMMs, og de enkelte kamre kan skal vurderes særskilt for at opnå reproducerbare resultater. Den første del af denne artikel beskriver de rette metoder til at dissekere en mus prostata, identificere og adskille hver lap og anerkender de histologiske forskelle mellem lapper.
Mens analyse af tumorvækst og histopatologi kan give værdifuld indsigt i tumor udvikling, giver de ikke mange oplysninger om molekylære mekanismer. For at studere mekanismen af tumor udvikling og progression, er det ofte nyttigt at analysere tumor celler in vitro. Flere metoder er blevet foreslået i de år, der involverer kulturer af disse celler, herunder suspension kulturer, 3D kulturer8 og for nylig, regelmæssig 2D kulturer9. De fleste af disse metoder medfører god celle overlevelse og spredning satser, skabe 3D kulturer et miljø, der er tættest på fysiologiske tilstande. I 3D eller klumpformet kulturer dyrkes i en basalmembran ekstracellulære matrix (ECM), har fuldt differentierede luminale cellerne normalt meget lav overlevelsesrate; basal og mellemliggende celler (for det meste stamceller) er imidlertid at udbrede og producere celle klynger kaldet spheroids10. Dette gør den velegnet til en kræft undersøgelse, da epitelial kræft menes at stamme fra stamceller (populært kendt som kræftstamceller)11. Den anden del af denne protokol beskriver en metode til dyrkning af musen prostata celler i 3D kulturer. De resulterende kugler kan bruges til flere typer af downstream analyser, herunder undersøgelse af organoid morfologi og adfærd af levende celle imaging, immunofluorescens farvning for forskellige proteiner, og studiet af svar til kemoterapeutiske behandlinger.
Samlet, målet med denne protokol er at skitsere optimale metoder til at bruge musemodeller i prostatakræft ved at beskrive teknikker for anatomi og dissektion af musen prostata og behandling af væv til klumpformet kulturer og in vitro- analyse .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus eksperimenter beskrevet her blev udført efter retningslinjerne i de institutionelle IACUC-godkendte protokoller på SUNY Upstate medicinske universitet.
1. det urogenitale System (UGS) dissektion
Bemærk: Skematiske er præsenteret i figur 1.
- Aflive en 3-måned-forhenværende mandlige C57BL/6 mus ved hjælp af metoden CO2 slimhindeirritation eutanasi eller en anden godkendt teknik.
Bemærk: Mus i alderen mellem 3 og 12 måneder kan bruges med succes til eksperimentet. Ældre mus (> 6 måneder) vil sandsynligvis have mere fedt omkring UGS, som skal ryddes. Identifikation og adskillelse af fligerne er ofte vanskeligt i mus yngre end 3 måneder. Andre stammer, der kan bruges til eksperimentet, så godt. - Placer musen på ryggen og sikre benene med knappenåle, så den ventrale side af dyret er udsat.
- Spray 70% ethanol på musens maven og tørre det rene.
Bemærk: Barbering maven hår før dissektion ikke er påkrævet. - Løft huden fra maven, sammen med muskel lag, med et par medium stump pincet og gøre et omvendt Y-formet snit på maven ved hjælp af saks.
- Først, sikre et lige snit med en skarp saks fra lige over penis til brystbenet (figur 2a).
- Skåret fra bunden af indsnit til hver tå, op til lår (figur 2b). Fold tilbage huden på begge sider og i bunden for at se hele maveregionen (figur 2 c-e).
Bemærk: Cut størrelsen varierer afhænge af musen alder og størrelse. Størrelsen af den oprindelige lige snit kan variere fra 1,5 til 4 cm, afhængigt af størrelsen af musen.
- Flytte over de andre organer til at udsætte UGS. Løfte og flytte brun-gul tarme (figur 2f). Afhente de abdominale fedtpuder (den uigennemsigtig hvid svampet væv) med pincet og flytte dem til sider (fig. 2 g).
Bemærk: UGS består af Sædblærer, urinrøret, prostata, ductus deferens (sædlederen) og urinblæren. Det kan identificeres af den karakteristiske par af uigennemsigtig hvid halvrunde buer, (som er Sædblærer), væskefyldt blære sac knyttet til bunden. Den gennemsigtige væv placeret lige under Sædblærer er prostata. - Find UGS, fast holder urinblæren med stumpe pincet, og løft den hele UGS opad fra mus maven.
Bemærk: Hvis blæren er fuld, dræne det først med en lille sprøjte til at give et bedre greb med pincet og reducere risikoen for brud blæren. - Fortsætter med at trække på blæren, slide et par saks nedenunder blæren og prostata hele vejen til rygsøjlen, og gøre et snit. Skære igennem enhver resterende tilslutninger til bughulen (figur 2 h og 2i). Pas på ikke at skære for tæt til UGS at undgå utilsigtet skære igennem enhver prostata væv.
Bemærk: Samtidig med at klippe under UGS, saksen bør indsættes hele vejen til bagsiden af musen, således at cut snaps rygsøjlen samt. Denne metode resulterer i overskæring næsten alle forbindelser mellem UGS og bughulen i en snip, reducere den tid at udtrække væv fra musen. - Fjerne UGS og placere den i 2-6 mL (nok til at dække vævet) af phosphat bufferet saltvand (PBS) eller Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM, høje glukose) i en 6 cm petriskål (figur 2j og 2 k) og flytte den til en dissektion mikroskop (10 X forstørrelse).
Bemærk: Ændre dissekere medierne som kræves i de resterende trin.
2. dissekere prostata
- Ryd alle fedt fra begge dorsal og ventral sider med et par fine pincet og microdissection saks (figur 3a). Bruge lignende kirurgiske instrumenter for resten af dissektion protokol.
Bemærk: Fedt er ofte tæt sammenflettet med UGS (kan identificeres ved dens hvide svampet udseende); Derfor skal dette trin udføres omhyggeligt for at undgå uheld snipping off enhver prostata væv. Det kan tage op til 10-15 min. til at klare alle fede. - Hold og trække blæren med pincet og snip det i bunden med en saks (figur 3b).
- Placer de resterende væv ventrale side op. Hold en ductus deferens med pincet, spore det til basen med en saks, og snip det (figur 3 c), og Gentag på anden siden. Fjerne ductus deferens, nu efterlod prostata (gennemsigtig og verminous), Sædblærer (uigennemsigtig og hvide, halvcirkelformet), og urinrøret (pink-rød og uigennemsigtige tube) (figur 3d og 3e).
- Indsæt pincet i mellem den inderste bue af Sædblærer og prostata væv forreste lapper. Vriste fra hinanden Sædblærer og prostata og snip enhver bindevæv som nødvendige (figur 3f). Spore Sædblærer til deres base i urinrøret og fjerne dem (figur 3 g og 3 h). Pas på ikke at punktere dem.
- Fortsæt til dissekere ud de enkelte prostata fliger.
3. brutto anatomi af prostata og individuelle Lobe Microdissection (tal 3i-Nielsen, figur 4)
- Flip væv med et par af stump pincet, således at den dorsale side vender opad, viser de dorsale fliger, som vil ligne en sommerfugl vinger.
- Indsamle de dorsale kamre ved at holde lap med pincet og snipping i bunden med en saks (figur 3j).
- Flip-over den resterende væv til den ventrale side.
- Indsamle sidefligerne, som er små og som regel wrap urinrøret på siden, som er klemt inde mellem de forreste, ventrale og dorsale kamre (figur 3 k).
- Næste, indsamle de ventrale fliger, der er større end den laterale kamre og ligge om urinrøret ventrally (figur 3 l).
- Sidste, høste de forreste fliger, den største af fire ved skæring og kassere urinrøret (figur 3 m).
- Behandle væv stykker efter eksperimentel behov. Gå til afsnit 4 for histologi eller til afsnit 5 for klumpformet kultur.
4. lap identifikation og morfologi fra hæmatoxylin og Eosin-farvede lysbilleder
- Fix det prostata væv og integrere den i paraffin. Fortsætte med farvning dias med hæmatoxylin og eosin (H & E) til at se og identificere forskelle i prostata lapper baseret på histologi, ved hjælp af de egenskaber beskrevet af Oliveira mfl. 12 (figur 5).
5. behandling af væv til 3D kultur10
Bemærk: Dette er skitseret i figur 6.
- Fortsætte med dyrkning af de hele prostata eller enkelte kamre som pr de eksperimentelle behov. Overføre den prostata væv til en 10 cm parabol indeholder 2-3 mL af DMEM. Med en skalpel, hakkekød den prostata tubuli som fint og jævnt som muligt under dissektion mikroskop.
- Fortsætte med de resterende trin under en vævskultur hætte, under sterile forhold.
- Overføre væv stykker sammen med DMEM at en 15 mL tube og øge lydstyrken til 9 mL med DMEM. Der tilsættes 1 mL af 10 x collagenase stamopløsning DMEM-væv blanding og vortex at blande.
Bemærk: Collagenase stamopløsning er 10 mg/mL i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, og den endelige koncentration i 15 mL tube er 1 mg/mL. - Røret anbringes på en roterende shaker eller tube rotator i 2 timer ved 37 ° C, for collagenase til at forringe den ekstracellulære matrix.
- Der centrifugeres tube på 400 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Supernatanten og resuspend i 2 mL varm 0,05% trypsin-EDTA at kløve de celle-celle og celle-matrix sammenvoksninger. Overføre røret til 37 ° C i 5 min.
Bemærk: Hvis væv klumper er for store til at blande godt, skær pipette spidsen med et barberblad til at foretage en bredere boring. - Bryde op nogen væv klumper af pipettering med P1000 pipette 8 - 10 gange, derefter gentage med P200 pipette.
- Neutralisere trypsin med 3 mL af komplet DMEM. Tilføje 500 U af DNAase jeg og bland godt.
- Passere gennem en 5 mL sprøjte 5 - 10 gange med en 18 G nåle. Derefter passere gennem 5 gange med en 20 G kanyle.
- Gentag trin 4-8 endnu engang hvis løsningen indeholder stadig store væv klumper.
- Filter cellesuspension gennem et 40 μm filter placeret på en 50 mL tube. Skyl 15 mL tube med 5 mL af DMEM og igennem det samme filter. Gentag skylles.
- Kassér filteret og centrifugeres rør indeholdende gennemstrømning på 400 x g i 5 min ved stuetemperatur.
6. plating og dyrkning af celler
- Resuspenderes i 0,5 mL af komplet prostata epitelial celle vækstmedium (PrEGM). Tælle celle tæthed ved hjælp af en celle counter eller hemocytometer og fortyndes celler til 5 x 105 celler/mL i komplet PrEGM.
Bemærk: Udbytte fra en 3-måned-forhenværende mus hele prostata kan variere fra 3 x 105-106 celler. Derfor er det vigtigt at i første omgang resuspenderes i højst 0,5 mL af PrEGM (som nævnt ovenfor) således at den ønskede celle tæthed kan opnås, selv med lavt udbytte. - Mix kræves mængden af celler med basalmembranen ECM i et 2:3 volumen ratio (60% basalmembranen ECM og 40% cellesuspension) og plade i en multi godt plade eller kammer dias som pr de eksperimentelle behov.
Bemærk: For immunfarvning, plade på glas-bund plader eller kammer dias, der dækker hele godt eller midten af brønden. Plade omkring kanten af brønden, hvis tælle de resulterende organoids, eller plade som adskillige dråber over hele brønden, hvis plating højere lydstyrker. Være opmærksomme på, at ikke sprede det for tyk eller for tynd. Plade mindst 100 µL af matrix-celle blanding pr. 1 cm2 af plating område; for eksempel, i et kammer dias med en 2 cm2-godt areal, 200 µL af matrix-celle blanding indeholdende 5 x 104 celler skal være forgyldt. - Overføre plade/dias til et 37 ° C kuvøse med 5% CO2 i 30 min for basalmembranen ECM at størkne. Derefter tilføje pre varmede komplet PrEGM for at dække godt, pas på ikke for at forstyrre basalmembranen ECM-stikket.
- Fjern halvdelen af medierne og tilføje frisk media hver 2-3 dage. Vokse spheroids i 5-10 dage.
- Fortsætte med høst (trin 7), immunfarvning (trin 8), og/eller imaging til downstream applikationer.
7. høst kugler
- For at høste sfærer, Aspirér medierne omhyggeligt uden at forstyrre basalmembranen ECM gel plug og tilsættes 1 mL af 1 mg/mL dispase løsning i PrEGM pr. 100 µL af basalmembranen ECM.
Bemærk: Det er lettere at høste spheroids, hvis de er belagt i brønden eller rand (i stedet for at dække det hele godt), at sikre, at en tilstrækkelig mængde dispase-opløsning kan føjes til brønden. - Skrab bunden af pladen med en celle skraber til løft fra basalmembranen ECM gel i dispase-PrEGM-løsning.
- Pipette hele løsningen op og ned ad en gang med en lang bar 1000 µL pipette tip eller 5 mL pipette til at bryde op gel plug i mindre stykker.
Bemærk: Skåret spidsen af en 1000 µL pipette tip med et barberblad til at gøre en bred bore spidsen. - Inkuber i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2 i 1-2 timer indtil basalmembranen ECM er helt opløst.
Bemærk: Dette kan sikres ved visuel inspektion af godt bunden mens vippe plade for at bekræfte, at ingen flere bidder af gel forbliver. - Indsamle cellesuspension i en 15 mL konisk slange.
- Centrifugeres kugler på 250 x g i 5 min ved stuetemperatur og fortsætte med downstream applikationer.
8. immunfarvning af kugler13
Bemærk: Efter spheroids er vokset til den ønskede mængde af tid, basalmembranen ECM kan opløses og kugler kan farves, som beskrevet i Colicino et al. 13.
- Kort, skyl kulturer med PBS og tilføje 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) direkte til basalmembranen ECM gel plug. Inkuber i 30-90 min. ved stuetemperatur med langsom ryster, indtil basalmembranen ECM er fuldt opløst, erstatter frisk PFA hvert 30 min.
Bemærk: PFA vil opløse gel plug og løse spheroids under denne proces. - Derefter vask med PBS 3 gange, og Tilføj 50 mM ammoniumklorid i 10 min til at slukke alle autofluorescence fra PFA. Gentag for 3 vasker med PBS.
- Permeabilize med 0,1% ikke-ionisk vaskemiddel til 5 min og blok med PBSAT (PBS, 1% BSA, 0,5% Triton X-100) i 30 min.
- Inkuber med en primær antistof i PBSAT natten over ved 4 ° C, efterfulgt af 3 vasker med PBSAT og en sekundær antistof i PBSAT i 2 timer ved stuetemperatur.
- Gentag vasker med PBSAT og pletten med DAPI efter producentens protokol, hvis det ønskes. Vask 3 eller flere gange med PBS.
- Tilføje PBS med 200 mM 1,4-diazabicyclo [2.2.2] oktan (DABCO) antifade reagens og gå videre til billedbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musen prostata lapper kan identificeres og dissekeret ved hjælp af deres placeringer Sædblærer og urinrøret. Musen prostata består af 4 par lapper beliggende dorsalt og ventrally Sædblærer og urinrøret. Figur 4a og 4b (top) Vis intakt prostata, Sædblærer og urinrøret dorsal og ventral synspunkter. Panelerne bunden (figur 4 c og 4 d) viser de forskellige kamre skitseret for identifikation. Lapper kan være adskilt fra mus så unge som 3 måneder.
De forskellige prostata kamre afviger betydeligt i histologi (figur 5). Alle mus prostata fliger er sammensat af flere kirtel profiler, der består af en lumen, omgivet af sekretoriske epitelceller; men formen af lapper, organisation af celler og arten af sekretionen varierer fra lap på lap. Identificerbare kendetegn fra H & E-farvede mus prostata er blevet effektivt skitseret af Oliveira et al. 12, kort skitseret her. Forreste lapper har moderat til store acini med hyppige infoldings og stærkt eosinofil sekretion. Dorsale lapper vises ligesom forreste med eosinofil sekretion, men har meget mindre acini og mindre infoldings. Sidefligerne har små til store acini med karakteristiske flade luminale grænser og eosinofil sekretion. Ventrale fliger er strukturelt ligesom sidefligerne, også med flad luminale grænser, men har en unik bleg ikke-eosinofil luminale sekretion.
Musen prostata celler kan være kulturperler som spheroids i basalmembranen ECM og udstille epitel-lignende egenskaber. Dette er skitseret som en skematisk i figur 6. Celler blev isoleret fra mus prostata som beskrevet ovenfor og kulturperler i basalmembranen ECM. Cellerne begynder at vokse ind i organoids i så tidligt som 4 dage af kultur. Figur 7 (top) viser repræsentative felter fra 8 dage gamle kulturer viser organoids i basalmembranen ECM. På ovennævnte kultur-betingelser vokse de fleste af cellerne ind i solid kugler, med en brøkdel at have en fuld eller delvis lumen inde. Disse organoids har som regel en selv sfæriske morfologi. Organoids blev høstet og immunostained som beskrevet i Colicino et al. 13. figur 7 (nederste panel) viser en organoid uden en lumen (venstre) og med en lumen (højre), farves med phalloidin (F-actin markør, grønne) og DAPI (nucleus, blå). Β-catenin er en celle-celle vedhæftning markør kraftigt udtrykt på celle-celle grænseflader i epitelceller. Figur 8 viser stærke β-catenin farvning (grøn) i celle-celle vejkryds i spheroids, der co Lokaliser med F-actin (rød). Spheroids express også cytokeratin 5, cytokeratin 8, p63 og androgen receptorproteiner, som dokumenterer, at spheroids faktisk stammer fra celler med oprindelse i prostata10.
Figur 1: skematisk rutediagram demonstrere dissektion af musen urogenitale system og isolation af prostata. Flowdiagram afsnit for protokollen trinene beskrevet i 1-2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: dissektion af musen UGS. Trin for trin billeder fra dissektion af UGS fra en 3-måned-forhenværende mus: (en og b) at gøre indsnit, (c-e) trække sig tilbage i huden for at udsætte den abdominale område, (f) at flytte tarme, (g) flytter de abdominale fedtpuder, (h og i) uddrager UGS fra den bughulen, (j) den udpakkede UGS, (k) den udpakkede UGS med de forskellige organer og væv mærket som følger: SV (gul) = Sædblærer; Pedersen (red) = prostata; F (lilla) = fedt; V (lyseblå) = sædlederen; og B (grøn) = blære. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: dissektion af musen prostata. Trin for trin billeder til dissektion af musen prostata fra UGS: (a) at fjerne fedt, (b) fjerne urinblæren, (c) at fjerne sædlederen, d ventrale visning af prostata med urinrøret, (e) dorsale udsigt af prostata med urinrøret, (f-h) at fjerne Sædblærer, (i) ventrale visning af prostata, (j) dissekere en dorsal lap, (k) dissekere en laterale lap, (l) dissekere en ventrale lap, (m) dissekere en forreste lap og (n) dissekeret prostata lapper: forreste = AP, dorsale = DP, lateral = LP og ventrale = VP. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: anatomi af musen prostata fliger. Repræsentative billeder fra 3-måned-forhenværende mus UGS efter fjernelse af fedt, blære og sædlederen. Billederne viser prostata lapper med Sædblærer og urinrøret, med dorsal (a og c), og ventrale (b og d) synspunkter. Top paneler (en og b) viser urørt billeder, mens bunden paneler (c og d) viser lapper vises med blåt (dorsale), rød (forreste), gul (ventrale) og grønne (lateral). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: de forskellige prostata kamre varierer betydeligt i histologi. Her er en H & E-farvede hele prostata billede viser Sædblærer, urinrøret, og de fire prostata fliger. Fligerne er skitseret i orange (forreste), blå (dorsale), grøn (lateral) og sort (ventrale). Indsatser: repræsentative billeder fra hver lap, taget under en 10 x mål. Skalalinjen repræsenterer 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: skematisk rutediagram demonstrerer fordøjelsen af prostata og efterfølgende klumpformet kulturer. Flowdiagram for protokollen trin beskrives i afsnit 5 og 6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: prostata celler vokse ind i selv sfæriske spheroids med eller uden en lumen. Prostata væv høstet fra en wild-type 3-måned-forhenværende mus var kulturperler ifølge protokollen. Kulturer var afbildet på en plade imager en 4 X med målet på 8 dage efter kultur, viser dannelsen af spheroids (øverst). Spheroids blev høstet og farves som beskrevet i protokol med et fluorescerende farvestof-konjugeret phalloidin til F-actin (grøn) og DAPI for kerner (blå), derefter afbildet på en roterende disk Konfokal mikroskop under en 40 X vand mål (nederst). Klumpformet til højre viser tegn på en lumen. Skala søjler repræsenterer 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: mus prostata organoids Vis junctional lokalisering af β-catenin. Spheroids høstet fra 6 dage gamle 3D kulturer var plettet, ved hjælp af en primære antistof mod β-catenin og et fluorescerende farvestof-konjugeret sekundær antistof, og afbildet på en roterende disk Konfokal mikroskop under en 40 X vand mål. Repræsentative billeder viser immunfarvning for β-catenin (grøn, venstre), F-actin (rød, midterste) og DAPI (blå). Højre panel viser alle 3 kanaler fusioneret. Skalalinjen repræsenterer 20 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver metoder til dissektion af musen prostata og identifikation af individuelle fliger. Også beskrevet er protokol til dyrkning mus prostata celler i en 3D kultur for in vitro- analyse.
Et kritisk trin i dissektion protokol er (1) høst det hele UGS ud af musen og adskille de enkelte organer under et mikroskop for dissektion. Den prostata væv er meget små og er omgivet af resten af UGS; Det er således næsten umuligt at høste orgel direkte fra kroppen hulrum mens rufferi alle fire par lapper intakt. Derfor er det vigtigt at høste den hele UGS fra musen og derefter gå videre til at udtrække prostata. Det er også afgørende i denne protokol til (2) udføre trinnene i tide, men forbliver omhyggelig. Tiden er essensen i dissektion for at minimere væv nedbrydning. Den særlige teknik beskrevet her til at udtrække UGS fra mus er hurtigere i forhold til alternativer og kan varmt anbefales. Hele dissektion og lap isolation proceduren tager normalt 35-40 min, som kan sænkes til 25 min med mere praksis. Den mest udfordrende del af dissektion er rengøring fedt omkring UGS, som fylder en stor del af fuldstaendig dissektion tid. Fedt skal fjernes omhyggeligt for at sikre, intet af det er stadig med prostata, men det er vigtigt at være meget omhyggelig med ikke at ved et uheld mister enhver prostata væv i processen. En anden kritisk trin er (3) ikke fjerne urinrøret før adskillelse af prostata fliger. Urinrøret hovedsagelig danner base på hvilken alle fire par af prostata fliger er arrangeret. Det er lettest at identificere lapper, hvis de stadig er knyttet til urinrøret, baseret på deres geografiske fordeling med hensyn til urinrøret.
Et kritisk trin i klumpformet kultur protokol er (1) hakkes vævet godt. Hakning af prostata væv med en skalpel er en kedelig skridt, især fordi den prostata væv har en klæbrig karakter. Det er imidlertid vigtigt at opnå maksimalt udbytte hakning væv så lille som muligt. Et andet vigtigt skridt er (2) pipettering efter trypsinization og passerer gennem sprøjter af størrelserne angivet post-neutralization. Begge disse trin skal udføres korrekt og gentages, hvis det kræves, at opnå optimal celle udbytte. Endelig er det vigtigt (3) ikke at plade basalmembranen ECM for tyk eller for tynd. Hvis basalmembranen ECM er belagt for tynd (dvs., mindre end 100 µL/cm2), celler vil ikke vokse ind i korrekt organoids i brønden, hvor gelen vil være den tyndeste. Plating den for tyk (dvs., mere end 250 µL/cm2) vil resultere i basalmembranen ECM ikke solidifying ordentligt og glide af under medieændringer. Plating midt i brønden vil bidrage til at opnå den mest selv gel tykkelse.
Protokollen beskrevet kan være ændret en smule efter eksperimentel behov. Teknik til ekstraktion af UGS fra bughulen kræver et fast greb på urinblæren med pincet. I tilfælde af blæren er for fuld, det er vigtigt at tømme blæren med en 1 mL sprøjte og tynd (26G eller lignende) nål, til at sikre en korrekt greb før du begynder at udtrække væv. Vævet bør holdes fugtig med PBS eller DMEM under hele dissektion. Ved hjælp af DMEM er at foretrække hvis væv vil blive brugt til klumpformet kulturer. Den høstede cellesuspension kan sorteres ved flowcytometri at isolere delpopulationer af celler før plating, hvis det ønskes, som beskrevet af Lukacs mfl. 10.
Histologiske karakteristika ved de forskellige prostata fliger er blevet skitseret i denne protokol, og man bør kunne identificere lapper i sund prostata væv ved at følge disse retningslinjer. Der er dog visse begrænsninger af processen. I tilfælde af hyperplasi eller aggressive tumorer afbrydes epitelial morfologi, som kan gøre det væsentligt sværere at skelne mellem fligene er baseret på H & E farvning. I sådanne tilfælde, adskillelse af lapper (som beskrevet i denne protokol) før indlejring og farvning er nødvendigt hvis lap-specifikke oplysninger er nødvendig. Selv i raske væv er det ofte nødvendigt at analysere lapper separat, da de nuværende bred variation i anatomi og histologi og har differentieret udtryk signaturer6. Dog kan translationel relevansen af adskille lapper i mus prostata diskuteres, da menneskelig prostata ikke er opdelt i lapper. På trods af dette, musen er stadig den bedste model til at studere PCa i vivo, og flere musemodeller har været udviklede14,15. Metoden 3D kultur er især en vigtig teknik, der kan bruges til at undersøge mekanismerne for sygdommen. Men en advarsel af metoden klumpformet kultur opstår fra det differentierede udtryk mønster af probasin, som er den almindeligt anvendte promotor for Cre recombinase i prostata cancer musemodeller. Probasin arrangøren er overvejende aktiveret i luminale og mellemliggende celler men ikke i basal celler7. Kultur betingelser beskrevet her fremme klumpformet dannelse overvejende fra basal og mellemliggende celler, men ikke fra luminale celler10. Derfor, de deraf følgende kulturer faktisk producerer en blanding af Cre-udtrykker og Cre-udtrykke spheroids (dvs., en blanding af kontrol og knock-out spheroids). Som følge heraf under analysen er det vigtigt at immunostain for protein af interesse at identificere knock-out organoids og drage konklusioner på organoid adfærd baseret på gen-knock-outs.
Betydningen af disse metoder ligger i de mangesidede programmer ved at bruge GEMMs i prostata cancer undersøgelser. Dissektion metoden har detaljerede trin, som vil gøre det muligt for forskere at udtrække vurderede hurtigere og mere effektivt. Rækkefølgen af dissektion proces er designet til at sikre, at enkelte kamre kan identificeret og ekstraheret, selv af dem med minimal erfaring i prostata dissektioner. Ved kultur metoden kan bruges til at analysere yderligere CLAUSS modeller af prostatakræft. Dyrkningsbetingelserne bør give mulighed for vækst og overlevelse af både kontrol og tumor celler. Vores erfaring, har vi med succes brugt CLAUSS vurderede, at udstiller mPIN16. Musen prostata med højere grade tumorer har også været brugt til klumpformet kultur analyse17. Control mus spheroids udviser en endog sfæriske morfologi; dog kan spheroids stammer fra prostata tumorceller påvise forskelle i morfologi og adfærd på grund af deres neoplastiske potentiale. Dermed, at studere organoid adfærd i vitro vil give en udvidet kigge ind Karakteristik af disse celler, og eventuelt observationer af klumpformet adfærd i realtid via live-celle billeddannelse.
Afslutningsvis, kan prostata dissektion og kultur i denne protokol beskrevne metoder integreres i forskellige typer af undersøgelser, hvor GEMMs for at fortsætte med at give oplysninger om prostatakræft i alle downstream applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute, R01CA161018 til LK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
- Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
- Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Society, A. C. Cancer Facts and Figures. , (2018).
- Shappell, S. B., et al. Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).
- Hofner, T., et al. Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin. Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Clarke, M. F., Fuller, M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Colicino, E. G., et al. Gravin regulates centrosome function through PLK1. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).
- Ittmann, M., et al. Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O. Mouse models of prostate cancer. Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).
- Xiong, X., et al. Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice. Oncogenesis. 1, e26 (2012).
- Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells. Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).
