Summary
Здесь, протокол для изоляции и характеристика CD4+ Т-клеток описал подмножеств из периферической крови человека. Очищенный CD4+ Т-клетки анализируются проточной цитометрии для определения пропорции T-фолликулярных клеток помощник подмножеств.
Abstract
Ненормальная T-фолликулярная активность клеток помощник (ЦГЗ) обнаружен в аутоиммунных условий, и их присутствие ассоциируется с клинических исходов при анализе микроокружения лимфоузлов в B-клеточной неходжкинской лимфомы. Подмножества циркулирующих Т-фолликулярных клеток помощник (cTfh), циркулирующей отсека памяти Tfh клеток в крови, также возмущенных в болезни и поэтому представляют собой потенциальный Роман интеллектуального биомаркеров. Периферической крови ориентированное тестирование выгодно, потому что это относительно неинвазивные и позволяет простой последовательный мониторинг. Эта статья описывает метод для изоляции CD4+ Т-клетки из крови человека и дальнейшего анализа подачей cytometry перечислить cTfh клеток и пропорции их различных подмножеств (cTfhPD-1-/ +/ Привет, cTfh1, 2, 17 и cTfh1/17). Уровень этих подмножеств был затем сравнить между обычные предметы и пациентов с лимфомой. Мы обнаружили, что метод был достаточно прочным, чтобы получить надежные результаты регулярно собранного материала пациента. Техника, которую мы опишем для анализа может быть легко адаптирована для сортировки клеток и нисходящие приложения, такие как RT-PCR.
Introduction
T-фолликулярная хелперы (ЦГЗ) являются CD4 Т-клеток подмножества, который первоначально был охарактеризован в лимфоидной ткани1+ . Эти клетки выразить PD-1 и CXCR5 поверхностная рецепторов, секретируют Ил-21 и Ил-4 и показать выражение ядерного транскрипционного фактора, BCL-62,3. Как их названия, они находятся в зародышевых центров и необходимы для высокое сродство антитела производства1.
Dysregulated Tfh ответы были вовлечены в патогенез заболевания, прежде всего аутоиммунных заболеваний, где они способствуют расширению клетки аутореактивная B4. Они также играют роль в микроокружения опухоли твердых5,6 и7лимфоидной опухоли. И наоборот генетические дефекты поверхности белков, необходимых для Tfh функционировать как индуцибельной Т-клеточной costimulator (МСОН) результат в синдромы иммунодефицита человека8. CD4+ CXCR5+ клеток в периферической крови человека называются циркулирующих Т-фолликулярных клеток помощник (cTfh) и считается отсек памяти Tfh клеток в тканях9. Цель метода, описанного здесь является анализ cTfh подмножеств после CD4+ ячейки изоляции от периферической крови.
Были определены несколько подмножеств cTfh и эффективность, с которой они помогают B-клетка отличается от одной подмножество другой9,10,,1112. Относительные пропорции этих подмножеств изменяются в ряде заболеваний, наиболее заметно аутоиммунное заболевание в котором есть почти всегда является относительное увеличение более функциональных PD-1+/ Привет или cTfh2 или cTfh17 подмножества по сравнению с менее функциональные PD-1– или cTfh1 подмножеств12. Масштабы этих изменений часто связать с клинические параметры, включая болезнь активности и аутоантител титры, указывающее потенциальную роль cTfh подмножество распределения как прогностического биомаркера в болезнь, которая может отражать деятельность ЦГЗ в лимфоидной ткани9,12,,1314. Кроме того проб крови от участников является быстрым, безопасным и приемлемым и поэтому позволяет последовательный мониторинг для анализа прогрессирования заболевания или ответа на терапию.
Использование изолированных CD4+ Т-клетки над традиционными периферической крови одноядерных клеток (PBMNC) подвески позволяет выше пропускная способность потока цитометрии эксперименты путем сокращения времени, необходимого для приобрести значительное количество клеток cTfh для анализа. Это особенно полезно, когда сортировка клеток из редких cTfh подмножества потока с помощью активации клеток, сортируя (FACS). Чтобы помочь эффективности, эти подвески можно криоконсервированных для включения «Пакетная обработка» образцов для использования в эксперименте цитометрии потока. На тестирование, CD4+ чистоты не было уменьшено криоконсервирования.
Хотя здесь представлены различные лаборатории используются различные маркеры классифицировать cTfh клеток на ранних стадиях их открытия, метод делает использование единой схемы двух групп клетк поверхности маркеров, предложенный Шмидт et al.12, 15 для одновременной идентификации cTfh и их девяти признанных подмножества в одном проточной цитометрии эксперимент.
Как используются только маркеры поверхности клетки, клетки не требуют фиксации или permeabilization и таким образом могут оставаться живыми течению функциональных исследований. Это могло бы способствовать путем сортировки с помощью СУИМ с той же панелью антитела клетки. Эта группа может быть расширена для включения других маркеров, позволяя для ограничения потока цитометр используется.
Анализ потока многоцветные цитометрии экспериментов может быть сложным из-за по существу субъективный характер стробирования на 2-мерной точки участках, особенно когда клеточных популяций не имеют четкой Би Модал распределения в маркер флуоресценции, как это чехол для cTfh клеток и их подмножества. По этой причине важно создать эффективные механизмы контроля для уменьшения артефактов лучше разрешение населения и установить стробирования стратегии уверенно. Таким образом дизайн панели антитела и настройке основных элементов для проточной цитометрии эксперимента, то есть, используя компенсации и FMO контроля изложены в шаге 3.4.2 и 3.4.3,respectively.
Все cTfh клетки определяются как CD4+ CXCR5+ CD45RA–. Уровень выражения характерным Tfh маркера активации PD-1 затем может быть определен для определения подмножества PD-1-, PD-1+ или PD-1Привет cTfh клетки. Затем, используя комбинацию хемокиновых рецепторов, CXCR3 и CCR6, которые дифференцировано выраженные традиционных Th1, 2 или 17 клетки, cTfh можно охарактеризовать как cTfh1, 2-17-как по профилю CXCR3+ CCR6-, CXCR3– CCR6- и CXCR3– CCR6+, соответственно.
В таблице 1отображается панель антитела, используемые в нашей лаборатории. Пользователю может потребоваться адаптировать их Флюорофор выбор для учета для лазерных и светофильтр конфигурации доступны на их местных проточный цитометр.
Следующие факторы влияют на выбор флуорофоров. Используйте яркие флуорофоров, там, где это возможно. В частности используйте ярких доступных флуорофоров на тёмной (менее сильно выраженной) маркеры. Диммер маркеры включают PD-1, CXCR3 и CCR6 и в меньшей степени, CXCR5. Мы специально сделали использование новых BB, БВ и був флуорофоров, которые обеспечивают отличную яркость и таким образом позволяют проще резолюции различных популяций клеток.
Распространение Флюорофор выбор через спектры выбросов, насколько это возможно свести к минимуму спектрального наложения и, таким образом, уровень компенсации требуется. Бесплатно, онлайн инструмент, который может использоваться для оказания помощи в проектировании группа цитометрии потока можно найти здесь: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Для экономии места на спектр излучения, мы заняты каналом «дампа» с помощью жизнеспособности краска с длина волны излучения, которая перекрывается с что APC-H7 (конъюгированных с CD45RA) для включения обнаружения (и исключения) оба умерли или CD45RA+ с помощью один детектор.
Здесь протокол для изоляции периферической крови CD4+ Т-клеток и их последующего анализа представлена проточной цитометрии для определения пропорции различных и недавно описал, циркулирующих подмножеств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы крови были получены от обычных предметов (НС) (n = 12) а также пациентов с лимфомой маргинальные зоны (MZL) (n = 7) и других типов B-клеточной неходжкинской лимфомы (BNHL) (6 FL больных, 2 Лимфоплазмоцитарной лимфомы пациента и 1 низкосортных B-клетки Неходжкинской лимфомы не оговорено пациента). Пациенты были набраны из Гематология клиники на Лестер Королевской больнице после того, как дали информацию, письменного согласия, этические утверждения в место для всех исследований. Этическое одобрение было получено Лестершир, Нортгемптоншир и Ратленд исследовательской этики Комитета 1, 06/Q2501/122 ведения пациентов образцов и центр исследований работоспособности (HRA) NRES Комитет Восточный Мидландс-Дерби, ссылка 14/EM/1176 для обычные предметы.
1. изоляция CD4+ T-клетки от всей периферической крови
- Учитывать свежие периферической крови (2-15 мл)2K ЭДТА трубы стандартные венепункции и процесс как можно скорее для поддержания максимальной жизнеспособности.
Примечание: Используйте стандартные лабораторные средства индивидуальной защиты (пальто, перчатки, очки) и выполнять работу в классе II биобезопасности кабинет. - Кровь и все необходимые реагенты (CD4+ обогащения коктейль, 2% плода bovine сыворотки/фосфатный буфер (FBS/PBS), градиент плотности СМИ и замораживание среднего, если cryopreserving клетки) до комнатной температуры.
- Смешайте кровь с коммерчески доступных коктейль антител для обогащения человеческого CD4 клеток T+ . Используйте 50 мкл реагента для каждого 1 мл крови. Используйте 50 мл конические полипропиленовые трубы для 5-15 мл крови.
Примечание: Если с помощью 2-4 мл крови, выполните этот шаг в 14 мл конические полипропиленовые трубы. - Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Разбавьте смесь с равным объемом 2% FBS/PBS
-
Слой этот разреженных смесь на вершине СМИ градиента плотности медленно, чтобы не мешать интерфейс и приступить к центрифугирования немедленно, чтобы избежать распространения крови в средний градиент плотности.
- Для 2-3 мл крови 3 мл раствора градиент плотности среды в 14 мл конические полипропиленовые трубы, но для 4 мл крови, используйте 4 мл средний градиент плотности в 14 мл конические полипропиленовых труб и для 5-15 мл крови , используйте 15 мл средний градиент плотности в 50 мл конические полипропиленовые трубы.
- Центрифуга слоистых смесь для 20 минут 1200 x g с тормозом с при 20 ° C.
Примечание: Температуре ниже атмосферного может привести к загрязнению с красных кровяных клеток и гранулоциты. Более низкой скорости приведет к CD4+ к сбою процесса изоляции. Оставляя перерыва открыли будет уменьшаться клеток урожайности. Используйте скамейке Топ центрифуги с роторами, которые могут быть закрыты для избежания аэрозолей. - Удаление обогащенного CD4+ слоя клеток из интерфейса с помощью пипетки Пастера.
Примечание: Слой обогащенного клетки будет напоминать стандарт «Баффи Пальто» белый облачный клеток, но как только CD4+ клетки присутствуют, естественно, это будет меньше и более трудно увидеть. - Добавить 2% FBS/PBS на CD4 клеток+ до общего объема 10 мл и затем дважды промыть 2% FBS/PBS центрифугированием 10 мин на 400 x g при каждой стирке.
- Ресуспензируйте гранулы в 2% FBS/PBS и count клетки окрашивали жизненно краситель (Трипановый синий) для определения числа клеток и жизнеспособности.
- Необязательный шаг: Ресуспензируйте 5 x 105 до 1 x 106 клеток в замораживания среднего (10% диметилсульфоксида в FBS) в 1 мл аликвоты.
Примечание: Уровни некоторых поверхностных маркеров могут быть изменены на крио сохранение и оттаивания. Это, таким образом, очень важно, что все образцы обрабатываются последовательно. Для того, чтобы свести к минимуму различия в аналитических переменных, образцы были крио сохранились и пакетном режиме для анализа в настоящем исследовании.
2. проточной цитометрии
- Оттепель криоконсервированных CD4+ клетки быстро в водяной бане при 37 ° C и мыть раз в подогретым среднего (RPMI 1640 + L-глютамином 10% FBS и 1 x пенициллин стрептомицином).
- Добавление ячеек в 9 мл среды, центрифуги для 5 мин на 400 x g и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте клеток в 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS (50 мкл) так, что каждое условие проверяется использует между 5 x 105 и 1 х 106 клеток.
- Смешать клетки с пятнать буфера (50 мкл).
Примечание: Блестящие пятна буфера предотвращает различные окрашивание артефакты, которые могут помешать с анализом данных, когда два или более BV или був пятна используются одновременно ввиду присущего химических свойств этих красителей. В условиях единого или безупречный, 50 мкл буфера блестящее пятно может быть заменен на 50 мкл 1% BSA/PBS. - Добавьте антитела клетки (в соответствии с «тома» столбец в таблице 1) и инкубировать на льду в темноте за 30 мин.
- Вымыть клетки дважды в 1% BSA/PBS центрифугированием на 3 мин на 600 x g при каждой стирке.
- Ресуспензируйте в 1% BSA/PBS (400 мкл) и передачи в поток цитометрии приобретение трубку.
- Вихревой клетки мягко до приобретения данных на проточный цитометр:
3. течь цитометрии элементов управления и настройки
- Используя пример безупречная, установите напряжение фотодиода, так что лимфоциты могут быть отделены от очевидный мусор и мертвые клетки (события с высокой стороне точечной (SSC) площадью и низкой вперед точечной (FSC))16. С помощью единого окрашенных образцов, установите фотоэлектронный умножитель напряжения (ПЛТ), так что позитивные флуоресцирования можно проследить от фона флуоресценции при убедившись, что все события подпадают обнаружению масштаба.
Примечание: Улучшение бы участок CV против ПЛТ напряжения для каждого ПЛТ, используя тускло флуоресцентные бусины найти минимальное напряжение для оптимального разрешения («Пик 2» метод19). - Учетная запись для спектральных дублирования путем создания матрицы компенсации с использованием одного пятна с бисером захвата. Добавить к 1% коммерчески доступных компенсации бусины (60 мкл) и отрицательный контроль бусины (60 мкл) BSA/PBS (100 мкл) и вихрь.
Примечание: Захват бисер используется должны совпадать с принимающей видов и IgG изотипа антитела используются. Матрица компенсации должно быть пересчитаны если номер лота любого тандем красители изменения, как они могут отображать значительные различия в их спектры выбросов между партиями. - Добавление одного антитела (20 мкл) и вихря.
- Инкубируйте в темноте за 30 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга на 200 x g 10 мин и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте в 1%BSA/PBS (500 мкл) и вихря.
- Получить образец с проточный цитометр, используя генератор матрица назначенный компенсации в приобретение программного обеспечения в соответствии с инструкциями производителя.
- Используйте элементы управления FMO для указания размещения ворот для флуоресценции положительных маркер для учета разлива краситель, который является главным источником фон флуоресценции в экспериментах с использованием ≥4 цвета16. Следуйте общие пятнать поверхности клетки протокол, как описано в шаге 3, но для каждого условия, пропустить один из флуорофоров от этапа окрашивания (где CD45RA опущен, также опустить жить/мертвые пятна). Приобрести 100 000 лимфоцитов для каждого условия.
- Установите ворота положительность на норме % клеток. Смотрите Рисунок 2 пример иллюстрируется FMO элементов управления.
4. анализ данных
- Использовать проточный цитометр приобретение программного обеспечения для установки порога 5000 единиц на параметре FSC для исключения очень мелких частиц мусора.
- Используйте остановки ворот для приобретения 10000 cTfh клетки (CD4+ CD45RA– CXCR5+).
Примечание: Индивидуальный пользователь может собирать более чем 10 000 ячеек. Это число представляет собой компромисс между сбор достаточно клеток для получения значимых результатов и времени для коллекции. - С использованием FSC-область / SSC-области точка сюжет, нарисуйте эллипс или многоугольник ворота для выбора населения лимфоцитов, пока за исключением мусора и открыто мертвые клетки (события с высоким SSC-площадью и низкой FSC-).
- С использованием FSC-область / FSC-ширина точка сюжет, ничья в полигон ворота выбрать отдельные ячейки исключая Дуплеты (Дуплеты имеют расширение области, но аналогичные ширина в отдельные ячейки).
- С использованием FSC-площадь CD45RA и жизнеспособности маркера точки участка, Нарисуйте прямоугольный ворота для выбора жить, CD45RA– (клетки с низкой флуоресценции для этого маркера).
- С использованием FSC-область / CD4 точка сюжет, Нарисуйте прямоугольный ворота для выбора CD4+ клетки (клетки с высоким флуоресценции для этого маркера).
- С помощью CD4 / CXCR5 точка сюжет, Нарисуйте прямоугольный ворота для выбора CXCR5+ (т.е. cTfh) клетки (клетки с высоким флуоресценции для этого маркера).
- С помощью CXCR3 / CCR6 точка сюжет, место quad ворота для разделения клетки cTfh на cTfh1, 2 и 17 клетки (клетки, которые являются высокими и низкими для каждого маркера).
Примечание: Клетки с фенотипом CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ являются плохо характеризуется. Мы называем эти клетки cTfh1/1718 потому что обычных вспомогательные Т-лимфоцитов (CD4+ CXCR5–), переход между Th17 и Th1 шоу выражение CXCR3 и CCR6 и были описаны как cTfh1/1719. - С помощью гистограммы PD-1, используйте средство диапазон для разделения клетки cTfh (или по желанию, отдельные cTfh1, 2, 17 или 1/17 подмножеств) в PD-1-/ + или Привет населения.
Примечание: Различие между PD-1+ и PD-1Привет не четко определены в литературе. Порог был установлен как той же интенсивности PD-1, необходимых для выявления Tfh Бона ФИДЕ в суспензиях лимфоцитов человека миндалин, с помощью проточной цитометрии с той же панелью антитела. Кроме того маркера для ICOS могут быть добавлены к панели антитела, только PD1Привет клетки находятся ICOS+.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Высоким CD4+ чистоты была достигнута с помощью CD4+ Протокол изоляции, который был надежным во всех образцов крови проверена нами (означает: 96,6%, SD: 2.38, n = 31) (рис. 3).
Выявление cTfh (CD4+ CXCR5+ клетки) в представитель нормальной тема представлена (рис. 4A). Доля общего cTfh клеток CD4 в+ клетки были медиану 29,4% (межквартильный диапазон (ИКР) = 10,8) через 12 нормальных субъектов. Многочисленные исследования через несколько различных заболеваний, включая гепатоцеллюлярной карциномы17,20, системная волчанка эритематозные11,21и ревматоидный артрит11,14 были противоречивыми в способность обнаружить разницу в общей cTfh между пациентами и вересковый элементами. Никаких существенных различий были найдены в общем cTfh между обычные предметы и MZL или BNHL больных (Рисунок 4B)21.
Идентификация PD-1 выражение в cTfh клетки от представителя обычный предмет и BNHL пациента для сравнения показан на рис. 5A. PD-1 выражение был значительно выше в MZL и BNHL больных, чем обычные предметы (рис. 5B)21. Аналогичный рост PD-1 выражение было продемонстрировано в несколько аутоиммунных расстройств11,12,,1314.
Определению cTfh1, 2, 17 и 1/17 в рамках населения cTfh клеток, используя CXCR3 и CCR6 выражение от представителя нормального субъекта показан на рисунке 6A. Доля cTfh1 клеток был значительно выше в MZL и BNHL больных, чем обычные предметы (Рисунок 6B)21.
Рисунок 1 : Иллюстрация общей стробирования стратегии, используемый для идентификации cTfh клеток и их подмножеств. Сверху слева население лимфоцитов отличаются, и Дуплеты исключаются. Live CD45RA– клетки выбираются с помощью «дамп канал». CD4+ клетки являются воротами и CXCR5+ клетки определяются как cTfh. cTfh делятся на cTfh1, 2-17-как с помощью CXCR3 и CCR6 выражения. PD-1 выражение в рамках этих подмножеств затем отличается. Цифры взяты из образца крови представитель нормального субъекта. FSC-A, FSC области; SSC-A ККК области; FSC-W, ширина FSC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Управляет иллюстрации FMO. Каждый участок цитометрии двухосных потока показывает CD4+ клетки окрашивали все флуорофоров, за исключением одного интереса для демонстрации минимум на какие ворота для флуоресценции позитивность можно задать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Двухосная потока цитометрии участок показаны определения CD4 + клетки после стробирования жить лимфоцитов. Взят из образца крови представитель нормального субъекта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Идентификация клеток cTfh. (A) двухосных потока цитометрии участок показаны CXCR5+ выражение на закрытом для CD4 клеток+ CD45RA–. Взяты из представительных нормального субъекта. (B) относительные доли cTfh в течение всего CD4 клеток+ в обычные предметы (n = 12), MZL (n = 7), BNHL (n = 9). Горизонтальные линии представляют средний, а погрешностей межквартильный диапазон. Значимых различий не были найдены между группами с помощью теста U Манна-Уитни. Эта цифра была изменена Байфорд et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : PD-1 выражение и отношения к cTfh клеткам. (A) потока цитометрии гистограммы используется для определения PD-1 выражение в течение всего cTfh клеток. Взяты из представительных нормальный предмет и BNHL пациента. (B) PD-1+ клетки как доля общего cTfh клеток. Горизонтальные линии представляют средний, а погрешностей межквартильный диапазон. Медиан являются значительно (U-тест Манна-Уитни) отличается от обычных предметов (21,5%, икр = 10,8, n = 12) и больных лимфомами (MZL 54,1%, икр = 21,2, n = 7, p = 0,0008 и BNHL 45,2%, ИКР = 11.4, n = 9, p = 0.0003). Эта цифра была изменена Байфорд et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : CXCR3 и CCR6 выражения и их отношения к номерам cTfh1. (A) двухосных потока цитометрии участок показаны на выражение CXCR3 и CCR6 на CD4+ CD45RA– CXCR5+ клеток. Взяты из представительных нормальный предмет и BNHL пациента. (B) cTfh1 клетки в процентах от общего cTfh клеток. Горизонтальные линии представляют средний, а погрешностей межквартильный диапазон. Медиан являются значительно (U-тест Манна-Уитни) отличается от обычных предметов (20,8%, икр = 6,7, n = 12) и больных лимфомами (MZL 32,1%, икр = 6,8, n = 7, p = 0,013 и BNHL 35,4%, икр = 7,6%, n = 9, p = 0,0056). Эта цифра была изменена Байфорд et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1: поток цитометрии антитела группа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол представляет собой простой и эффективный способ для анализа клеток периферической крови cTfh, Включение обнаружения всех соответствующих подмножеств, идентифицированных в литературе. Можно легко и эффективно получить образцы крови, как часть стандартных амбулаторных клиник и серийный образцы могут быть собраны параллельно с клинических данных. В свою очередь это позволяет перспективных исследований, оценке подмножеств cTfh качестве биомаркеров для прогрессирования заболевания или ответ на лечение. Эти исследования особенно целесообразно в болезни, где Tfh dysregulation замешан в патогенезе аутоиммунных заболеваний и некоторых видов твердых и гематологических рака. Кроме того изменения в функции cTfh в болезни могут расследоваться сортировки cTfh клеток с помощью проточной цитометрии, как только клеток поверхности маркеры используются в настоящем Протоколе. Сортировка клеток cTfh у больных MZL позволили нам найти различия в ген выражение профили по сравнению с нормальной субъектов21.
Мы обнаружили, что эффективный CD4+ Т-клеток изоляции улучшить анализ данных. Мы описываем этапы в деталях, потому что незначительные проблемы, например скорости и торможения центрифуги имеют решающее значение для процедуры изоляции. Еще один важный шаг, как все cytometry анализ потока, является компенсация и FMO элементов управления.
PD-1 выражение меняется на cTfh клетки и те клетки с высоким PD-1 могут быть наиболее функциональные и поэтому актуально, особенно для изучения аутоиммунных заболеваний11,12. Одним из важных вопросов было решить ворота для идентификации PD-1Привет клеток, активированные cTfh подмножество, как есть не стандартный лимит, определенный в литературе. Это важный, но незначительные подмножество вероятно отражает активную Tfh дифференциации в лимфоидной ткани11. Чтобы преодолеть этот вызов, порог был установлен таким образом, что это был тот же, что для выявления добросовестных Tfh клетки от человека миндалин с той же панелью антитела. Мы признаем, что получение миндалин может быть проблематичным для некоторых пользователей. В качестве альтернативы можно расширить панель антитела, используемые в настоящем протоколе путем добавления анти ИКО, как только PD-1Привет клетки являются ICOS+ 12.
Здесь мы представляем группу антитела для обнаружения поверхностных маркеров характеристика циркулирующих CD4+ Т-клеток. Циркулирующих клеток T-фолликулярная регулирования (cTfr) являются отсека памяти крови T-фолликулярная регулирования клеток (ОКР), которые являются резидентами в лимфоидной ткани и имеют важную роль в регулировании зародышевого центра реакции22,23 . cTfr являются крови CD4+ CXCR5+ клеток T-регуляторные ячейки маркеры что Сопредседатель Экспресс, включая фактор транскрипции FoxP3. Измерение cTfr вместе с cTfh могут предоставлять более полную картину деятельности в зародышевого центра и может представлять биомаркеров в болезни в его собственное право24. Хотя cTfr числа низких (означает: 1.82%, SD: 1.40, n = 24 всего CD4+ клеток в наших собственных экспериментов), отделяя cTfr от cTfh также увеличит специфику cTfh анализа. Добавление сочетание конкретных T-регуляторные клетк поверхности маркеров в нашей группе например CD25 и CD12725 позволят обнаружение cTfr помимо всех подмножеств cTfh в же эксперимент с использованием протокола очень похожи. Кроме того может использоваться более классических внутриклеточного регулирования маркер FoxP3, хотя это требует фиксации и permeabilization, предотвращая течению функциональных анализов. В сосредоточении на cTfh анализе, однако, есть также преимущества для определения минимальной панели, которые могут быть использованы в сочетании с проточный цитометр Стандартный лабораторный для получения клинически или экспериментально полезные результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Работа была поддержана грантом от лейкоза Великобритании ETB и MJA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II Flow Cytometer | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Flow Cytometer Acquisition Software |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Flow Cytometry Data Analysis Software | |
| Anti-CXCR3 antibody | BD Horizon | 565223 | |
| Anti-CCR6 antibody | BD Horizon | 563923 | |
| Anti-CXCR5 antibody | BD Horizon | 562747 | |
| Anti-CD4 antibody | BD Horizon | 564419 | |
| Anti-PD-1 antibody | BD Pharmingen | 557946 | |
| Anti-CD45RA antibody | BD Pharmingen | 560674 | |
| Viability Marker | ThermoFisher Scientific | L34973 |
References
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009).
- Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).
- Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).
- Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).
- Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).
- Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).
- Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).
- He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).
- Schmitt, N., Bentebibel, S. -E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).
- Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).
- Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).
- Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
- Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).
- Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).
- Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).
- Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).
- Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).
- Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).
