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Medicine

Valutare gli effetti Neuroprotective di Glycyrrhizae Radix et Rhizoma estrarre utilizzando un modello murino di occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media

doi: 10.3791/58454 Published: December 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

In questo studio, modifichiamo un metodo sperimentale esistente per ottenere più risultati riproducibili, stabilendo un modello murino di occlusione (MCAO) dell'arteria cerebrale media. La somministrazione orale di Glycyrrhizae Radix et Estratto del metanolo di Rizoma (GR) (GRex), dopo induzione di colpo, diminuito significativamente il volume di infarto totale rispetto al gruppo di controllo non trattato.

Abstract

Ischemia seguita da riperfusione di flusso sanguigno cerebrale dopo un ictus conduce alla morte delle cellule nervose e perdita di tessuto cerebrale. Il modello animale più comunemente usato per lo studio di colpo è il modello di occlusione (MCAO) dell'arteria cerebrale media. Precedenti studi di ricerca sono riportati dimensioni differenti infarto anche quando la stessa specie animale sperimentale è stato usato in condizioni simili di MCAO. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un metodo sperimentale migliore per affrontare questa discrepanza. Topi sono stati sottoposti a MCAO utilizzando un filamento di come il materiale di occlusione per simulare condizioni di colpo umano e lo spessore del filamento è stato ottimizzato per stabilire più volume di infarto riproducibile. Topi trattati con un metanolo Estratto di Glycyrrhizae Radix et Rizoma (GRex) dopo induzione di colpo ha mostrato un volume di infarto totale significativamente in diminuzione e aumento del numero di sopravvivere cellule riguardante il gruppo di controllo non trattato. Questo modificato protocollo sperimentale con successo e riproducibile ha dimostrato l'effetto benefico di GRex il colpo ischemico.

Introduction

Danni al cervello causati da ischemia e riperfusione di flusso sanguigno cerebrale conduce alla morte delle cellule nervose e perdita di tessuto cerebrale. Questo tipo di danno cerebrale continua ad aumentare con la crescente prevalenza di malattie cerebrovascolari a causa della diffusione di malattie metaboliche come l'obesità, ipertensione e diabete mellito1,2. Il numero assoluto di pazienti anziani con ictus è aumentato drammaticamente in tutto il mondo, e il costo delle cure mediche per questi pazienti, che spesso sono lasciati con disabilità a lungo termine, è un grave onere della società. Di conseguenza, disabilità secondaria dovrebbe essere attenuato per quanto possibile per ridurre l'onere economico1,2.

Il modello di roditore più comunemente usato di infarto cerebrale è il modello di occlusione (MCAO) arteria cerebrale media (MCA), in cui il MCA è occluso con un filamento di sutura chirurgico silicio per bloccare il flusso sanguigno, causando ictus ischemico3, 4. utilizzando un filamento di come il materiale di occlusione permette il controllo del tempo di occlusione e permanenza manipolando la durata dell'inserzione del filamento intra-luminale.

Gli studi precedenti hanno mostrato che anche quando viene utilizzato lo stesso modello MCAO roditore, il volume totale di infarto cerebrale varia tra esperimenti, causando scarsa riproducibilità degli studi. Per migliorare la riproducibilità, abbiamo ottimizzato lo spessore della zecca filamento usato nell'esperimento. I risultati di uno studio preliminare del periodo ischemico cerebrale e infarto indotto ha mostrato che un periodo ischemico più di 60 min ammessi regione volumetrica del danneggiato tessuto cerebrale per essere osservato e misurato.

Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), noto anche come liquirizia, è costituito da radici secche e rizomi di Glycyrrhiza uralensis e g. glabra. È stato utilizzato nella medicina tradizionale cinese e coreana per vari scopi incluso come un additivo alimentare e medicinale5,6,7.

In un precedente studio8, pre-trattamento con l'Estratto del metanolo GR (GRex) ha mostrato un effetto anti-apoptotico in topi MCAO, tra cui la prevenzione significativa della diminuzione nell'espressione della proteina di linfoma della B-cellula 2 (Bcl-2) e Bcl extra-large (Bcl-xL). Questo studio è stato condotto per migliorare la riproducibilità del modello del topo MCAO convenzionale valutando la sua efficienza nel determinare se il trattamento post-infartuale con GRex efficacemente ridotto il volume di infarto nel danno cerebrale indotto da MCAO.

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Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal comitato etico dell'Università nazionale di Pusan (numero di omologazione, PNU-2016-1087). Una panoramica grafica di questo studio è illustrata nella Figura 1.

1. preparazione e somministrazione di GRex

Nota: Il GR utilizzato in questo studio è stato acquistato da una società farmaceutica commerciale.

  1. Mettere 200 g di GR in 2.000 mL di metanolo e incubare a temperatura ambiente (25 ° C) per 5 giorni.
  2. Filtrare la miscela utilizzando carta da filtro con spessore di 0,26 mm e porosità di 5 µm e quindi rimuovere il surnatante. Aggiungere 1.000 mL di metanolo al residuo GR e filtrare nuovamente.
  3. Combinare i due surnatanti, filtrare attraverso carta da filtro, concentrato sotto vuoto e quindi liofilizzare il residuo per produrre GRex.
  4. Sciogliere il GRex in dimetilsolfossido (DMSO), diluire con soluzione fisiologica 0,9% e filtrare attraverso un filtro per siringa da 0,45 µm. Quindi, regolare la concentrazione finale di DMSO per < 5%.
  5. Amministrare GRex (300 mg/kg di peso corporeo) 1 h dopo la riperfusione di MCAO via orale mediante sonda gastrica. Amministrare il DMSO diluito in soluzione fisiologica (10 mL/kg di peso corporeo) solo al gruppo normale e gruppi di controllo, rispettivamente.
    Nota: La concentrazione di GRex utilizzati in questo esperimento è stata determinata secondo la concentrazione che è stata attiva attraverso il nostro precedente studio8.

2. Mouse modello di MCAO

  1. Uso di topi C57BL/6 maschi di età compresa tra 6 settimane e pesatura g. 22-25 fornire tutti gli animali con libero accesso al cibo standard, acqua e casa loro in un ambiente con temperatura controllata (22 ± 1 ° C) e un ciclo luce/buio di 12 h.
    1. Dividere i topi in gruppi di sei topi ciascuno, che dovrebbero consistere di falsità-azionati normale, controllo e gruppi di trattamento GRex.
    2. Eseguire un intervento chirurgico MCAO (modifica del metodo di Koizumi et al. 9) sul controllo e gruppi di trattamento GRex stereo-microscopio.
  2. Indurre l'anestesia per inalazione nei topi utilizzando 2% isoflurane in 70% N2O e 30% O2. L'anestesia è considerata sufficiente quando il mouse non risponde allo stimolo meccanico applicato alla sua coda. Mantenere la temperatura corporea dei topi a 36,5 ± 0,5 ° C, usando un corpo temperatura-tenuta coperta collegata ad un termometro.
  3. Rimuovere tutti i peli sul petto e collo dei topi da rasatura, seguita da uso di crema depilatoria, disinfezione il sito chirurgico della pelle con betadine scrub alternati con alcool per due volte e poi fare un'incisione di circa 2 cm lungo con chirurgica lama al centro del collo. Isolare accuratamente l'arteria carotide comune sinistra (LCCA), arteria carotide esterna e il ramo dell'arteria carotica interna dai tessuti connettivi circostanti.
  4. Legare l'arteria carotide esterna e l'arteria carotica comune con una sutura chirurgica (sutura seta 4-0, nodo mezzo collo) per bloccare temporaneamente il flusso sanguigno nell'arteria carotica interna durante il funzionamento.
  5. Inserire un suturare di nylon di silicio (8-0 monofilamento, 11 mm di lunghezza) attraverso l'arteria carotica interna all'origine del MCA di sinistra. Regolare lo spessore della parte di silicio del filamento ad una gamma di 0,10-0,12 mm.
  6. Misurare la riduzione del flusso sanguigno cerebrale relativo (rCBF) nel MCA usando un flussometro Doppler laser. MCAO verrà confermato quando il rCBF è mantenuto a < 20% dei valori di condizione di riposo durante l'intero periodo ischemico.
  7. Difficoltà il filamento inserito per il vaso sanguigno per 2 h, mentre l'arteria cerebrale è occlusa e quindi estrarre delicatamente il filamento per ripristinare il flusso di sangue per 22 h di riperfusione. Suturare la pelle con una cucitura a 5 posti (sutura seta 3-0, due metà intoppi nodo) e consentire ogni mouse a risvegliarsi dall'anestesia.
  8. Nel gruppo normale, eseguire un'operazione finta seguendo la stessa procedura sopra (fino a 2.4), con la seguente eccezione. Legare l'arteria carotica comune e suturare il muscolo incisa e la pelle.

3. misurazione del Volume del tessuto cerebrale danneggiato

  1. Dopo l'eutanasia dei topi per la misura del danno cerebrale con inalazione di CO2 , accise il mouse cervelli 24 h dopo l'inizio di MCAO utilizzando forbici chirurgiche iris e forcipe angolato.
    1. Dopo aver rimosso la testa utilizzando le forbici, fare un'incisione nella pelle della linea mediana della testa per capovolgere la pelle dal cranio.
    2. Rompere le ossa parietali con forcipe angolato, staccava dura materia allo stesso tempo e quindi isolare il cervello con attenzione dal cranio.
  2. Taglia il tessuto asportato in sezioni (spessore 1 mm) utilizzando una matrice di cervello del mouse e quindi macchiare le sezioni per 17 min in una soluzione di 2% 2, 3,5-triphenyltetrazolium cloruro (TTC).
  3. Fissare le sezioni in formalina al 10% per almeno 2 h e poi fotografarli utilizzando una fotocamera digitale. TTC sarà osservato a macchiare il tessuto vitale rosso mentre le zone necrotiche sarà bianche.
  4. Analizzare e quantificare l'area di infarto cerebrale di ogni sezione using ImageJ.

4. ematossilina ed eosina (H & E) e Cresyl Violet macchiatura delle sezioni istologiche

  1. Eutanasia i topi per esame istologico per inalazione di CO2 e irrorare loro via con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS), seguita da 10 mL di paraformaldeide al 4% (PFA). Isolare il cervello utilizzando la stessa procedura come sopra (3.1) e immergete il cervello in 10 mL di saccarosio 30% durante la notte.
  2. Incorporare il tessuto cerebrale in temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e affettarlo coronalmente in sezioni di 15-µm di spessore utilizzando un criostato. Montare i profili sulle lastre di vetro, seguite da colorazione con ematossilina ed eosina (H & E) o viola di cresyl.
  3. Immergere i vetrini in etanolo di 80% per 1 min seguita dalla macchiatura in soluzione di ematossilina per 5 min.
    1. Immergere i vetrini in alcool acido 1% due volte, immergere in soluzione satura di carbonato del litio per 30 s, lavare con acqua corrente per 30 s e poi il colorante di contrasto in soluzione di eosina per 30 s.
    2. Sciacquare i vetrini in acqua di rubinetto, ammollo in 95% ed etanolo assoluto consecutivamente.
    3. Asciugare i vetrini, eliminarle in xilene per almeno 10 min e poi montare i vetrini coprioggetti utilizzando il mezzo di montaggio.
  4. Posizionare i vetrini in una diapositiva più caldo per almeno 1 h, seguito da immersione in 50% etanolo diluito con cloroformio durante la notte.
    1. Colorare i vetrini con la viola di cresyl 0,1% per 10 min in forno secco a 40 ° C.
    2. Immergere in etanolo al 95% per 30 minuti, quindi disidratare in etanolo assoluto per 2 volte.
    3. Chiara 2 volte in xilene per 5 min, quindi montare con mezzo di montaggio dopo essiccazione all'aria.
  5. Utilizzando un microscopio, osservare i cambiamenti istologici che si sono verificati dopo il trauma cranico indotto da MCAO.

5. elaborazione statistica

  1. Esprimere i risultati sperimentali come mezzi ± deviazione standard e determinare la significatività statistica fra i gruppi utilizzando un unidirezionale analisi della varianza (ANOVA), seguita dall'analisi di post hoc di Tukey utilizzando un software di analisi dati.
  2. Impostare la significatività statistica a un p-value < 0.05.

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Representative Results

Nel gruppo normale di falsità-azionati, nessun infarto cerebrale si osserva mentre nel gruppo di controllo, si osserva una gamma piuttosto ampia di aree danneggiate. Nei topi GRex amministrato 300 mg/kg nel gruppo modello MCAO, una riduzione statisticamente significativa nella zona danneggiata è osservato (Figura 2).

I cambiamenti istologici sono studiati dalla macchiatura sezioni di cervello ischemico con H & E o cresyl violet. Macchiatura di H & E fornisce informazioni strutturali e funzionali informazioni specifiche cellule10, mentre viola di cresyl colorazione viene utilizzato per stimare il numero totale di neuroni ippocampali11. Così, H & E o cresyl violet intensità, misurata utilizzando il software ImageJ (Figura 3A), fornisce un indice di sopravvivenza delle cellule. H & E e cresile viola intensità di colorazione significativamente diminuire nel gruppo di controllo rispetto al gruppo normale (Figura 3B, 3C). Il gruppo GRex-trattato dimostra una maggiore integrità istologica, che implica meno morte neuronale, rispetto al gruppo di controllo (Figura 3C). Questi risultati indicano che il GRex ha effetti neuroprotective potente contro la lesione cerebrale indotta da ischemia/riperfusione.

Figure 1
Figura 1 . Schema del modello di occlusione (MCAO) dell'arteria cerebrale media e trattamento con l'Estratto del metanolo di Glycyrrhizae Radix et Rizoma (GRex). Topi sono stati trattati con 300 mg/kg di GRex 1 h dopo riperfusione MCAO, che è stata mantenuta per 2 h. topi sono stati eutanasizzati 24 h dopo la MCAO cominciò, e quindi le fette di cervello raccolte erano conservate in un congelatore per analisi della proteina o colorate con soluzione TTC per infarto unità di misura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Immagini rappresentative delle sezioni (A) cervello mostrano gli effetti di metanolo Estratto di Glycyrrhizae Radix et trattamento Rizoma (GRex) su occlusione post-media dell'arteria cerebrale (MCAO)-indotto da volumi di infarto cerebrale e (B) singolo trattamento con 300 mg/kg GRex 1 h dopo riperfusione MCAO ha soppresso significativamente volumi di infarto. Risultati sono presentati come mezzi ± SDs. #p # # < 0,001 vs gruppo normale, * * p < 0,01 vs controllo gruppo; n = 6 per ogni gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Immagini rappresentative di (A) ematossilina ed eosina (H & E)- e sezioni di cervello tinto di viola di cresyl e (B, C) colore intensità, che sono stati utilizzati per valutare gli effetti dell'estratto del metanolo di Glycyrrhizae Radix et Rizoma (GRex) su cervelli di medio occlusione dell'arteria cerebrale (MCAO)-ferito topi. Danno istologico di integrità e tessuto in cervelli di topo sono stati valutati utilizzando (B) H & riperfusione cresile viola colorazione 1h post-MCAO E o (C). Colorazione in H & sezioni colorate con EE rossa indica un danno nucleare. Neuroni tinti con la viola di cresyl erano macchiati viola. Il gruppo GRex-trattati ha mostrato meglio istologico integrità rispetto al gruppo di controllo, che indica meno morte neuronale. un, H & colorati; b, cresile tinto di viola; c e d, ingrandimenti di a e b, rispettivamente. I risultati sono mezzi ± SDs. #p # # < 0,001, e * p < 0,05 vs normale e gruppi di controllo; n = 6 per ogni gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Con la crescente prevalenza di malattie metaboliche come l'ipertensione cronica, diabete ed iperlipidemia, che sono i principali fattori di rischio per l'ictus, il trattamento e la prevenzione del colpo sono diventati un'importante area di ricerca medica12, 13. i deficit nel linguaggio e movimento dopo un ictus sono fortemente correlati con il grado di danneggiamento del tessuto14 del cervello e provocare una scarsa qualità di vita per i pazienti e le loro famiglie15. È importante utilizzare un appropriato modello animale del colpo che coinvolge gli stessi cambiamenti patologici come quelli che si verificano nella malattia umana per studiare l'efficacia di trattamenti farmacologici. Il modello MCAO imita ictus trombotici ostruendo i vasi arteriosi cerebrali. È comunemente usato perché è relativamente riproducibile e minimamente invasiva16,17,18,19.

Tuttavia, un confronto tra l'area di infarto cerebrale indotto per il riposo stesso tempo segnalato da diversi ricercatori, rivela che il volume di infarto totale varia tra gli studi. Abbiamo concluso che questo era dovuto le differenze in occlusione materiali utilizzati e la procedura chirurgica. Pertanto, anche se il modello di roditore MCAO è considerato altamente riproducibile, esso non è sempre possibile ottenere tale riproducibilità. Di conseguenza, abbiamo ottimizzato lo spessore dei filamenti utilizzati nel modello MCAO del mouse attraverso il nostro studio preliminare e il precedente rapporto8.

Il risultato più caratteristico del nostro studio preliminare rispetto a quella di altri studi è che la macchiatura TTC non ha rivelato alcun infarto cerebrale quando l'ischemia è stata indotta per 60 min (dati non mostrati). Anche a seguito di 90 e 120 min di MCAO nei topi, il nostro risultato ha mostrato un volume di infarto inferiore rispetto a quella di altri studi di ricerca. Una limitazione di questo studio è che non abbiamo ancora stabilito la causa esatta di questi risultati; Tuttavia, stiamo progettando di esplorare questo fenomeno in ulteriori studi.

Numerosi studi hanno recentemente riferito che GR o i suoi componenti hanno attività farmacologiche, tra cui effetti antitumorali, antimicrobiche ed antinfiammatorie20,21,22. Uno studio precedente ha riferito che il pre-trattamento GRex efficacemente ha inibito l'attivazione di caspase-9 aumentando l'espressione della proteina Bcl-2 e Bcl-xL8. Tuttavia, trattamenti preventivi per l'ictus sono meno clinicamente rilevanti rispetto al trattamento di post-ictus.

In questo studio, che è stata basata su un precedente studio8 ha valutato l'efficacia del post-trattamento GRex in un modello murino MCAO. Come illustrato nella sezione risultati rappresentativi, GRex post-trattamento ha mostrato effetti benefici nella riduzione volume di infarto totale e miglioramento danni a strutture cellulari nella ferita di cervello MCAO-indotta in topi. I meccanismi di azione specifica di GRex sulla lesione cerebrale post-ischemico manca in questo studio, ma i protocolli sperimentali utilizzati con successo in questo studio ha dimostrato gli effetti di questo rimedio di erbe imitando gli effetti sugli umani di un tratto.

Anche se i risultati sperimentali non sono osservati in questo studio, il Punteggio di deficit neuronale (NDS) è stata misurata nel nostro esperimento preliminare e nessuna differenza significativa è stata notata fra il controllo e i gruppi GRex-trattati, che è presunto per essere dovuto per il tempo di osservazione breve rispetto alla gravità del tratto. Stiamo progettando di osservare gli effetti del trattamento di GRex su NDS per un lungo periodo dopo aver causato danni moderati.

In conclusione, l'effetto di neuroprotective del trattamento GRex in un modello MCAO topo è stato dimostrato in questo studio con buona riproducibilità. Le proteine coinvolte nel meccanismo sottostante dovrebbero essere esaminate negli studi futuri.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Non applicabile.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitative filter paper Advantec Filter paper No. 2 Qualitative filter paper
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-250ML Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Syringe filter (0.45 µm) Sigma CLS431220 Syringe filter (0.45 µm)
Stereo Microscope Leica M50 Stereo Microscope
Stereo Microscope Nikon SMZ745 Stereo Microscope
Laser Doppler Moor Instrument moorVMS-LDF Laser Doppler
Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System Harvard Appratus 34-1352 Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System
Homeothermic Monitoring System Harvard Appratus 55-7020 Homeothermic Monitoring System
Digital Camera Canon Eos-M2 Digital Camera
Cryostat Leica CM3050S Cryostat
Microscope Carl Zeiss Zeiss Axio Microscope
Data Analysis Systat Software Inc. SigmaPlot version 12 Data Analysis
Data Analysis NIH Image ImageJ Data Analysis
Mouse diet Doo Yeol Biotech Standard rodent chow Mouse diet
Isoflurane JOONGWAE A02104781 Isoflurane
Isoflurane TROIKAA ISOTROY 100 Isoflurane
Silk suture (4-0 Black silk)  AILEE SK47510 Silk suture (4-0 Black silk) 
Silk suture (3-0 White silk)  Baekjae 57 Silk suture (3-0 White silk) 
Nylon suture (8-0 monofilament)  AILEE NB825 Nylon suture (8-0 monofilament) 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma T8877-25G 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)
Formalin (Formaldehyde solution) JUNSEI 69360-1263 20KG Formalin (Formaldehyde solution)
Hematoxylin (Harris Hematoxylin) YD Diagnostics EasyStain Hematoxylin (Harris Hematoxylin)
Eosin (1% Eosin Y Solution) MUTO PURE CHEMICALS 3200-2 Eosin (1% Eosin Y Solution)
Cresyl violet (acetate) Sigma C5042-10G Cresyl violet (acetate)
Paraformaldehyde  Sigma-Aldrich P6148-1KG Paraformaldehyde 
Sucrose JUNSEI 31365-0350 1KG Sucrose
Optimum cutting temperature (OCT) compound Scigen 4583 Optimum cutting temperature (OCT) compound
Disecting Knife Fine Science Tools 10055-12 Disecting Knife
#4 Forcep Fine Science Tools 11241-30 #4 Forcep
#5 Forcep Fine Science Tools 11254-20 #5 Forcep
#6 Forcep Fine Science Tools 11260-20 #6 Forcep
#7 Fine Forcep Fine Science Tools 11274-20 #7 Fine Forcep
Surgical Scissors Fine Science Tools 14001-12 Surgical Scissors
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 Extra Fine Bonn Scissors
Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors Fine Science Tools 15371-92 Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors
Vessel Dilating Forcep Fine Science Tools 18153-11 Vessel Dilating Forcep

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Lee, S. E., Lim, C., Lee, M., Kim, C. H., Kim, H., Lee, B., Cho, S. Assessing Neuroprotective Effects of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Extract Using a Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Mouse Model. J. Vis. Exp. (142), e58454, doi:10.3791/58454 (2018).More

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