Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الإنتاج الواسع النطاق للكشف المؤتلف في سقالة دائرية باستخدام نظام المستمدة من فرويد في الإشريكيّة القولونية

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58472
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universitat Politècnica de València, Spain

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في الإشريكيّة القولونية بالإعراب شارك الجيش الملكي النيبالي تشيميريك التي تحتوي على الحمض النووي الريبي للفائدة في سقالة فرويد ومصنع للحمض الريبي النووي النقال ليجاسى. المنتج الرئيسي هو جزيء تعميم الذي يسهل تنقية للتجانس.

Abstract

ومع تزايد الاهتمام بالبيولوجيا الجيش الملكي النيبالي، واستخدام جزيئات الحمض النووي الريبي في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية تطورا، الأساليب التي تنتج كميات كبيرة من الكشف المؤتلف محدودة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في الإشريكيّة القولونية يستند التعبير المشارك من جزيء تشيميريك التي تحتوي على الحمض النووي الريبي للفائدة في سقالة فرويد ومصنع للحمض الريبي النووي النقال ليجاسى. فيرويدس يتم الكشف دائرية صغيرة نسبيا، غير الترميز، درجة عالية من إقران قاعدة يتم المعدية على النباتات العليا. النباتات المضيفة الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى هو إنزيم جندهم فيرويدس التي تنتمي إلى الأسرة، أفسونفيرويدايمثل فرويد الكامنة الباذنجان (الفد)، للتوسط على الجيش الملكي النيبالي أثناء النسخ المتماثل فرويد. على الرغم من أن الفد لا النسخ المتماثل في كولايوكفاءة يتم نسخها من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي كولاي مؤشرا الفد ويتم معالجتها بواسطة ribozymes المطرقة المضمنة في الخلايا البكتيرية، وهي سيركولاريزيد مونومرات الناجمة عن ذلك شارك أعرب ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال التوصل إلى تركيز ملحوظ. إدراج الحمض النووي الريبي للفائدة في سقالة الفد يتيح إنتاج عشرات ملليغرام من المؤتلف الحمض النووي الريبي للتر الواحد من ثقافة البكتيرية في الظروف المختبرية العادية. جزء الرئيسي من المنتج الجيش الملكي النيبالي التعميم، ميزة تسهل على تطهير الجيش الملكي النيبالي المؤتلف إلى التجانس الظاهري. في هذا البروتوكول، يتم إدراج المقابلة الحمض النووي (كدنا) مكملة للجيش الملكي النيبالي للفائدة في موضع معين من كدنا الفد في تعبير بلازميد المستخدمة، على طول بلازميد لﻹعراب الباذنجان الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى، شاركت في تحويل كولاي. التعبير المشترك كلا الجزيئات تحت سيطرة المروجين التأسيسي قوي يؤدي إلى إنتاج كميات كبيرة من الجيش الملكي النيبالي المؤتلف. يمكن استخراجه من الخلايا البكتيرية الجيش الملكي النيبالي المؤتلف وفصلها عن الجزء الأكبر الكشف البكتيرية الاستفادة به دائرية.

Introduction

وعلى النقيض من الحمض النووي والبروتينات، بروتوكولات لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي سهلة وفعالة وفعالة من حيث التكلفة ليست وفيرة. ومع ذلك، متطورة الطلب البحوث والصناعة زيادة مبالغ هذه الجزيئات الحيوية للتحقيق عن الخصائص البيولوجية الفريدة1، أو استخدامها في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية، بما في ذلك استخدامها الابتامرات محددة للغاية 2أو3من العوامل العلاجية أو مبيدات انتقائية4. النسخ في المختبر والتوليف الكيميائية تستخدم عادة في البحوث لإنتاج الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، هذه الأساليب تستتبع القيود الهامة عندما يتطلب الأمر كميات كبيرة من المنتجات. البديل المنطقي لاستخدام آلات النسخ الذاتية من الخلايا الحية، تليها عملية تنقية لفصل الكشف لمصلحة من رفاقه الخلوية. وفي أعقاب هذه الاستراتيجية، وضعت أساليب لإنتاج الكشف المؤتلف في الخلايا البكتيرية، مثل المختبر الصديقة الإشريكيّة القولونية5 أو البحرية الأرجواني فوتوتروفيك ألفا-بروتيوباكتيريوم سولفيدوفيلوم رهودوفولوم 6-معظم الأساليب لإنتاج الحمض النووي الريبي المؤتلف في البكتيريا تعتمد على التعبير عن السقالة الحمض النووي الريبي مستقرة جداً الأصلي، مثل إدراج7الحمض الريبي النووي النقال أو الرنا الريباسي، التي يكون فيها الجيش الملكي النيبالي للفائدة. وهذا يفرض ضرورة الإفراج عن الجيش الملكي النيبالي للفائدة من جزيء تشيميريك، في حالة وجود الحمض النووي الريبي إضافي مشكلة بالنسبة للتطبيقات المصب8. مفهوم آخر في المؤتلف الحمض النووي الريبي التكنولوجيا الأحيائية هو إنتاج مجمعات ribonucleoprotein التوليفية التي قد تكون المنتج المطلوب في حد ذاتها أو تستخدم كاستراتيجية وقائية لزيادة الاستقرار في الجيش الملكي النيبالي للفائدة9، 10. وبالمثل، اقترحت أيضا كاستراتيجية لتوليد منتجات أكثر استقرارا11إنتاج الكشف دائرية.

قمنا مؤخرا بتطوير أسلوب جديد لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في كولاي التي تشارك في ثلاثة من المفاهيم المذكورة أعلاه: الإدراج من الجيش الملكي النيبالي للفائدة في سقالة الحمض النووي الريبي دائرية عالية مستقرة والتعبير المشترك عن رنا المؤتلف مع بروتين التفاعل المحتمل أن إنتاج ribonucleoprotein مستقرة معقدة التي تتراكم في المبالغ الملحوظة في البكتيريا خلايا12. على النقيض من التطورات السابقة، استخدمنا الحمض النووي الريبي سقالة غريبة تماما على كولاي، إلا وهي فرويد. فيرويدس هي نوع خاص جداً من العوامل المعدية من النباتات العليا التي تتألف حصرا من صغيرة نسبيا (nt 246-401) درجة عالية من إقران قاعدة التعميم الحمض النووي الريبي13. من المثير للاهتمام، فيرويدس هي غير الترميز الكشف، ومع أي مساعدة من البروتينات الخاصة بها، فقادرة على إكمال دورات المعدية المعقدة في المضيفين المصابة14. تشمل هذه الدورات تكرار الحمض النووي الريبي للجيش الملكي النيبالي في نوى أو المعايشة، اعتماداً على الأسرة فيرويد –بوسبيفيرويداي أو أفسونفيرويداي، على التوالي – الحركة عن طريق النباتات المصابة والتهرب من استجابة دفاعية المضيف. يجب أن يتم تصنيفهم فيرويدس بين الكشف الأكثر استقرارا في طبيعتها، ونتيجة ليجري الحمض النووي الريبي دائرية عارية، والحاجة إلى البقاء على قيد الحياة في بيئة معادية للخلايا النباتية المصابة. وقد جعل هذه الخاصية فيرويدس مناسبة خاصة السقالات على استقرار المؤتلف الحمض النووي الريبي في نهج التكنولوجيا الحيوية. وباﻹضافة إلى ذلك، أسلوب جديد يستند إلى التعبير المشارك من السقالة فرويد مع بروتين النباتي متفاعلة. فيرويدس نسخاً متماثلاً من خلال إليه دائرة المتداول في استضافة التي يجند الإنزيمات لتحفيز الخطوات المختلفة لهذه العملية. لا سيما بعض فيرويدس، وبشكل أكثر تحديداً تلك التي تنتمي إلى أفسونفيرويدايالأسرة15، تحتوي على ريبوزيميس التي تشارك أيضا في عملية النسخ المتماثل. تبعاً للأنواع الأحيائية فرويد، توسط نسخ فرويد الكشف المضيفة الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني أو بوليميريز الحمض النووي الريبي النووي ترميز تشلوروبلاستيك (NEP). معالجة فرويد الجيش الملكي النيبالي ويبدو أن تحفزها مضيف رناسي نوع-ثالثا، على الرغم من أن تنشق وسيطة في فيرويدس مع الحمض النووي الريبي أوليجوميريك ribozymes ذاتيا أثناء النسخ المتماثل. وأخيراً، مونومرات فرويد الناتجة هي سيركولاريزيد، اعتماداً على الأسرة، وفرويد ليجاسى الحمض النووي المضيف 1 أو isoform تشلوروبلاستيك الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى16،17. هذا الإنزيم الأخير تشارك في عملية ربط أحادي أشكال فيرويدس في الأسرة أفسونفيرويداي، مثل فرويد الكامنة الباذنجان (الفد)18.

أثناء عمل تحليل متطلبات الفد تسلسل والهيكلية التي تحدد الاعتراف بالباذنجان (Solanum melongena L.) ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال، أنشأنا نظام تجريبي يستند إلى التعبير المشترك لكل الجزيئات في كولاي 19-لاحظنا أن تنشق ذاتية أطول من وحدة الفد النصوص كفاءة في الخلايا كولاي عن طريق ribozymes المطرقة جزءا لا يتجزأ، وأن مونومرات فرويد الناتجة مع 5 '-هيدروكسيل و 2'، 3 '-phosphodiester تيرميني كانت كفاءة سيركولاريزيد من ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان أعرب المشترك. بل أكثر من ذلك، رنا فرويد التعميم الناتج الذي تم التوصل إليه بتركيز عال غير متوقعة في كولاي، تتجاوز تلك التي ررناس الذاتية12. أظهرت عدم وجود وسيطة النسخ المتماثل عدم التضخيم الفد الحمض النووي الريبي للجيش النيبالي الملكي في هذه الخلايا البكتيرية. من المثير للاهتمام، الإدراج للكشف مغايرة في موقف معين للجزيء فرويد أثرا معتدلة في تراكم الكشف مشتقة فرويد-التعميم12. هذه الملاحظات جعلتنا نتصور طريقة لإنتاج كميات كبيرة من المؤتلف الكشف في البكتيريا. في هذا الأسلوب، يتم إدراج كدناس المقابلة للكشف الفائدة في كدنا الفد والجيش الملكي النيبالي تشيميريك الناتجة في كولاي عن طريق أحد المروجين تأسيسي قوية. لنظام العمل، يجب تحويل كولاي يشترك مع بلازميد للتعبير عن ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان. نسخة أطول من الوحدة المشتقة من الفد تتم معالجتها بواسطة ribozymes المطرقة جزءا لا يتجزأ ومعترف بها وسيركولاريزيد من ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال المشترك أعرب مونومرات الناتجة مع تيرميني المناسبة. بهذه الطريقة، يتم إدراج الجيش الملكي النيبالي لمصلحة سقالة دائرية مستقرة جداً يتألف من جزيء دائري فرويد. هذا الحمض النووي الريبي تشيميريك المؤتلف على الأرجح كذلك استقرت داخل الخلايا كولاي بتشكيل ribonucleoprotein المعقدة من خلال التفاعل مع الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى. باستخدام هذا الأسلوب (انظر البروتوكول أدناه)، الابتامرات الجيش الملكي النيبالي ودبوس الكشف وغيرها الكشف المنظم بسهولة أنتجت بكميات عشرات مليغرام للتر الواحد من الثقافة كولاي في الظروف المختبرية العادية وتنقيته للتجانس مع أخذ الاستفادة من تدوير12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-بلازميد البناء

  1. تضخيم بكر (أو النسخ العكسي PCR إذا البدء من قالب الحمض النووي الريبي) كدنا المقابلة للجيش الملكي النيبالي للاهتمام باستخدام كبسولة تفجير 5 ' ملحق للسماح للجمعية إلى بلازميد التعبير. لتجنب حدوث طفرات غير مرغوب فيها، استخدام عالية دقة بوليميريز الحمض النووي.
    1. لإدراج كدنا في بلازميد التعبير عن جيبسون الجمعية20، إضافة 5 'الملحقات التالية إلى الإشعال بكر: الأمام، 5'-تكتكككككتكككاجتاكتاتككككتكسكسسسسسسسسسسسسسسسسسسسسس-3 '؛ عكس، 5 '-كككتككتاججاكاكاتككتجاكسكسسسسسسسسسسسسسسسسسسسسس-3'؛ يمثل X النيوكليوتيدات مثلى لنهايات طرفية للجيش الملكي النيبالي للفائدة.
    2. احتضان لمدة 30 ثانية عند 98 درجة مئوية، تليها دورات 30 10 s عند 98 درجة مئوية، 30 s في 55 درجة مئوية و 30 s في 72 درجة مئوية، وتمديد نهائي من 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
  2. ملخص 100 نانوغرام من بلازميد بليلفد-بزب مع 10 يو إنزيم التقييد IIS نوع Bpi أنا ح 1 في 37 درجة مئوية في رد فعل ميليلتر 20 مل 0.5 أنبوب في المخزن المؤقت ز (10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 10 مم مجكل2, 50 مم كلوريد الصوديوم ، 0.1 مغ/مل جيش صرب البوسنة).
    ملاحظة: والبلازميدات جميع متاحة بناء على طلب صاحب البلاغ المقابلة. Bpi أنا ما يعادل Bbs أنا.
  3. فصل المنتجات بكر والهضم بالتفريد في 1% [اغروس] هلام في تاي المخزن المؤقت (40 مم تريس، 20 ملم حمض الخليك، يدتا 1 مم، الرقم الهيدروجيني 7.2). وصمة عار للهلام لمدة 15 دقيقة قبل المصافحة في 200 مل من 0.5 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد. تصور الحمض النووي باستخدام ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية وقطع العصابات تناظر كدنا تضخيم و Bpi يهضم أنا بلازميد (2046 bp) باستخدام شفرة المبضع.
    ملاحظة: Bpi وأنا هضم بليلفد بزب تطلق أيضا منتج شركة بريتيش بتروليوم 528 المقابلة للمراسل لاكز الأزرق والأبيض.
  4. الوت السلطات الوطنية المعينة من الشظايا جل استخدام أعمدة السليكا هلام (جل الحمض النووي استعادة كيت في الجدول للمواد)، وقياس تركيز الحمض النووي عن طريق التحليل سبيكتروفوتوميتريك.
  5. قم بإعداد رد فعل الجمعية جيبسون استخدام كدنا تضخيم وبلازميد هضمها. استخدام فائض مولى 3-fold في مقابل إدراج مكافحة ناقلات20. احتضانها ح 1 عند 50 درجة مئوية وتنقية نواتج التفاعل باستخدام عمود هلام السليكا (الحمض النووي نظيفة ومركزات كيت في الجدول للمواد).
  6. استخدام المنتجات النقية من رد فعل الجمعية جيبسون إلى اليكتروبوراتي المختصة كولاي DH5α الخلايا. استخدام الترعة انهانسر 1 ملم، يتم تطبيق الإعدادات التالية: 1500 V و 5 السيدة إينكوباتي ح 1 في 37 درجة مئوية في مرق سوبر الأمثل مع القمع كاتابوليتي (شركة نفط الجنوب؛ تريبتوني 20 غرام/لتر، استخراج الخميرة 5 غرام/لتر، 0.5 غرام/لتر كلوريد الصوديوم، 2.5 مم بوكل، 10 مم مجكل2 ، الجلوكوز 20 ملم، ودرجة الحموضة 7.0) المتوسطة السائل وانتشار ثم إلى بيرتاني لوريا (رطل؛ تريبتوني 10 غرام/لتر، استخراج الخميرة 5 غرام/لتر، 10 غرام/لتر كلوريد الصوديوم) أجار (1.5 ٪) لوحات تحتوي على 50 الأمبيسلّين ميكروغرام/مل.
    1. على الشاشة للمستعمرات المقابلة لتحول كولاي تنتشر الحيوانات المستنسخة التي يرجح أن إدراج insert، 15 دقيقة قبل طلاء الخلايا اليكتروبوراتيد، 30 ميليلتر من 50 ملغ/مل 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-غال) في ديميثيلفورماميدي. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  7. اختيار عدة مستعمرات بيضاء وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في وسائل الإعلام LB السائل. تنقية والبلازميدات استخدام مينيبريب كيت (انظر الجدول للمواد)، وتحليل أحجامها بالتفريد في 1% [اغروس] هلام في تاي المخزن المؤقت.
  8. حدد بلازميد المؤتلف على الأرجح استناداً إلى الهجرة الغرواني الكهربي مقارنة إلى عنصر التحكم بزب بليلفد. تأكيد تسلسل بلازميد المحدد بالتسلسل باستخدام كبسولة تفجير 5 '-ككتتتتكاتاتاتجاجك-3' و 5 '-جاتجكتكجتكاجججججكجاج-3' أن الجناح كاسيت التعبير كله في بزب بليلفد.
    ملاحظة: تذكر أن هذا بلازميد يحتوي على بوليلينكير bp 528 مع علامة لاكز الذي يتم استبداله بكدنا للفائدة. تعيين قيود قد تساعد على تحديد والبلازميدات حق المؤتلف.

2-الجيش الملكي النيبالي التعبير

  1. اليكتروبوراتي Co (انظر الشروط في 1.6) المحدد كولاي سلالة (BL21كولاي أو مشتق BL21) مع بليلفد-بزب-مشتق يحتوي على كدنا المقابلة للجيش الملكي النيبالي للفائدة وبلازميد p15LtRnlSm للتعبير عن المشاركة باذنجان الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى. استخدام كولاي HT115(DE3)، الذي يفتقر إلى "الثالث رناسي"21، للتعبير عن الكشف مع مناطق طويلة مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل.
    ملاحظة: كلا الجيش الملكي النيبالي للفائدة وليجاسي الحمض الريبي النووي النقال مرناً يتم نسخها من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي كولاي . مطلوب لا ليسوجين DE3 للتعبير عن T7 رنا بوليميراز في سلالة كولاي ، على الرغم من وجود هذا ليسوجين له أي آثار ضارة.
  2. بعد ح 1 الحضانة عند 37 درجة مئوية في المتوسط السائل شركة نفط الجنوب، لوحة البكتيريا اليكتروبوراتيد في رطل المتوسطة الصلبة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين و 34 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  3. اختيار مستعمرة وتطعيم 1 ل حير قارورة Erlenmeyer مع 250 مل من سائل مرق رائع (السل) متوسطة (تريبتوني 12 غرام/لتر، 24 غرام/لتر الخميرة 0.72 م ك2مكتب البراءات الهنغاري4، 0.17 م خ2ص4، استخراج ووالغليسيرول 0.4 في المائة)، التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين و 34 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي في 180 الثورات في الدقيقة الواحدة (لفة في الدقيقة). حصاد البكتيريا بين 12 و 16 ساعة بعد التطعيم الثقافة.

3-الجيش الملكي النيبالي استخراج وتنقية

  1. لأغراض التحليل، تأخذ 2 مل مختبرين للثقافة في نقاط الوقت المطلوب والطرد المركزي في 14,000 س ز 2 دقيقة تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 مم يدتا تريس-HCl و pH 8.0 ملم 1) قبل فورتيكسينج.
    1. إضافة مجلد واحد (50 ميليلتر) 1:1 (v/v) مزيج من الفينول (المشبعة بالماء واكويليبراتيد على درجة الحموضة 8.0 مع تريس-HCl، pH 8.0) الكلوروفورم. كسر الخلايا من فورتيكسينج قوية وفصل مراحل مائي والعضوية بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق في س 14,000 ز.
    2. استعادة مراحل مائي (العليا) التي تحتوي على الحمض النووي الريبي البكتيرية مجموع بعناية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الأعمال التحضيرية في-20 درجة مئوية للتحليل اللاحق.
  2. لأغراض التحضير، من أجل الثقافة إلى 250 مل زجاجة أجهزة الطرد المركزي وزيادة ونقصان لأسفل الخلايا في س 14,000 ز للمادة 10 دقيقة تجاهل طافية. تغسل الخلايا التي ريسوسبيندينج في 30 مل الماء. نقل إلى أنبوب الطرد مركزي وتدور أسفل الخلايا مرة أخرى تحت نفس الظروف.
  3. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 10 مل من المخزن المؤقت اللوني (50 مم تريس-HCl، الرقم الهيدروجيني 6.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، يدتا 0.2 مم) قبل فورتيكسينج.
    ملاحظة: وفي هذا الوقت، يمكن تجميد الخلايا في-20 درجة مئوية المضي قدما في تنقية في أي لحظة أخرى.
  4. استخدام إعداد بكتيرية طازجة أو المذابة، كسر الخلايا بإضافة المجلد 1 (10 مل) من الفينول: كلوروفورم (راجع الخطوة رقم 3.2) وفورتيكسينج بشدة.
  5. الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 12,000 س زواستعادة المرحلة المائية وإعادة استخراج مع حجم 1 (10 مل) من كلوروفورم نفس الظروف.
    ملاحظة: ويمكن تخزين إعداد الجيش الملكي النيبالي في-20 درجة مئوية في هذه المرحلة.
  6. كذلك تنقية الحمض النووي الريبي البكتيرية مجموع بشاردة-تبادل اللوني. تصفية إعداد الجيش الملكي النيبالي خلال 45 ميكرومتر محقن تصفية والتحميل على عمود 1 مل ديثيليثانولاميني (دي).
    1. لتنقية اللوني، استخدم نظام لوني سائل بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة. قبل تحميل عينة، حجته العمود مع 10 مل من المخزن المؤقت اللوني (راجع الخطوة 3، 3 للتكوين).
    2. تحميل العينة وتغسل العمود مع 10 مل من المخزن المؤقت اللوني. الوت الجيش الملكي النيبالي مع 20 مل من شطف المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCl، الرقم الهيدروجيني 6.5، 1 م كلوريد الصوديوم، 0.2 مم يدتا) وجمع مختبرين 1 مل.
      ملاحظة: التيس الجيش الملكي النيبالي بسرعة في كسور الأولية. يمكن إعادة استخدامها لزيادة تنقية العمود. لهذا، أغسل العمود مع 10 مل مياه وتخزينها في 4 درجات مئوية في الإيثانول 20%.
  7. منذ جزءا رئيسيا من المؤتلف الحمض النووي الريبي يتراكم في كولاي في شكل دائري، يمكن استفادت هذه الخاصية لتنقية لتجانس12. فصل الكشف دائرية من نظرائهم الخطي بالأبعاد polyacrylamide هلام التفريد (2D صفحة) يجمع بين غير يشوه ويشوه (م 8 اليوريا) شروط12،22.

4. تحليل الحمض النووي الريبي

  1. تحضير هلام polyacrylamide 5% (أكريلاميدي 37.5:1:ن، ن '-ميثيلينيبيساكريلاميدي، نسبة الشامل) في TBE العازلة (مم 89 تريس، 89 مم الماء المقطر يدتا 2 مم) التي تحتوي على 8 أمتار اليوريا.
  2. ميكس 20 ميليلتر من استعدادات الجيش الملكي النيبالي بحجم 1 (20 ميليلتر) تحميل المخزن المؤقت (ميثلامين 98% 10 ملم تريس-HCl، pH 8.0، 1 مم يدتا، 0.0025% بروموفينول الأزرق وزايلين زيلين نفط 0.0025%)، احتضانها لدقيقة 1.5 عند 95 درجة مئوية في كتلة تدفئة، والتقط باردة على الجليد.
  3. تحميل العينات في جل polyacrylamide وتشغيل التفريد في الظروف المناسبة استناداً إلى أبعاد هلام (مثلاً، تشغيل 140 × 130 × 2 مم الهلام ح 2.5 في 200 V). وصمة عار للهلام لمدة 15 دقيقة في 0.5 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد ويغسل بالماء، وتصور الجيش الملكي النيبالي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لإنتاج المؤتلف الحمض النووي الريبي في كولاي استخدام نظام المستمدة من الفد12، هو المطعمة الجيش الملكي النيبالي للفائدة إلى سقالة "رنا الفد". هذا الجيش الملكي النيبالي تشيميريك أعرب عن المشاركة على طول ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان في كولاي. حالما تتم معالجتها والمشقوق وسيركولاريزيد، تشيميريك دائرية الجيش الملكي النيبالي، الذي يبرز الجيش الملكي النيبالي للفائدة، يرجح أن يشكل ribonucleoprotein معقدة مع الإنزيم الباذنجان أعرب المشترك الذي يصل إلى تركيز ملحوظ في الخلايا البكتيرية ( الشكل 1). ونتيجة لذلك، الخطوة الأولى لإنتاج المؤتلف الحمض النووي الريبي باستخدام هذا النظام يتألف من إدراج كدنا المقابلة للجيش الملكي النيبالي للفائدة في موضع معين في كدنا الفد، T245-T246 في متغير سلسلة الفد AJ536613. بلازميد بليلفد بزب، الذي يحتوي بوليلينكير في هذا الموقف مع اثنين Bpi أنا الاعتراف بالمواقع وجين الأزرق/الأبيض علامة لاكز، يسهل هذا الإدراج جيبسون الجمعية أسلوب فعال جداً20. التحديد من تحول كولاي استنساخ يتضمن يسر والبلازميدات المؤتلف المطلوب فحص ماركر لاكز أبيض وأزرق. والبلازميدات فيه مزدوجة Bpi أنا الهضم غير كاملة ولا يمكن أن تتضمن المستعمرات إدراج المنتجات المحتمل الأزرق حضور X-غال. ويبين الشكل 2 تحليل الغرواني الكهربي لعدة والبلازميدات التوليفية التي أدرجت كدناس مختلفة. وتظهر هذه البلازميدات هجرات مختلفة عند مقارنة بزب بليلفد. علما أن بليلفد-بزب يحتوي على علامة لاكز (528 bp) التي يتم استبداله كدنا المقابلة للجيش الملكي النيبالي للفائدة. لذا، على الرغم من أن هذا يعتمد على حجم كدنا المدرج، عادة ما يهاجر والبلازميدات المؤتلف أسرع من بلازميد التحكم (الشكل 2).

يتم استخدام بليلفد-بزب-المشتقات التي تحتوي على كدناس المقابلة للكشف للفائدة على طول p15LtRnlSm لشركة-اليكتروبوراتي كولاي. يتم تحديد البكتيريا تحول المشترك على لوحات تتضمن الأمبيسلّين والكلورامفينيكول. ثم قم بتحديد كولاي استنساخ تزرع في 37 درجة مئوية مع الانفعالات قوية في المتوسط السل الغنية. في ظل هذه الظروف الثقافة، مكبر إنتاج المؤتلف الجيش الملكي النيبالي12. يمكن رصد وجود الجيش الملكي النيبالي المؤتلف في البكتيريا بسهولة عن طريق كسر الخلايا مع مزيج من الفينول كلوروفورم حضور المخزن مؤقت وتحليل الحمض النووي الريبي، أي الأقسام الموجودة في المخزن المؤقت مائي، قبل يشوه الصفحة. إظهار الرقم 3 اثيديوم بروميد الملون polyacrylamide المواد الهلامية في فيها الكشف التام من مختلف كولاي فصلت الحيوانات المستنسخة. وتظهر الصور العصابات القوية التي تتوافق مع الفد فارغة وأشكال الفد تشيميريك التي تم إدراجها في الكشف المختلفة ذات الاهتمام. من المثير للاهتمام أننا نجد جزءا رئيسيا من الجيش الملكي النيبالي المؤتلف كشكل دائري. باستخدام مزيج من صفحتين تحت ظروف يشوه قوام الأيونية العالية والمنخفضة، تدوير الكسر الرئيسي من المؤتلف الحمض النووي الريبي ويمكن بسهولة ملاحظة (الشكل 4).

اعتماداً على التطبيق المصب، مجموع كولاي الحمض النووي الريبي إعداد يحتوي على تشيميريك الفد-الجيش الملكي النيبالي للفائدة قد يكون هدف البروتوكول الحالي. ومع ذلك، عند الحاجة، إعداد الجيش الملكي النيبالي يمكن يكون كذلك تنقية اللوني شاردة-تبادل. ويبين تشروماتوجرام في الشكل 5 الاحتفاظ كولاي الجيش الملكي النيبالي على عمود في انخفاض القوة الأيونية (150 مم كلوريد الصوديوم) وشطف اللاحقة بكفاءة في عالية القوة الأيونية (من كلوريد الصوديوم م 1). يتم جمع معظم الجيش الملكي النيبالي في الكسور 2 و 3. لتنقية الجيش الملكي النيبالي المؤتلف إلى التجانس، دائرية يمكن الاستفادة. يتم تأخير الكشف التعميم فيما يتعلق بنظرائهم الخطي في معرفة ظروف22. يمكن التيد هذه الكشف من الجل بعد اثيديوم بروميد تلطيخ. استخدام هلام بولياكريلاميدي سولوبيليزابل، مثل تلك تصميمهما مع ن، ن '-مكررا (أكريلويل) سيستاميني23، يسهل تنقية كميات كبيرة من الكشف المؤتلف (الشكل 6).

Figure 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للنظام القائم على فرويد لإنتاج الحمض النووي الريبي المؤتلف في القولونية. كدنا المقابلة للجيش الملكي النيبالي للفائدة (98 nt طوله الجيش الملكي النيبالي ابتمر السبانخ في المخطط) ويتم إدراج بلازميد بليلفد-بزب. كولاي تحول يشترك مع p15LtRnlSm بليلفد-بزب-المشتقة وبلازميد لﻹعراب الباذنجان الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى المشترك. كولاي فينسخة "الحمض النووي الريبي" الفد-السبانخ تشيميريك ملصوق ذاتيا (رؤوس حمراء) قبل ribozymes المطرقة فرويد. الاعتراف بواسطة ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال المشترك أعرب مونومر الناتجة وسيركولاريزيد. الجيش الملكي النيبالي المؤتلف يتكون من السقالة فرويد التعميم الذي يبرز الجيش الملكي النيبالي للفائدة (باللون الأخضر). تراكم من الجيش الملكي النيبالي المؤتلف بكميات كبيرة في كولاي المحتمل نتيجة لاستقرار ribonucleoprotein المعقدة مع ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال. بالإضافة إلى الانقسام كدنا الفد، بليلفد-بزب بلازميد يحتوي على مصدر النسخ متماثل pUC (pUC أوري)، جينات تحديد الأمبيسلّين (أمبيرR) والمروج كولاي مورين بروتين دهني (الطب الخاص المحدود) والمنهي الرنا الريباسي (ررنك) ولاكز علامة. P15LtRnlSm بلازميد يحتوي على مصدر النسخ متماثل p15A (أوري p15A) وجينات مقاومة كلورامفينيكول (CmR) والمروج كولاي الطب الخاص المحدود وفاصل بالعاثية T7 نسخ، بالإضافة إلى كدنا ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحليل الغرواني الكهربي والبلازميدات التعبير المستمدة من بزب بليلفد التي تحتوي على كدناس مختلفة للفائدة- تم فصل والبلازميدات التفريد في 1% [اغروس] هلام التي كانت ملطخة اثيديوم بروميد. لين 1، علامة الحمض النووي مع أحجام في kbp بعض المكونات على اليسار؛ لين 2، بليلفد-بزب؛ لين 3، مشتقات بليلفد-بزب للتعبير عن الفد فارغة؛ الممرات 4 إلى 7، مشتقات بليلفد-بزب للتعبير عن ابتمر الجيش الملكي النيبالي السبانخ (لين 4)، ابتمر ملزمة ستريبتافيدين (ممر 5)، دبوس الجيش الملكي النيبالي مع متجاورة 42 منطقة مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل bp (لين 6)، و 3 ' الترجمة المستقلة كاب محسن (CITE) نبات الفيروسات (لين 7). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تنتج المؤتلف الحمض النووي الريبي في كولاي استخدام النظام القائم على فرويد. "الكشف التام" من مختلف كولاي استخرجت استنساخ قبل المعاملة بالفينول: كلوروفورم ومختبرين مفصولة يشوه الصفحة. يتم إظهار الهلام الملون مع اثيديوم بروميد. وأنتجت الكشف المؤتلف في BL21(DE3) كولاي (أ) و (ب) HT115(DE3). (أ و ب) 1 الممرات، علامة الجيش الملكي النيبالي مع أحجام في nt على اليسار؛ الممرات 2، الكشف عن استنساخ كولاي للتعبير عن الفد فارغة (333 nt). تشكل الممرات (A) 3 و 4، الكشف عن استنساخ كولاي للتعبير عن الفد تشيميريك التي تحتوي على ابتمر السبانخ (98 nt) وابتمر ملزمة ستريبتافيدين (42 nt)، على التوالي. (ب) لين 3، الكشف من كولاي استنساخ للتعبير عن نموذج الفد تشيميريك يحتوي على 42 bp طوله رنا تقطعت بهم السبل مزدوجة. الأسهم الحمراء تشير إلى الكشف المؤتلف دائرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تدوير للجيش الملكي النيبالي المؤتلف المنتجة في كولاي استخدام النظام القائم على فرويد. "مجموع الكشف" من استنساخ كولاي للتعبير عن الفد تشيميريك الذي يحتوي على ابتمر السبانخ كانت مفصولة 2D يشوه الصفحة الأولى تحت عالية، ومن ثم تحت منخفضة القوة الأيونية. كانت ملطخة الجل اثيديوم بروميد. الأسهم الزرقاء تشير إلى اتجاهات الهجرة الغرواني الكهربي. يشير السهم الأحمر إلى التعميم الفد-السبانخ التي يتأخر بشكل انتقائي من نظرائها الخطي من نفس الحجم خلال فصل اثنين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: تنتج الكروماتوغرافي تنقية المؤتلف الحمض النووي الريبي في كولاي استخدام النظام القائم على فرويد. "الكشف التام" من استنساخ كولاي التي تنتج من تشيميريك الفد-3 ' CITE (55 nt) حملت على عمود كروماتوغرافيا دي التي تم غسلها حضور 150 مم كلوريد الصوديوم. وكان الوتيد الحمض النووي الريبي حضور 1 م كلوريد الصوديوم. ويبين chromatogram امتصاص 254 نانومتر (الخط الأزرق) والتوصيل في mS/سم (خط برتقالي) مقابل وحدة التخزين. يتم الإشارة إلى الخطوات المختلفة للفصل الكروماتوغرافي (تجديد الموازنة، حقن، والمياه والصرف الصحي، وشطف والعمود). يتم أيضا الإشارة إلى الكسور التي تم جمعها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6: تنقية للتجانس المؤتلف الحمض النووي الريبي المنتجة في كولاي استخدام النظام القائم على فرويد. "الكشف التام" من استنساخ كولاي التي تنتج من تشيميريك الفد-3 ' CITE تنقيتها أولاً اللوني باستخدام عمود دي-سيفاروسي وثم مفصولة بصفحة 2D. تم تشغيل جل الأولى تحت يشوه الشروط (م 8 اليوريا، المخزن المؤقت TBE). بعد تلطيخ مع اثيديوم بروميد، نقلت الفرقة جل يحتوي على شكل دائري من الجيش الملكي النيبالي المؤتلف إلى الجزء العلوي من جل الثانية التي تم تشغيلها بشرط عدم يشوه (المخزن المؤقت تاي). الاكريلاميد جل الثانية تم cross-linked مع ن، ن '-مكررا (أكريلويل) سيستاميني، مما أتاح solubilization الجزء جل يحتوي على الجيش الملكي النيبالي المؤتلف نقية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أثناء البحث في تسلسل الفد ومتطلبات بنية المشاركة في الاعتراف بواسطة ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان، لاحظنا أن التعبير المشترك كل الجزيئات في غير المضيفة كولاي التي أدت إلى تراكم فرويد دائرية كبيرة غير متوقعة أشكال في الخلايا البكتيرية19. أننا فهمنا أن تراكم كبير فرويد الجيش الملكي النيبالي في كولاي كان على الأرجح نتيجة للمشترك معربا عن جزيء الحمض النووي الريبي مستقرة جداً، مثل الصغيرة نسبيا (333 nt)، والغاية أساس-إقران، فرويد دائرية، وبروتين لهذا يعرض فرويد خاصة تقارب عالية. يجب أن تجند "الجيش الملكي النيبالي الفد" ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال المضيف للتوسط لها على أثناء النسخ المتماثل في النباتات المصابة17. على الرغم من أن ليس لدينا تأكيد التجريبية، ونحن نتوقع أن كلا جزيئات شكل ribonucleoprotein معقدة في كولاي التي تزيد من استقرار فرويد الجيش الملكي النيبالي ويتيح التوصل إلى تركيز ملحوظ من 150 ملغ للتر الواحد من البكتيريا ثقافة عالية يتجاوز تلك للكشف الذاتية، مثل ررناس12. نظراً لعدم تكرار الفد في كولاي، نحن مسبب أن الإدراج الحمض النووي الريبي مغايرة لن هائلة تؤثر على تراكم الحمض النووي الريبي المستمدة من فرويد، وفي الواقع، أن الأمر كذلك. وهذه الملاحظة هو الأساس للأسلوب لإنتاج كميات كبيرة من المؤتلف الحمض النووي الريبي في كولاي أن يصف لنا هنا. يستخدم الأسلوب جزيء الحمض النووي الريبي دائرية من الفد سقالة التي يرد الجيش الملكي النيبالي للفائدة. لإنتاج سقالة الفد تعميم في كولاي، نحن بحاجة إلى التعبير عن مقدمة الجيش الملكي النيبالي مع المجال المكررة من رايبوزيم المطرقة فرويد. Ribozymes الفد الذاتي تنشق كفاءة عالية في كولاي ومعترف بها وسيركولاريزيد من ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال المشترك أعرب مونومرات فرويد الناتجة. التعبير المشارك من ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال سمة رئيسية للنظام. يتم الكشف عن "الحمض النووي الريبي الفد" يكاد في كولاي ما لم يكن هذا الإنزيم خاص أعرب شارك12.

لدينا البروتوكول، يسمح بلازميد بليلفد-بزب لإدراج كدنا المقابلة للجيش الملكي النيبالي اهتمام الجمعية جيبسون بسيطة وفعالة بين المواقف U245 و U246 الفد. ويناظر هذا الموقع حلقة المحطة الطرفية من دبوس طويل هذا في أغلب الظن الفد تكيف24،25. يجب تشجيع الإدراج في هذا الموقف خاصة أن الجيش الملكي النيبالي لمصلحة يبرز من السقالة مستقرة جداً التي شكلتها الفد ويجب تجنب تفاعل إينتراموليكولار بين الجيش الملكي النيبالي للفائدة والفد (الشكل 1). ونحن لم تستكشف أثر إدراج الجيش الملكي النيبالي للفائدة في مواقع بديلة للجزيء الفد. P15LtRnlSm بلازميد يتيح التعبير المشارك من ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان. الكشف يتم نسخها في كلا والبلازميدات تحت سيطرة قوية التأسيسي كولاي المروج، هما مورين بروتين دهني (الطب الخاص المحدود). وهذا يجعل النظام التأسيسي مع عدم وجود حاجة للاستقراء. ومع ذلك، نحن أيضا بناء بلازميد مماثلة (p15tRnlSm) للتعبير عن ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال تحت سيطرة بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 بالعاثية بنظام إيندوسيبلي (إيبتج) β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي الأيزوبروبيل. استخدام هذا بلازميد، تراكم من الجيش الملكي النيبالي المؤتلف يحدث فقط بعد التعريفي للحمض الريبي النووي النقال ليجاسى التعبير عن طريق إضافة إيبتج12. في النظام الحالي، يعبر عن الجيش الملكي النيبالي للفائدة من بلازميد رقم نسخة عالية مع النسخ المتماثل pUC المنشأ، بينما يتم التعبير عن ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال من بلازميد رقم نسخة معتدلة مع النسخ المتماثل p15A الأصل. ما إذا كان تغيير عدد النسخ يحسن كلا والبلازميدات المشتركين في النظام تراكم المؤتلف الحمض النووي الريبي لم تستكشف حتى الآن. حجم مجموعة من الجيش الملكي النيبالي للفائدة واعترف بأن النظام لم يكن بصورة منهجية التحقيق أما، على الرغم من أن الكشف الصغيرة من المتوقع منطقياً أن تتراكم وتصل إلى تركيزات أعلى من أكبر منها.

أحد الأسباب لماذا إنتاج الحمض النووي الريبي المجراة في المؤتلف ليس من السهل على الأرجح بسبب نصف انخفاض جوهري من جزيئات الحمض النووي الريبي. نظامنا ليس غريبا على هذه المشكلة. في الواقع، أواخر كولاي تنمو المرحلة، يبدأ تراكم المؤتلف الحمض النووي الريبي إنقاص لتختفي تقريبا12. هذا يفرض أحد على إيجاد الإطار الصحيح لحصاد الخلايا. لاحظنا، على الرغم من أن هذا الإطار كبيرة بما يكفي لجعل النظام ودية. ومع ذلك، لاحظنا أيضا أن الإطار الأمثل يعتمد على العديد من العوامل بما في ذلك صفة خاصة كولاي سلالة، الثقافة المتوسطة، تزايد الشروط (التحريض، وحجم قارورة، بث، إلخ.) والمرحلة الفسيولوجية للبكتيريا يستخدم لبدء ثقافة السائل. نحن نوصي ببدء إنتاج الحمض النووي الريبي المؤتلف استخدام الطازجة كولاي المستعمرات من صفيحة تلقيح في اليوم السابق، ونمت في 37 درجة مئوية. تخزين لوحات في الثلاجة يجعل نافذة الحصاد أكثر لا يمكن التنبؤ بها. حصلنا على نتائج أكثر اتساقا بالثقافات السائل بدءاً من البكتيريا التي التقطت من صفيحة مع مسواك. استخدام ثقافة ما قبل السائل، ولا سيما إذا كانت مشبعة، يدفع أيضا إلى تقلب في البروتوكول الإنتاج.

فيما يتعلق بتنقية، معاملة الخلايا البكتيرية مع الفينول: كلوروفورم هو طريقة فعالة جداً لكسر الخلايا ويسمح لاسترداد رنا البكتيرية مجموع الكمية في المرحلة مائي. اعتماداً على التطبيق المصب من المؤتلف الحمض النووي الريبي، هذه المرحلة مائي أو الإعداد التي تنتج من عجل الجيش الملكي النيبالي من هذه المرحلة المائية مع الكحول قد يكون كافياً. إذا كان المزيد من تنقية، نوصي شاردة-تبادل اللوني باستخدام عمود صرف شاردة دي (الشكل 5). تسمح هذه الخطوة تنقية كفاءة إزالة الحمض النووي والجرثومي من الأيض أيضا تقسيمه إلى مرحلة مائي. إذا تطلب التطبيق الأمامية للجيش الملكي النيبالي المؤتلف تنقية للتجانس، يوفر نظام المستمدة من فرويد ميزة واضحة عند مقارنة بالأساليب الأخرى. حيث يتم إنتاج جزء الرئيسي للجيش الملكي النيبالي المؤتلف كشكل دائري، يمكن اتخاذ الاستفادة من هذه الخاصية لفصلها من الجزء الأكبر الكشف البكتيرية. الكشف دائرية تواجه تأخيراً في الهجرة الغرواني الكهربي في يشوه الظروف فيما يتعلق بنظرائها الخطي من الحجم نفسه22. هذا التأخير هو أكثر وضوحاً عند الجيش الملكي النيبالي هو اليكتروفوريسيد تحت القوة الأيونية أقل. في الممارسة العملية، التعميم يمكن الكشف كما تم مفصولة بالصفحة يشوه ثنائية الأبعاد تحت عالية ومنخفضة القوة الأيونية (الشكل 4). بعد فصل الغرواني الكهربي، يجب أن التيد الجيش الملكي النيبالي المؤتلف من الجل. استخدام كروسلينكير عكسها اكريلاميد، مثل ن، ن '-مكررا (أكريلويل) سيستاميني23، يسهل الانتعاش، ولا سيما عند تنقية كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي (الشكل 6). وأخيراً، إذا كان التطبيق الأمامية للجيش الملكي النيبالي المنتجة تطالب بالفصل بين الجيش الملكي النيبالي للفائدة من السقالة فرويد، لدينا بروتوكول لا تقدم أي ميزة خاصة للأساليب السابقة. الجيش الملكي النيبالي لمصلحة يجب أن تكون اقتطعت من جزيء تشيميريك استخدام بعض الاستراتيجيات التي سبق وصفها، مثل استخدام ريبوزيميس، دنازيميس، أو استخدام "ح رناسي" ربما الأكثر كفاءة، وتسترشد النوكليوتيد الحمض النووي هما7. في محاولة لتجنب هذه الخطوة الأخيرة في تنقية مرهقة، وقد عملنا في محاولة لتقليل حجم سقالة فرويد، على الرغم من أن بنجاح جزئي. كنا قادرين على إنتاج كميات ملحوظة من المؤتلف الحمض النووي الريبي باستخدام أشكال فرويد حذف (175 و 215 و 246 nt) ولكن زيادة العناصر المحذوفة السقالة فرويد يرتبط بتقليل تراكم12.

وخلاصة القول، هنا يرد بروتوكول إنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في كولاي التي، على حد علمنا، يحسن عائد أساليب المنشورة سابقا. يقوم البروتوكول للمشارك التعبير كولاي من الجيش الملكي النيبالي من الفائدة إدراجها في سقالة فرويد (الفد) وليجاسي الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان، الإنزيم الذي سيركولاريزيس هذا فرويد في النباتات المصابة. سمة مميزة لأن البروتوكول هو المؤتلف أن الجيش الملكي النيبالي هو ينتج أساسا كشكل دائري، خاصية التي يسهل تنقية للتجانس للتطبيقات المتلقين للمعلومات. باستخدام هذا البروتوكول عشرات من ملليغرام من المؤتلف الحمض النووي الريبي يمكن أن تنتج بسهولة للتر الواحد للثقافة كولاي في الظروف المختبرية العادية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن التكنولوجيا المبينة في هذا البروتوكول كان براءة اختراع (الولايات المتحدة للبراءات رقم EP14382177.5 PCT/EP2015/060912).

Acknowledgments

أيد هذا العمل منح BIO2017-83184 آر واكسب-BIO2017-91865 من وزارة العلوم دي الإسبانية, Innovación y جامعات (FEDER صناديق التمويل المشترك).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F530S
Bpi I Thermo Scientific ER1011
Agarose Conda 8010 D1 low EEO
Tris PanReac AppliChem A1086,1000
Acetic acid PanReac AppliChem 131008.1214
EDTA Sigma-Aldrich E5134-500G
Ethidium bromide PanReac AppliChem A1152,0025 1%
Zymoclean Gel DNA Recovery Zymo Research D4001
NanoDrop ThermoFisher Scientific ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England BioLabs E2621S
DNA Clean & Concentrator Zymo Research D4003
Eporator Eppendorf 4309000019
Escherichia coli DH5α Invitrogen 18265-017
Tryptone Intron Biotechnology Ba2014
Yeast extract Intron Biotechnology 48045
NaCl PanReac AppliChem 131659.1211
Agar Intron Biotechnology 25999
Ampicillin PanReac AppliChem A0839,0010
X-gal Duchefa X1402.1000
N,N-Dimethylformamide PanReac AppliChem 131785.1611
NucloSpin Plasmid Macherey-Nagel 22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3) Novagen 69387-3
Escherichia coli HT115(DE3) Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol Duchefa C 0113.0025
Glycerol PanReac AppliChem 122329.1211 87%
KH2PO4 PanReac AppliChem 131509.1210
K2HPO4 PanReac AppliChem 122333.1211
HCl PanReac AppliChem 131020.1211
Phenol Scharlau FE04791000 90%
Chloroform PanReac AppliChem A3691,1000
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column GE Healthcare Life Sciences 17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system GE Healthcare Life Sciences 11001313
Acrylamyde PanReac AppliChem A1089,1000 2K
N,N’-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich M7279-100G
Urea PanReac AppliChem 146392.1211
Boric acid PanReac AppliChem A2940,1000
Formamide PanReac AppliChem A0937,2500
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026-5G
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine Sigma-Aldrich A4929-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
  2. Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
  3. Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise? Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
  4. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4 (2017).
  5. Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
  6. Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).
  7. Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
  8. Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
  9. El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
  10. Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).
  11. Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
  12. Daròs, J. -A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).
  13. Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , Springer International Publishing Switzerland. 295-322 (2016).
  14. Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
  15. Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
  16. Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
  17. Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
  18. Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
  19. Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  21. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  22. Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
  23. Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
  24. Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
  25. López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 141، المؤتلف الحمض النووي الريبي، والتعميم الحمض النووي الريبي، فرويد، ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال، والجيش الملكي النيبالي ابتمر، الإشريكيّة القولونية
الإنتاج الواسع النطاق للكشف المؤتلف في سقالة دائرية باستخدام نظام المستمدة من فرويد في <em>الإشريكيّة القولونية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cordero, T., Aragonés, V.,… More

Cordero, T., Aragonés, V., Daròs, J. A. Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (141), e58472, doi:10.3791/58472 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter