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Medicine

Glycyrrhizae मूलांक एट Rhizoma एक क्षणिक मध्यम मस्तिष्क धमनी रोड़ा माउस मॉडल का उपयोग कर निकालने के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव का आकलन

doi: 10.3791/58454 Published: December 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन में, हम एक मध्यम सेरेब्रल धमनी रोड़ा (MCAO) माउस मॉडल की स्थापना करके, अधिक reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए एक मौजूदा प्रयोगात्मक पद्धति को संशोधित. मौखिक प्रशासन Glycyrrhizae का मूलांक एट प्रकंद (जीआर) मेथनॉल निकालने (GRex), निंनलिखित स्ट्रोक प्रेरण, काफी कम अनुपचारित नियंत्रण समूह के सापेक्ष कुल रोधगलन मात्रा में कमी आई ।

Abstract

Ischemia मस्तिष्क रक्त के प्रवाह के बाद एक स्ट्रोक तंत्रिका कोशिकाओं और मस्तिष्क के ऊतकों की हानि की मौत की ओर जाता है के बाद reperfusion द्वारा पीछा किया । स्ट्रोक का अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया पशु मॉडल मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (MCAO) मॉडल है. पिछले अनुसंधान अध्ययन अलग infarct आकार भी सूचित किया है जब एक ही प्रयोगात्मक पशु प्रजातियों के समान MCAO शर्तों के तहत इस्तेमाल किया गया था । इसलिए, हमने इस विसंगति को हल करने के लिए एक बेहतर प्रायोगिक पद्धति विकसित की है । चूहों मानव स्ट्रोक की स्थिति की नकल करने के लिए रोड़ा सामग्री के रूप में एक रेशा का उपयोग MCAO के अधीन थे और रेशा मोटाई अधिक reproducible रोधगलन की मात्रा स्थापित करने के लिए अनुकूलित किया गया था. चूहों का एक मेथनॉल निकालने के साथ इलाज किया Glycyrrhizae मूलांक एट प्रकंद (GRex) निंनलिखित स्ट्रोक प्रेरण एक काफी कम कुल रोधगलन की मात्रा और जीवित अनुपचारित नियंत्रण समूह के सापेक्ष कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि दिखाई । इस संशोधित प्रायोगिक प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक और reproducibly कोरोनरी स्ट्रोक पर GRex के लाभकारी प्रभाव का प्रदर्शन किया ।

Introduction

मस्तिष्क के ischemia और मस्तिष्क रक्त प्रवाह के reperfusion की वजह से नुकसान तंत्रिका कोशिकाओं और मस्तिष्क के ऊतकों के नुकसान की मौत की ओर जाता है । मस्तिष्क क्षति के इस प्रकार के मोटापे, उच्च रक्तचाप, और मधुमेह1,2के रूप में चयापचय रोगों के प्रसार के कारण मस्तिष्कवाहिकीय रोगों की बढ़ती व्यापकता के साथ वृद्धि करने के लिए जारी है. स्ट्रोक के साथ बुजुर्ग रोगियों की निरपेक्ष संख्या नाटकीय रूप से दुनिया भर में वृद्धि हुई है, और इन रोगियों, जो अक्सर लंबे समय से विकलांग के साथ छोड़ दिया जाता है के लिए चिकित्सा देखभाल की लागत, एक प्रमुख सामाजिक बोझ है । इसलिए, माध्यमिक विकलांगों को यथासंभव आर्थिक बोझ1,2को कम करने के लिए शमन किया जाना चाहिए ।

मस्तिष्क रोधगलन के सबसे अधिक इस्तेमाल किया कुतर मॉडल मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) रोड़ा (MCAO) मॉडल है, जिसमें एमसीए एक सिलिकॉन लेपित शल्य suturing रेशा के साथ occluded है रक्त प्रवाह को अवरुद्ध करने के लिए, जिससे कोरोनरी स्ट्रोक3, 4. रोड़ा सामग्री के रूप में एक रेशा का प्रयोग अंतर-चमकदार रेशा सम्मिलन की अवधि को जोड़कर रोड़ा समय और स्थायित्व के नियंत्रण की अनुमति देता है.

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि जब भी एक ही कुतर MCAO मॉडल का प्रयोग किया जाता है, मस्तिष्क रोधगलन की कुल मात्रा प्रयोगों के बीच बदलती रहती है, जिससे पढ़ाई की कम reproducibility है । reproducibility में सुधार करने के लिए, हम प्रयोग में प्रयुक्त रेशा टकसाल की मोटाई अनुकूलित । मस्तिष्क कोरोनरी अवधि और प्रेरित रोधगलन के एक प्रारंभिक अध्ययन के परिणाम से पता चला कि एक कोरोनरी अवधि से अधिक ६० मिनट क्षतिग्रस्त मस्तिष्क ऊतक के volumetric क्षेत्र को मनाया और quantified की अनुमति दी ।

Glycyrrhizae का मूलांक एट Rhizoma (जीआर) भी नद्यपान के रूप में जाना जाता है, सूखे जड़ों और rhizomes के Glycyrrhiza uralensis और जी glabra के होते हैं । यह एक खाद्य additive और औषधीय5,6,7के रूप में सहित विभिंन प्रयोजनों के लिए चीनी और कोरियाई पारंपरिक चिकित्सा में इस्तेमाल किया गया है ।

पिछले एक अध्ययन में8, जीआर मेथनॉल निकालने के साथ पूर्व उपचार (GRex) MCAO चूहों में एक विरोधी अपोप्तोटिक प्रभाव दिखाया, बी सेल लिंफोमा 2 की प्रोटीन अभिव्यक्ति में कमी की महत्वपूर्ण रोकथाम सहित (Bcl-2) और Bcl अतिरिक्त-बड़े (Bcl-एक्स्ट्रा लार्ज). इस अध्ययन के निर्धारित करने में अपनी दक्षता का मूल्यांकन अगर GRex के साथ infarct उपचार प्रभावी ढंग से infarct में MCAO मात्रा कम-प्रेरित मस्तिष्क क्षति के आकलन से पारंपरिक MCAO माउस मॉडल के reproducibility में सुधार आयोजित किया गया ।

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Protocol

सभी पशुओं को शामिल प्रक्रियाओं पूषण राष्ट्रीय विश्वविद्यालय की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया (अनुमोदन संख्या, पनॠ-2016-1087) । इस अध्ययन का एक ग्राफिकल सिंहावलोकन चित्रा 1में दिखाया गया है ।

1. GRex की तैयारी और प्रशासन

नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त जीआर एक व्यावसायिक दवा कंपनी से खरीदा गया था ।

  1. 5 दिनों के लिए कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर मेथनॉल और मशीन की २,००० मिलीलीटर में जीआर के २०० ग्राम रखें ।
  2. ०.२६ mm मोटाई और 5 µm ताकना आकार के साथ फिल्टर कागज का उपयोग कर मिश्रण फ़िल्टर, और फिर supernatant निकालें । जीआर अवशेषों और फिल्टर करने के लिए मेथनॉल के १,००० मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. दो supernatants का मिश्रण, फिल्टर कागज के माध्यम से फिल्टर, निर्वात के तहत ध्यान केंद्रित है, और फिर फ्रीज-अवशेषों GRex उत्पादन करने के लिए सूखी ।
  4. dimethyl sulfoxide (DMSO) में GRex भंग, ०.९% शारीरिक खारा के साथ पतला है, और एक ०.४५ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर. फिर, DMSO की अंतिम एकाग्रता को < 5% में समायोजित करें ।
  5. प्रशासन GRex (३०० mg/किलो शरीर का वजन) 1 ज ओरल gavage के जरिए MCAO के reperfusion के बाद. प्रशासन शारीरिक खारा में पतला (10 मिलीलीटर/DMSO शरीर के वजन) केवल सामांय समूह और नियंत्रण समूहों के लिए, क्रमशः ।
    नोट: इस प्रयोग में प्रयुक्त GRex की एकाग्रता एकाग्रता के अनुसार निर्धारित की गई थी जो हमारे पिछले अध्ययन8के माध्यम से क्रियाशील थी ।

2. MCAO के माउस मॉडल

  1. पुरुष C57BL/6 चूहों 6 सप्ताह की आयु वर्ग और 22-25 जी का उपयोग करें मानक चाउ और पानी के लिए नि: शुल्क उपयोग के साथ सभी जानवरों को उपलब्ध कराने, और उन्हें नियंत्रित तापमान के साथ एक वातावरण में घर (22 ± 1 ° c) और एक 12 ज प्रकाश/
    1. चूहों को छह चूहों के समूहों में विभाजित करें, जो अन्तर्वासना से मिलकर सामान्य, नियंत्रण और GRex उपचार समूहों को शामिल करना चाहिए ।
    2. प्रदर्शन MCAO सर्जरी (कोइज़ुमी एट अल की विधि के संशोधन । 9) एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नियंत्रण और GRex उपचार समूहों पर.
  2. ७०% N2में 2% isoflurane का उपयोग कर चूहों में साँस लेना संज्ञाहरण प्रेरित हे और 30% हे2. संज्ञाहरण पर्याप्त माना जाता है जब माउस अपनी पूंछ के लिए लागू यांत्रिक उत्तेजना के लिए अप्रतिसादी हो जाता है । ३६.५ ± ०.५ डिग्री सेल्सियस पर चूहों के शरीर का तापमान बनाए रखने के एक शरीर के तापमान का उपयोग कर एक थर्मामीटर से जुड़ा कंबल धारण ।
  3. बालों को हटाने क्रीम के उपयोग के बाद शेविंग द्वारा चूहों की छाती और गर्दन पर सभी बाल निकालें, betadine सफ़ाई के साथ त्वचा की शल्य चिकित्सा साइट दो बार के लिए शराब के साथ बारी, और फिर लगभग 2 सेमी लंबे समय के सर्जिकल के साथ एक चीरा बनाने गर्दन के केंद्र में ब्लेड । ध्यान से अलग छोड़ दिया आम मन्या धमनी (LCCA), बाहरी मन्या धमनी, और आंतरिक मन्या धमनी से संयोजी ऊतक के आसपास से शाखा.
  4. Ligate बाहरी मन्या धमनी और आम मन्या धमनी के साथ एक शल्य टांका (4-0 रेशम सीवन, आधा अड़चन गाँठ) अस्थायी रूप से रक्त के प्रवाह को ऑपरेशन के दौरान आंतरिक मन्या धमनी में ब्लॉक करने के लिए.
  5. बाईं एमसीए की उत्पत्ति के लिए आंतरिक मन्या धमनी के माध्यम से एक सिलिकॉन लेपित नायलॉन सीवन (8-0 monofilament, 11 मिमी लंबे) डालें । रेशा के सिलिकॉन लेपित भाग की मोटाई 0.10-0.12 mm की सीमा को समायोजित करें ।
  6. एक लेजर डॉपलर flowmeter का उपयोग एमसीए में सापेक्ष सेरेब्रल रक्त प्रवाह (rCBF) में कमी को मापने. MCAO की पुष्टि की जाएगी जब rCBF पूरे कोरोनरी अवधि के दौरान शेष शर्त मूल्यों के < 20% पर बनाए रखा है ।
  7. 2 एच के लिए रक्त वाहिका के लिए डाला रेशा फिक्स जबकि मस्तिष्क धमनी occluded है, और फिर ध्यान से reperfusion के 22 ज के लिए रक्त के प्रवाह को बहाल करने के लिए रेशा वापस ले लो । सिलाई द्वारा 5 स्थानों पर त्वचा टांका (3-0 रेशम सीवन, दो आधा अड़चन गाँठ) और प्रत्येक माउस संज्ञाहरण से जगाने के लिए अनुमति देते हैं ।
  8. सामान्य समूह में, निम्न अपवाद के साथ (२.४ तक), ऊपर एक ही प्रक्रिया के बाद एक शम कार्रवाई निष्पादित करें । आम मन्या धमनी Ligate और incised मांसपेशियों और त्वचा सीवन ।

3. क्षतिग्रस्त मस्तिष्क ऊतक की मात्रा का मापन

  1. सह2 साँस लेना के साथ मस्तिष्क क्षति माप के लिए चूहों की इच्छामृत्यु के बाद, MCAO की शुरुआत के बाद माउस दिमाग उत्पाद 24 एच आइरिस सर्जिकल कैंची और angled संदंश का उपयोग कर.
    1. कैंची का उपयोग कर सिर को हटाने के बाद, खोपड़ी से त्वचा पर फ्लिप करने के लिए सिर की midline त्वचा में एक चीरा बनाओ ।
    2. angled संदंश के साथ पार्श्विका हड्डियों को तोड़ो, एक ही समय में बंद बाडी मैटर को छील कर, और फिर मस्तिष्क को खोपड़ी से अलग कर लें ।
  2. वर्गों (1 मिमी मोटी) में एक माउस मस्तिष्क मैट्रिक्स का उपयोग कर, और फिर 2% 2, 3, 5-triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) के एक समाधान में 17 मिनट के लिए वर्गों दाग में उत्पाद के ऊतकों को काट ।
  3. 10% formalin में वर्गों को ठीक से कम 2 घंटे के लिए और फिर तस्वीर उंहें एक डिजिटल कैमरे का उपयोग कर । टीटीसी के लिए व्यवहार्य ऊतक लाल दाग मनाया जाएगा, जबकि गल क्षेत्रों सफेद हो जाएगा ।
  4. विश्लेषण और ImageJ का उपयोग कर प्रत्येक खंड के सेरेब्रल infarct क्षेत्र को बढ़ाता है.

4. Hematoxylin और Eosin (एच एंड ई) और ऊतकवैज्ञानिक वर्गों के Cresyl वायलेट धुंधला

  1. Euthanize द्वारा ऊतकवैज्ञानिक अध्ययन के लिए चूहों को2 साँस लेना और perfuse उन्हें फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 10 मिलीलीटर के साथ transcardially, 4% paraformaldehyde (पीएफए) के 10 मिलीलीटर के बाद. (३.१) ऊपर के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग मस्तिष्क को अलग और 30% सुक्रोज रात भर के 10 मिलीलीटर में मस्तिष्क विसर्जित कर दिया ।
  2. इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक में मस्तिष्क के ऊतकों को एंबेड करें और यह एक cryostat का उपयोग कर 15-µm-मोटी वर्गों में राज्याभिषेक का टुकड़ा । कांच स्लाइड पर वर्गों माउंट, hematoxylin और eosin (एच एंड ई) या cresyl वायलेट के साथ धुंधला द्वारा पीछा किया ।
  3. 1 मिनट के लिए ८०% इथेनॉल में ग्लास स्लाइड विसर्जित 5 मिनट के लिए hematoxylin समाधान में धुंधला द्वारा पीछा किया ।
    1. 1% एसिड शराब में स्लाइड दो बार डुबकी, 30 एस के लिए संतृप्त लिथियम कार्बोनेट समाधान में विसर्जित, 30 एस के लिए नल के पानी से धो, और फिर eosin समाधान में counterstain के लिए 30 एस ।
    2. नल के पानी में स्लाइड कुल्ला, ९५% और निरपेक्ष इथेनॉल में लगातार भिगोना ।
    3. हवा शुष्क स्लाइड, xylene में उंहें साफ करने के लिए कम से 10 मिनट, और फिर माउंट coverslips बढ़ते माध्यम का उपयोग कर ।
  4. एक स्लाइड पर ग्लास स्लाइड प्लेस गर्म कम 1 घंटे के लिए, ५०% रात भर क्लोरोफॉर्म के साथ पतला इथेनॉल में विसर्जन के बाद ।
    1. एक ४० ° c सूखी ओवन में 10 मिनट के लिए ०.१% cresyl वायलेट के साथ स्लाइड दाग ।
    2. 30 मिनट के लिए ९५% इथेनॉल में विसर्जित, तो निरपेक्ष इथेनॉल में 2 बार के लिए निर्जलीकरण ।
    3. 5 मिनट के लिए xylene में 2 बार स्पष्ट है, तो हवा सुखाने के बाद बढ़ते माध्यम के साथ माउंट ।
  5. एक खुर्दबीन का प्रयोग, ऊतकवैज्ञानिक परिवर्तन है कि MCAO प्रेरित मस्तिष्क चोट के बाद हुई निरीक्षण करते हैं ।

5. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. एक्सप्रेस के रूप में प्रयोगात्मक परिणाम ± मानक विचलन का अर्थ है और समूहों के बीच सांख्यिकीय महत्व का उपयोग कर एक एक तरह से विश्लेषण प्रसरण (ANOVA) Tukey के बाद एक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण द्वारा पीछा किया ।
  2. कोई p-मान < ०.०५ पर सांख्यिकीय महत्व सेट करें ।

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Representative Results

अन्तर्वासना-संचालित सामान्य समूह में, कोई सेरेब्रल infarct है जबकि नियंत्रण समूह में, क्षतिग्रस्त क्षेत्रों की एक अपेक्षाकृत विस्तृत श्रृंखला मनाया जाता है । चूहों में प्रशासित ३०० मिलीग्राम/GRex MCAO मॉडल समूह में, क्षतिग्रस्त क्षेत्र में एक सांख्यिकीय उल्लेखनीय कमी (चित्रा 2) मनाया जाता है ।

ऊतकवैज्ञानिक परिवर्तन एच एंड ई या cresyl वायलेट के साथ धुंधला कोरोनरी मस्तिष्क वर्गों द्वारा जांच कर रहे हैं । H & E धुंधला संरचनात्मक जानकारी और10कोशिकाओं के बारे में विशिष्ट कार्यात्मक जानकारी प्रदान करता है, जबकि cresyl बैंगनी धुंधला हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स11की कुल संख्या का अनुमान लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस प्रकार, एच एंड ई या cresyl वायलेट तीव्रता, के रूप में ImageJ सॉफ्टवेयर (चित्रा 3) का उपयोग कर मापा, सेल अस्तित्व के एक सूचकांक प्रदान करता है । एच एंड ई और cresyl वायलेट धुंधला तीव्रता काफी सामान्य समूह के सापेक्ष नियंत्रण समूह में कमी (चित्रा 3बी,2 सी). GRex-इलाज समूह अधिक ऊतकवैज्ञानिक अखंडता से पता चलता है, कम न्यूरॉन सेल मौत जिसका अर्थ, नियंत्रण समूह से (चित्रा 3सी). इन परिणामों से संकेत मिलता है कि GRex ischemia/reperfusion-प्रेरित मस्तिष्क चोट के खिलाफ शक्तिशाली न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव है ।

Figure 1
चित्रा 1 . मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (MCAO) मॉडल और Glycyrrhizae मूलांक एट प्रकंद (GRex) के मेथनॉल निकालने के साथ उपचार की योजना. चूहों के साथ इलाज किया गया ३०० मिलीग्राम/GRex के 1 ज के बाद MCAO reperfusion, जो 2 एच के लिए बनाए रखा गया था चूहों euthanized 24 ज के बाद शुरू MCAO, और फिर काटा मस्तिष्क स्लाइस प्रोटीन परख के लिए एक गहरी फ्रीज में संग्रहीत किए गए थे या टीटीसी के लिए infarct समाधान के साथ सना हुआ माप. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . (क) मस्तिष्क वर्गों के प्रतिनिधि छवियों Glycyrrhizae मूलांक एट के मेथनॉल निकालने के प्रभाव दिखा प्रकंद (GRex) पोस्ट पर उपचार-मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (MCAO)-प्रेरित मस्तिष्क infarct संस्करणों और (ख) ३०० मिलीग्राम/kg GRex 1 ज के साथ एकल उपचार के बाद MCAO reperfusion काफी दबा infarct मात्रा। परिणाम का अर्थ है ± एसडीएस के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । # # #p < 0.001 बनाम सामान्य समूह, * * p < 0.01 बनाम नियंत्रण समूह; n = 6 प्रति समूह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . (क) hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के प्रतिनिधि छवियों-और cresyl वायलेट-सना हुआ मस्तिष्क वर्गों और (बी, सी) रंग तीव्रता, जो Glycyrrhizae मूलांक एट प्रकंद के मेथनॉल निकालने के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया (GRex) मध्यपूर्व के दिमाग पर सेरेब्रल धमनी रोड़ा (MCAO)-घायल चूहों. ऊतकवैज्ञानिक अखंडता और माउस दिमाग में ऊतक क्षति का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया (B) h & E या (C) cresyl वायलेट धुंधलान 1 h पोस्ट-MCAO reperfusion. एच और ई-दाग वर्गों में लाल दाग परमाणु क्षति इंगित करता है । cresyl वायलेट के साथ रंगे ंयूरॉंस बैंगनी दाग थे । GRex-इलाज समूह नियंत्रण समूह से बेहतर ऊतकवैज्ञानिक अखंडता दिखाया था, कम न्यूरॉन सेल मौत का संकेत. a, H व E सना; b, cresyl वायलेट-सना; सी और डी, क्रमशः a और bकी वृद्धि । परिणामों का अर्थ है ± एसडीएस. # # #p < ०.००१, और * p < 0.05 बनाम सामान्य और नियंत्रण समूह; n = 6 प्रति समूह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

जैसे पुरानी उच्च रक्तचाप, मधुमेह, और hyperlipidemia, जो स्ट्रोक के लिए प्रमुख जोखिम कारक हैं चयापचय रोगों की बढ़ती व्यापकता के साथ, स्ट्रोक की रोकथाम और उपचार चिकित्सा अनुसंधान के एक महत्वपूर्ण क्षेत्र बन गए हैं12, 13. एक स्ट्रोक के बाद भाषा और आंदोलन में घाटा दृढ़ता से मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान की डिग्री के साथ संबद्ध कर रहे हैं14 और परिणाम रोगियों और उनके परिवार के लिए जीवन की एक गरीब गुणवत्ता में15. यह स्ट्रोक की एक उपयुक्त पशु मॉडल है कि उन है कि मानव रोग में होने के रूप में एक ही रोग परिवर्तन शामिल है का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है दवा उपचार की प्रभावकारिता का अध्ययन । MCAO मॉडल निरोधक मस्तिष्क धमनी वाहिकाओं द्वारा थ्रोम्बोटिक स्ट्रोक की नकल । यह आमतौर पर प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह अपेक्षाकृत reproducible और ंयूनतम इनवेसिव16,17,18,19है ।

हालांकि, कई शोधकर्ताओं द्वारा रिपोर्ट एक ही आराम समय के लिए प्रेरित मस्तिष्क रोधगलन के क्षेत्र की तुलना, पता चलता है कि कुल रोधगलन मात्रा अध्ययन के बीच बदलता है. हम निष्कर्ष निकाला है कि यह रोड़ा सामग्री का इस्तेमाल किया और शल्य प्रक्रिया में अंतर के कारण था । इसलिए, हालांकि MCAO कुतर मॉडल अत्यधिक reproducible माना जाता है, यह हमेशा संभव नहीं है इस तरह के reproducibility प्राप्त करने के लिए । इसलिए, हम अपने प्रारंभिक अध्ययन और पिछले रिपोर्ट8के माध्यम से माउस MCAO मॉडल में इस्तेमाल रेशा की मोटाई अनुकूलित ।

अंय अध्ययनों की तुलना में हमारे प्रारंभिक अध्ययन का सबसे विशिष्ट परिणाम यह है कि टीटीसी धुंधला किसी भी मस्तिष्क रोधगलन जब ischemia ६० मिनट के लिए प्रेरित किया गया था प्रकट नहीं किया था (डेटा नहीं दिखाया) । यहां तक कि चूहों में MCAO के ९० और १२० मिनट के बाद, हमारे परिणाम अन्य अनुसंधान अध्ययन की तुलना में कम रोधगलन मात्रा दिखाया. इस अध्ययन की एक सीमा है कि हम अभी तक इन परिणामों का सही कारण निर्धारित नहीं किया है; हालांकि, हम आगे की पढ़ाई में इस घटना का पता लगाने की योजना बना रहे हैं ।

कई अध्ययनों ने हाल ही में बताया है कि जीआर या उसके घटकों अर्बुदरोधी, रोगाणुरोधी, और विरोधी भड़काऊ प्रभाव20,21,22सहित औषधीय गतिविधियों है । एक पिछले अध्ययन की रिपोर्ट है कि GRex पूर्व उपचार प्रभावी ढंग से Bcl-2 और Bcl-xL8के प्रोटीन अभिव्यक्ति को विनियमित द्वारा caspase-9 के सक्रियकरण बाधित । हालांकि, स्ट्रोक के लिए preventative उपचार कम चिकित्सकीय बाद स्ट्रोक उपचार से प्रासंगिक हैं ।

इस अध्ययन में, जो एक पिछले अध्ययन पर आधारित था8 एक MCAO माउस मॉडल में GRex के बाद उपचार की प्रभावशीलता का मूल्यांकन किया । के रूप में प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में दर्शाया गया है, GRex के बाद उपचार चूहों में MCAO प्रेरित मस्तिष्क चोट में सेलुलर संरचनाओं के लिए कुल रोधगलन मात्रा और उन्नति नुकसान को कम करने में लाभकारी प्रभाव दिखाया. पोस्ट पर GRex के विशिष्ट कार्रवाई तंत्र-कोरोनरी मस्तिष्क चोट इस अध्ययन में कमी आती है, लेकिन प्रयोगात्मक इस अध्ययन में इस्तेमाल प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक एक स्ट्रोक के मानव प्रभाव नकल उतार द्वारा इस हर्बल उपचार के प्रभाव का प्रदर्शन किया ।

हालांकि प्रयोगात्मक परिणाम इस अध्ययन में स्वीकार्य नहीं हैं, हमारे प्रारंभिक प्रयोग में ंयूरॉन घाटे स्कोर (एनडीएस) मापा गया था और कोई महत्वपूर्ण अंतर नियंत्रण और GRex-इलाज समूहों के बीच नोट किया गया था, जो माना के कारण किया गया है स्ट्रोक की गंभीरता की तुलना में कम अवलोकन समय के लिए । हम एक लंबी अवधि के दौरान एनडीएस पर GRex उपचार के प्रभावों के उदारवादी क्षति के कारण निरीक्षण करने की योजना बना रहे हैं ।

अंत में, एक माउस MCAO मॉडल में GRex उपचार के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव अच्छा reproducibility के साथ इस अध्ययन में प्रदर्शन किया गया । अंतर्निहित तंत्र में शामिल प्रोटीन की जांच भविष्य में पढ़ाई में होनी चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लागू नहीं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitative filter paper Advantec Filter paper No. 2 Qualitative filter paper
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-250ML Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Syringe filter (0.45 µm) Sigma CLS431220 Syringe filter (0.45 µm)
Stereo Microscope Leica M50 Stereo Microscope
Stereo Microscope Nikon SMZ745 Stereo Microscope
Laser Doppler Moor Instrument moorVMS-LDF Laser Doppler
Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System Harvard Appratus 34-1352 Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System
Homeothermic Monitoring System Harvard Appratus 55-7020 Homeothermic Monitoring System
Digital Camera Canon Eos-M2 Digital Camera
Cryostat Leica CM3050S Cryostat
Microscope Carl Zeiss Zeiss Axio Microscope
Data Analysis Systat Software Inc. SigmaPlot version 12 Data Analysis
Data Analysis NIH Image ImageJ Data Analysis
Mouse diet Doo Yeol Biotech Standard rodent chow Mouse diet
Isoflurane JOONGWAE A02104781 Isoflurane
Isoflurane TROIKAA ISOTROY 100 Isoflurane
Silk suture (4-0 Black silk)  AILEE SK47510 Silk suture (4-0 Black silk) 
Silk suture (3-0 White silk)  Baekjae 57 Silk suture (3-0 White silk) 
Nylon suture (8-0 monofilament)  AILEE NB825 Nylon suture (8-0 monofilament) 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma T8877-25G 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)
Formalin (Formaldehyde solution) JUNSEI 69360-1263 20KG Formalin (Formaldehyde solution)
Hematoxylin (Harris Hematoxylin) YD Diagnostics EasyStain Hematoxylin (Harris Hematoxylin)
Eosin (1% Eosin Y Solution) MUTO PURE CHEMICALS 3200-2 Eosin (1% Eosin Y Solution)
Cresyl violet (acetate) Sigma C5042-10G Cresyl violet (acetate)
Paraformaldehyde  Sigma-Aldrich P6148-1KG Paraformaldehyde 
Sucrose JUNSEI 31365-0350 1KG Sucrose
Optimum cutting temperature (OCT) compound Scigen 4583 Optimum cutting temperature (OCT) compound
Disecting Knife Fine Science Tools 10055-12 Disecting Knife
#4 Forcep Fine Science Tools 11241-30 #4 Forcep
#5 Forcep Fine Science Tools 11254-20 #5 Forcep
#6 Forcep Fine Science Tools 11260-20 #6 Forcep
#7 Fine Forcep Fine Science Tools 11274-20 #7 Fine Forcep
Surgical Scissors Fine Science Tools 14001-12 Surgical Scissors
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 Extra Fine Bonn Scissors
Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors Fine Science Tools 15371-92 Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors
Vessel Dilating Forcep Fine Science Tools 18153-11 Vessel Dilating Forcep

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References

  1. Bejot, Y., Delpont, B., Giroud, M. Rising stroke incidence in young adults: more epidemiological evidence, more questions to be answered. Journal of the American Heart Association. 11, (5), (2016).
  2. Hadadha, M., Vakili, A., Bandegi, A. R. Effect of the inhibition of hydrogen sulfide synthesis on ischemic injury and oxidative stress biomarkers in a transient model of focal cerebral ischemia in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 24, (12), 2676-2684 (2015).
  3. Durukan, A., Tatlisumak, T. Animal models of ischemic stroke. Article in Handbook of Clinical Neurology. 92, 43-66 (2009).
  4. Kim, D. Animal Models of Stroke. Brain and Neurorehabilitation. 4, (1), 1-11 (2011).
  5. Rizzato, G., Scalabrin, E., Radaelli, M., Capodaglio, G., Piccolo, O. A new exploration of licorice metabolome. Food Chemistry. 221, 959-968 (2017).
  6. Zhu, Z., et al. Rapid determination of flavonoids in licorice and comparison of three licorice species. Journal of Separation Science. 39, (3), 473-482 (2016).
  7. Ota, M., Mikage, M., Cai, S. Q. Herbological study on the medicinal effects of roasted licorice and honey-roasted licorice. Yakushigaku Zasshi. 50, (1), 38-45 (2015).
  8. Lim, C., et al. Licorice pretreatment protects against brain damage induced by middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Medicinal Food. 21, (5), 474-480 (2018).
  9. Koizumi, J. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. Nosotchu. 8, (1), 1-8 (1986).
  10. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  11. Zhu, Y., Liu, F., Zou, X., Torbey, M. Comparison of unbiased estimation of neuronal number in the rat hippocampus with different staining methods. Journal of Neuroscience Methods. 254, 73-79 (2005).
  12. Alberts, M. J., Ovbiagele, B. Current strategies for ischemic stroke prevention: role of multimodal combination therapies. Journal of Neurology. 254, (10), 1414-1426 (2007).
  13. Pinto, A., Tuttolomondo, A., Di Raimondo, D., Fernandez, P., Licata, G. Cerebrovascular risk factors and clinical classification of strokes. Seminars in Vascular Medicine. 4, (3), 287-303 (2004).
  14. Barlow, S. J. Identifying the brain regions associated with acute spasticity in patients diagnosed with an ischemic stroke. Somatosensory and Motor Research. 33, (2), 1-8 (2016).
  15. Roth, S., Liesz, A. Stroke research at the crossroads - where are we heading. Swiss Medical Weekly. 146, 14329 (2016).
  16. Feuerstein, G. Z., Wang, X. Animal models of stroke. Molecular Medicine Today. 6, (3), 133-135 (2000).
  17. Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9, (5), 541-551 (2014).
  18. Kumar, A., Gupta Aakriti, V. A review on animal models of stroke: an update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
  19. O'Collins, V. E., Donnan, G. A., Howells, D. W. History of animal models of stroke. International Journal of Stroke. 6, (1), 77-78 (2011).
  20. Ji, S., et al. Bioactive constituents of Glycyrrhiza uralensis (licorice): discovery of the effective components of a traditional herbal medicine. Journal of Natural Products. 79, (2), 281-292 (2016).
  21. Yang, R., Wang, L. Q., Yuan, B. C., Liu, Y. The pharmacological activities of licorice. Planta Medica. 81, (18), 1654-1669 (2015).
  22. Yang, R., Yuan, B. C., Ma, Y. S., Zhou, S., Liu, Y. The anti-inflammatory activity of licorice, a widely used Chinese herb. Pharmaceutical Biology. 55, (1), 5-18 (2017).
Glycyrrhizae मूलांक एट Rhizoma एक क्षणिक मध्यम मस्तिष्क धमनी रोड़ा माउस मॉडल का उपयोग कर निकालने के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव का आकलन
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Lee, S. E., Lim, C., Lee, M., Kim, C. H., Kim, H., Lee, B., Cho, S. Assessing Neuroprotective Effects of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Extract Using a Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Mouse Model. J. Vis. Exp. (142), e58454, doi:10.3791/58454 (2018).More

Lee, S. E., Lim, C., Lee, M., Kim, C. H., Kim, H., Lee, B., Cho, S. Assessing Neuroprotective Effects of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Extract Using a Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Mouse Model. J. Vis. Exp. (142), e58454, doi:10.3791/58454 (2018).

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