Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Storskalig produktion av rekombinant RNAs på en cirkulär byggnadsställning Viroid-härledda System med i Escherichia coli

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58472
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universitat Politècnica de València, Spain

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att producera stora mängder rekombinant RNA i Escherichia coli genom samtidig uttrycker en chimär RNA som innehåller RNA intresse en viroid byggnadsställning och en växt tRNA ligase. Den viktigaste produkten är en cirkulär molekyl som underlättar rening till homogenitet.

Abstract

Med ökande intresse för RNA-biologi och användning av RNA-molekyler i sofistikerade biotekniska tillämpningar, är metoder att producera stora mängder rekombinant RNAs begränsad. Här beskriver vi ett protokoll för att producera stora mängder rekombinant RNA i Escherichia coli baserat på samtidig uttryck för en chimär molekyl som innehåller RNA intresse en viroid byggnadsställning och en växt tRNA ligase. Viroider är relativt små, icke-kodande, mycket bas-parat cirkulär RNAs som är smittsamma till högre växter. Mottagande anläggningen tRNA ligase är ett enzym som rekryterats av viroider som tillhör familjen Avsunviroidae, såsom aubergine latent viroid (ELVd), för att medla RNA circularization under viroid replikering. Även om ELVd inte replikeras i E. coli, en ELVd föregångare är effektivt transkriberas av E. coli RNApolymerasen och bearbetas av den inbäddade hammerhead ribozymerna i bakterieceller, och de resulterande monomersna är circularized av den tillsammans uttryckt tRNA ligase når en anmärkningsvärd koncentration. Införandet av en RNA av intresse i ELVd ställningen möjliggör produktion av tiotals milligram rekombinant RNA per liter bakteriekulturen i regelbundna laboratorieförhållanden. En huvudsakliga bråkdel av produktens RNA är cirkulär, en funktion som underlättar rening av rekombinant RNA till virtuella homogenitet. I detta protokoll infogas ett kompletterande DNA (cDNA) motsvarande RNA sevärdheter i en viss position av den ELVd cDNA i ett uttryck plasmiden som används, längs plasmiden tillsammans uttrycka aubergine tRNA ligase, för att omvandla E. coli. Samtidig uttryck av båda molekyler under kontroll av stark konstituerande initiativtagare leder till produktion av stora mängder rekombinant RNA. Rekombinant RNA kan utvinnas från bakteriecellerna och separerade från huvuddelen av bakteriell RNAs utnyttja dess loopkontroll.

Introduction

I motsats till DNA och proteiner är protokoll för lätt, effektiv och kostnadseffektiv produktion av stora mängder RNA inte riklig. Men, forskning och industri efterfrågan ökande mängder av dessa biomolekyler att undersöka deras unika biologiska egenskaper1, eller att vara anställd i sofistikerade biotekniska tillämpningar, inbegripet deras användning som mycket specifika aptamers 2, terapeutiska medel3eller selektiv bekämpningsmedel4. In vitro-transkription och kemisk syntes används ofta i forskning för att producera RNA. Dessa metoder innebär viktiga begränsningar när stora mängder av produkterna som krävs. Logiska alternativet är att använda den endogena transkription maskinen av levande celler, följt av en reningsprocess att separera RNASEN sevärdheter från cellulära följeslagare. Efter denna strategi har metoder utvecklats för att producera rekombinant RNAs i bakterieceller, såsom lab-vänliga Escherichia coli5 eller den marina lila phototrophic alpha-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. de flesta metoder att producera rekombinant RNA i bakterier lita på uttrycket av en infödd mycket stabil RNA byggnadsställning, såsom en tRNA eller en rRNA, där RNA av intresse är isatt7. Detta ställer nödvändigheten av att släppa RNA av intresse ur chimära molekylen, om förekomsten av extra RNA är ett problem för den efterföljande program8. Ett annat begrepp i rekombinant RNA bioteknik är produktionen av rekombinant ribonukleoprotein-komplex som kan vara den önskade produkten i sig. eller används som en skyddande strategi för att öka stabiliteten i RNA av intresse9, 10. Likaså har produktionen av cirkulär RNAs också föreslagits som en strategi för att generera mer stabila produkter11.

Vi har nyligen utvecklat en ny metod för att producera stora mängder rekombinant RNA i E. coli som deltar i tre av ovanstående begrepp: införande av RNA av intresse i en mycket stabil cirkulär RNA byggnadsställning och samtidig uttryck för den rekombinant RNA med en samverkande protein till sannolikt producera en stabil ribonukleoprotein komplex som ackumuleras i anmärkningsvärda mängder i bakteriell celler12. I motsats till tidigare utveckling använde vi en RNA byggnadsställning helt främmande för E. coli, nämligen en viroid. Viroider är en mycket speciell typ av smittämnen av högre växter som uteslutande består av en relativt liten (246-401 nt) mycket bas-parat cirkulär RNA13. Intressant, viroider icke-kodande RNAs och utan någon hjälp från sina egna proteiner, de ska kunna slutföra komplexa smittsamma cykler i den infektera värdar14. Dessa cykler inkludera RNA-till-RNA replikeringen i kärnor eller kloroplaster, beroende på familjen viroid —Pospiviroidae eller Avsunviroidae, respektive — rörelse genom den smittade anläggningen och skatteflykt av värd defensiva svar. Viroider måste rangordnas bland de mest stabila RNAs i naturen, till följd av att en naken cirkulär RNA och med att överleva i den ogästvänliga miljön i anläggningen infekterade celler. Detta boende kan göra viroider särskilt lämplig som ställningar att stabilisera rekombinant RNA i biotekniska metoder. Dessutom, är den nya metoden baserad på Co uttryck för viroid ställningen med ett samverkande växtprotein. Viroider replikera genom en rullande-cirkel mekanism i vilken värd enzymer rekryteras för att katalysera de olika stegen i processen. Särskilt vissa viroider, närmare bestämt de som tillhör familjen Avsunviroidae15, innehåller ribozymerna som också deltar i replikeringen. Beroende på viroid Art medieras transkription av viroid RNAs av värden RNA-polymeras II eller chloroplastic kärn-kodade RNApolymerasen (NEP). Viroid RNA bearbetning verkar vara katalyseras av en värd typ III RNase, även om i viroider med ribozymerna Oligomera RNA klyva intermediärer själv under replikeringen. Slutligen, de resulterande viroid monomersna är circularized, beroende på familjen viroid, genom den värd DNA-ligase 1 eller den chloroplastic isoformen tRNA ligase16,17. Detta sista enzym är involverat i ligering av monomera former av viroider i familjen Avsunviroidae, som aubergine latent viroid (ELVd)18.

I ett arbete att analysera sekvens och strukturella krav i ELVd bestämma erkännande av äggplanta (Solanum melongena L.) tRNA ligase, vi satt upp ett experimentella system baserat på samtidig uttryck av båda molekyler i E. coli 19. vi märkte att längre-än-unit ELVd avskrifter själv klyva effektivt i E. coli celler via den inbäddade hammerhead ribozymerna och att de resulterande viroid monomersna med 5'-hydroxylgruppen och 2', 3'-phosphodiester termini var effektivt circularized av ligase med samtidig uttryckt aubergine i tRNA. Ännu mer, nådde den resulterande cirkulär viroid RNA en oväntat hög koncentration i E. coli, överstiger de av endogena rRNAs12. Avsaknad av replikering intermediärer anges bristande ELVd RNA-till-RNA amplifiering i dessa bakterieceller. Intressant, hade införande av heterologa RNAs i ett visst läge av viroid molekylen en måttlig effekt på ackumulering av cirkulär viroid-derived RNAs12. Dessa observationer fick oss att föreställa sig en metod för att producera stora mängder rekombinant RNAs i bakterier. I denna metod, de cDNAs som motsvarar RNASEN sevärdheter infogas i den ELVd cDNA och den resulterande chimära RNA uttrycks i E. coli genom en stark konstitutiva promotorn. För att systemet ska fungera, måste E. coli omvandlas tillsammans med en plasmid att uttrycka den aubergine tRNA-ligase. ELVd-derived längre-än-enheten utskriften bearbetas av den inbäddade hammerhead ribozymerna och de resulterande monomersna med lämpliga termini är erkänt och circularized av de Co uttryckt tRNA-ligase. Detta sätt sätts RNA av intresse in i en mycket stabil cirkulär byggnadsställning bestående av viroid cirkulär molekylen. Detta rekombinant chimär RNA är troligen ytterligare stabiliseras inne i E. coli cellerna genom bildandet av en komplex genom interaktion med tRNA ligase ribonukleoprotein. Med den här metoden (se protokoll nedan), RNA aptamers, hårnål RNAs och andra strukturerade RNAs har enkelt produceras i mängder på tiotals milligram per liter av E. coli kultur i regelbundna laboratoriemiljö och renas till homogenitet tar Fördelen med loopkontroll12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plasmid konstruktion

  1. Förstärka genom PCR (eller genom omvänd Transkription PCR om start från en RNA-mall) det cDNA som motsvarar RNA av intresse med hjälp av grundfärger med 5' förlängning för att tillåta montering i uttrycket Plasmiden. Undvik oönskade mutationer, använda en HiFi-DNA-polymeras.
    1. Om du vill infoga cDNA i uttrycket plasmiden med Gibson församling20, lägga till följande 5' tillägg till PCR primers: framåt, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; omvänd, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X representerar nukleotider homologa till terminalen ändarna av RNA av intresse.
    2. Inkubera i 30 s vid 98 ° C, följt av 30 cykler av 10 s på 98 ° C, 30 s vid 55 ° C och 30 s vid 72 ° C, och en sista förlängning av 10 minuter vid 72 ° C.
  2. Digest 100 ng av Plasmiden pLELVd-BZB med 10 U av enzymet typ-IIS begränsning Bpi jag för 1 h vid 37 ° C i en 20 µL reaktion i en 0,5 mL tub i buffert G (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl 0,1 mg/mL BSA).
    Obs: Alla plasmider finns tillgängliga på begäran till motsvarande författare. BPI Jag är likvärdigt till Bbs jag.
  3. Separera de PCR och matsmältningen produkterna genom elektrofores i en 1% agarosgel i TAE buffert (40 mM Tris, 20 mM ättiksyra, 1 mM EDTA, pH 7,2). Fläcken gelen under 15 minuter genom att skaka i 200-mL 0.5 µg/mL etidiumbromid. Visualisera DNA med hjälp av en UV-transilluminator och skär banden motsvarar den förstärkta cDNA och Bpi jag-rötas plasmiden (2046 bp) med hjälp av en skalpell blad.
    Obs: BPI Jag nedbrytning av pLELVd-BZB också befriar en 528 bp produkt motsvarar Lindholm blå-vit reportern.
  4. Eluera de utsedda nationella myndigheterna från gel fragment med hjälp av kiselgelkolonner (gel DNA återställningskit i Tabellen av material) och kvantifiera DNA koncentrationen av spektrofotometrisk analys.
  5. Ställa in en Gibson församlingen reaktion med den förstärkta cDNA och smält Plasmiden. Använd en 3-faldig molar överskott av infoga kontra vektor20. Inkubera i 1 h vid 50 ° C och rena reaktionsprodukterna med en kiselgel kolonn (DNA ren & koncentrator kit i Tabellen för material).
  6. Användning av renat produkterna Gibson församlingen reaktion till electroporate behöriga E. coli DH5α celler. Använda 1-mm elektroporation kyvetter, tillämpas följande inställningar: 1.500 V och 5 ms. Inkubera för 1 h vid 37 ° C i super optimerad buljong med catabolite förtryck (SOC; 20 g/L trypton, 5 g/L jästextrakt, 0,5 g/L NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2 20 mM glukos, pH 7,0) flytande medium och sedan sprids till Luria-Bertani (LB; 10 g/L trypton, 5 g/L jästextrakt, 10 g/L NaCl) agar (1,5%) plattor innehållande 50 µg/mL ampicillin.
    1. Skärm för kolonier motsvarar transformerad E. coli sprida kloner som sannolikt införlivade skäret, 15 min innan plätering electroporated cellerna, 30 µL av 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) i dimetylformamid. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C.
  7. Plocka flera vita kolonier och växa över natten vid 37 ° C i flytande LB media. Rena plasmider som använder en miniprep kit (se Tabell av material) och analysera deras storlekar genom elektrofores i en 1% agarosgel i TAE buffert.
  8. Välj den mest sannolikt rekombinant plasmid baserat på elektroforesiska migrationen jämfört med pLELVd-BZB kontroll. Bekräfta sekvensen av valda plasmiden genom sekvensering med grundfärg 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' och 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' som flankerar hela uttrycket kassetten i pLELVd-BZB.
    Obs: Kom ihåg att denna plasmid innehåller en 528 bp polylinker med Lindholm markören som ersätts av cDNA sevärdheter. Begränsning mappning kan hjälpa till att välja rätt rekombinant plasmidsna.

2. RNA uttryck

  1. Co-electroporate (se villkor i 1.6) den valda E. coli stam (E. coli BL21 eller ett BL21 derivat) med pLELVd-BZB-derivatan som innehåller det cDNA som motsvarar RNA av intresse och plasmiden p15LtRnlSm Co uttrycka den äggplanta tRNA ligase. Använda den E. coli HT115(DE3), som saknar RNase III21, för att uttrycka RNAs med långa dubbelsträngat regioner.
    Obs: Båda RNA av intresse och den tRNA-ligase mRNA transkriberas av E. coli RNApolymerasen. Ingen DE3 lysogen till express T7 RNA-polymeras krävs i E. coli stam, även om närvaron av denna lysogen har inga skadliga effekter.
  2. Efter 1 h inkubation vid 37 ° C i SOC flytande medium, tallrik electroporated bakterier i LB fast medium innehållande 50 µg/mL ampicillin och 34 µg/mL kloramfenikol. Inkubera över natten vid 37 ° C.
  3. Plocka en koloni och Inokulera en 1 L snopen Erlenmeyerkolven med 250 mL flytande Terrific buljong (TB) medium (12 HB trypton, 24 g/L jäst extrakt, 0,4% glycerol, 0.17 M KH2PO4och 0,72 M K2HPO4), som innehåller 50 µg/mL ampicillin och 34 µg/mL kloramfenikol. Inkubera vid 37 ° C med kraftig skakning på 180 varv per minut (rpm). Skörda bakterier mellan 12 och 16 h efter kultur inympning.

3. RNA-extraktion och rening

  1. För analysändamål, ta 2 mL alikvoter av kulturen på önskade tidpunkter och centrifugera vid 14 000 x g i 2 min. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 50 µL av TE buffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 och 1 mM EDTA) av vortexa.
    1. Lägga till en volym (50 µL) av en 1:1 (v/v) blandning av fenol (mättad med vatten och jämviktas vid pH 8,0 med Tris-HCl, pH 8,0) och kloroform. Bryta cellerna genom kraftig skakning och separata vattenfasen och den organiska faserna genom centrifugering för 5 min vid 14 000 x g.
    2. Försiktigt återställa aqueous faserna (övre) som innehåller totalt bakteriell RNA.
      Obs: Preparat kan förvaras vid-20 ° C för efterföljande analys.
  2. I förberedande syfte, häll kultur i en 250 mL centrifug flaska och spinn ner cellerna vid 14 000 x g i 10 min. Kassera supernatanten. Tvätta cellerna genom omblandning i 30 mL vatten. Transfer till ett centrifugrör och snurra ner celler igen på samma villkor.
  3. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 mL av kromatografi buffert (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 150 mM NaCl, 0,2 mM EDTA) av vortexa.
    Obs: Vid denna tid, kan celler frysas vid-20 ° C till fortsätta med rening vid något annat tillfälle.
  4. Använder ett färska eller tinade bakteriella preparat, bryta celler genom att lägga till 1 volym (10 mL) fenol: kloroform (se punkt 3.2) och vortexa kraftigt.
  5. Centrifugera i 10 min vid 12 000 x g, återställa vattenfasen och extrahera med 1 volym (10 mL) av kloroform på samma villkor.
    Obs: RNA preparatet kan förvaras vid-20 ° C vid denna punkt.
  6. Ytterligare rena totala bakteriell RNA av anjon-exchange kromatografi. Filtrera fram RNA genom en 45 µm spruta filter och belastningen på en 1 mL diethylethanolamine (DEAE) kolumn.
    1. För kromatografi rening, använda en Vätskekromatografisystem med en flödeshastighet av 1 mL/min. Innan provet lastning, jämvikta kolonnen med 10 mL av kromatografi buffert (se punkt 3.3 för sammansättning).
    2. Fyll på provet och Tvätta kolonnen med 10 mL av kromatografi buffert. Eluera RNA med 20 mL eluering buffert (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 1 M NaCl, 0,2 mM EDTA) och samla 1 mL portioner.
      Obs: Eluerar RNA snabbt i de inledande fraktionerna. Kolumnen kan återanvändas för ytterligare reningar. För detta, Tvätta kolonnen med 10 mL vatten och förvaras vid 4 ° C i 20% etanol.
  7. Eftersom en stor del av den rekombinant RNA ackumuleras i E. coli i en cirkulär form, kan detta boende vara gagnade för rening till homogenitet12. Separata cirkulär RNAs från de linjära motsvarigheterna av tvådimensionella polyakrylamid gelelektrofores (2D sida) att kombinera icke-denaturering och denatureringen (8 M urea) villkor12,22.

4. RNA analys

  1. Förbereda en 5% polyakrylamidgel (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, förhållandet massa) i TBE buffert (89 mM Tris, 89 mM borsyra, 2 mM EDTA) innehållande 8 M urea.
  2. Blanda 20 µL av RNA preparat med 1 volymdel (20 µL) lastning buffert (98% formamid, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,0025% bromophenol blå och 0,0025% xylen cyanol), inkubera i 1,5 min vid 95 ° C i ett värmeblock och fästa cool på is.
  3. Läsa in proverna i Polyakrylamidgelen och köra elektrofores på lämpliga villkor beroende på de gel-dimensionerna (t.ex., köra 140 x 130 x 2 mm geler för 2,5 h på 200 V). Fläcken gelen i 15 min i 0,5 µg/mL etidiumbromid, tvätta med vatten och visualisera RNA under UV-ljus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att producera rekombinant RNA i E. coli använda ELVd-härledda system12, ympas RNA sevärdheter in i en ELVd RNA byggnadsställning. Denna chimär RNA är samtidig uttryckt längs den aubergine tRNA-ligase i E. coli. När behandlat, klyvs och circularized, bildar chimär cirkulär RNA, som sticker ut RNA av intresse, sannolikt ett komplex med samtidig uttryckt aubergine enzymet som når anmärkningsvärda koncentration i bakteriecellerna ( ribonukleoprotein Figur 1). Följaktligen består det första steget att producera rekombinant RNA med hjälp av detta system av att infoga det cDNA som motsvarar RNA av intresse på en viss plats i den ELVd cDNA, T245-T246 i den ELVd sekvens varianten AJ536613. Plasmiden pLELVd-BZB, som innehåller en polylinker på denna position med två Bpi jag erkännande platser och en Lindholm blå/vit markörgen, underlättar detta införande av den mycket effektiva Gibson montering metod20. Urval av omvandlade E. coli kloner som innehåller önskad rekombinant plasmidsna underlättas av blå/vit screening av Lindholm markör. Plasmider som de dubbla Bpi jag matsmältning var ofullständiga och inte kunde införliva infoga sannolikt producera blå kolonierna i närvaro av X-gal. Figur 2 visar den elektroforesiska analysen av flera rekombinant plasmider där olika cDNAs sattes in. Dessa plasmider visar olika flyttningar jämfört med pLELVd-BZB. Observera att pLELVd-BZB innehåller Lindholm markören (528 bp) som ersätts av det cDNA som motsvarar RNA av intresse. Så, även om detta beror på storleken på den infogade cDNA, migrera rekombinant plasmidsna vanligtvis snabbare än kontrollplasmid (figur 2).

PLELVd-BZB-derivat som innehåller den cDNAs som motsvarar RNASEN sevärdheter används längs p15LtRnlSm till co-electroporate E. coli. Tillsammans omformade bakterier väljs på plåtar som innehåller ampicillin och kloramfenikol. Valde sedan, E. coli kloner odlas vid 37 ° C med stark agitation i det rika TB-mediet. Under denna kultur förhållanden maximerad produktionen av den rekombinant DNA RNA är12. Förekomsten av rekombinant RNA i bakterier kan enkelt övervakas genom att bryta cellerna med en blandning av fenol och kloroform i närvaro av en buffert och analysera RNA, vilka partitioner i vattenlösning bufferten, av denaturering sida. Figur 3 Visa etidiumbromid målat polyakrylamidgeler i vilka totala RNAs från olika E. coli kloner skildes. Bilderna visar starka band som motsvarar tomma ELVd och chimära ELVd former där olika RNAs sevärdheter sattes in. Intressant finner vi en stor del av rekombinant RNA som cirkulär form. Med en kombination av två sidor denatureringen villkor på hög och låg jonstyrka, kan loopkontroll för huvudsakliga fraktionen av rekombinant RNA enkelt observeras (figur 4).

Beroende på den efterföljande ansökan, den totala E. coli RNA beredning som innehåller chimära ELVd-RNA av intresse kan vara målet för det aktuella protokollet. Dock när det behövs, kan RNA preparatet ytterligare renas genom anjon-exchange kromatografi. Kromatogrammet i figur 5 visar effektiv lagring av E. coli RNA på kolumn på låg jonstyrka (150 mM NaCl) och efterföljande eluering på hög jonstyrka (1 M NaCl). De flesta av RNA samlas i fraktioner 2 och 3. För att rena rekombinant RNA till homogenitet, kan utnyttja loopkontroll tas. Cirkulär RNAs fördröjs med avseende på deras linjära motsvarigheter i denatureringen villkor22. Dessa RNAs kan vara elueras från gelen efter etidiumbromid bromid färgning. Användning av en solubilizable polyakrylamidgel, såsom de tvärbunden med N, N'-bis (acryloyl) cysteaminklorhydrat23, underlättar rening av stora mängder rekombinant RNAs (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av det viroid-baserat systemet för att producera rekombinant RNA i e. coli. Det cDNA som motsvarar RNA av intresse (de 98 nt långa RNA aptamer spenat i systemet) infogas i plasmiden pLELVd-BZB. E. coli är co omvandlas med den pLELVd-BZB-derivat och plasmiden p15LtRnlSm Co uttrycka aubergine tRNA ligase. I E. coli, chimär ELVd-spenat RNA avskriften är själv klyvs (röda pilspetsar) av den viroid hammerhead ribozymerna. Den resulterande monomeren är erkänd av de Co uttryckt tRNA-ligase och circularized. Rekombinant RNA består av en cirkulär viroid byggnadsställning som sticker RNA av intresse (i grönt). Ansamling av rekombinant RNA till stora belopp i E. coli sannolikt resultat från stabilisering av den komplexa med tRNA ligase ribonukleoprotein. Förutom spliten ELVd cDNA, plasmid pLELVd-BZB innehåller ett pUC replikering ursprung (pUC ori), en ampicillin urval gen (AmpR), E. coli murina lipoprotein (lpp) arrangören och rRNA (rrnC) terminator och Lindholm markör. Plasmiden p15LtRnlSm innehåller ett p15A replikering ursprung (p15A ori), en kloramfenikol motstånd gen (CmR), E. coli lpp arrangören och en fag T7 transkription terminator, förutom den aubergine tRNA ligase cDNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: elektroforetiska analys av pLELVd-BZB-härledda uttryck plasmider som innehåller olika cDNAs av intresse. Plasmider var åtskilda av elektrofores i en 1% agarosgel som var målat med etidiumbromid. Lane 1, DNA-markör med storlekar i kbp av vissa komponenter till vänster; Lane 2, pLELVd-BZB; Lane 3, pLELVd-BZB derivat att uttrycka en tom ELVd; körfält 4 till 7, pLELVd-BZB derivat att uttrycka den RNA aptamer spenat (lane 4), den streptividin bindande aptamer (lane 5), en RNA hårnål med en sammanhängande 42 bp dubbelsträngat region (lane 6) och den 3' cap-oberoende översättning förstärkare (CITE) av en anläggning virus (lane 7). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Rekombinant RNA produceras i E. coli använder viroid-baserade systemet. Totala RNAs från olika E. coli kloner utvanns genom behandling med fenol: kloroform och alikvoter åtskilda av denaturering sida. Geler som färgas med etidiumbromid visas. Rekombinant RNAs producerades i E. coli (A) BL21(DE3) och (B) HT115(DE3). (A och B) körfält 1, RNA markör med storlekar i nt till vänster; körfält 2, RNAs från E. coli kloner att uttrycka en tom ELVd (333 nt). (A) körfält 3 och 4, RNAs från E. coli kloner att uttrycka en chimär ELVd bildar som innehåller aptamer spenat (98 nt) och den streptividin bindande aptamer (42 nt), respektive. (B) Lane 3, RNAs från en E. coli -klon att uttrycka en chimär ELVd formulär som innehåller en 42 bp lång dubbelsträngat RNA. Röda pilarna pekar på cirkulär rekombinant RNASEN. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Loopkontroll av rekombinant RNA produceras i E. coli använder viroid-baserade systemet. Totala RNAs från en E. coli -klon att uttrycka en chimär ELVd som innehåller aptamer spenat var åtskilda av 2D denatureringen sida först under hög och sedan låg jonstyrka. Gelerna var fläckad med etidiumbromid. De blå pilarna indikerar riktningarna elektroforesiska migrationen. Den röda pilen pekar på den cirkulära ELVd-spenat som försenas selektivt från de linjära motsvarigheterna av samma storlek under de två separationerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Kromatografisk rening av ett rekombinant RNA produceras i E. coli använder viroid-baserade systemet. Totala RNAs från en E. coli -klon som producerar en chimär ELVd-3' CITE (55 nt) lastades på en kolumn av DEAE-kromatografi som tvättades i närvaro av 150 mM NaCl. RNA var elueras i närvaro av 1 M NaCl. Kromatogrammet visar absorbansen vid 254 nm (blå linje) och konduktivitet mS/cm (orange linje) jämfört med volym. De olika stegen av kromatografisk separation (Jämviktstiden, injektion, tvätta, eluering och kolumn regenerering) indikeras. Insamlade fraktioner indikeras också. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Rening till homogenitet av ett rekombinant RNA produceras i E. coli använder viroid-baserade systemet. Totala RNAs från en E. coli -klon som producerar en chimär ELVd-3' CITE var först renas genom kromatografi använder en DEAE-Sepharose kolumn och sedan separerade av 2D. Första gel kördes under denatureringen villkor (8 M urea, buffert TBE). Efter färgning med etidiumbromid, överfördes gel bandet som innehåller cirkulär form av rekombinant RNA till toppen av en andra gel som kördes under icke-denatureringen skick (TAE buffert). Akrylamid av andra gel var korslänkad med N, N'-bis (acryloyl) cysteaminklorhydrat, som tillät lösbarhet av gel fragment som innehöll rena rekombinant RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även forskning av ELVd ordningsföljd och struktur krav inblandade i erkännandet av den aubergine tRNA-ligase, märkte vi att samtidig uttryck av båda molekyler i den icke-host E. coli ledde till en oväntat stor ackumulation av viroid cirkulär former i bakterieceller19. Vi förstod att stor ansamling av viroid RNA i E. coli troligen var en följd av samtidig uttrycker en mycket stabil RNA-molekyl, såsom den relativt liten (333 nt), mycket baserat-Parade, cirkulär viroid, och ett protein som den här viss viroid visar hög affinitet. ELVd RNA måste rekrytera den värd tRNA ligase för att medla dess circularization under replikeringen i den smittade anläggning17. Även om vi inte har experimentell bekräftelse, räknar vi med att både molekyler bildar en komplex i E. coli som ytterligare stabiliserar viroid RNA och tillåter att nå anmärkningsvärda koncentrationen av 150 mg per liter av bakteriell ribonukleoprotein kultur som starkt överskrider de av endogena RNAs, såsom rRNAs12. Eftersom ELVd inte replikeras i E. coli, resonerade vi att införandet av ett heterologt RNA inte kommer att dramatiskt påverka ansamling av viroid-derived RNA och, i själva verket så var fallet. Denna observation är grunden i metoden att producera stora mängder rekombinant RNA i E. coli som vi beskriver här. Metoden använder den cirkulära RNA-molekylen ELVd som en byggnadsställning som RNA sevärdheter presenteras. För att producera en cirkulär ELVd byggnadsställning i E. coli, måste vi uttrycka en föregångare RNA med duplicerade domänen för den viroid hammerhead ribozyme. ELVd ribozymerna klyva själv mycket effektivt i E. coli och de resulterande viroid monomersna är erkänt och circularized av de Co uttryckt tRNA-ligase. Samtidig uttrycket för den tRNA-ligase är ett viktigt inslag i systemet. ELVd RNA upptäcks knappt i E. coli om inte detta särskilt enzym är samtidig uttryckt12.

I våra protokoll tillåter plasmid pLELVd-BZB för att infoga det cDNA som motsvarar RNA av intresse av enkel och effektiv Gibson församling mellan positioner U245 och U246 av ELVd. Denna webbplats motsvarar den terminal slingan av en lång hårnål som är närvarande i de mest sannolika ELVd konformation24,25. Införande i denna särskilda ställning måste främja att RNA sevärdheter sticker ut från den mycket stabil byggnadsställning som bildas av ELVd och måste undvika intramolekylära samspelet mellan RNA av intresse och ELVd (figur 1). Vi har inte undersökt effekten av att infoga RNA intresset för alternativa lägen av ELVd molekylen. Plasmiden p15LtRnlSm tillåter samtidig uttryck för den aubergine tRNA-ligase. RNAs transkriberas i båda plasmider under kontroll av en konstitutiv stark E. coli promotorn, nämligen murein lipoprotein (lpp). Detta gör systemet konstituerande utan behov av induktion. Dock bygger vi även en liknande plasmid (p15tRnlSm) för att uttrycka den tRNA ligase under kontroll av den fag T7 RNA-polymerasen i ett isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inducerbara system. Använder denna plasmid, sker ansamling av rekombinant RNA först efter induktion av tRNA ligase uttryck genom att lägga till IPTG12. I det nuvarande systemet uttrycks RNA av intresse från en hög kopia nummer plasmid pUC replikering ursprung, medan den tRNA-ligase uttrycks från en måttlig kopia nummer plasmid med p15A replikering ursprung. Om att ändra kopia antalet förbättrar både plasmider som är inblandade i systemet ackumulering av de rekombinant RNA inte har undersökts hittills. Storleksintervallet av RNA av intresse upptagna av systemet har inte systematiskt undersökt heller, även om små RNAs förväntas logiskt ackumuleras till högre koncentrationer än större.

En av anledningarna till varför produktionen av rekombinant RNA i vivo inte är lätt beror troligen på den inneboende låga halveringstiden för RNA-molekyler. Vårt system är inte främmande för detta problem. I själva verket på ett sent E. coli växande fas, börjar ansamling av rekombinant RNA avta för att nästan försvinna12. Detta tvingar en att hitta rätt fönster att skörda cellerna. Vi påpekade dock att detta fönster är tillräckligt stor för att göra systemet vänliga. Vi konstaterade dock även att optimala fönstret beror på många faktorer, inklusive den särskilda E. coli stam, odlingsmedium, odlingsförhållanden (agitation, volymen av kolven, vädring, etc.) och fysiologiska scenen av bakterier används för att starta den flytande kulturen. Vi rekommenderar att du börjar rekombinant RNA produktion med hjälp av färska E. coli kolonier från en tallrik inokuleras föregående dag och odlas på 37 ° C. Lagring av plattor i kylen gör fönstret skörd mer oförutsägbart. Vi fick de mest konsekventa resultat genom att starta flytande kulturer med bakterier plockade från en tallrik med en tandpetare. Användning av en flytande före kultur, driver särskilt om mättad, också att variationen i protokollet produktion.

Angående rening, behandling av bakterieceller med fenol: kloroform är ett mycket effektivt sätt att bryta cellerna och möjliggör kvantitativa återvinning av totala bakteriell RNA i vattenfasen. Beroende på nedströms tillämpningen av rekombinant RNA, kan denna vattenfasen eller den beredning som resulterar från utfällning av RNA från denna vattenfasen med en alkohol vara tillräckligt. Om det krävs ytterligare rening, rekommenderar vi anjon-exchange kromatografi använder en DEAE anjon Jonbytarkolonnen (figur 5). Detta reningssteg tillåter effektiv borttagning av DNA och bakteriell metaboliter som också partitionerats i vattenfasen. Om nedströms tillämpningen av rekombinant RNA kräver rening till homogenitet, ger viroid-härledda system en klar fördel jämfört med andra metoder. Sedan en huvudsakliga bråkdel av rekombinant RNA produceras som en cirkulär form, kan fördel av detta boende tas att skilja det från huvuddelen av bakteriell RNAs. Cirkulär RNAs uppstå en fördröjning i elektroforesiska migrationen i denatureringen villkor med avseende på de linjära motsvarigheterna av samma storlek22. Denna försening är mer uttalad när RNA är electrophoresed under lägre jonstyrka. I praktiken, cirkulär RNAs kan också varit separerade av tvådimensionella denatureringen under hög och låg jonisk styrkor (figur 4). Efter elektroforetisk separation, måste rekombinant RNA vara elueras från gelen. Användning av en reversibel cross-linker akrylamid, såsom N, N'-bis (acryloyl) cysteaminklorhydrat23, underlättar återhämtning, särskilt när renande stora mängder RNA (figur 6). Slutligen, om nedströms tillämpningen av den producerade RNA kräver separation av RNA av intresse från viroid schavotten, erbjuder våra protokoll inte någon särskild fördel tidigare metoder. RNA av intresse måste vara censurerade från chimära molekylen med några av de tidigare beskrivna strategierna, såsom användning av ribozymerna, DNAzymes eller möjligen mest effektiva, användning av RNase H styrs av två DNA oligonukleotider7. Försöker du undvika detta sista besvärliga reningssteg, har vi arbetat på att försöka minska storleken på viroid schavotten, men med partiell framgång. Vi skulle kunna producera anmärkningsvärda mängder av rekombinant RNA viroid bort blanketter (175, 215 och 246 nt) men ökar borttagningar av viroid schavotten korrelerade med minskande ackumulering12.

Sammanfattningsvis beskrivs här ett protokoll för att producera stora mängder rekombinant RNA i E. coli som, enligt vår kännedom, förbättrar avkastningen av tidigare publicerade metoder. Protokollet är baserat på samtidig intresseanmälan i E. coli av RNA infogas en viroid (ELVd) byggnadsställning och den aubergine tRNA ligase, det enzym som circularizes denna viroid i infekterade plantor. Kännetecknande för våra protokoll är det rekombinant RNA produceras främst som en cirkulär form, en egenskap som underlättar rening till homogenitet för nedströms tillämpningar. Använder det här protokollet tiotals milligram rekombinant RNA kan enkelt skapas per liter av E. coli kultur i regelbundna laboratorieförhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att den teknik som beskrivs i detta protokoll har patenterade (oss Patent No. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Acknowledgments

Detta arbete stöds av bidrag BIO2017-83184-R och BIO2017-91865-EXP från den spanska Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (samfinansierade FEDER fonder).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F530S
Bpi I Thermo Scientific ER1011
Agarose Conda 8010 D1 low EEO
Tris PanReac AppliChem A1086,1000
Acetic acid PanReac AppliChem 131008.1214
EDTA Sigma-Aldrich E5134-500G
Ethidium bromide PanReac AppliChem A1152,0025 1%
Zymoclean Gel DNA Recovery Zymo Research D4001
NanoDrop ThermoFisher Scientific ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England BioLabs E2621S
DNA Clean & Concentrator Zymo Research D4003
Eporator Eppendorf 4309000019
Escherichia coli DH5α Invitrogen 18265-017
Tryptone Intron Biotechnology Ba2014
Yeast extract Intron Biotechnology 48045
NaCl PanReac AppliChem 131659.1211
Agar Intron Biotechnology 25999
Ampicillin PanReac AppliChem A0839,0010
X-gal Duchefa X1402.1000
N,N-Dimethylformamide PanReac AppliChem 131785.1611
NucloSpin Plasmid Macherey-Nagel 22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3) Novagen 69387-3
Escherichia coli HT115(DE3) Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol Duchefa C 0113.0025
Glycerol PanReac AppliChem 122329.1211 87%
KH2PO4 PanReac AppliChem 131509.1210
K2HPO4 PanReac AppliChem 122333.1211
HCl PanReac AppliChem 131020.1211
Phenol Scharlau FE04791000 90%
Chloroform PanReac AppliChem A3691,1000
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column GE Healthcare Life Sciences 17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system GE Healthcare Life Sciences 11001313
Acrylamyde PanReac AppliChem A1089,1000 2K
N,N’-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich M7279-100G
Urea PanReac AppliChem 146392.1211
Boric acid PanReac AppliChem A2940,1000
Formamide PanReac AppliChem A0937,2500
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026-5G
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine Sigma-Aldrich A4929-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
  2. Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
  3. Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise? Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
  4. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4 (2017).
  5. Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
  6. Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).
  7. Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
  8. Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
  9. El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
  10. Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).
  11. Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
  12. Daròs, J. -A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).
  13. Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , Springer International Publishing Switzerland. 295-322 (2016).
  14. Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
  15. Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
  16. Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
  17. Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
  18. Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
  19. Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  21. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  22. Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
  23. Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
  24. Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
  25. López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).

Tags

Biokemi fråga 141 rekombinant RNA cirkulär RNA RNA aptamer Escherichia coli viroid tRNA ligase
Storskalig produktion av rekombinant RNAs på en cirkulär byggnadsställning Viroid-härledda System med i <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cordero, T., Aragonés, V.,… More

Cordero, T., Aragonés, V., Daròs, J. A. Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (141), e58472, doi:10.3791/58472 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter