Summary
Biz bir non-invaziv vivo içinde aerodinamik ve maliyet-etkin, protokolü Imaging görselleştirmek ve reaktif oksijen türlerine (ROS) bir fare excisional yara modelinde oluşturulan ölçmek için L-012, bir chemiluminescent luminol-analog, kullanan açıklar.
Abstract
Reaktif oksijen türleri (ROS) nesil iltihabi süreçleri özelliğidir ama fazla, oksidatif stres yaygın kanser, ateroskleroz ve diyabet gibi çeşitli patolojileri içinde karıştığı. Daha önce nükleer faktör (2 erythroid elde edilen) bu disfonksiyon göstermiştir-2 (Nrf2) hangi tarihlerde / yol açar aşırı ROS dengesizlik kutanöz sırasında sinyal Kelch benzeri erythroid protein 1 (Keap1) hücre kaynaklı yara diyabet şifa. ROS düzeyleri yara iyileşme progresyon önemli bir göstergesi olduğundan, özel ve doğru miktar teknikleri değerlidir. ROS hücre ve dokulara ölçmek için birkaç vitro deneyleri tarif var; Ancak, onlar sadece örnek başına tek bir toplu ölçüm sağlar. Daha yakın zamanlarda, protein bazlı göstergeleri ve görüntüleme yöntemleri benzersiz kronolojik zamanmekansal analizleri için izin. L-012 (C13H8ClN4NaO2) içinde vivo ve in vitro chemiluminescent için kullanılabilir bir luminol türevi olan NAPDH oksidaz tarafından oluşturulan ROS tespiti. L-012 Diğer Floresan problar daha güçlü sinyale yayar ve hassas ve güvenilir ROS algılama olduğu gösterilmiştir. L-012-kolaylaştırdı görüntüleme zaman atlamalı uygulanabilirliği ise kurban gereksinimini azaltma ve genel olarak çalışma hayvan sayısını azaltarak iltihabi süreçleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, L-012-kolaylaştırdı vivo içinde yerel olarak işlevsel olmayan Nrf2/Keap1 ile diyabetik fare kullanarak excisional yara iyileşmesi bir modeldir oksidatif stres ölçmek için Imaging kullanan bir iletişim kuralı açıklar.
Introduction
Oksijen metabolitleri inflamatuar işlemler üretilen çeşitli sinyal cascades hem de hücresel bileşenleri1yıkıcı İLETİMLERİNİZE katkıda. ROS ölçmek için hassas ve belirli teknikler kullanan iltihabi süreçleri eğitim ve oksidatif stresin etkilerini karakterize için önemlidir. Vivo görüntüleme canlı dokuya dinamik uzamsal ve zamansal veri sağlamak yeteneği nedeniyle değerlidir. Süperoksit anyon için son derece hassas ve Diğer Floresan problar hücre, doku ve tam kan1,2,3, daha yüksek bir ışık şiddeti üreten bir sentetik chemiluminescent sonda L-012 olduğunu 4. bu başarıyla vivo içinde görüntüleme fare modelleri için çeşitli inflamatuar hastalıklar, artrit ve kolit5,6dahil olmak üzere çalışmaya istihdam edilmiştir. Modeli şifa kurulan bir kutanöz yarada istihdam edilecek henüz. Oluşturulan ROS ölçümü farklı koşullar altında yara iyileşmesi ilerlemeyi değerlendirmek aynı derecede uygundur. Duyarlılık ve bu yöntemin invaziv olmayan doğa arasında fare modelleri yara iyileşmesi için umut verici bir yüntem yapar.
Nrf2 antioksidan yanıt ve bir transkripsiyon faktörü antioksidan yanıt öğesi (vardır) birçok antioksidan enzimler8organizatörü bölgelerinde yaygın için özgüllük ile büyük bir sürücüdür. Oksidatif stres, yokluğunda Nrf2 sitoplazma içinde daha sonra onun ubiquitination ve düşmesine neden olan Keap1 tarafından münzevi. Nrf2/Keap1 yolu dengesizlik uygunsuz redoks homeostazı ve artmış oksidatif stres9ayarında gecikmiş yara iyileşmesi karıştığı olmuştur. Biz daha önce Keap1 bastırılması artan Nrf2 etkinliği uyarır ve teşvik göstermiştir diyabetik içinde patolojik kutanöz yara iyileşme Kurtarma yarası9.
Burada L-012-destekli bioluminescence ROS ile yara iyileşmesi arasındaki ilişkiyi vurgulamak için önemlidir excisional kutanöz yara iyileşme modelinde ROS düzeyleri ölçmek için Imaging kullanan bir iletişim kuralı açıklar. Bu teknik oksidatif yük yaralar ve acil çevre içinde gerçek zamanlı değişiklikleri gösterir. Ayrıca, bu yöntem hızlı değerlendirme müdahaleler ve mekanizmaları için bu etkiler redoks işleme sağlar. Burada biz bir modelini Keap1 nakavt redoks homeostazı restorasyonu için stratejimiz uygulanabilirliğini değerlendirmek için kullanın. Bizim non-invaziv bir tekniktir ve yaralar rahatsız oldukları için aynı hayvan histolojisi veya hücre lysates temelinde daha fazla doğrulama analizleri için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, New York Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından onaylanmıştır. Tüm fareler bir engel yer alan ve tüm personel uygun kişisel koruyucu ekipman giymek.
1. gün 0: Excisional yara iyileşmesi fare modeli hazırlanması
- İnhalational % 2 isoflurane ile 8-12 hafta yaşlı diyabetik (Leprdb/db) fareler anestezi. Her fare düzgün Ayak pedi çimdik testi kullanılarak anestezi olduğunu doğrulayın. Steril oküler yağ tahriş kimden kuruluğu önlemek için her göz için geçerlidir. Araştırmacılar isoflurane kullanarak hayvanlar anesthetizing zaman onların kurumsal hayvan hastalıklarıyla ilgili personelinin yönergeleri takip etmelidir.
- Fareler tartmak ve vücut ağırlığı her fare ile kayıt. Her hayvan bir şeker ölçüm kullanarak kan şekeri kaydederek hayvanlar diyabetik durumunu doğrulayın.
- Yordam çalışma alanı ve anestezi ekipman dezenfekte. Bir saç düzeltici kullanarak fare dorsal tüylerden uzak kıllarında silmek için uygulama saç Temizleme losyonu tarafından takip. İki kez maruz kalan cilt temizlemek için alkol mendil kullanın ve kurumasını bekleyin.
- Steril 10 mm biyopsi yumruk tekniği7,8şifa köklü bir excisional yara göre kullanarak panniculus carnosus aracılığıyla uzanan iki 10 mm tam-kalınlık yaralar oluşturmak. Steril eldiven tüm survival cerrahi için kullanın. Otoklav tüm cerrahi aletler cerrahi ve cerrahi alan sadece açıkta önce torbalarda.
- Yaraları ile 10 mm dairesel kesik bir 0,5 mm kalın silikon sayfasını kullanarak açın ve kullanım yeri olarak restenoz güvenli ateli 4-0 ipek sütür kesildi.
- Aşağıdaki cerrahi, hayvanlar anesteziden çıkarın ve uygun kurtarma kolaylaştırmak için yastık Isıtma üzerinde yerleştirin. Hayvan vücut ısısı işlem sırasında azalýrsa belirtmek gerekirse hayvan ısıtma yastığını daha önce anestezi altında vücut ısı kaybını en aza indirmek için taşınmış olabilir. Uyanık ve mobil kadar hayvanları izlemek.
- Sonra tamamen iyileşti, hayvanlar bireysel kafesleri, yiyecek ve su (ameliyat sonrası zenginleştirme için kafes katında yiyecek bir şeyler olduğundan emin olun) içeren dönün. Rendelenmiş kağıt havlu 2 hafta kadar ek iç içe geçmiş malzeme sağlamak. Cerrahi olumsuz etkileşim ve yara iyileşme durumu değişiklikleri önlemek için diğer hayvanlarla geçiren hayvanlar ev değil.
- Ameliyat sonrası ağrı yardım için fareler subkutan buprenorfin 0.1 mg/kg vücut ağırlığı ile günde iki kez, 3 gündür yordamın hemen ardından başlayan enjekte et.
2. gün 1: Keap1 siRNA hazırlanması
Not: tüm tedaviler bir Biyogüvenlik kabini içinde hazırlamak.
- SiRNA seyreltme 12.5 µL (250 pmol) 20 µM Keap1 siRNA (sıKeap1) ile düşük serum orta 37,5 µL birleştirerek buz bir 1.5 mL microcentrifuge Tüp hazırlayın.
- Lipozom seyreltme lipozom Mix bir 1.5 mL microcentrifuge tüp 25 µL düşük serum orta 25 µL birleştirerek hazırlayın.
- SiRNA seyreltme 50 µL 50 µL lipozom seyreltme için dropwise (1:1 cilt) ekleyin ve karışımı yavaşça.
- Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya.
- % 2 methylcellulose jel 50 µL su ekleyin ve karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetting.
- Her hayvan ya da bir saçmalık siNS (kontrol) ile tedavi siKeap1 (deneysel). Jel yara uygulamak. Hayvanın gövde jel, bacaklarda hareketlilik korumak ücretsiz tutmak tutmak için şeffaf film soyunma ile sarın.
3. gün 3: L-012 çözüm hazırlanması
Not: tüm reaktifler bir Biyogüvenlik kabini içinde hazırlamak.
- 1.5 mL microcentrifuge Tüp, bir konsantrasyon 0,5 mg/100 mL 1 X PBS L-012 hazırlayın.
- El ile microcentrifuge tüp girdap. Eşit olarak sıvı içinde askıya ancak L-012 tamamen PBS çözülmez yok. Not, enjeksiyon takip rahatsız edici fizyolojik elektrolit denge önlemek için L-012 suda çözülür girişiminde bulunmaz.
- Çözüm 27 G iğne kullanarak 1 mL şırınga aktarın.
Not: L-012 çözüm ışıktan korumak emin olun.
4. gün 3: Vivo içinde görüntüleme, diyabetik yaralar
- İnhalational % 2 isoflurane ile fareler anestezi. Araştırmacılar isoflurane kullanarak hayvanlar anesthetizing zaman onların kurumsal hayvan hastalıklarıyla ilgili personelinin yönergeleri takip etmelidir. Her fare düzgün Ayak pedi çimdik testi kullanılarak anestezi olduğunu doğrulayın. Steril oküler yağ tahriş kimden kuruluğu önlemek için her göz için geçerlidir.
- Yavaşça şeffaf film soyunma fareler yaralar bozmadan çıkarın.
- Fareler kendi siparişlerini görüntüleme odasında yerleştirin. Uygun O2 düzeyleri odasında korumak için 1.0 L/dak için görüntüleme sistemi girişi ve indüksiyon odası O2 düzeyleri ayarlayın.
- Fareler bioluminescence ve temel L-012 bileşik enjeksiyon önce fotoğrafa için görüntü.
- Karın alkol mendil ile silin ve kurumasını sağlar. Mayi iğne 27'lik iğne kullanarak 200 g vücut ağırlığı başına 5 mg L-012 çözümün gerçekleştirin. Örneğin, 20 gr ağırlığında bir fare 0.5 mg L-012 almanız gerekir.
- Hemen ardından L-012 enjeksiyon geri yerlerde onların anılan sıraya göre görüntüleme odasında fareler yer. Fareler 4 dakika aralıklarla 1 dakika 60 dakika boyunca görüntü. 10 mm yara faiz ROS düzeyini belirlemek için bölge tanımlamak için kullanılır.
- Aşağıdaki cerrahi, hayvanlar anesteziden çıkarın ve uygun kurtarma kolaylaştırmak için yastık Isıtma üzerinde yerleştirin. Uyanık ve mobil kadar hayvanları izlemek.
- Bir zamanlar tamamen iyileşti, bireysel kafesleri, daha önce açıklanan 1,6 aynı ameliyat sonrası zenginleştirme ortamı korumak için dönüş hayvanlar. Cerrahi olumsuz etkileşim ve yara iyileşme durumu değişiklikleri önlemek için diğer hayvanlarla geçiren hayvanlar ev değil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Göre kurulan excisional yara modeli (Şekil 1A), ikili yaralar oluşturduktan sonra üç gün diyabetik fare görüntüleme odasında konumlandırılır. Bir ilk fotoğrafı ve bir ölçü bioluminescence L-012 enjeksiyon önce arka plan sinyal (Şekil 1B) için hesap için alınır. Mayi enjeksiyonu ile L-012 çözüm, fareler odasında konumlandırılır ve bioluminescence nerede ROS algılandığında yara alanlarında görüntülenir (ekil 1 c). Doğru görüntüleme ve Şekil 2' de özetlenen çözümlemesi ayarlarını seçtikten sonra görüntüleme ile devam edin. Bioluminescence için 1 dakika 5 dakika aralıklarla 60 dakika (Şekil 3) boyunca kaydedilir. Bu bölgenin ilgi bioluminescence doygunluk zaman içinde gösterir. Bizim hayvan modelinde, tam L-012 doygunluk ulaşmak için en uygun görüntüleme saat 50 dk sonra bioluminescence içinde önemli bir fark takdir edilmiştir olmak tespit edilmiştir. Bu sefer hayvan bağlı olarak farklı olacaktır modeli kullanılan ve bağımsız olarak belirlenecek ve yara modelleri boyutu, hayvan türü, tedavi, vb bağlı olarak değişen için en iyi duruma getirilmiş
Bir bölge diyabetik yaranın alanına sınırlı bioluminescence miktarının amacıyla (ROI) ilgi Bindirme görüntüsünü (Şekil 4) çizilir. Bu ROIs L-012 enjeksiyon (Şekil 4A) önce ve sonra L-012 enjeksiyon saçma siRNA tedavi (Şekil 4B) ve Keap1 siRNA tedavi fareler (Şekil 4 c) de dahil olmak üzere tüm yaralar için benzer şekilde tanımlanır. Bioluminescence alanına göre ışık yoğunluğunu toplam sayıları bölünmesi ile hesaplanır. Tablo 1 Şekil 4 diçinde Grafiği çizilecek hesaplamaları gösterir. Saçma siRNA tedavi diyabetik yaralar 45,775 11,649 vardı 19,405 5,939 bioluminescence/cm2 ' (ortalama SD) Keap1 bastırma sonuçlandı iken bioluminescence/cm2,. Öğrenci'nin t-testi önemli ölçüde azalmıştır bioluminescence göstermiştir (p 0.042 =) alt oksidatif yük ile daha yüksek Nrf2 aktivite (şekil ile korele yara, saçma ile karşılaştırıldığında siRNA tedavi yara Keap1 siRNA tedavi içinde 4 D). sıNS ve siKeap1 ilişkili iltihap ölçme kurulan diğer araçlar ile L-012 tarafından görüntülenmiştir ROS göreli seviyeleri, biz 10 günlük analiz onaylamak için doku bölümleri yara. H & E lekeleri gösterdi azaltılmış hücresel infiltrasyon sıKeap1-tedavi yaralar aksine sıNS-işlem görmüş olanlar, gösteren azaltılmış inflamatuar morfoloji (Şekil 5A). İmmunoreactivity F4/80, bir protein makrofaj işaretleyici (kırmızı floresans) yara dokusu bölümlerinde ortaya azaltılmış sıKeap1 makrofajlar tedavi yaralar sıNSile karşılaştırıldığında-tedavi yaralar (Şekil 5B). Bu daha da L-012 tarafından görüntülenmiştir ROS düzeyleri doğru ve diğer kurulan ROS ölçüm modelleriyle correlate gösterir. Eleştirel, bu tekniği uygulamak hayvanlar H & E ve ayirt boyama için gerekli olduğu gibi doku bölümler için ödün gerekli değil.
Şekil 1: görüntüleme için deneysel set-up. (A)diyabetik farelerin yaralı bir kurulan excisional yara modelini kullanarak. (B) A taban kaplaması bioluminescence pre-L-012 enjeksiyon ile fotoğrafın. (C) L-012 mayi enjeksiyonu, ROS görüntülenir. Işıma ölçek B ve c için Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Ayarları sistem program görüntüleme vitro olarak görüntü ve analiz. (A) Select "Imaging Sihirbazı" satın alma kontrol panelindeki (kırmızı ok). (B) "Bioluminescence görüntüleme" görüntüleme modu seçili olduğunu. (C) "açık filtre" ölçüm tekniği seçilir. (D) seçili görüntüleme konu "fare" ve "serisi çalışma zamanı" seçeneği seçilir. Kesimleri ve kesimleri arasındaki gecikme süresi toplam sayısını girin. (Görüntüleme ile devam etmek içinE) Select "Sequence" elde etmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: uzunlamasına çalışmalar in vivo ROS düşsel. Diyabetik farelerin yansıma için 1 dakikadan 5 dakikada L-012 ile mayi enjeksiyon takip aralıkları boyunca 60 dk. kırmızı daireler: yatırım getirisi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: bioluminescence miktarının. Fotoğraf bioluminescence kaplaması, yaralar ile L-012 enjeksiyon, (B) önce diyabetik yaralar(a)ile günahları ile L-012 enjeksiyon ve (C) sonra sıKeap1 ile L-012 enjeksiyon sonra tedavi yaralar tedavi. (D) miktar ortalama bioluminescence, ROIs günahları ve sıKeapiçin yüzey alanı 1 tedavi yaralar bölünür. Sarı daire: yatırım getirisi. Veriler ortalama±standart sapma temsil edilir; p < 0,05, n = 4. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: immunohistokimyasal lekeleri ile ROS korelasyonlar. Şeker hastası(a)H & E lekeleri 10 gün yara dokusu bölümleri gösterdi azaltılmış hücresel infiltrat azaltılmış inflamatuar kara delik sıKeap1 kanıtı kabul ile karşılaştırıldığında sıNS -yaralar tedavi yaralar. (B) sı tedaviKeap1 yara bölümleri ile karşılaştırıldığında onların sıNS -10 gün tedavi karşıtları makrofajlar azalan sayısı F4/80 ayirt (kırmızı) gösterdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| YATIRIM GETİRİSİ | si | Toplam sayıları | AVG sayar | STDSAPMA sayar | Alan [cm²] | Toplam sayıları/alan | Ortalama sayar/alan |
| YATIRIM GETİRİSİ 1 | NS | 9.38E + 03 | 1.14E + 02 | 3.85E + 01 | 2.48E-01 | 3.78E + 04 | 4.58E + 04 |
| ROI 2 | NS | 4.68E + 03 | 5.37E + 01 | 3.13E + 01 | 2.63E-01 | 1.78E + 04 | |
| YATIRIM GETİRİSİ 3 | NS | 1.72E + 04 | 2.18E + 02 | 1.54E + 02 | 2.39E-01 | 7.20E + 04 | |
| ROI 4 | NS | 1.24E + 04 | 1.68E + 02 | 8.41E + 01 | 2.24E-01 | 5.55E + 04 | |
| YATIRIM GETİRİSİ 5 | Keap1 | 3.21E + 03 | 3.41E + 01 | 2.76E + 01 | 2.84E-01 | 1.13E + 04 | 1.94E + 04 |
| ROI 6 | Keap1 | 2.56E + 03 | 2.88E + 01 | 1.06E + 01 | 2.69E-01 | 9.52E + 03 | |
| YATIRIM GETİRİSİ 7 | Keap1 | 4.92E + 03 | 6.48E + 01 | 5.03E + 01 | 2.30E-01 | 2.14E + 04 | |
| ROI 8 | Keap1 | 8.34E + 03 | 1.07E + 02 | 5.25E + 01 | 2.36E-01 | 3.54E + 04 |
Tablo 1: bioluminescence için miktarının tanımlanan ROIs. Bioluminescence her yatırım getirisi için ölçülebilir ve göreli olarak yüzey alanı standart. Hesaplamalar ortalama, standart sapma ve standart hata için buna göre hesaplanır. Yatırım getirisi 1, 2, 3 ve 4 temsil yaraları yatırım getirisi, biyolojik tekrarlar günahların ele diyabetik yaralar ve yatırım getirisi 5, 6, 7 ve 8 temsil ROIs biyolojik tekrarlar dan sıKeap1 diyabetik yaralar tedavi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ROS ölçmek için ortak teknikleri doku çekme ya da benzer şekilde invaziv teknikler gerektiren karmaşık iletişim kuralları tarafından sınırlı sahip. Son yıllarda, böylece kronolojik zamanmekansal değerlendirmeler9,10,11izin yenilikçi görüntüleme yöntemleri temelinde ölçümleri oksidatif stres bildirilmiştir. L-012 chemiluminescent bir sonda luminol, lucigenin ve FREDY271,4göreli olarak birçok avantajı vardır. Toksik olmayan bileşiktir kolayca emilir ve luminol veya benzer probları12ile karşılaştırıldığında çok daha güçlü bioluminescence vardır. Eleştirel, L-012 güvenli bir şekilde birden çok kez devamlılığının herhangi bir yan etkisi olmadan boyuna analiz için yönetilebilir veya hayvan zarar6modelleri. Bu strateji sınırlı özel eğitim gerektirir ve ekipman gerekli çoğu araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak erişilebilir bir protokol yaparak hazır olduğunu.
En iyi kullanım için biz reaktifler düzgün bir şekilde güncel ve yıkımı önlemek için ışık korunan öneririz. Yaralar stent uygulamaları aracılığıyla humanizing olarak geçiş ve yeniden epithelialization, tarafından önemli daralma iyileşmek fare yaralar için izin verir. Dikiş yara kenarları yerde güvenli yolu stent çevre yoluyla üçte yer almalıdır. Jel uygulama topikal tedaviler yerinde kalmasını sağlar sonra şeffaf film giyinme ile fare kaydırma. Sonuçları yıkmak, fare, kendi açtığı yaraları önlemek için acı tadım sprey ısırma vazgeçirmek için çevre ve dikiş knot uygulanabilir. L-012 çözünürlük PBS içinde sınırlıdır ama tekrarlayan çözümü pipetting tarafından bir süspansiyon form olacaktır. Bu önlemler sorun giderme arası Kullanıcı değişkenlik hayvan konfor koruyarak ortadan kaldırarak farklı yaralar arasında tutarlılığı sağlamak. Bu teknik bir çözüm mayi enjeksiyon içine bir hayvan modeli kullanır beri çeşitli faktörler müdahale hangi kontrol edilemez hayvanlar doğal. Örneğin, yerel kan akımı ve sonraki emme ve L-012 yerelleştirme ilgi alanları için dikte edemez. Ancak, böyle bir yara, kendi iç kontrol ile sıNS ve siKeap1ile diğer tedavi edilebilir gibi bu değişken bir hayvan kullanımı yoluyla azaltılabilir.
Biz ROS modeli şifa bir kutanöz yara vivo incelenmesi için bir strateji yeni rapor. Bizim çalışmanın, Keap1 siRNA yaraları tedavisinde anlayışımızı Nrf2 önemini teyit azalmış oksidatif yük içinde sonuçlandı / antioksidan içinKeap1 yolu işleme. Bu yöntemi kantitatif analiz için izin verirken, bir dizi önemli sınırlamalar vardır. L-012 son derece hassas olmakla birlikte, ROS için spesifik değildir ve ayrıca reaktif nitrojen türler6için tepki gösterdi. Daha fazla çözümleme hedeflenen sonda ve immunoassay tabanlı yöntemleri ile gelişmiş özgüllük ve hücre altı yerelleştirme ROS ilişkilendirir13Bu yaklaşımla tamamlıyor. L-012 tabanlı bioluminescence için önerilen mekanizma L-012 oksidasyon peroksidaz H2O212ile birlikte faaliyetleri ile moleküler oksijen tarafından içerir. Bu peroksidaz ile etkileşim antioksidan enzim inhibitörleri çalışmak için bu teknik kısıtlar. Daha ayrıntılı analiz için özellikle ROS süperoksit anyon dışında ölçmek veya reaktif nitrojen türler metabolitleri ile mevcut strateji mümkün değildir yönelik.
L-012 yüksek hassasiyet ROS geniş algılamak için göz önüne alındığında, çeşitli kutanöz yara iyileşmesi ve diğer doku modelleri için kolayca uyarlanabilir. RTA 408 gibi diyabetik yaralar için hedeflenmiş tedavi redoks etkileri ve Keap1 siRNA14,15lipoproteoplex teslimini değerlendirmek için bu teknik nizamın göstermiştir. Bu iletişim kuralı en önemli güçlerinden göz önüne alındığında, var. büyük gelecekteki potansiyel ROS ex vivo yaklaşımlar, odaklı diseksiyonu ve organoids daha derin bölmeleri içinde eğitim benzer stratejileri uygulama
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Raporlanacak hiçbir açıklamalar var.
Acknowledgments
NYU School of Medicine, Orlando Aristizabal ve Youssef Zaim Wadghiri teşekkür etmek istiyorum ile görüntüleme preklinik özünde için minnettarız. Kısmen Laura ve Isaac Perlmutter Kanser Merkezi destek hibe NIH/ncı 5P30CA016087 ve NIBIB biyomedikal teknolojisi kaynak merkezi Grant NIH P41 EB017183 tarafından desteklenen bir paylaşılan kaynak çekirdeğidir. Bu eser DC [grant numarası 1-16-as-08] ve NYU uygulanan araştırma destek fonu için halkla ilişkiler için Amerikan Diyabet Derneği "Yolu için durdurmak diyabet" tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
- Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
- Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
- Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
- Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
- Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
- Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
- Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
- Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
- Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
- Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
- Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).
