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Évaluation des effets neuroprotecteurs de Glycyrrhizae Radix et Rhizoma extraire à l’aide d’un modèle de souris de l’Occlusion artère cérébrale moyenne transitoire

doi: 10.3791/58454 Published: December 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Dans cette étude, nous modifions une méthode expérimentale existante afin d’obtenir des résultats plus reproductibles, en établissant un modèle de souris (OACM) une occlusion artère cérébrale moyenne. L’administration orale de Glycyrrhizae Radix et extrait au méthanol (GRex), Rhizome (GR) après induction de l’accident vasculaire cérébral, diminue significativement le volume total d’infarctus du myocarde par rapport au groupe témoin non traité.

Abstract

Ischémie suivie d’une reperfusion du débit sanguin cérébral après un accident vasculaire cérébral entraîne la mort des cellules nerveuses et de la perte de tissu cérébral. Le modèle animal plus couramment utilisé pour l’étude des accidents vasculaires cérébraux est le modèle de l’occlusion (OACM) artère cérébrale moyenne. Études de recherches antérieures ont signalé tailles différents infarctus même lorsque les mêmes espèces animales expérimentales a été utilisé dans des conditions semblables OACM. Par conséquent, nous avons développé une méthode expérimentale améliorée pour résoudre cette contradiction. Souris ont subi OACM utilisant un filament comme le matériau de l’occlusion pour imiter les conditions de l’accident vasculaire cérébral humain et épaisseur à incandescence a été optimisé pour créer plus de volume du myocarde reproductible. Les souris traitées avec un méthanol extrait de Glycyrrhizae Radix et Rhizome (GRex) après induction de l’accident vasculaire cérébral a montré un volume total une baisse significative du myocarde et augmentation du nombre de survivants des cellules par rapport au groupe témoin non traité. Cette modification protocole expérimental avec succès et reproductible a démontré l’effet bénéfique du GRex sur accident ischémique cérébral.

Introduction

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Les lésions cérébrales causées par une ischémie-reperfusion du débit sanguin cérébral entraîne la mort des cellules nerveuses et de la perte de tissu cérébral. Ce type de lésions cérébrales ne cesse d’augmenter avec l’augmentation de la prévalence des maladies cérébro-vasculaires en raison de la propagation des maladies métaboliques comme l’obésité, d’hypertension et de diabète sucré1,2. Le nombre absolu de personnes âgées atteintes de maladies a augmenté considérablement dans le monde entier, et le coût des soins médicaux pour ces patients, qui sont souvent laissés souffrant d’un handicap à long terme, est un fardeau sociétal majeur. Par conséquent, déficiences secondaires devraient atténuer autant que possible réduire le fardeau économique1,2.

Le plus couramment utilisé rongeur modèle d’infarctus cérébral est l’artère cérébrale moyenne (MCA) occlusion (OACM), dans lequel le MCA est obturé avec un filament de suture chirurgical enduit de silicone pour bloquer la circulation sanguine, causant l’accident vasculaire cérébral ischémique3, 4. à l’aide d’un filament comme le matériau de l’occlusion permet le contrôle du temps d’occlusion et de la permanence en manipulant la durée de l’insertion du filament intra-Luminale.

Des études antérieures ont montré que, même lorsque le même modèle OACM rongeur est utilisé, le volume total des infarctus cérébraux varie entre expériences, causant faible reproductibilité des études. Afin d’améliorer la reproductibilité, nous avons optimisé l’épaisseur de la monnaie de filaments utilisée dans l’expérience. Les résultats d’une étude préliminaire de la période ischémique cérébrale et infarctus du myocarde induit a montré qu’un ischémique pendant plus de 60 min a permis à la région volumétrique d’endommagé les tissus cérébraux être observées et quantifiées.

Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), également connu sous le nom de réglisse, est composé des racines séchées et des rhizomes de Glycyrrhiza uralensis et g. glabra. Il a été utilisé en médecine traditionnelle chinoise et coréenne à diverses fins, notamment comme additif alimentaire et en médecine5,6,7.

Dans une précédente étude8, avant le traitement avec l’extrait au méthanol GR (GRex) a montré un effet anti-apoptotique chez la souris OACM, y compris prévention importante de la diminution de l’expression de la protéine de lymphome à cellules B 2 (Bcl-2) et Bcl extra-large (Bcl-xL). Cette étude a été réalisée afin d’améliorer la reproductibilité du modèle souris OACM classique en évaluant son efficacité pour déterminer si le traitement post infarctus avec GRex a effectivement réduit le volume d’un infarctus dans la lésion cérébrale induite par l’OACM.

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Protocol

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Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Université nationale de Pusan (numéro d’agrément, PNU-2016-1087). Une vue d’ensemble graphique de cette étude est montré à la Figure 1.

1. préparation et Administration de GRex

Remarque : Les ressources génétiques utilisées dans cette étude a été acheté auprès d’une compagnie pharmaceutique commerciale.

  1. 200 g de GR à 2 000 mL de méthanol et incuber à température ambiante (25 ° C) pendant 5 jours.
  2. Filtrer le mélange à l’aide de papier filtre avec 0,26 mm d’épaisseur et 5 µm taille de pore et ensuite enlever le surnageant. Ajouter 1 000 mL de méthanol au résidu GR et filtrer à nouveau.
  3. Combiner les deux surnageants, filtrer sur papier filtre, concentré sous vide et puis lyophiliser le résidu pour produire le GRex.
  4. Dissoudre le GRex dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), diluer avec sérum physiologique 0,9 % et filtrer sur un filtre de seringue de 0,45 µm. Ensuite, ajuster la concentration finale de DMSO à 5 < %.
  5. Administrer GRex (300 mg/kg de poids corporel) 1 h après la reperfusion des OACM par gavage oral. Administrer le DMSO dilué dans du sérum physiologique (10 mL/kg de poids corporel) seulement pour le groupe normal et les groupes témoins, respectivement.
    Remarque : La concentration du GRex utilisé dans cette expérience a été déterminée selon la concentration qui a été active par le biais de notre précédente étude8.

2. Mouse Model of OACM

  1. Utilisation des souris C57BL/6 mâles âgés de 6 semaines et pesant 22-25 g. de fournir tous les animaux avec accès gratuit à chow standard et eau et la maison dans un environnement à température contrôlée (22 ± 1 ° C) et un cycle lumière/obscurité de 12 h.
    1. Diviser les souris en groupes de six souris chaque, qui doivent être composé d’opérés normal, le contrôle et les groupes de traitement GRex.
    2. Effectuer une chirurgie OACM (modification de la méthode de Koizumi et al. 9) sur le contrôle et les groupes de traitement GRex à l’aide d’un microscope stéréo.
  2. Induire l’anesthésie par inhalation chez les souris à l’aide de 2 % isoflurane dans 70 % N2O et 30 % O2. L’anesthésie est considéré comme suffisant lorsque la souris ne répond pas aux stimulus mécanique appliquée à sa queue. Maintenir la température du corps des souris à 36,5 ± 0,5 ° C à l’aide d’un corps de température-exploitation couverture reliée à un thermomètre.
  3. Enlever tous les poils sur la poitrine et le cou des souris en se rasant suivie par l’utilisation de crème dépilatoire, désinfecter le site de la chirurgie de la peau avec betadine scrub alternant avec de l’alcool pour deux fois et puis faire une incision d’environ 2 cm long avec chirurgicale lame dans le centre de la nuque. Soigneusement isoler l’artère carotide commune gauche (LCCA), artère carotide externe et la branche de l’artère carotide interne d’entourant les tissus conjonctifs.
  4. Ligaturer l’artère carotide externe et l’artère carotide commune avec une suture chirurgicale (suture de soie de 4-0, nœud demi-clef) pour bloquer temporairement le flux sanguin dans l’artère carotide interne lors de l’opération.
  5. Insérer une suture de nylon enduit silicone (8-0 monofilament, 11 mm de long) par l’intermédiaire de l’artère carotide interne à l’origine de la MCA gauche. Ajuster l’épaisseur de la partie enduit de silicone du filament d’une gamme de 0,10-0,12 mm.
  6. Mesurer la diminution du débit sanguin cérébral relative (DSCR) dans le MCA à l’aide d’un débitmètre Doppler laser. OACM sera confirmée lorsque le DSCR est maintenue à < 20 % des valeurs d’État au repos pendant toute la période ischémique.
  7. Fixer le filament inséré au vaisseau sanguin pendant 2 h tandis que l’artère cérébrale est obstrué, puis ensuite soigneusement retirer le filament pour restaurer le flux sanguin pour 22 h de reperfusion. Suturer la peau par couture à 5 places (suture de soie, noeud deux demi-clés 3-0) et laisser chaque souris d’éveiller de l’anesthésie.
  8. Dans le groupe normal, effectuer une opération fictive, suivant la même procédure ci-dessus (jusqu'à 2,4), avec l’exception suivante. Ligaturer l’artère carotide commune et suturer les muscles incisé et la peau.

3. mesure du Volume des tissus cérébraux endommagés

  1. Après l’euthanasie des souris pour la mesure des lésions cérébrales avec l’inhalation de CO2 , accise la souris brains 24h après l’apparition des OACM à l’aide de ciseaux chirurgicaux iris et pince coudée.
    1. Après avoir enlevé la tête à l’aide de ciseaux, faire une incision dans la peau de la ligne médiane de la tête à retourner la peau du crâne.
    2. Rompre les os pariétaux avec pince coudée, d’épluchage dura d’importance en même temps et ensuite isoler le cerveau soigneusement sur le crâne.
  2. Couper les tissus excisés en sections (1 mm d’épaisseur) en utilisant une matrice de cerveau de souris et puis colorer les sections pendant 17 min dans une solution de 2 % de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC).
  3. Difficulté les sections dans du formol 10 % pendant au moins 2 h et puis photographier à l’aide d’un appareil photo numérique. TTC sera célébrée pour colorer les tissus viables rouge tandis que les zones nécrotiques sera blancs.
  4. Analyser et quantifier la zone de l’infarctus cérébral de chaque section à l’aide de ImageJ.

4. l’hématoxyline et éosine (H & E) et Cresyl Violet la coloration des coupes histologiques

  1. Euthanasier les souris pour étude histologique par inhalation de CO2 et perfuse les transcardially avec 10 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), suivie de 10 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA). Isoler le cerveau en utilisant la même procédure que ci-dessus (3.1) et y plonger le cerveau dans 10 mL de saccharose 30 % du jour au lendemain.
  2. Incorporer le tissu cérébral dans la température de coupe optimale (OCT) composée et du trancher en sections 15-µm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat. Monter les sections sur les lames de verre, suivies de la coloration à l’hématoxyline et éosine (H & E) ou violet de crésyle.
  3. Plonger les lames de verre dans l’éthanol à 80 % pendant 1 min, suivie d’une coloration en solution de l’hématoxyline pendant 5 min.
    1. Tremper les diapositives de 1 % d’alcool acide deux fois, de plonger dans une solution saturée de carbonate de lithium pour 30 s, laver avec de l’eau du robinet pour 30 s, puis contre-colorant en solution d’éosine pendant 30 s.
    2. Rincer les lames dans l’eau du robinet, laissez tremper dans 95 % et éthanol absolu consécutivement.
    3. Sécher les diapositives, faire disparaître dans le xylène pendant au moins 10 min et puis monter les lamelles à l’aide du milieu de montage.
  4. Placez les lames de verre sur une lame plus chaud pendant au moins 1 h, suivi d’une immersion dans 50 % d’éthanol dilué avec du chloroforme, du jour au lendemain.
    1. Tacher les diapositives avec violet de crésyle 0,1 % pendant 10 min dans un four sec à 40 ° C.
    2. Plonger dans l’éthanol à 95 % pendant 30 min, puis déshydrater en éthanol absolu pour 2 fois.
    3. Clair 2 fois dans le xylène pendant 5 min, puis monter avec milieu de montage après séchage à l’air.
  5. À l’aide d’un microscope, observer les changements histologiques survenus après lésion cérébrale induite par l’OACM.

5. analyse statistique

  1. Exprimer les résultats expérimentaux comme moyen ± écart-type et déterminer la signification statistique entre les groupes à l’aide d’une analyse de variance (ANOVA) suivie post hoc analyse de Tukey à l’aide d’un logiciel d’analyse de données.
  2. Définir la signification statistique à une p-valeur < 0,05.

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Representative Results

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Dans le groupe normal opérés, aucun un infarctus cérébral n’est observé alors que dans le groupe témoin, on observe un éventail assez large des zones endommagées. Chez les souris 300 mg/kg administrée GRex dans le groupe de modèles OACM, une réduction statistiquement significative de la zone endommagée est observée (Figure 2).

On a étudié les changements histologiques souillant des sections cérébrale ischémique avec H & E ou cresyl violet. La coloration H & E fournit des informations structurales et fonctionnelles des informations spécifiques de cellules10, tandis que la coloration violet de crésyle sert à estimer le nombre total de neurones de l’hippocampe11. Ainsi, H & E ou cresyl violet intensité, telle que mesurée à l’aide de logiciels ImageJ (Figure 3A), fournit un indice de la survie des cellules. H & E et cresyl violet intensités de coloration nettement diminuent dans le groupe témoin par rapport au groupe normal (Figure 3B, 3C). Le groupe GRex traités montre une plus grande intégrité histologique, ce qui implique moins mort neuronale, celui du groupe témoin (Figure 3C). Ces résultats indiquent que GRex a des effets neuroprotecteurs puissant contre l’ischémie et reperfusion-induits crânien.

Figure 1
Figure 1 . Schéma de l’artère cérébrale moyenne occlusion (OACM) modèle et le traitement avec l’extrait au méthanol de Glycyrrhizae Radix et Rhizome (GRex). Souris ont été traitées avec 300 mg/kg de GRex 1 h après reperfusion OACM, qui a été maintenue pendant 2 h. souris ont été euthanasié 24h après l’OACM a commencé, et puis les tranches de cerveau récoltés ont été stockés dans un congélateur pour dosage protéique ou teintés avec solution TTC pour infarctus mesure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Les images représentant des sections de cerveau (A) montrant les effets du méthanol extrait de Glycyrrhizae Radix et traitement de Rhizome (GRex) sur l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne post (OACM)-induites par les volumes infarctus du cerveau et (B) seul traitement à 300 mg/kg GRex 1 h après reperfusion OACM supprimés significativement les volumes infarctus. Les résultats sont présentés comme des moyens ± SDD. ## #p < groupe normal vs 0,001, ** p < 0,01 vs contrôlent groupe ; n = 6 par groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Des images représentatives de (A) l’hématoxyline et éosine (H & E)- et sections de cerveau teinté violet de crésyle et (B, C) couleur des intensités qui ont servi à évaluer les effets de l’extrait au méthanol de Glycyrrhizae Radix et Rhizome (GRex) sur le cerveau du milieu occlusion de l’artère cérébrale (OACM)-blessé souris. Histologiques intégrité et tissus des dommages dans le cerveau de souris ont été évalués à l’aide de (B) H & E ou C 1 h une coloration violet de crésyle post-OACM ré-perfusion. Coloration H & E teinté sections rouge indique des dommages nucléaires. Neurones teintés avec violet de crésyle ont été colorés en violets. Le groupe traité GRex a montré mieux histologique intégrité qu’au groupe témoin, indiquant moins mort neuronale. a, H & E-souillé ; b, crésyl violet-souillé ; c et d, agrandissements de a et b, respectivement. Les résultats sont moyens ± SDD. ## #p < 0,001, et * p < 0,05 vs normales et des groupes témoins ; n = 6 par groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Avec l’augmentation de la prévalence des maladies métaboliques telles que l’hypertension chronique, le diabète et l’hyperlipidémie, qui sont les principaux facteurs de risque d’accident vasculaire cérébral, traitement et prévention des AVC sont devenus un domaine important de recherche médicale12, 13. les déficits en langue et en mouvement après un accident vasculaire cérébral sont fortement corrélés avec le degré de dommages aux tissus14 du cerveau et entraîner une mauvaise qualité de vie pour les patients et leurs familles15. Il est important d’utiliser un modèle animal approprié d’accident vasculaire cérébral qui implique les mêmes modifications pathologiques comme celles qui se produisent dans la maladie humaine pour étudier l’efficacité des traitements médicamenteux. Le modèle OACM imite les traits thrombotique en obstruant les vaisseaux artériels cérébraux. Il est couramment utilisé car il est relativement reproductible et mini-invasive16,17,18,19.

Toutefois, une comparaison de la zone de l’infarctus cérébral induites pour la mise au repos même heure signalée par plusieurs chercheurs, révèle que le volume total de myocarde varie selon les études. Nous avons conclu que c’était à cause de différences dans les matériaux l’occlusion et l’intervention chirurgicale. Par conséquent, bien que le modèle de rongeur OACM est considérée comme hautement reproductible, il n’est pas toujours possible d’obtenir ce reproductibilité. Par conséquent, nous avons optimisé l’épaisseur des filaments utilisés dans le modèle OACM souris à travers notre étude préliminaire et le précédent rapport8.

Le résultat le plus distinctif de notre étude préliminaire par rapport à celui des autres études est que TTC coloration n’a pas révélé un infarctus cérébral lorsque l’ischémie est induite pendant 60 min (données non présentées). Même après 90 et 120 min d’OACM chez les souris, nos résultats ont montré un volume du myocarde inférieur à celui d’autres études. Une des limites de cette étude est que nous n’avons pas encore déterminé la cause exacte de ces résultats ; Cependant, nous prévoyons d’étudier ce phénomène dans d’autres études.

De nombreuses études ont rapporté récemment que GR ou ses composants ont des activités pharmacologiques, y compris les effets antitumoraux, antimicrobien et anti-inflammatoire20,21,22. Une étude antérieure a signalé que le prétraitement GRex inhibe efficacement l’activation de la caspase-9 de régulariser l’expression de la protéine Bcl-2 et Bcl-xL8. Toutefois, les traitements préventifs pour les accidents vasculaires cérébraux sont moins cliniquement pertinentes que le traitement de post-accident vasculaire cérébral.

Dans cette étude, qui reposait sur une étude antérieure,8 a évalué l’efficacité du post-traitement GRex dans un modèle murin d’OACM. Comme décrit dans la section résultats représentatifs, post-traitement GRex a montré des effets bénéfiques en réduisant le volume total d’infarctus et d’améliorer des dommages à des structures cellulaires induites par OACM crânien chez les souris. Les mécanismes d’action spécifique du GRex sur les lésions cérébrales post-ischémique manque dans cette étude, mais les protocoles expérimentaux utilisés avec succès dans cette étude ont démontré les effets de cette plante médicinale en imitant des effets humains d’un accident vasculaire cérébral.

Bien que les résultats expérimentaux ne sont pas respectées dans cette étude, le score de déficit neuronal (NDS) a été mesurée dans notre expérience préliminaire et aucune différence significative n’a été noté entre le contrôle et les groupes traités GRex, qui est présumé avoir été dûment à l’heure de l’observation courte par rapport à la gravité de l’accident vasculaire cérébral. Nous avons l’intention d’observer les effets du traitement par GRex sur la NDS sur une longue période après avoir causé des dégâts modérés.

En conclusion, l’effet neuroprotecteur de traitement GRex dans un modèle de souris OACM a été démontrée dans cette étude avec bonne reproductibilité. Les protéines impliquées dans le mécanisme sous-jacent doivent être examinées dans de futures études.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ne s’applique pas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitative filter paper Advantec Filter paper No. 2 Qualitative filter paper
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-250ML Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Syringe filter (0.45 µm) Sigma CLS431220 Syringe filter (0.45 µm)
Stereo Microscope Leica M50 Stereo Microscope
Stereo Microscope Nikon SMZ745 Stereo Microscope
Laser Doppler Moor Instrument moorVMS-LDF Laser Doppler
Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System Harvard Appratus 34-1352 Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System
Homeothermic Monitoring System Harvard Appratus 55-7020 Homeothermic Monitoring System
Digital Camera Canon Eos-M2 Digital Camera
Cryostat Leica CM3050S Cryostat
Microscope Carl Zeiss Zeiss Axio Microscope
Data Analysis Systat Software Inc. SigmaPlot version 12 Data Analysis
Data Analysis NIH Image ImageJ Data Analysis
Mouse diet Doo Yeol Biotech Standard rodent chow Mouse diet
Isoflurane JOONGWAE A02104781 Isoflurane
Isoflurane TROIKAA ISOTROY 100 Isoflurane
Silk suture (4-0 Black silk)  AILEE SK47510 Silk suture (4-0 Black silk) 
Silk suture (3-0 White silk)  Baekjae 57 Silk suture (3-0 White silk) 
Nylon suture (8-0 monofilament)  AILEE NB825 Nylon suture (8-0 monofilament) 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma T8877-25G 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)
Formalin (Formaldehyde solution) JUNSEI 69360-1263 20KG Formalin (Formaldehyde solution)
Hematoxylin (Harris Hematoxylin) YD Diagnostics EasyStain Hematoxylin (Harris Hematoxylin)
Eosin (1% Eosin Y Solution) MUTO PURE CHEMICALS 3200-2 Eosin (1% Eosin Y Solution)
Cresyl violet (acetate) Sigma C5042-10G Cresyl violet (acetate)
Paraformaldehyde  Sigma-Aldrich P6148-1KG Paraformaldehyde 
Sucrose JUNSEI 31365-0350 1KG Sucrose
Optimum cutting temperature (OCT) compound Scigen 4583 Optimum cutting temperature (OCT) compound
Disecting Knife Fine Science Tools 10055-12 Disecting Knife
#4 Forcep Fine Science Tools 11241-30 #4 Forcep
#5 Forcep Fine Science Tools 11254-20 #5 Forcep
#6 Forcep Fine Science Tools 11260-20 #6 Forcep
#7 Fine Forcep Fine Science Tools 11274-20 #7 Fine Forcep
Surgical Scissors Fine Science Tools 14001-12 Surgical Scissors
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 Extra Fine Bonn Scissors
Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors Fine Science Tools 15371-92 Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors
Vessel Dilating Forcep Fine Science Tools 18153-11 Vessel Dilating Forcep

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Lee, S. E., Lim, C., Lee, M., Kim, C. H., Kim, H., Lee, B., Cho, S. Assessing Neuroprotective Effects of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Extract Using a Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Mouse Model. J. Vis. Exp. (142), e58454, doi:10.3791/58454 (2018).More

Lee, S. E., Lim, C., Lee, M., Kim, C. H., Kim, H., Lee, B., Cho, S. Assessing Neuroprotective Effects of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Extract Using a Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Mouse Model. J. Vis. Exp. (142), e58454, doi:10.3791/58454 (2018).

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