Här presenterar vi ett protokoll för beredning av agaros-fyllda mänsklig precision-cut lung skivor från opererande patientens vävnad som är lämpliga för att generera 3D lung vävnadskulturer till modell mänskliga lungsjukdomar i biologisk och biomedicinsk studier.
Översättningen av romanen upptäckter till mänskliga sjukdomar är begränsat av tillgången på mänskliga vävnad-baserade modeller av sjukdom. Precision-cut lung skivor (avgiften) används eftersom 3D lung vävnadskulturer (3D-LTCs) utgör en elegant och biologiskt mycket relevanta 3D cell kultur modell, som mycket likna jordbaserad vävnad på grund av sin komplexitet, biomekanik och molekylär sammansättning. Vävnaden skivning används allmänt i olika djurmodeller. 3D-LTCs härrör från mänskliga avgiften kan användas för att analysera Svaren till nya läkemedel, vilket ytterligare kan bidra till att bättre förstå mekanismerna och funktionella effekter av droger i mänsklig vävnad. Beredning av avgiften från kirurgiskt avlägsnande lung vävnadsprover på patienter, som upplevt lung lobektomi, ökar tillgängligheten till sjuka och peritumoral vävnad. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för generering av mänskliga avgiften från kirurgiskt avlägsnande soft-elastisk patienten lungvävnad. Agaros infördes i bronkoalveolär utrymmet av resectates, således bevara lung struktur och öka vävnads stelhet, vilket är avgörande för efterföljande skivning. 500 µm tjocka skivor var beredda från vävnad blocket med en vibratome. Biopsi slag tas från avgiften säkerställa jämförbara vävnad urvalsstorlekar och ytterligare öka mängden av vävnadsprover. De genererade lung vävnadskulturer kan användas i en mängd studier i mänsklig lung biologi, inklusive patofysiologi och mekanismer av olika sjukdomar, såsom fibrotiska processer på dess bäst på (sub-) cellulära nivåer. Den högsta nyttan av 3D-LTC ex vivo modell är dess nära representation av jordbaserad mänskliga lungan avseende 3D vävnad arkitektur, cell typ mångfald och lung anatomi samt potentialen för bedömning av vävnad från enskilda patienter, som är relevant att ytterligare utveckla nya strategier för precision medicin.
Kroniska och akuta lungsjukdomar är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet i hela världen1. För patienter med kroniska lungsjukdomar som obstruktiv lungsjukdom (kol)2, svår astma3, lung cancer4 och diffusa parenkymal lung sjukdomar5för läkande terapier närvarande inte tillgängliga. Även om studier i djurmodeller för lungsjukdomar har fördjupat förståelsen av sjukdomen patomekanism6 och har lett till identifiering av potentiella nya terapeutiska mål7,8,9, dessa modeller uppvisar relevanta biologiska och fysiologiska skillnader jämfört med människor10. För att övervinna dessa skillnader mellan murina och människans biologi samt anatomi, mänskliga ex vivo 3D lung vävnadsodling används (3D-LTC) system på olika områden inom biomedicinsk forskning. Dessa 3D-LTC kultur system bygger på precision-cut lung skivor (avgiften). Generering av avgiften ex vivo tillåter analys av en tredje rumsliga dimensionerna, som gör det möjligt för utredning av de rumsliga och funktionella relationerna av celler i hela alveolerna och airways11, samt interstitium, kärlsystemet och mesothelium. Noterbart är är avgiften ex vivo modeller flercelliga, vilket innebär att de innehåller mest funktionella celler av jordbaserad lungor, således nära svarar cellernas biologiska miljön och därmed övervinna den begränsade cell-cell och cell-matrix växelverkan i de flesta 2D cellkultur strategier. Fram till nu, ex vivo murina avgiften användes för att modellera lungsjukdomar, som kol12, lung fibros13, lung cancer14, virusinfektion15,16, bronkopulmonell dysplasi17, och astma18. Dock en avsevärd del av romanen läkemedelsbehandlingar i mänskliga lungsjukdomar som undersöktes i kliniska prövningar översätter inte till kliniken på grund av deras bristande effekt eller säkerhet, assumingly på grund men ändå betydande skillnader mellan människa och murina biologi och sjukdomar19,20,21.
Under flera år, har mänskliga avgiften i stor utsträckning använts för att bedöma lungtoxicitet av kemikalier och läkemedel. Mänsklig lungvävnad har nyligen använts från patienter med kol22,23, astma24och lung fibros25, att bedriva patofysiologiska och farmakologiska studier. Genom att använda opererande patienten organmaterial och generera avgiften därav, man kan sammanfatta stora sjukdom kännetecken i en komplex 3D vävnad miljö22 som representerar och underhålla de flesta av de infödda cellulära mångfalden av orgeln. Dessutom visades sjuk vävnad tillämpas i en mängd olika försöksuppställningar att efterlikna sjukdomen-liknande förändringar i lever, tarm och njurar26,27,28,29.
Bearbetning av lungvävnad förblir emellertid utmanande av flera skäl. Till skillnad från solid vävnad, infödda lungparenkym tenderar att kollapsa utan ventilation och uppvisar lägre vävnad stelhet. Dessa egenskaper hindra skivning av vävnad. Således, fyllning av luftvägarna och alveolära utrymmet med låg-smältande punkt agaros bevarar strukturen infödda lung och ger den stelhet som behövs för precision-cut skivning av murina och mänskliga lungor30. Människans lung resectates donerade för forskningsändamål är till sin natur anatomiskt och genetiskt fysiologiskt mycket mångskiftande, därigenom ofta medför en hög mellan patienter variabilitet när du utför experiment25. I motsats till den hela loben eller hela lungan bladsticklingar, lung prover resected med hjälp av thoraxkirurgi inte nödvändigtvis följa de anatomiska segment och kräver därför speciell beredning. I den här artikeln ger vi en detaljerad och optimerade protokoll för generering av mänskliga avgiften från opererande lungvävnad och deras efterföljande odling och experimentell användning till modell lungsjukdom.
Protokollet beskrivs i detta manuskript täcker utvecklingen av avgiften från mänsklig lunga vävnad resectates genom att fylla den med flytande agaros och efterföljande vibratome skivning. Generation av vävnad skivor visades innan för ett par av organ, som lever och hjärna, medan inneboende styvheten i dessa organ får direkta skivning utan någon ändring av vävnad. Notera är inledande korrekt beredning av lungvävnaden det mest avgörande steget i generera avgiften. Agaros påfyllning av lungan är metoden för val att stabilisera sin mjuk och elastisk natur och att säkerställa en homogen och reproducerbara avgiften generation. Stora luftvägarna av opererande lungvävnaden är kanylerade för att ge åtkomst till de små luftvägarna samt intakt lungparenkym. Avsaknaden av en intakt lungsäcken, vilket gör agaros fylla nästan omöjligt, är en viktig orsak till varför lungvävnad mestadels inte är användbara för lung skivning. Prospektivt, skulle en syntetisk lungsäcken som ursprungligen avsedd att utföra funktionella experiment på cell-lösa ställningar potentiellt kunna tillämpas för att uppnå framgångsrika agaros fyllning av bladsticklingar som saknar ett intakt lungsäcken31. Resektioner vilket resulterar i en mänsklig lunga vävnad bit med intakt lungsäcken är nödvändiga för att generera vävnad block för skivning. Opererande vävnad är mer tillgängliga på grund av tumör-fri vävnad från cancer resektioner än helt intakt loberna eller hela-lung bladsticklingar av patienter som genomgick lungtransplantation.
Vanligen, två system används till att producera avgiften: den Krumdieck vävnad skivare15 och vibrerande mikrotomer (vibratomes). Vävnaden utsnitt generera skivor genom att passera en vävnad block genom metall fartyg, som klipper avgiften vid 90° i slutet av detta fartyg. Vibratomes generera avgiften genom att flytta en vibrerande kniv horisontellt över en förankrade block av vävnad som är nedsänkt i en kyld medium bad, som jämfört utsnittet Krumdieck utövar mindre tvärkraft på vävnad. Detta resulterar i mindre hårda behandling av vävnaden före odling. Å andra är vibratome styckning mer tid och arbete konsumerar. I våra händer stansar vibratome skivning aktiverade produktion av högst 100 avgiften eller 500 avgiften i en dag, tillräckligt för mest experimentella studier. AVGIFTEN kan vara odlade på olika sätt: (a) bifogas Trans-brunnar, vilket genererar ett luft flytande gränssnitt (ALI) system, (b) som dynamiska orgelkultur (DOC) eller (c) nedsänkt i cellodlingsmedium vid standard cellen odlingsbetingelser. I-detalj odling av avgiften var tidigare beskrivna22,23,25; dock saknas fortfarande en gemensam standard av odling villkor mellan deras användning i olika laboratorier runt om i världen. I synnerhet kultur tiden kan vara kritiska: liksom murina avgiften, en förlust av SFTPC positiva alveolära typ 2 celler observeras efter 144 h, men inte efter 120 h22. Dessutom verkar metabolisk aktivitet förblir stabila i murina22 och mänskliga avgiften25 för 120 h.
Det finns ett par tekniska begränsningar för generering av avgiften: antalet och storleken på resectates varierar över tid. effektiviteten i Agarens fyllning, som beror på närvaron av intakt lungsäcken inom erhållna vävnaden, avgör den slutliga framgången av avgiften generationen. och vävnad förstörs orsakas av sjukliga förändringar inom den erhållna (sjuka) lungvävnaden kan störa avgiften beredning. Luftvägarna hinder och fibrotisk vävnad saknas intakt alveolära utrymme hindrar med agarosgelelektrofores fyllning och därmed göra skivning av fibrotisk vävnad en krävande uppgift. Emphysematous vävnader som finns i sjukdomar såsom kol eller alfa-1-anti-trypsin-brist inte kan tåla trycket av agaros fylla, och kommer att resultera i bristning av alveolerna och arkitektoniska artefakter. I dessa fall kan användningen av agaros som låg koncentration, t.ex., 1% (w/v), vara bra att minska trycket och snabba under agaros fyllning. Sammantaget kan tillståndet sjukdomen av vävnad dramatiskt begränsa användningen av vävnaden för avgiften generation. Alla dessa parametrar fastställa beloppet för avgiften som kan genereras från lungvävnad, och även hur lång tid det tar för att producera avgiften. Ytterligare är begränsningar av avgiften inkonsekvenser mellan olika lung skivor med avseende på storlek eller vävnad innehåll, vilket kräver ytterligare normalisering steg för experiment. För att övervinna detta, kan biopsi slag av liknande regioner i samma segment skapas. Detta förfarande är benägna att minska vävnad variabiliteten och, som en extra förmån, öka antalet avgiften prover som kan användas för experiment.
Sammanfattningsvis, mänskliga 3D lung vävnadskulturer från agaros fylld avgiften ger en komplex human modell för att studera lungcancer fysiologi och sjukdomar. Protokollet ger en detaljerad beskrivning av förberedelserna av avgiften från opererande lungvävnad och deras odling, och dessutom hanterar utmaningar i agaros fyllning av mänskliga lungan resektioner och hur man kan övervinna dem.
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksam mot Marisa Neumann för teknisk experthjälp. Alla lungvävnad var vänligt tillhandahålls av CPC-M Bio-arkivet. Detta arbete stöds av stadens tyska Lung forskning (DĒZL), Helmholtz föreningen och CPC forskarskolan bidrag.
Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | – | |
Hyrax CU 65 | Zeiss | – | |
Vasofix Braunüle 18G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
30mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | – | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |