Summary
हम एक गैर-इनवेसिव vivo इमेजिंग प्रोटोकॉल है कि सुव्यवस्थित और लागत प्रभावी है का वर्णन, एल 012 का उपयोग, एक chemiluminescent luminol-एनालॉग, कल्पना और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) एक माउस excisional घाव मॉडल में उत्पन्न करता है ।
Abstract
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के उत्पादन भड़काऊ प्रक्रियाओं की एक बानगी है, लेकिन अतिरिक्त में, ऑक्सीडेटिव तनाव व्यापक रूप से कैंसर, atherosclerosis और मधुमेह जैसे विभिन्न विकृतियों में फंसा है । हम पहले से पता चला है कि परमाणु कारक की शिथिलता (erythroid-2 व्युत्पंन)-2 की तरह (Nrf2)/Kelch-जैसे erythroid कोशिका-1 प्रोटीन व्युत्पंन (Keap1) संकेतन मार्ग मधुमेह में त्वचा के घाव भरने के दौरान चरम ROS असंतुलन की ओर जाता है । चूंकि ROS स्तर घाव भरने की प्रगति का एक महत्वपूर्ण संकेतक हैं, विशिष्ट और सटीक ठहराव तकनीक मूल्यवान हैं । कई इन विट्रो में कोशिकाओं और ऊतकों में ROS को मापने के लिए परख वर्णित किया गया है; हालांकि, वे केवल प्रति नमूना एक संचई माप प्रदान करते हैं । हाल ही में, प्रोटीन के विकास आधारित संकेतकों और इमेजिंग मोडलों अद्वितीय spatiotemporal विश्लेषण के लिए अनुमति दी है । L-012 (सी13ज8ClN4नाव2) एक luminol व्युत्पंन है कि दोनों vivo में और इन विट्रो chemiluminescent NAPDH oxidase द्वारा उत्पंन ROS का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एल 012 अंय फ्लोरोसेंट जांच की तुलना में एक मजबूत संकेत उत्सर्जन करता है और ROS का पता लगाने के लिए दोनों संवेदनशील और विश्वसनीय होना दिखाया गया है । एल के समय चूक प्रयोज्य-012-सुविधा इमेजिंग भड़काऊ प्रक्रियाओं के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता है, जबकि बलिदान के लिए जरूरत को कम करने और समग्र अध्ययन पशुओं की संख्या को कम करने । यहां, हम का उपयोग प्रोटोकॉल का वर्णन एक एल-012- vivo इमेजिंग में सुविधा के लिए excisional घाव चिकित्सा के एक मॉडल में ऑक्सीडेटिव तनाव यों तो स्थानीय रूप से बेकार Nrf2 के साथ मधुमेह चूहों का उपयोग/Keap1 ।
Introduction
भड़काऊ प्रक्रियाओं के माध्यम से उत्पन्न ऑक्सीजन चयापचयों विभिन्न संकेतन झरने के साथ ही सेलुलर घटक1के विनाशकारी परिवर्तन करने के लिए योगदान । ROS को मापने के लिए संवेदनशील और विशिष्ट तकनीकों का उपयोग भड़काऊ प्रक्रियाओं का अध्ययन करने और ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रभाव निस्र्पक के लिए महत्वपूर्ण है । vivo इमेजिंग में अपने जीवित ऊतक में गतिशील स्थानिक और लौकिक डेटा प्रदान करने की क्षमता की वजह से मूल्यवान है । L-012 एक सिंथेटिक chemiluminescent जांच है कि सुपरऑक्साइड ॠणायन के लिए अत्यधिक संवेदनशील है और कोशिकाओं, ऊतकों में अन्य फ्लोरोसेंट जांच की तुलना में एक उच्च प्रकाश तीव्रता का उत्पादन है, और पूरे रक्त1,2,3, 4. यह सफलतापूर्वक murine मॉडल में vivo इमेजिंग में गठिया और कोलाइटिस5,6सहित कई भड़काऊ रोगों का अध्ययन करने के लिए, के लिए कार्यरत किया गया है । यह अभी तक एक की स्थापना की त्वचा के घाव भरने मॉडल में कार्यरत है । ROS उत्पन्न की माप विभिन्न स्थितियों के तहत घाव भरने की प्रगति का आकलन करने के लिए समान रूप से प्रासंगिक है । इस विधि की संवेदनशीलता और इनवेसिव प्रकृति यह murine मॉडल भर में घाव भरने का अध्ययन करने के लिए एक होनहार तकनीक बनाता है ।
Nrf2 एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रिया के एक प्रमुख चालक और एंटीऑक्सीडेंट प्रतिक्रिया तत्व के लिए विशिष्टता के साथ एक transcriptional कारक है (कर रहे हैं) कई एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों8के प्रवर्तक क्षेत्रों के लिए आम है । ऑक्सीडेटिव तनाव के अभाव में Nrf2 Keap1 द्वारा कोशिका द्रव्य में तनहा है, जो बाद में इसके ubiquitination और क्षरण का कारण बनता है । Nrf2/Keap1 मार्ग के असंतुलन अनुचित redox homeostasis में फंसाया गया है और बढ़ी हुई ऑक्सीडेटिव तनाव9की सेटिंग में घाव भरने में देरी । हम पहले से पता चला है कि Keap1 के दमन वृद्धि हुई Nrf2 गतिविधि को उत्तेजित करता है और रोग के बचाव को बढ़ावा देता है मधुमेह घावों में घाव भरने की त्वचा घाव9।
यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन है कि एल-012-असिस्टेड bioluminescence इमेजिंग एक excisional त्वचा के घाव भरने मॉडल है, जो ROS और घाव भरने के बीच सहयोग पर प्रकाश डाला के लिए महत्वपूर्ण है में ROS स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल करता है । यह तकनीक घाव और तत्काल परिधि के भीतर ऑक्सीडेटिव बोझ में वास्तविक समय परिवर्तन को दर्शाता है । इसके अलावा, इस विधि के हस्तक्षेप और तंत्र है कि redox हैंडलिंग को प्रभावित के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । यहां हम redox homeostasis की बहाली के लिए Keap1 पछाड़ना के एक मॉडल का उपयोग करने के लिए हमारी रणनीति की प्रयोज्यता का मूल्यांकन । क्योंकि हमारी तकनीक गैर इनवेसिव है और घाव परेशान कर रहे हैं, एक ही जानवर प्रोटोकॉल या कोशिका lysates के आधार पर आगे पुष्टि विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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Protocol
सभी तरीकों यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और ंयूयॉर्क विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन के उपयोग की समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है । सभी चूहों एक बाधा के पीछे स्थित हैं और सभी कर्मियों उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनते हैं ।
1. दिन 0: Excisional घाव भरने के Murine मॉडल की तैयारी
- Anesthetize मधुमेह (Leprdb/db) चूहों, आयु वर्ग 8 – 12 सप्ताह, साँस का 2% isoflurane के साथ. प्रत्येक माउस पैर पैड चुटकी परीक्षण का उपयोग कर ठीक से anesthetized किया गया है कि की पुष्टि करें । सूखापन से जलन को रोकने के लिए प्रत्येक आंख को बाँझ नेत्र स्नेहक लागू करें । शोधकर्ताओं जब anesthetizing पशुओं isoflurane का उपयोग कर अपने संस्थागत पशु चिकित्सा कर्मचारियों के दिशा निर्देशों का पालन करना चाहिए ।
- चूहों वजन और प्रत्येक माउस के शरीर के वजन रिकॉर्ड । एक ग्लूकोमीटर का उपयोग कर प्रत्येक जानवर के रक्त ग्लूकोज रिकॉर्डिंग द्वारा पशुओं की मधुमेह की स्थिति की पुष्टि करें ।
- प्रक्रियात्मक कार्यक्षेत्र और संज्ञाहरण उपकरण को संक्रमित । एक बाल trimmer का उपयोग कर चूहों के पृष्ठीय बाल निकालें, बालों को हटाने लोशन के आवेदन के बाद दूर करने के लिए अतिरिक्त बाल पोंछ । उजागर त्वचा, दो बार साफ करने के लिए शराब पोंछे का प्रयोग करें, और शुष्क करने की अनुमति ।
- बनाएं २ १० mm पूर्ण मोटाई घाव panniculus carnosus के माध्यम से विस्तार बाँझ 10 mm बायोप्सी घूंसे का उपयोग कर एक अच्छी तरह से स्थापित excisional घाव हीलिंग तकनीक7,8के अनुसार । सभी जीवित रहने की सर्जरी के लिए बाँझ दस्ताने का प्रयोग करें । सर्जरी से पहले बैग में सभी सर्जिकल उपकरणों आटोक्लेव और शल्य क्षेत्र में ही खुला ।
- घाव पट्टी 10 मिमी परिपत्र कटआउट के साथ एक ०.५ mm मोटी सिलिकॉन शीट का उपयोग कर खुला और जगह में बाधित 4-0 रेशम टांके का उपयोग कर stents सुरक्षित ।
- सर्जरी के बाद, संज्ञाहरण और हीटिंग पैड पर जगह से पशुओं को हटाने के लिए उचित वसूली की सुविधा । ध्यान दें की, यदि प्रक्रिया के दौरान पशु शरीर का तापमान कम हो जाती है, पशु हीटिंग पैड के लिए ले जाया जा सकता है पहले संज्ञाहरण के तहत शरीर की गर्मी नुकसान को कम करने के लिए । जानवरों की निगरानी जब तक वे जाग और मोबाइल कर रहे हैं ।
- एक बार पूरी तरह से बरामद, व्यक्तिगत पिंजरों को वापस पशुओं, भोजन और पानी युक्त (कुछ खाना सुनिश्चित करने के बाद ऑपरेटिव संवर्धन के लिए पिंजरे की मंजिल पर है) । 2 सप्ताह के लिए अतिरिक्त घोंसले के माल के रूप में कटा हुआ कागज तौलिए प्रदान करें । जानवरों है कि अन्य जानवरों के साथ सर्जरी आया है घर नहीं है, प्रतिकूल बातचीत को रोकने के लिए और घाव भरने की स्थिति के लिए परिवर्तन ।
- ऑपरेटिव दर्द से राहत के लिए, एक दिन में दो बार शरीर के वजन के ०.१ मिलीग्राम/किलोग्राम पर buprenorphine के साथ चमड़े के नीचे सुई, तुरंत प्रक्रिया के बाद शुरू, 3 दिनों के लिए ।
2. Day 1: Keap1 सिरना की तैयारी
नोट: एक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर सभी उपचार तैयार करें ।
- १२.५ µ एल के 20 µ एम Keap1 सिरना (siKeap1) (२५० pmol) बर्फ पर १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के साथ कम सीरम मध्यम के ३७.५ µ एल के संयोजन से सिरना कमजोर पड़ने की तैयारी करें ।
- एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में liposome मिश्रण के 25 µ एल के साथ कम सीरम मध्यम के 25 µ एल के संयोजन से liposome कमजोर पड़ने की तैयारी करें ।
- जोड़ें ५० µ सिरना कमजोर पड़ने के एल ५० µ एल liposome कमजोर पड़ने dropwise (1:1 मात्रा), और धीरे मिश्रण.
- कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
- पानी में 2% methylcellulose जेल के ५० µ एल जोड़ें और धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण ।
- या तो एक बकवास एसआईएनएस (नियंत्रण) या siKeap1 (प्रयोगात्मक) के साथ प्रत्येक जानवर का इलाज । घाव के शीर्ष करने के लिए जेल लागू होते हैं । जगह में जेल रखने के लिए पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग के साथ पशु का धड़ लपेटें, गतिशीलता बनाए रखने के लिए स्वतंत्र अंग रखने.
3. Day 3: एल-012 समाधान की तैयारी
नोट: सभी एजेंट एक सुरक्षा कैबिनेट में तैयार करें ।
- एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, ०.५ मिलीग्राम/100 मिलीलीटर की एकाग्रता पर 1x पंजाब में एल 012 तैयार ।
- मैंयुअल रूप से भंवर microcentrifuge ट्यूब । एल 012 पूरी तरह से पंजाबियों में भंग नहीं करता है, लेकिन यह समान रूप से तरल में निलंबित कर दिया जाना चाहिए । नोट की, को भंग करने का प्रयास न करें L-012 पानी में परेशान शारीरिक इलेक्ट्रोलाइट संतुलन निम्नलिखित इंजेक्शन से बचने के लिए.
- एक 1 एमएल सिरिंज एक 27 जी सुई का उपयोग कर में समाधान स्थानांतरण ।
नोट: प्रकाश से एल 012 समाधान की रक्षा करने के लिए सुनिश्चित करें ।
4. दिन 3: Vivo में मधुमेह घावों की इमेजिंग
- साँसों के साथ Anesthetize चूहों 2% isoflurane. शोधकर्ताओं जब anesthetizing पशुओं isoflurane का उपयोग कर अपने संस्थागत पशु चिकित्सा कर्मचारियों के दिशा निर्देशों का पालन करना चाहिए । प्रत्येक माउस पैर पैड चुटकी परीक्षण का उपयोग कर ठीक से anesthetized किया गया है कि की पुष्टि करें । सूखापन से जलन को रोकने के लिए प्रत्येक आंख को बाँझ नेत्र स्नेहक लागू करें ।
- धीरे घावों को परेशान किए बिना चूहों से ड्रेसिंग पारदर्शी फिल्म निकालें ।
- उनके संबंधित आदेश में माउस इमेजिंग चैंबर में रखें । चैंबर में उचित हे2 स्तर बनाए रखने के लिए, इमेजिंग प्रणाली बहिर्वाह और प्रेरण चैंबर हे2 स्तर १.० एल के लिए सेट/
- छवि bioluminescence और एल के इंजेक्शन से पहले आधारभूत पर फोटोग्राफ-012 यौगिक के लिए चूहों ।
- पेट को अल्कोहल वाइप्स से पोंछें और सूखने दें । एक intraperitoneal इंजेक्शन के एल 012 समाधान में 5 मिलीग्राम प्रति २०० g शरीर के वजन का उपयोग कर एक 27-गेज सुई । उदाहरण के लिए, एक चूहा 20 जी वजन ०.५ एल 012 के मिलीग्राम प्राप्त करना चाहिए ।
- तुरंत एल 012 इंजेक्शन के बाद, चूहों इमेजिंग चैंबर में अपने संबंधित स्थानों में वापस जगह है । ६० मिनट के पाठ्यक्रम पर माउस छवि, 4 मिनट के अंतराल पर 1 मिनट के लिए । ROS के स्तर के निर्धारण के लिए ब्याज के क्षेत्र के रूप में 10 मिमी घाव को परिभाषित करें ।
- सर्जरी के बाद, संज्ञाहरण और हीटिंग पैड पर जगह से पशुओं को हटाने के लिए उचित वसूली की सुविधा । जानवरों की निगरानी जब तक वे जाग और मोबाइल कर रहे हैं ।
- एक बार पूरी तरह से बरामद, व्यक्तिगत पिंजरों को वापस पशुओं, एक ही पोस्ट को बनाए रखने के ऑपरेटिव संवर्धन पर्यावरण पहले १.६ में वर्णित है । जानवरों है कि अन्य जानवरों के साथ सर्जरी आया है घर नहीं है, प्रतिकूल बातचीत को रोकने के लिए और घाव भरने की स्थिति के लिए परिवर्तन ।
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Representative Results
एक स्थापित excisional घाव मॉडल (चित्रा 1a) के अनुसार द्विपक्षीय घाव बनाने के तीन दिन बाद, मधुमेह चूहों इमेजिंग चैंबर में तैनात हैं । एक प्रारंभिक तस्वीर और bioluminescence का एक उपाय करने के लिए एल 012 के इंजेक्शन से पहले ले रहे है पृष्ठभूमि संकेत (आंकड़ा 1b) के लिए खाते । एल-012 समाधान के साथ intraperitoneal इंजेक्शन के बाद, चूहों कक्ष में स्थिति है और bioluminescence जहां ROS (चित्रा 1C) का पता लगाया है घाव के क्षेत्रों में visualized है। चित्रा 2में उल्लिखित के रूप में सही इमेजिंग और विश्लेषण सेटिंग्स का चयन करने के बाद, इमेजिंग के साथ आगे बढ़ें । Bioluminescence ६० मिनट (चित्रा 3) के पाठ्यक्रम पर 5 मिनट के अंतराल पर 1 मिनट के लिए दर्ज की गई है । यह समय के साथ ब्याज की क्षेत्र की bioluminescence संतृप्ति को दर्शाता है । हमारे पशु मॉडल में, इष्टतम इमेजिंग समय तक पहुंचने के लिए पूरा L-012 संतृप्ति ५० मिनट के लिए निर्धारित किया गया था, जिसके बाद bioluminescence में कोई उल्लेखनीय अंतर की सराहना की थी । इस समय का उपयोग पशु मॉडल के आधार पर अलग और स्वतंत्र रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए और आकार, पशु प्रकार, उपचार, आदि के आधार पर घाव मॉडल बदलती के लिए अनुकूलित करना होगा ।
ब्याज का एक क्षेत्र (ROI) मधुमेह घाव क्षेत्र तक सीमित bioluminescence को बढ़ाता है के प्रयोजन के लिए ओवरले छवि (चित्रा 4) पर तैयार की है । ये ROIs इसी तरह सभी घावों के लिए परिभाषित कर रहे है सहित l-012 इंजेक्शन (चित्रा 4a), और के बाद एल-012 इंजेक्शन में बकवास सिरना-इलाज (चित्रा 4B) और Keap1 सिरना-इलाज चूहों (चित्रा 4c) । Bioluminescence क्षेत्र द्वारा प्रकाश की तीव्रता की कुल गिनती विभाजित करके गणना की गई । तालिका 1 चित्रा 4dमें रेखांकन गणना से पता चलता है । बकवास सिरना-इलाज मधुमेह घाव था ४५,७७५ ११,६४९ bioluminescence/सेमी2, जबकि Keap1 दमन १९,४०५ ५,९३९ bioluminescence/मुख्यमंत्री2 में परिणाम (एसडी मतलब) । एक छात्र के टी परीक्षण एक काफी कम bioluminescence प्रदर्शन किया (पी = 0.042) Keap1 सिरना-इलाज घाव में बकवास सिरना-इलाज घाव की तुलना में, उच्च correlating गतिविधि के साथ कम ऑक्सीडेटिव बोझ के साथ Nrf2 (चित्रा 4d). पुष्टि करने के लिए कि ROS के सापेक्ष स्तर siएन एस और siKeap1 पर एल 012 द्वारा कल्पना की सूजन को मापने के अन्य स्थापित साधन के साथ सहसंबंधी बनाना, हम 10 दिन घाव ऊतक वर्गों का विश्लेषण किया. एच एंड ई दाग एसआईएनएस-इलाज वाले लोगों के विपरीत में siKeap1-इलाज घावों में कम सेलुलर घुसपैठ दिखाया, कम भड़काऊ आकृति विज्ञान (आंकड़ा 5) का संकेत है । F4/80 के Immunoreactivity, एक प्रोटीन मैक्रोफेज मार्कर, (लाल प्रतिदीप्ति) घाव ऊतक वर्गों पर siKeapमें कम मैक्रोफेज से पता चला घाव के रूप में siNS-इलाज घावों (चित्रा 5B) की तुलना में । यह आगे प्रदर्शित करता है कि एल 012 द्वारा visualized ROS स्तर सही हैं और अन्य स्थापित ROS माप मॉडल के साथ सहसंबंधी बनाना. गंभीर, इस तकनीक को लागू करने जरूरत नहीं ऊतक वर्गों के लिए जानवरों के बलि के रूप में एच एंड ई और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए आवश्यक है ।
चित्र 1: इमेजिंग के लिए प्रयोगात्मक सेट-अप । (क) मधुमेह चूहों एक स्थापित excisional घाव मॉडल का उपयोग कर घायल कर रहे हैं । (ख) bioluminescence पूर्व एल-012 इंजेक्शन के साथ फोटोग्राफ की एक आधारभूत ओवरले । (ग) एल-012 के साथ निम्नलिखित intraperitoneal इंजेक्शन, ROS visualized है । बी और सी के लिए Luminescence स्केल कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्र 2: इन विट्रो इमेजिंग सिस्टम प्रोग्राम में छवि और विश्लेषण सेटिंग्स । (A) प्राप्ति नियंत्रण कक्ष (लाल तीर) पर "इमेजिंग विज़ार्ड" का चयन करें । (ख) "Bioluminescence इमेजिंग" का चयन इमेजिंग मोड है । (ग) "ओपन फिल्टर" माप तकनीक के रूप में चुना जाता है । (घ) इमेजिंग विषय चयनित है "माउस" और "समय श्रृंखला अध्ययन" विकल्प चुना गया है । सेगमेंट की कुल संख्या और सेगमेंट के बीच देरी समय इनपुट है. (ङ) इमेजिंग के साथ आगे बढ़ने के लिए "मोल अनुक्रम" का चयन करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3: vivo ROS इमेजिंग में अनुदैर्ध्य स्टडीज । मधुमेह चूहों 1 मिनट L-012 के साथ ६० मिनट के पाठ्यक्रम पर 5 मिनट के अंतराल पर निम्नलिखित intraperitoneal इंजेक्शन के लिए imaged हैं: रॉय. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: बढ़ाता bioluminescence । मधुमेह के घावों के bioluminescence ओवरले के साथ तस्वीरें (क) एल-012 इंजेक्शन से पहले, (ख) l-012 इंजेक्शन के बाद पापों के साथ इलाज घावों के साथ, और (सी) एल 012 इंजेक्शन के बाद siKeap1 के साथ इलाज किया । (घ) पापों और siKeap1 उपचारित घावों के लिए ROIs की सतह क्षेत्र द्वारा विभाजित औसत bioluminescence की ठहराव. पीला हलकों: रॉय । डेटा मतलब ± मानक विचलन के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं; *p < ०.०५, n = 4. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: immunohistochemical दाग के साथ ROS सहसंबंध । (क) एच एंड ई के दाग 10 दिनों में मधुमेह के घाव ऊतक वर्गों के कम सेलुलर में कम भड़काऊ आकृति विज्ञान के सबूत के रूप में घुसपैठ पता चला siKeap1 के रूप में एसआईएनएस-इलाज घावों की तुलना में घाव का इलाज किया । (ख) F4/80 इम्यूनोफ्लोरेसेंस (लाल) si में मैक्रोफेज की घटी हुई संख्या को दिखाया गयाKeap1 घाव वर्गों का इलाज 10 दिनों में उनके एसआईएनएस-व्यवहार समकक्षों की तुलना में. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| रॉय | सी | कुल गणना | औसत गणना | Stdev गणना | क्षेत्र [cm ²] | कुल गणना क्षेत्र/ | औसत गणना क्षेत्र/ |
| रोि 1 | एन एस | 9.38 ई + 03 | 1.14 ई + 02 | 3.85 ई + 01 | 2.48 ई-01 | 3.78 ई + 04 | 4.58 ई + ०४ |
| रॉय 2 | एन एस | 4.68 ई + 03 | 5.37 e + ०१ | 3.13 ई + 01 | 2.63 ई-01 | 1.78 ई + ०४ | |
| रॉय 3 | एन एस | 1.72 ई + 04 | 2.18 ई + 02 | 1.54 ई + 02 | 2.39 ई-01 | 7.20 ई + ०४ | |
| रोि 4 | एन एस | 1.24 ई + 04 | 1.68 e + 02 | 8.41 e + ०१ | 2.24 ई-01 | 5.55 ई + 04 | |
| रोि 5 | Keap1 | 3.21 ई + 03 | + + 01 | 2.76 e + ०१ | 2.84 ई-01 | 1.13 ई + 04 | 1.94 ई + ०४ |
| रोि 6 | Keap1 | 2.56 ई + 03 | 2.88 e + ०१ | 1.06 ई + 01 | म. सं.-01 | 9.52 ई + 03 | |
| रोि 7 | Keap1 | 4.92 ई + 03 | 6.48 e + ०१ | 5.03 ई + 01 | 2.30 ई-01 | 2.14 ई + 04 | |
| रोि 8 | Keap1 | 8.34 ई + 03 | 1.07 ई + 02 | 5.25 ई + 01 | 2.36 ई-01 | 3.54 ई + 04 |
तालिका 1: निर्धारित ROIs के लिए bioluminescence को बढ़ाता है । Bioluminescence प्रत्येक रॉय और मानकीकृत क्षेत्र सतह के सापेक्ष के लिए मापा जाता है । माध्य, मानक विचलन और मानक त्रुटि के लिए परिकलन तदनुसार परिकलित किए जाते हैं । 1, 2, 3 रॉय, और 4 मधुमेह के घावों का इलाज किया पापों की जैविक दोहराता के घावों से रॉय का प्रतिनिधित्व करते हैं और रॉय 5, 6, 7, और 8 ROIs का प्रतिनिधित्व जैविक दोहराने सेKeap1 मधुमेह के घावों का इलाज किया.
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Discussion
ROS मापने के लिए आम तकनीक जटिल ऊतक निष्कर्षण या इसी तरह इनवेसिव तकनीक की आवश्यकता प्रोटोकॉल द्वारा सीमित किया गया है । हाल के वर्षों में, ऑक्सीडेटिव तनाव की माप अभिनव इमेजिंग विधियों के आधार पर सूचित किया गया है, जिससे spatiotemporal आकलन9,10,11के लिए अनुमति देता है । L-012 luminol, lucigenin, और MCLA1,4के सापेक्ष एक chemiluminescent जांच के रूप में कई फायदे हैं । यौगिक गैर विषैले, आसानी से अवशोषित कर लेता है, और luminol या इसी तरह की जांच12की तुलना में बहुत मजबूत bioluminescence है । गंभीर, एल 012 सुरक्षित रूप से किसी भी प्रतिकूल प्रभाव या पशु मॉडल6को नुकसान के बिना अनुदैर्ध्य विश्लेषण के लिए सातत्य में कई बार प्रशासित किया जा सकता है । इस रणनीति सीमित विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता है, और आवश्यक उपकरण सबसे अनुसंधान प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध है, यह एक व्यापक रूप से सुलभ प्रोटोकॉल बना ।
इष्टतम उपयोग के लिए, हमारा सुझाव है कि रिएजेंटों को ठीक तरह से तारीख तक और प्रकाश से रक्षा की गिरावट से बचने के लिए । स्टेंटिंग के माध्यम से Humanizing घाव murine घावों के लिए माइग्रेशन और पुनः epithelialization के माध्यम से चंगा करने के लिए अनुमति देता है, के रूप में महत्वपूर्ण संकुचन द्वारा विरोध किया । टांके जगह में घाव किनारों को सुरक्षित करने के लिए स्टेंट परिधि के माध्यम से रास्ते के दो तिहाई रखा जाना चाहिए । जेल आवेदन के बाद पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग के साथ चूहों लपेटना सुनिश्चित करता है कि सामयिक उपचार जगह में रहते हैं । को रोकने के लिए स्वयं चूहों में घाव, जो परिणाम मिल सकता है, कड़वा चखने स्प्रे परिधि और टांका समुद्री मील के लिए लागू किया जा सकता काटने को हतोत्साहित करने के लिए । एल 012 पंजाब में सीमित घुलनशीलता है, लेकिन समाधान के दोहराव pipetting द्वारा एक निलंबन फार्म का होगा । ये समस्या निवारण उपाय विभिन्न घावों में निरंतरता सुनिश्चित करते हैं, पशु आराम बनाए रखते हुए अंतर-उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता को नष्ट करते हैं । इस तकनीक के बाद से एक पशु मॉडल में एक समाधान के intraperitoneal इंजेक्शन पर निर्भर करता है, वहां कई हस्तक्षेप जानवरों जो नियंत्रित नहीं किया जा सकता है के लिए निहित कारकों हैं । उदाहरण के लिए, स्थानीय रक्त प्रवाह और बाद में अवशोषण और एल के स्थानीयकरण-012 ब्याज के क्षेत्रों के लिए तय नहीं किया जा सकता है । हालांकि, इस चर अपने स्वयं के आंतरिक नियंत्रण के रूप में एक जानवर के उपयोग के माध्यम से कम किया जा सकता है कि इस तरह के एक घाव siएनएस और एसआईKeap1के साथ दूसरे के साथ इलाज किया जा सकता है ।
हम में vivo अध्ययन के लिए एक रणनीति की उपयोगिता पर रिपोर्ट ROS के एक त्वचा के घाव हीलिंग मॉडल. हमारे वर्तमान अध्ययन में, Keap1 सिरना के साथ घावों के उपचार में कमी आई ऑक्सीडेटिव बोझ जो Nrf2 के महत्व के बारे में हमारी समझ की पुष्टि/Keap1 मार्ग एंटीऑक्सीडेंट से निपटने के लिए । हालांकि इस विधि मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, वहां महत्वपूर्ण सीमाओं के एक नंबर रहे हैं । जबकि एल 012 अति संवेदनशील है, यह ROS के लिए विशिष्ट नहीं है और यह भी प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियों के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए दिखाया गया है6. इसके अलावा लक्षित जांच और immunoassay-आधारित तरीकों के साथ विश्लेषण बढ़ाया विशिष्टता और ROS के उपसेलुलर स्थानीयकरण के माध्यम से इस दृष्टिकोण पूरक13संबद्ध । l-012 के लिए प्रस्तावित तंत्र-bioluminescence आधारित एच2ओ212के साथ संयोजन में peroxidase की गतिविधि के माध्यम से आणविक ऑक्सीजन द्वारा एल 012 के ऑक्सीकरण शामिल है । यह एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम अवरोधकों कि peroxidase के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का उपयोग सीमा । अधिक विस्तृत विश्लेषण विशेष रूप से सुपरऑक्साइड आयनों या प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियों के अलावा अंय ROS यों तो इरादा चयापचयों वर्तमान रणनीति के साथ संभव नहीं है ।
ROS का पता लगाने के लिए एल-012 के उच्च संवेदनशीलता को देखते हुए मोटे तौर पर, यह विभिन्न त्वचा के घाव भरने और अन्य ऊतक मॉडल के लिए आसानी से अनुकूलनीय है. हम ऐसे आरटीए ४०८ और Keap1 सिरना14,15के lipoproteoplex वितरण के रूप में मधुमेह के घावों के लिए लक्षित चिकित्सकीय के redox निहितार्थ का आकलन करने के लिए इस तकनीक की मतलब का प्रदर्शन किया है । इस प्रोटोकॉल की महत्वपूर्ण ताकत को देखते हुए, वहां है पूर्व vivo दृष्टिकोण के माध्यम से गहरे डिब्बों के भीतर ROS अध्ययन के लिए समान रणनीति लागू करने में अपार भविष्य की क्षमता है, ध्यान केंद्रित विच्छेदन, और organoids ।
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Disclosures
हम रिपोर्ट करने के लिए कोई प्रकटीकरण है ।
Acknowledgments
हम NYU स्कूल ऑफ मेडिसिन में, ऑरलैंडो Aristizabal और Youssef Zaim Wadghiri के लिए विशेष धंयवाद के साथ नैदानिक इमेजिंग कोर के लिए आभारी हैं । कोर एक साझा संसाधन आंशिक रूप से लौरा और इसहाक Perlmutter कैंसर केंद्र सहायता अनुदान NIH/NCI 5P30CA016087 और NIBIB जैव प्रौद्योगिकी संसाधन केंद्र अनुदान NIH P41 EB017183 द्वारा समर्थित है । यह काम अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन द्वारा समर्थित किया गया था "मधुमेह रोकने के लिए मार्ग" डीसी को [अनुदान संख्या 1-16-इक्का-08] और NYU एप्लाइड अनुसंधान सहायता कोष के लिए P.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
- Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
- Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
- Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
- Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
- Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
- Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
- Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
- Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
- Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
- Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
- Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).
