Summary
Her beskriver vi en protokoll for å uttrykke proteiner i protoplasts ved hjelp av PEG-mediert transformasjon metode. Metoden gir enkel uttrykk for proteiner av interesse og effektiv undersøkelse av protein lokalisering og importprosessen for ulike eksperimentelle forhold i vivo.
Abstract
Chloroplast er en viktig organelle som er ansvarlig for ulike cellulære prosesser i planter, som fotosyntesen og produksjon av mange sekundære metabolitter og lipider. Chloroplasts krever et stort antall proteiner for disse ulike fysiologiske prosesser. Over er 95% av chloroplast proteiner kjernen-kodet og importeres til chloroplasts fra stoffer etter oversettelse på cytosolic ribosomer. Dermed er riktig import eller målretting av disse kjernen-kodede chloroplast proteiner til chloroplasts avgjørende for riktig funksjon av chloroplasts samt anlegget celle. Kjerne-kodede chloroplast proteiner inneholder signal sekvenser for bestemte målretting for chloroplasts. Molekylær maskiner lokalisert til chloroplast eller stoffer gjenkjenne disse signalene og utføre importen. Undersøke mekanismer av protein import eller målretting chloroplasts i vivo, utviklet vi en rask, effektiv protoplast-basert metode for å analysere protein import i chloroplasts av Arabidopsis. I denne metoden bruker vi protoplasts isolert fra blad vev av Arabidopsis. Her gir vi en detaljert protokoll for å bruke protoplasts for å undersøke mekanismen som proteiner er importert til chloroplasts.
Introduction
Chloroplast er en av de viktigste organeller i planter. En av Hovedfunksjonene til chloroplasts er å gjennomføre fotosyntese1. Chloroplasts også utføre mange andre biokjemiske reaksjoner for produksjon av fettsyrer, aminosyrer, nukleotider og mange sekundære metabolitter1,2. For alle disse reaksjonene krever chloroplasts et stort antall forskjellige typer proteiner. Chloroplast genomet inneholder imidlertid bare ca 100 gener3,4. Chloroplasts må derfor importere fleste av sine proteiner fra stoffer. Faktisk ble de fleste chloroplast proteiner vist importeres fra stoffer etter oversettelse4,5,6. Anlegget celler krever spesifikke mekanismene importere proteiner fra stoffer til chloroplasts. Men selv om disse protein import mekanismene er gransket for de siste tiårene, forstår vi fortsatt ikke fullt ut dem på molekylært nivå. Her gir vi en detaljert metode for utarbeidelse protoplasts og exogenously uttrykke genene i protoplasts. Denne metoden kan være nyttig for Klargjørende molekylære mekanismer underliggende protein import i chloroplasts i detalj.
Protein import kan studeres ved hjelp av mange ulike tilnærminger. En av disse metodene innebærer bruk av en i vitro protein import system7,8. Bruker denne tilnærmingen, i vitro-oversatt protein prekursorer er ruges med renset chloroplasts i vitro, og protein import analyseres av SDS side etterfulgt av western blot analyse. Fordelen med denne tilnærmingen er at hvert trinn av protein import i chloroplasts kan bli studert i detalj. Dermed har denne metoden vært mye brukt til å definere komponentene i protein import molekylær maskiner og dissekere oppstartsrekkefølgen for transitt peptider. Flere nylig, en annen tilnærming med bruk av protoplasts fra blad vev ble utviklet og det har blitt mye brukt til å studere protein import i chloroplasts9,10. Fordelen med denne tilnærmingen er at protoplasts gir et mobilnettet miljø som er nærmere til intakt celler enn i vitro system. Dermed tillater protoplast systemet oss å ta mange flere aspekter av denne prosessen, som tilknyttede cytosolic hendelsene og hvordan spesifisiteten av målretting signaler bestemmes. Her presenterer vi en detaljert protokoll for bruk av protoplasts å studere protein import i chloroplasts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vekst av Arabidopsis planter
- Forberede 1 L Gamborg B5 (B5) medium ved å legge til 3,2 g B5 middels inkludert vitaminer, 20 g sukrose, 0,5 g 2-(N-morpholino) etan sulfonsyre (MES) til ca 800 mL deionisert vann, og justere pH til 5.7 med kaliumhydroksid (KOH). Legg til mer vaskebuffer vann bringe det totale volumet til 1 L. legge til 8 g phytoagar og autoklav i 15 min på 121 ° C.
- Tillate medium å kjøle ned til 55 ° C og hell 20-25 mL B5 mediet i en Petriskål (9 cm i diameter, 1,5 cm i høyden) på en ren benk. Tørr plater for 2-3 dager, pakk dem med ren brytes, og holde dem i kjøleskap før bruk.
- Sterilisere Arabidopsis thaliana frø med 1 mL av 70% (v/v) etanol i en sentrifuge tube (e-tube) av kontinuerlig risting i 2-3 min. fjerne nedbryting, Legg 1 mL 1% (v/v) natriumhypokloritt løsning og riste kontinuerlig i 2-3 min. forberede 100 -150 frø per Petriskål.
- Fjerne supernatants og vask frøene med 1 mL destillert vann. Gjenta dette trinnet 4 x. Plass sterilisert frøene i 4 ° C for 3 dager å synkronisere frø spiring.
- Så 100-150 frø på B5 plater ved hjelp av brønnene og forsegle platen med kirurgisk tape.
- Dyrke planter i vekst rom med en 16 h/8 h lys/mørke syklus på 100 µmol·m-2·s-1 lysintensiteten, 70% relativ fuktighet og 20 ° C temperatur i 2 uker.
2. utarbeidelsen av plasmider
Merk: Høy renhetsgrad plasmider skal brukes for transformering. Bruk av en kommersiell plasmider rensing kit anbefales.
- Rense plasmider (RbcS-nt:GFP) med en DNA isolering kit. Å konsentrere seg DNA, utføre etanol nedbør i en 1,5 mL tube og oppløse DNA pellet i 100 µL destillert vann. Bestemme konsentrasjonen av plasmider bruker et spektrofotometer på 260 nm. Fortynne plasmider til en siste konsentrasjon av ~ 2 µg / µL. Hold plasmider på 20 ° C før bruk.
3. isolering av Protoplasts
- Klargjør følgende løsninger.
- Forberede enzym løsningen inneholder 0,25% (w/v) macerozyme, 1,0% (w/v) cellulase, 400 mM D-mannitol, 8 mM veisalt (CaCl2), 0,1% (w/v) bovin serum albumin (BSA), og 5 mM MES. Justere pH til 5.6 med KOH.
- Filtrere enzym løsningen ved å benytte en celluloseacetat filter enhet 0,45 μm pore størrelse. Aliquot 25 mL av enzymet løsningen i 50 mL konisk rør og holde på 20 ° C. Tine enzym løsningen ved romtemperatur (RT) og bland godt bare før bruk.
- Forbered en 21% (w/v) sucrose løsning ved oppløsning 21 g av sukrose i 100 mL deionisert vann og autoklav løsningen.
- Forberede U5 løsning inneholder 154 mM natriumklorid (NaCl), 125 mM CaCl2, 5 mM kalium klorid (KCl), 5 mM glukose og 1,5 mM MES. Justere pH til 5.6 med KOH og autoklav løsningen.
- Forberede MaMg løsning inneholder 400 mM D-mannitol, 15 mM magnesiumklorid (MgCl2), og 5 mM MES. Justere pH til 5.6 med KOH og autoklav løsningen.
- Forberede 1 M D-mannitol og 1 M nitrat lager løsninger for å gjøre PEG løsningen. Autoclave disse løsningene.
- Forberede enzym løsningen inneholder 0,25% (w/v) macerozyme, 1,0% (w/v) cellulase, 400 mM D-mannitol, 8 mM veisalt (CaCl2), 0,1% (w/v) bovin serum albumin (BSA), og 5 mM MES. Justere pH til 5.6 med KOH.
- Høste intakt blad vev fra 2 uker gamle planter fra ~ 1 – 2 B5 plater ved hjelp av en kirurgisk kniv og sted høstet bladene i en 50 mL konisk rør som inneholder 25 mL av enzymet løsning. Sett konisk røret som inneholder enzym løsning og blad vev vannrett på en roterende shaker med mild agitasjon i mørket. Det tar 8-12 h for full fordøyelsen av blad vev.
- På 8-12 h etter inkubasjon, hell enzym løsningen (som inneholder protoplasts fra blad vev) i en fersk Petriskål gjennom en maske med 140 µm porestørrelse. Nøye laget protoplast inneholder enzym løsningen på 15 mL 21% (w/v) sucrose løsning og sentrifuge det 98 x g i 10 min med lavest akselerasjon og deselerasjon innstillingene i en svingende bøtte rotor.
- Bruker en Pasteur pipette, nøye overføre protoplasts fra det øverste laget (enzym løsning) og på grensesnittet mellom enzym løsning og sucrose løsning til en 50 mL konisk rør inneholder 30 mL U5 løsning. Sentrifuge dette røret 51 x g for 6 min. På dette stadiet, vil protoplasts være i pellet nederst konisk røret.
- Kast nedbryting forsiktig med en pipette uten å forstyrre protoplasts pellets. Legg 25 mL U5 løsning, og forsiktig resuspend protoplasts. Inkuber protoplast løsningen i 4 ° C kjøleskap minst 1t for stabilisering.
4. protoplast transformasjon med polyetylenglykol
- Forberede en 40% pinne løsning ved å legge til 4 g pinne 8000, 4 mL 1 M mannitol løsning, 1 mL 1 M Ca (ingen3)2og 1,8 mL destillert vann inn i et 50 mL konisk rør og bland godt. Oppløse pinne av oppvarming i en mikrobølgeovn for 20-30 s. sted 40% PEG løsning på RT for nedkjøling.
Merk: 40% PEG løsning bør være forberedt fersk hver gang. Hvis protoplasts ikke er pelleted helt under 4 ° C incubation i kjøleskapet, sentrifuge materialet 46 x g i 2 minutter. - Fjerne nedbryting nøye men helt og legge MaMg løsning til protoplast pellets til konsentrasjonen av 5 x 106/mL.
Merk: Antall protoplast kan bestemmes av en hemocytometer vises under et mikroskop. - Sted 10 µg av plasmider DNA hver Tom 13 mL runde bunn rør og legger 300 µL protoplast løsning bruker en pipette.
Merk: Slutten av pipette spissen bør kuttes av. Når protoplasts samples, skal protoplast inneholder løsningen være resuspended rett før pipettering slik at like mange protoplasts legges til hver tube. - Bland plasmider DNA med protoplasts av varsomt roterende rør og umiddelbart legge 300 µL av 40% PEG løsning ved hjelp av en pipette. Bland forsiktig men helt ved å rotere rør og ruge i 30 min ved romtemperatur; Tilt røret nærmest horisontalt og rotere det flere ganger.
- Legg 1 mL av U5 løsning og bland forsiktig men helt ved å rotere røret for hånd på en lignende måte. Inkuber utvalget for 10 min ved romtemperatur.
- Gjenta dette trinnet to ganger mer med 1,5 mL og 2 mL U5 løsning, henholdsvis. Inkuber i 30 minutter etter at siste U5 løsning.
- Sentrifuge 46 x g for 4 min. Forkast nedbryting og legge 2 mL U5 løsning. Bland forsiktig men helt. Ruge på 22 ° C i en mørk kammer.
5. analyse av Protein importen til Chloroplasts
Merk: Etter PEG-mediert transformasjonen av protoplasts varierer inkubasjonstiden fra 8 til 24 timer.
-
Fluorescens mikroskopi
- Sted 10 µL protoplast løsningen på et lysbilde glass bruker en pipette med trimmet tips og nøye dekk med en dekkglassvæske å unngå skade på protoplasts.
- Sted i lysbildet på scenen av fluorescens mikroskop utstyrt med eksitasjon/utslipp filter angir for observere grønne fluorescerende protein (GFP) og klorofyll auto-fluorescens.
- Ta bilder med en avkjølt kostnad - sammen enhet (CCD) kamera og prosessen bilder bruke et bilderedigeringsprogram til å produsere pseudo fargebilder.
-
Totalt Protein utvinning og Immunoblotting
- Forberede rødsprit bufferen som inneholder 2,5% (w/v) natrium dodecylsulfate (SDS) og 2% (v/v) 2-mercaptoethanol.
Merk: Protein import i chloroplasts kan kvantifiseres ved å måle graden av transitt peptid behandling via immunoblot analyse med anti-GFP antistoff. - Overføre protoplasts til en sentrifuge rør og sentrifuge 46 x g for 4 min.
- Fjern nedbryting og legge 80 µL rødsprit bufferen. Kraftig vortex 5 s og legge 5 x SDS eksempel buffer (250 mM Tris-Cl (pH 6.8), 0,5 M DTT, 10% (w/v) SDS, 0,05% (w/v) Bromophenol blå og 50% (v/v) glyserol). Bland godt og kok i 10 min.
- Underlagt eksempelfilen protein til standard SDS-side og immunoblotting med anti-GFP antistoff.
- Forberede rødsprit bufferen som inneholder 2,5% (w/v) natrium dodecylsulfate (SDS) og 2% (v/v) 2-mercaptoethanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Import av proteiner i chloroplasts kan undersøkes med to tilnærminger: fluorescens mikroskopi og immunoblot analyse etter SDS-side-mediert separasjon. Her vi brukte RbcS-nt:GFP, en fusjon konstruere koding 79 N-terminal aminosyre rester av RbcS inneholder transitt peptid del GFP. Når proteiner importeres til chloroplasts, grønne fluorescens signaler fra målet protein RbcS-nt:GFP skal flette med røde fluorescerende signalene fra klorofyll auto-fluorescens, fordi undersøkt av fluorescens mikroskopi (figur 1). Lukk overlappingen av to signaler angir protein import i chloroplasts. Ofte GFP signaler er spredt over chloroplasts eller er konsentrert i sentrum av chloroplasts, med svakt diffus signaler gjennom chloroplasts, avhengig av individuelle protein. Import av proteiner kan bli bekreftet av immunoblot analyse med GFP antistoffer. Totalt proteiner er forberedt fra protoplasts og atskilt av SDS side etterfulgt av Western blot analyse (figur 2). I de fleste tilfeller to protein band bør være observert i immunoblot hvis et protein var riktig importeres til chloroplasts: øvre band tilsvarer full lengde forløperen og lavere bandet i behandlet skjemaet etter import i chloroplasts. Mengden av prosessert form av protein bør øke på tidsavhengige måte. Slike resultater ville innebære at protein RbcS-nt:GFP importeres til chloroplasts i Arabidopsis protoplasts. Videre kan forholdet mellom behandlet skjemaet til den totale mengden uttrykt proteiner (behandlet skjemaet pluss forløper) brukes som et mål på import effektivitet. Hvis nødvendig, chloroplasts kan bli renset fra forsiktig lysed protoplasts og proteiner fra chloroplast brøkdel kan analyseres av vestlige blotting for å ytterligere å bekrefte importen av proteiner i chloroplasts.
Figur 1. I vivo lokalisering av GFP del RbcS transitt peptid til chloroplasts.
Bildene ble tatt 18 h etter transformasjon under fluorescens mikroskop. Grønn (en) (b), flettede (c), og lyse (d) etiketter indikerer GFP bilde, klorofyll bilde, sammenslåtte bildet av to signaler og lys feltet bilde, henholdsvis. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Western blot analyse av RbcS-nt:GFP å undersøke protein import i chloroplasts.
Totalt protein ekstrakter var forberedt fra protoplasts og adskilt med 10% (w/v) SDS-side, etterfulgt av western blot analyse ved hjelp av anti-GFP antistoff. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har gitt en detaljert protokoll for bruk av protoplasts av Arabidopsis å studere protein import i chloroplasts. Denne metoden er kraftig for å undersøke protein importprosessen. Denne enkle, allsidig teknikken er nyttig for å undersøke målretting av de tiltenkte Last proteinene til chloroplasts. Bruker denne metoden, er protoplasts forberedt fra blad vev Arabidopsis11,12 som kan fås fra planter i mange forskjellige vekst stadier, fra veldig tidlig til fullt ut modne blader. Imidlertid må utvises som vokser planter brukt for protoplast forberedelse. Man bør bruke veldig sunt planter, som protoplasts forberedt fra friske planter tåler mange trinnene involvert i PEG-mediert transformasjon. En annen viktig forholdsregel er å bruke fersk løsninger. Små endringer i konsentrasjonen av løsningene kan sterkt skade protoplasts, siden de er skjøre og veldig følsom for osmotisk trykk.
Vi har brukt protoplasts for å studere protein import i chloroplasts9,13,14. Basert på disse studiene, kunne vi dissekere sekvens motiver i ulike transitt peptider. I tillegg har vi brukt protoplasts for å identifisere målretting signaler (positivt ladet regionen flankert C-terminus transmembrane domenet) av proteiner rettet mot ytre konvolutt membranen av chloroplast15. Tilsvarende har vi brukt protoplasts for å undersøke protein import i mitokondrier10. Igjen, vi klarte å identifisere mange kritiske sekvens motiver i presequences mitokondrie proteiner. I tillegg inneholde til ytre membran proteiner av mitokondrier også et positivt ladet område flankert transmembrane domenet som deres målretting signal15. Disse målretting signalene dele en stor grad av likhet i aminosyre komposisjon. Faktisk var chloroplast proteiner mistargeted til mitokondrier under i vitro import eksperimenter16. Men er chloroplast og mitokondrie proteiner spesielt importeres til deres mål organeller i vivo. Protoplasts kan dermed brukes til å belyse mekanismene bak hvordan målretting spesifisitet er fastsatt mellom chloroplasts og mitokondrier.
Protoplasts representerer et ideelt system for å analysere import av proteiner i chloroplasts i vivo. Men er en påminnelse at protoplasts kan være under sterkt stress forhold som såret stress. Dermed utelukke vi ikke muligheten for at slike stress kan påvirke importen. Således, i enkelte tilfeller resultatene bør tolkes med varsomhet når protoplasts brukes for protein import eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble utført med støtte Cooperative Research Program for landbruk vitenskap og teknologiutvikling (Project nr. PJ010953012018), Rural Development administrasjon og National Research Foundation (Korea) stipendet finansiert av departementet for vitenskap og IKT (nr. 2016R1E1A1A02922014), Sør-Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
- Li, H. M., Chiu, C. C.
- Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
- Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
- Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
- Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
- Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
- Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
- Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
- Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
- Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
- Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
- Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).
