Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

De grootschalige productie van recombinante RNAs op een circulaire steiger met behulp van een systeem van Viroïde afkomstige in Escherichia coli

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58472
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universitat Politècnica de València, Spain

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNA in Escherichia coli mede uitspreken een chimeer RNA waarin het RNA van belang in een Viroïde steiger en een plant tRNA ligase. Het hoofdproduct is een circulaire molecuul dat zuivering aan homogeniteit wordt vergemakkelijkt.

Abstract

Met de toenemende belangstelling voor RNA biologie en het gebruik van de molecules van RNA in geavanceerde biotechnologische toepassingen, zijn de methoden voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNAs beperkt. Hier beschrijven we een protocol voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNA in Escherichia coli gebaseerd op co expressie van een chimeer molecuul waarin het RNA van belang in een Viroïde steiger en een plant tRNA ligase. Viroïden zijn relatief kleine, niet-coderende, zeer base-gepaarde circulaire RNAs die besmettelijk tot hogere planten zijn. De host plant tRNA ligase is een enzym gerekruteerd door viroïden die tot de familie Avsunviroidae, zoals aubergine latente Viroïde (ELVd), behoren om te bemiddelen RNA circularization tijdens Viroïde replicatie. Hoewel ELVd niet gerepliceerd in E. coli, een voorloper van de ELVd is efficiënt getranscribeerd door de E. coli RNA polymerase en verwerkt door de ribozymes van de ingesloten hammerhead in bacteriële cellen, en de resulterende monomeren zijn circularized door de Co uitgedrukt tRNA ligase een opmerkelijke concentratie bereiken. Het inbrengen van een RNA van belang in de ELVd steiger kan de productie van tientallen milligram van de recombinant RNA per liter bacteriecultuur in normale laboratoriumomstandigheden. Een belangrijke fractie van het RNA-product is circulaire, een functie die de reiniging van de recombinante RNA naar virtuele homogeniteit vergemakkelijkt. In dit protocol, wordt een complementaire DNA (cDNA) dat overeenkomt met het RNA van belang ingevoegd in een bepaalde stand van de ELVd cDNA in een plasmide expressie die wordt gebruikt, langs de plasmide uitspreken aubergine tRNA ligase, mede om te transformeren van E. coli. Co expressie van beide moleculen onder de controle van sterke constitutieve initiatiefnemers leidt tot de productie van grote hoeveelheden van de recombinante RNA. De recombinante RNA kan worden geëxtraheerd uit de bacteriële cellen en gescheiden van het merendeel van de bacteriële RNAs profiteren van haar cirkelvormigheid.

Introduction

In tegenstelling tot DNA en proteïnen zijn protocollen voor eenvoudige, efficiënte en rendabele productie van grote hoeveelheden van RNA niet overvloedig. Echter, onderzoek en industrie vraag steeds grotere hoeveelheden van deze biomoleculen te onderzoeken hun unieke biologische eigenschappen1, of om te worden gebruikt geavanceerde biotechnologische toepassingen, waaronder hun gebruik als zeer specifieke aptamers 2, therapeutische agenten3of selectieve pesticiden4. In vitro transcriptie en chemische synthese worden vaak gebruikt in onderzoek voor de productie van RNA. Deze methoden leiden echter tot belangrijke beperkingen wanneer grote hoeveelheden van de producten nodig zijn. De logische alternatief is het gebruik van de machines van de endogene transcriptie van levende cellen, gevolgd door een zuiveringsproces te scheiden van de RNAs van belang van de cellulaire metgezellen. Naar aanleiding van deze strategie, zijn methoden ontwikkeld voor de productie van recombinante RNAs in bacteriële cellen, zoals de lab-vriendelijke Escherichia coli5 of de marine paarse fototrofe alpha-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. de meeste methoden voor de productie van recombinante RNA bij bacteriën is afhankelijk van de expressie van een inheemse zeer stabiele RNA steiger, zoals een tRNA of een rRNA, waarin RNA van belang is ingevoegd7. Dit legt de noodzaak van het vrijgeven van het RNA van belang uit het chimeer molecuul, als de aanwezigheid van extra RNA een probleem voor de downstream toepassingen8 is. Een ander concept in recombinant RNA biotechnologie is de productie van recombinante ribonucleoprotein complexen die mogelijk het gewenste product per se of gebruikt als een beschermende strategie om te verhogen de stabiliteit van het RNA van belang9, 10. Ook is de productie van circulaire RNAs ook voorgesteld als een strategie voor het genereren van meer stabiele producten11.

We hebben onlangs een nieuwe methode voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNA in E. coli die deelneemt aan drie van de bovenstaande concepten ontwikkeld: de invoeging van het RNA van belang in een zeer stabiele cirkelvormige RNA steiger en de co uitdrukking van de recombinante RNA met een interactie eiwit waarschijnlijk tot een stabiele ribonucleoprotein complex dat zich in opmerkelijke bedragen in bacteriële ophoopt cellen12. In tegenstelling tot eerdere ontwikkelingen gebruikten we een volkomen vreemd is aan E. coli, namelijk een Viroïde RNA-steiger. Viroïden zijn een bijzonder soort infectieuze agentia van hogere planten die zijn uitsluitend gevormd door een relatief klein (246-401 nt) zeer base-gepaarde circulaire RNA13. Interessant, viroïden zijn niet-coderende RNAs en met geen hulp van hun eigen eiwitten, ze zijn in staat om het volledige complex besmettelijke cycli in de geïnfecteerde hosts14. Deze cycli opnemen de replicatie van RNA-RNA-in de kernen of chloroplasten, afhankelijk van de familie Viroïde —Pospiviroidae of Avsunviroidae, respectievelijk — verkeer via de besmette plant en -ontduiking van de defensieve reactie van de gastheer. Viroïden moeten worden gerangschikt onder de meest stabiele RNAs in de natuur, als gevolg van een naakte circulaire RNA en om te overleven in de vijandige omgeving van plantencellen besmet. Deze eigenschap kan maken viroïden bijzonder geschikt als steigers te stabiliseren recombinant RNA in biotechnologische benaderingen. Bovendien is de nieuwe methode gebaseerd op co uitdrukking van de Viroïde steiger met een interactie plantaardige eiwitten. Viroïden gerepliceerd via een mechanisme van de rolling-circle in welke host enzymen zijn gerekruteerd om te katalyseren van de verschillende stappen van het proces. Met name sommige viroïden, meer in het bijzonder degenen die tot de familie Avsunviroidae15 behoren, bevatten ribozymes die ook bij de replicatie zijn betrokken. Afhankelijk van de soort Viroïde, is transcriptie van Viroïde RNAs gemedieerd door de host RNA polymerase II of de chloroplastic nucleaire-gecodeerd RNA polymerase (NEP). Viroïde RNA verwerking lijkt te worden gekatalyseerd door een host type III RNase, hoewel in viroïden met ribozymes oligomere RNA tussenproducten zelf tijdens de replicatie klieven. Tot slot, de resulterende Viroïde monomeren zijn circularized, afhankelijk van de familie Viroïde door de host DNA ligase 1 of de chloroplastic isovorm van tRNA ligase16,17. Dit laatste enzym is betrokken bij Afbinding van de monomere vormen van de viroïden in de familie Avsunviroidae, zoals aubergine latente Viroïde (ELVd)18.

In de loop van een werk voor het analyseren van de volgorde en de structurele eisen van ELVd die bepalen van erkenning door de aubergine (Solanum melongena L.) tRNA ligase, wij stellen een experimenteel systeem gebaseerd op co expressie van beide moleculen in E. coli 19. Wij merkten dat langer-dan-unit ELVd afschriften zelf efficiënt in E. coli cellen via de ingesloten hammerhead ribozymes klieven en dat de resulterende Viroïde monomeren met 5'-hydroxyl en 2', 3'-phosphodiester termini efficiënt circularized door de mede uitgedrukt aubergine tRNA ligase. Sterker nog, bereikt de resulterende circulaire Viroïde RNA een onverwachte hoge concentraties in E. coli, dan die van de endogene rRNAs12. Afwezigheid van replicatie tussenproducten aangegeven gebrek ELVd RNA-RNA-amplificatie in deze bacteriële cellen. Interessant, had invoeging van heterologe RNAs in een bepaalde stand van het molecuul Viroïde een matig effect op de accumulatie van de circulaire Viroïde afkomstige RNAs12. Deze opmerkingen maakte ons voorzien van een methode om grote hoeveelheden recombinant RNAs in bacteriën produceren. Bij deze methode wordt de cDNAs overeenkomt met de RNAs van belang worden ingevoegd in de cDNA ELVd en de resulterende chimeer RNA wordt uitgedrukt in E. coli via een sterke constitutieve promotor. Voor het systeem te werken, moet de E. coli samen met een plasmide wil de aubergine tRNA ligase worden omgevormd. Het langer-dan-unit ELVd-afgeleide transcript is verwerkt door de ingesloten hammerhead ribozymes en de resulterende monomeren met de juiste termini zijn erkend en circularized door de mede uitgedrukt tRNA ligase. Op deze manier is de RNA van belang een zeer stabiele cirkelvormige steiger bestaande uit het Viroïde circulaire molecuul ingevoegd. Deze recombinante chimeer RNA is waarschijnlijk verder gestabiliseerd in de cellen van E. coli door vorming van een complexe door interactie met tRNA ligase ribonucleoprotein. Met behulp van deze methode (zie protocol hieronder), RNA aptamers, haarspeld RNAs en andere gestructureerde RNAs zijn gemakkelijk geproduceerd in hoeveelheden van tientallen milligram per liter voor E. coli cultuur in normale laboratoriumomstandigheden en gezuiverd tot homogeniteit nemen voordeel van cirkelvormigheid12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plasmide bouw

  1. Versterken door PCR (of omgekeerde transcriptie PCR als vanaf een sjabloon van RNA) overeenkomt met de RNA van belang gebruikend inleidingen met 5' extensie toe vergadering in de expressie plasmide cDNA. Om te voorkomen dat ongewenste mutaties, gebruikt u een hifi-polymerase van DNA.
    1. Als u wilt invoegen de cDNA in het plasmide expressie door Gibson vergadering20, de volgende 5' extensies toevoegen aan de PCR inleidingen: forward, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; omgekeerde, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X vertegenwoordigt nucleotiden homoloog aan de terminal uiteinden van het RNA van belang.
    2. Incubeer gedurende 30 s bij 98 ° C, gevolgd door 30 cycli van 10 bij 98 ° C, 30 s s bij 55 ° C en 30 s bij 72 ° C, en een definitieve verlenging van 10 minuten bij 72 ° C.
  2. Digest 100 ng van plasmide pLELVd-BZB met 10 U van de type-IIS restrictie-enzym Bpi ik gedurende 1 uur bij 37 ° C in een 20 µL reactie in een 0,5 mL tube in buffer G (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl BSA 0,1 mg/mL).
    Opmerking: Alle plasmiden zijn beschikbaar op verzoek aan de bijbehorende auteur. BPI Ik neerkomt op Bbs ik.
  3. De PCR en de spijsvertering producten van elkaar gescheiden door elektroforese in een 1% agarose gel in TAE-buffer (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur, 1 mM EDTA, pH 7,2). Vlek de gel gedurende 15 minuten door het schudden in 200 mL van 0,5 µg/mL ethidiumbromide. Visualiseren van het DNA met behulp van een UV-transilluminator en de bands die overeenkomt met de versterkte cDNA en de Bpi ik-verteerd plasmide (2046 bp) met behulp van een scalpel mes snijd.
    Opmerking: BPI Ik vertering van pLELVd-BZB brengt ook een 528 bp product overeenkomt met de verslaggever van de blauw-wit LacZ.
  4. Elueer de ANI van de fragmenten van de gel met behulp van silica gel kolommen (gel DNA herstel kit in Tabel van materialen) en kwantificeren van de DNA-concentratie door spectrofotometrische analyse.
  5. Instellen van een Gibson vergadering reactie versterkte cDNA met het verteerd plasmide. Gebruik een 3-voudig molaire overmaat van invoegen versus vector20. Incubeer gedurende 1 uur bij 50 ° C en te zuiveren van de reactieproducten met behulp van een kolom silicagel (DNA schoon & concentrator kit in de Tabel van de materialen).
  6. Gebruik van de gezuiverde producten van de Gibson vergadering reactie op electroporate bevoegde E. coli DH5α cellen. Met behulp van 1-mm electroporation cuvettes, gelden de volgende instellingen: 1.500 V en 5 ms. Incubate gedurende 1 uur bij 37 ° C in super geoptimaliseerde bouillon met onderdrukking van de omzettingsproducten (SOC; 20 g/L trypton, 5 g/L gistextract, 0,5 g/L NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2 20 mM glucose, pH 7,0) vloeistof en vervolgens verspreiding op Luria Bertani (LB; 10 g/L trypton, 5 g/L gistextract, 10 g/L NaCl) agar (1,5%) platen met 50 µg Mo/mL ampicilline.
    1. Om te screenen op kolonies overeenkomt met getransformeerde E. coli verspreid klonen die waarschijnlijk het invoegen, 15 min voordat de electroporated cellen, plating 30 µL van 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) in dimethylformamide. Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C.
  7. Kies verschillende witte kolonies en 's nachts groeien bij 37 ° C in vloeibare LB-media. Zuiveren plasmiden met behulp van een miniprep kit (Zie Tabel van materialen) en analyseren van hun maten door elektroforese in een 1% agarose gel in TAE-buffer.
  8. De meest waarschijnlijke recombinante plasmide gebaseerd op elektroforetische migratie ten opzichte van het pLELVd-BZB-besturingselement selecteren De volgorde van de geselecteerde plasmide bevestigen door sequentiebepaling met behulp van primers 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' en 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' dat de gehele expressie cassette in pLELVd-BZB flank.
    Opmerking: Vergeet niet dat deze plasmide bevat een 528 bp polylinker met de markering van de LacZ, die is vervangen door de cDNA van belang. Beperking toewijzing kan helpen om te kiezen van de juiste recombinante plasmiden.

2. RNA expressie

  1. Co-electroporate (zie voorwaarden in 1.6) de geselecteerde E. coli stam (E. coli BL21 of een BL21-derivaat) met de pLELVd-BZB-derivaat, dat overeenkomt met het RNA van belang en plasmide p15LtRnlSm mede uitspreken cDNA bevat de aubergine tRNA ligase. Gebruik de E. coli HT115(DE3), die RNase III21 mist, uitspreken RNAs met lange double-stranded regio's.
    Opmerking: Zowel de RNA van belang en het tRNA ligase mRNA worden getranscribeerd door de RNA-polymerase van E. coli . Geen DE3 lysogen aan uitdrukkelijke T7 RNA-polymerase is vereist in de E. coli -stam, hoewel de aanwezigheid van deze lysogen geen schadelijke effecten heeft.
  2. Na 1 uur incubatie bij 37 ° C in SOC opgietvloeistof, plaat electroporated bacteriën op stevige middellange LB met 50 µg Mo/mL ampicilline en 34 µg/mL chlooramfenicol. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
  3. Kies een kolonie en enten van een 1 L verbijsterd erlenmeyerkolf met 250 mL van vloeibare geweldig Bouillon (TB)-medium (12 g/L trypton, 24 g/L gist extract, 0,4% glycerol, 0,17 M KH2PO4en 0,72 M K2HPO4), met 50 µg Mo/mL ampicilline en 34 µg/mL chlooramfenicol. Incubeer bij 37 ° C met krachtig schudden 180 omwentelingen per minuut (rpm). Oogst bacteriën tussen 12 en 16 h na inoculatie van de cultuur.

3. RNA extractie en zuivering

  1. Voor analytische doeleinden, nemen 2 mL aliquots van de cultuur op de gewenste tijdstippen en centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 2 min. negeren het supernatant en resuspendeer de cellen in 50 µL van TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 en 1 mM EDTA) door vortexing.
    1. Toevoegen van één volume (50 µL) van een 1:1 (v/v) mix van fenol (verzadigd met water en geëquilibreerd op pH 8,0 met Tris-HCl, pH 8,0) en chloroform. Breek de cellen door krachtige vortexing en scheiden de waterige en biologische fasen door centrifugeren voor 5 min op 14.000 x g.
    2. Zorgvuldig herstellen de waterige fase (bovenste) waarin de totale bacteriële RNA.
      Opmerking: Voorbereidingen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor latere analyse.
  2. Voor de doeleinden van het voorbereidende, giet u cultuur in een centrifuge-flacon 250 mL en spin down cellen bij 14.000 x g gedurende 10 min. Discard supernatant. Het wassen van de cellen door resuspending in 30 mL water. Overbrengen in een centrifugebuis en spin down cellen opnieuw onder dezelfde voorwaarden.
  3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 mL chromatografie buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 150 mM NaCl, 0,2 mM EDTA) door vortexing.
    Opmerking: Op dit moment kunnen de cellen worden bevroren bij-20 ° C om door te gaan met de zuivering op elk andere moment.
  4. Cellen met behulp van een verse of ontdooide bacteriële voorbereiding, breken door toevoeging van 1 deel (10 mL) van fenol: chloroform (zie stap 3.2) en vortexing krachtig.
  5. Centrifugeer gedurende 10 min op 12.000 x g, de waterfase te herstellen en opnieuw uitpakken met 1 volume (10 mL) van chloroform onder dezelfde voorwaarden.
    Opmerking: De voorbereiding van het RNA kan worden achtergelaten bij-20 ° C op dit punt.
  6. Verder zuiveren totale bacteriële RNA door anion-uitwisseling chromatografie. De voorbereiding van het RNA door een 45 µm spuit filter en belasting op een 1 mL diethylethanolamine (DEAE) kolom te filteren.
    1. Voor de zuivering van de chromatografie, gebruik van een vloeibare chromatografie-systeem op een debiet van 1 mL/min. Equilibreer voordat monster laden, de kolom met 10 mL van chromatografie buffer (zie stap 3.3 voor samenstelling).
    2. Laden van het monster en was de kolom met 10 mL van chromatografie buffer. RNA Elueer met 20 mL elutie buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 1 M NaCl, 0,2 mM EDTA) en verzamelen van 1 mL aliquots.
      Opmerking: RNA GC snel in de eerste breuken. De kolom kan opnieuw worden gebruikt voor verdere zuivering. Daarvoor was de kolom met 10 mL water en bewaren bij 4 ° C in de 20% ethanol.
  7. Aangezien een groot deel van de recombinant die RNA in E. coli in een ronde vorm accumuleert, kan deze eigenschap voor zuivering aan homogeniteit12worden geprofiteerd. Circulaire RNAs van de lineaire tegenhangers scheiden door twee-dimensionale polyacrylamide-gelelektroforese (2D pagina) combinatie van niet-denaturering en denaturering (8 M ureum) voorwaarden12,22.

4. RNA analyse

  1. Bereiden van een 5% polyacrylamide-gel (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, massaverhouding) in TBE buffer (89 mM Tris, boorzuur 89 mM, 2 mM EDTA) met 8 M ureum.
  2. Mix 20 µL van RNA-preparaten met 1 deel (20 µL) van het laden van de buffer (98% formamide, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0.0025% bromophenol blauw en 0.0025% xyleen cyanol), Incubeer gedurende 1,5 min bij 95 ° C in een blok van Verwarming, en snap cool op ijs.
  3. De monsters in het polyacrylamidegel laden en draaien de elektroforese op passende voorwaarden afhankelijk van de afmetingen van de gel (bijvoorbeelduitvoeren van 140 x 130 x 2 mm gels voor 2,5 h bij 200 V). Vlekken van de gel gedurende 15 min. in 0,5 µg/mL ethidiumbromide, wassen met water en visualiseren van RNA onder UV-licht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het RNA van belang is voor de productie van recombinant RNA in E. coli met behulp van de ELVd-afgeleide systeem12, een steiger ELVd RNA geënt. Deze chimeer RNA is mede uitgedrukt langs de aubergine tRNA ligase in E. coli. Zodra verwerkt, gekloofd en circularized, vormt het chimeer circulaire RNA, waaruit de RNA van belang steekt, waarschijnlijk een complex met de mede uitgedrukt aubergine enzym dat opmerkelijke concentratie in de bacteriële cellen ( bereikt ribonucleoprotein Figuur 1). Dus bestaat de eerste stap voor de productie van recombinante RNA met behulp van dit systeem uit het invoegen van cDNA overeenkomt met de RNA van belang in een bepaalde positie in de ELVd cDNA, T245-T246 in de ELVd reeks variant AJ536613. Plasmide pLELVd-BZB, waarin een polylinker op deze positie met twee Bpi I erkenning sites en een LacZ blauw/wit marker-gen, vergemakkelijkt deze invoeging door de zeer efficiënte Gibson vergadering methode20. Selectie van getransformeerde E. coli klonen waarin de gewenste recombinante plasmiden wordt vergemakkelijkt door de blauw/wit screening van LacZ marker. Plasmiden waarin de dubbele Bpi ik spijsvertering onvolledig was en de koloniën waarschijnlijk produceren blauwe invoegen in het bijzijn van X-gal niet konden opnemen. Figuur 2 toont de elektroforetische analyse van verschillende recombinante plasmiden, waarin verschillende cDNAs werden ingevoegd. Deze plasmiden tonen verschillende migraties in vergelijking met pLELVd-BZB. Opmerking dat pLELVd-BZB bevat de LacZ marker (528 bp) die wordt vervangen door de cDNA dat correspondeert met de RNA van belang. Dus, hoewel dit is afhankelijk van de grootte van de ingevoegde cDNA, migreren de recombinante plasmiden zich meestal sneller dan de controle plasmide (Figuur 2).

De pLELVd-BZB-derivaten, die bevatten de cDNAs die overeenkomt met de RNAs van belang worden gebruikt langs p15LtRnlSm naar co-electroporate E. coli. Co getransformeerd bacteriën zijn geselecteerd op platen met ampicilline en chlooramfenicol. Vervolgens geselecteerd E. coli klonen worden gekweekt bij 37 ° C met sterke agitatie in het rijke TB-medium. Onder de voorwaarden van deze cultuur, productie van de recombinant die RNA is gemaximaliseerd12. De aanwezigheid van de recombinante RNA in de bacteriën kan gemakkelijk worden gecontroleerd door het breken van de cellen met een mix van fenol en chloroform in aanwezigheid van een buffer en analyseren van het RNA, welke partities in de waterige buffer, door denaturering van de pagina. Figuur 3 Toon ethidiumbromide gekleurd polyacrylamide gels in welke totale RNAs uit verschillende E. coli klonen werden gescheiden. De afbeeldingen tonen sterke banden die met de lege ELVd corresponderen en chimeer ELVd formulieren waarin verschillende RNAs van belang zijn ingevoegd. Interessant vinden we een grote fractie van recombinante RNA als ronde vorm. Met behulp van een combinatie van twee pagina's onder denatureren voorwaarden bij hoge en lage Ionische sterkte, kan de cirkelvormigheid van de belangrijkste fractie van de recombinant RNA worden gemakkelijk waargenomen (Figuur 4).

Afhankelijk van de stroomafwaartse toepassing, de totale E. coli RNA voorbereiding waarin het chimeer ELVd-RNA van belang kan zijn het doel van het huidige protocol. Echter wanneer nodig, kan de voorbereiding van het RNA verder gezuiverd worden door anion-uitwisseling chromatografie. Chromatografische in Figuur 5 toont de efficiënte handhaving van E. coli RNA op de kolom op lage Ionische sterkte (150 mM NaCl) en de daaropvolgende elutie op hoge Ionische sterkte (1 M NaCl). Allermeest naar de RNA wordt verzameld in de fracties 2 en 3. Als u wilt zuiveren de recombinante RNA aan homogeniteit, kan van cirkelvormigheid worden geprofiteerd. Circulaire RNAs zijn vertraagd ten opzichte van hun lineaire tegenhangers in de denaturering voorwaarden22. Deze RNAs kunnen na ethidium bromide kleuring van de gel worden geëlueerd. Het gebruik van een solubilizable polyacrylamide-gel, zoals die kruiselings gekoppelde met N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, vergemakkelijkt reiniging van grote hoeveelheden van recombinante RNAs (Figuur 6).

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van het Viroïde gebaseerde systeem voor de productie van recombinante RNA in E.coli. CDNA overeenkomt met de RNA van belang (de 98 nt-lang RNA aptamer spinazie in de regeling) wordt ingevoegd plasmide pLELVd-BZB. E. coli is mede veranderde met de p15LtRnlSm van het pLELVd-BZB-afgeleide en plasmide aubergine tRNA ligase mede wordt uitspreken. In E. coli, het chimeer ELVd-spinazie RNA transcriptie is zelf gekloofd (rode pijlpunten) door de Viroïde hammerhead ribozymes. Het resulterende monomeer is erkend door de mede uitgedrukt tRNA ligase en circularized. De recombinante RNA bestaat uit een cirkelvormige Viroïde steiger waaruit het RNA van belang (in groen steekt). Accumulatie van de recombinante RNA aan grote hoeveelheden in E. coli waarschijnlijk het gevolg van stabilisatie van de ribonucleoprotein complex met tRNA ligase. Naast de splitsing ELVd cDNA, plasmide pLELVd-BZB bevat een pUC replicatie oorsprong (pUC ori), een ampicilline selectie gen (AmpR), de E. coli lymfkliertest lipoproteïne (lpp) promotor en terminator rRNA (rrnC) en de LacZ marker. Plasmide-p15LtRnlSm bevat een p15A replicatie oorsprong (p15A ori), een chlooramfenicol resistentie gen (CmR), de E. coli lpp promotor en terminator een Transcriptie T7 phage naast de aubergine tRNA ligase cDNA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: elektroforetische analyse van pLELVd-BZB-afgeleide expressie plasmiden, die verschillende cDNAs van belang bevatten. Plasmiden werden gescheiden door elektroforese in een 1% agarose gel die werd gekleurd met ethidiumbromide. Lane 1, DNA marker met formaten in kbp van enkele van de onderdelen aan de linkerkant; Lane 2, pLELVd-BZB; Lane 3, pLELVd-BZB afgeleide uitspreken een lege ELVd; rijstroken 4 tot en met 7, pLELVd-BZB derivaten te geven de RNA-aptamer spinazie (lane 4), de streptavidine bindend aptamer (lane 5), een RNA haarspeld met een aaneengesloten 42 bp double-stranded regio lane (6) en de 3' GLB-onafhankelijke vertaling enhancer (CITE) van een plant virus (lane 7). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Recombinante RNA geproduceerd in E. coli met behulp van het Viroïde gebaseerde systeem. Totale RNAs uit verschillende E. coli klonen werden gehaald door behandeling met fenol: chloroform en aliquots gescheiden door denaturering van de pagina. Gels met ethidiumbromide gekleurd worden weergegeven. Recombinante RNAs werden geproduceerd in E. coli (A) BL21(DE3) en (B) HT115(DE3). (A en B) rijstroken 1, RNA marker met formaten in nt aan de linkerkant; rijstroken 2, RNAs van E. coli klonen om uit te drukken van een leeg ELVd (333 nt). (A) stegen 3 en 4, RNAs van E. coli klonen uitspreken een chimeer ELVd vormen die de aptamer spinazie (98 nt) en de daar bindende aptamer (42 nt), respectievelijk. (B) Lane 3, RNAs van een kloon van E. coli om uit te drukken een chimeer ELVd-formulier met een 42 bp-lange dubbele gestrande RNA. Rode pijlen wijzen naar de circulaire recombinante RNAs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Cirkelvormigheid van recombinante RNA geproduceerd in E. coli met behulp van het Viroïde gebaseerde systeem. Totale RNAs van een kloon van E. coli om uit te drukken een chimeer ELVd waarin de aptamer spinazie werden gescheiden door 2D denaturering pagina eerst onder hoge en klik vervolgens onder lage Ionische sterkte. De gels zijn gekleurd met ethidiumbromide. De blauwe pijlen geven de richtingen van elektroforetische migratie. De rode pijl wijst naar de circulaire ELVd-spinazie die selectief vanaf de lineaire tegenhangers van de zelfde grootte tijdens de twee scheidingen is vertraagd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Chromatografische zuivering van een recombinant RNA geproduceerd in E. coli met behulp van het Viroïde gebaseerde systeem. Totale RNAs van een kloon van E. coli die een chimeer ELVd-3 produceert "CITE (55 nt) werden geladen op een DEAE chromatografie kolom die werd gewassen in aanwezigheid van 150 mM NaCl. RNA was geëlueerd in aanwezigheid van 1 M NaCl. Het chromatogram toont absorptie bij 254 nm (blauwe lijn) en geleidbaarheid in mS/cm (oranje lijn) versus volume. De verschillende stappen van de gaschromatografische scheiding (evenwichtsinstelling, injectie, wassen, elutie en kolom regeneratie) zijn aangegeven. Ingezamelde fracties worden ook aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Zuivering aan homogeniteit van een recombinant RNA geproduceerd in E. coli met behulp van het Viroïde gebaseerde systeem. Totale RNAs van een kloon van E. coli die een chimeer ELVd-3 produceert "CITE waren eerst gezuiverd door chromatografie met behulp van een kolom DEAE-Sepharose en vervolgens gescheiden door 2D pagina. Eerste gel werd uitgevoerd onder voorwaarden (8 M ureum, buffer FSME) denaturering. Na kleuring met ethidiumbromide, werd de gel-band waarin de ronde vorm van de recombinante RNA overgeplaatst naar de top van een tweede gel die is uitgevoerd onder niet-denaturering voorwaarde (buffer TAE). De acrylamide van de tweede gel was kruislings gekoppelde met N, N'-bis (acryloyl) cystamine, waardoor de solubilisatie van het fragment van de gel die de zuivere recombinante RNA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoewel het onderzoek naar de ELVd volgorde en structuur eisen die betrokken zijn bij de erkenning door de aubergine tRNA ligase, merkten we dat mede expressie van beide moleculen in de niet-host E. coli leidde tot een onverwachte grote opeenstapeling van Viroïde circulaire formulieren in bacteriecellen19. We begrepen dat de grote opeenstapeling van Viroïde RNA in E. coli waarschijnlijk het gevolg was van mede uiting van een zeer stabiele RNA-molecuul, zoals de relatief kleine (333 nt), zeer gebaseerd-gekoppeld, circulaire Viroïde en een eiwit welke hiervoor bijzondere Viroïde geeft hoge affiniteit. ELVd RNA, moet de host tRNA ligase om te bemiddelen zijn circularization tijdens de replicatie in de besmette plant17werven. Hoewel er geen experimentele bevestiging, verwachten we dat beide moleculen vormen een complex in E. coli die verder stabiliseert de Viroïde RNA en kunt bereiken de opmerkelijke concentratie van 150 mg per liter voor bacteriële ribonucleoprotein cultuur die zeer later valt dan die van de endogene RNAs, zoals rRNAs12. Aangezien ELVd niet gerepliceerd in E. coli, redeneerde wij dat invoeging van een heteroloog RNA ging niet dramatisch invloed hebben op de accumulatie van het RNA Viroïde afkomstige en, in feite, dat het geval was. Deze constatering is de basis van de methode voor de productie van grote hoeveelheden van recombinant RNA in E. coli die we hier beschrijven. De methode maakt gebruik van het cirkelvormige RNA-molecuul van ELVd als een steiger waarop het RNA van belang is gepresenteerd. Voor de productie van een cirkelvormige ELVd steiger in E. coli, moeten we een voorloper van RNA met het gedupliceerde domein van de Ribozym van de hammerhead Viroïde uitdrukken. ELVd ribozymes klieven zelf zeer efficiënt in E. coli en de resulterende Viroïde monomeren zijn erkend en circularized door de mede uitgedrukt tRNA ligase. Co uitdrukking van het tRNA ligase is een belangrijk kenmerk van het systeem. ELVd RNA wordt nauwelijks ontdekt in E. coli , tenzij dit specifieke enzym mede uitgedrukt12 is.

In ons protocol kunt plasmide pLELVd-BZB invoegen de cDNA dat correspondeert met de RNA van belang door eenvoudige en efficiënte Gibson vergadering tussen posities U245 en U246 van ELVd. Deze site komt overeen met de RD Session Host lus van een lange haarspeld aanwezig in de meest waarschijnlijke ELVd conformatie24,25. Inlassing in deze bijzondere positie moet bevorderen dat de RNA van belang uit de zeer stabiel steiger gevormd door ELVd steekt en voorkomen intramoleculaire interactie tussen het RNA van belang en ELVd (Figuur 1 dat moet). We hebben niet onderzocht het effect van het RNA belangstelling voor alternatieve standpunten van de molecule ELVd invoegen. Plasmide p15LtRnlSm kunt co uitdrukking van de aubergine tRNA ligase. RNAs worden getranscribeerd in beide plasmiden onder de controle van een constitutief sterke E. coli promotor, namelijk mureïne lipoproteïne (lpp). Dit maakt het systeem constitutieve zonder de noodzaak van inductie. Echter, wij bouwen ook een soortgelijk plasmide (p15tRnlSm) om het tRNA ligase onder de controle van de bacteriofaag T7 RNA polymerase uitdrukken in een afleidbare systeem van isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Met behulp van deze plasmide, accumulatie van de recombinante RNA treedt alleen op na de inductie van tRNA ligase expressie door toe te voegen IPTG12. In het huidige systeem, wordt het RNA van belang uitgedrukt uit een plasmide hoge kopie nummer met pUC replicatie oorsprong, terwijl de tRNA ligase van een plasmide gematigde kopie nummer met p15A replicatie oorsprong wordt uitgedrukt. Of wijziging van het exemplaaraantal van beide plasmiden die betrokken zijn bij het systeem verbetert accumulatie van de recombinant RNA is tot nu toe niet onderzocht. Het bereik van de grootte van het RNA van belang toegelaten door het systeem niet systematisch is onderzocht, hoewel kleine RNAs verwachting logisch te accumuleren aan hogere concentraties dan grotere.

Een van de redenen waarom de productie van recombinante RNA in vivo niet gemakkelijk is is waarschijnlijk te wijten aan de intrinsieke lage halveringstijd van molecules van RNA. Ons systeem is niet vreemd aan dit probleem. In feite, op een late E. coli groeiende fase, begint accumulatie van recombinante RNA te dalen om vrijwel verdwijnen12. Dit dwingt een te vinden van het juiste venster om te oogsten van de cellen. We waargenomen, echter dat dit venster groot genoeg is om vriendelijk maken van het systeem. Wij merkte echter ook dat het optimale venster hangt af van veel factoren, waaronder de bijzondere E. coli stam, kweekmedium, teeltomstandigheden (agitatie, volume van de kolf, luchten, enz.) en de fysiologische stadium van de bacteriën gebruikt voor het starten van de vloeibare cultuur. We raden aan te beginnen van recombinante RNA productie met behulp van verse E. coli kolonies van een plaat geënt van de vorige dag en gekweekt bij 37 ° C. Platen op te slaan in de koelkast, maakt het venster oogst meer onvoorspelbaar. Wij verkregen de meest consistente resultaten door het starten van vloeibare culturen met bacteriën geplukt uit een plaat met een tandenstoker. Het gebruik van een vloeibare pre cultuur, rijdt met name als verzadigd, ook naar variabiliteit in het protocol van de productie.

Over zuivering, behandeling van bacteriële cellen met fenol: chloroform is een zeer effectieve manier om te breken van de cellen en zorgt voor de kwantitatieve herstel van totale bacteriële RNA in de waterige fase. Afhankelijk van de stroomafwaartse toepassingvan de recombinant RNA, kan deze waterige fase of het preparaat die voortvloeit uit het neerslaan van RNA van deze waterige fase met een alcohol volstaan. Als verdere zuivering nodig is, raden we anion-uitwisseling chromatografie met behulp van een DEAE anion wisselingskolom (Figuur 5). Deze zuivering kan efficiënt afvoeren van DNA en bacteriële metabolieten die ook gepartitioneerd in de waterige fase. Als de downstream toepassing van recombinant RNA zuivering aan homogeniteit vereist, biedt het Viroïde afkomstige-systeem een duidelijk voordeel in vergelijking met andere methoden. Aangezien een belangrijke fractie van de recombinante RNA wordt geproduceerd als een ronde vorm, kan profiteren van deze eigenschap te scheiden het van het grootste deel van bacteriële RNAs worden genomen. Circulaire RNAs vertraging in elektroforetische migratie in de denaturering van de voorwaarden met betrekking tot de lineaire tegenhangers van de dezelfde grootte22. Deze vertraging is meer uitgesproken bij de RNA is electrophoresed onder lagere Ionische sterkte. In de praktijk, circulaire RNAs kan ook zijn gescheiden door twee-dimensionale denatureren pagina onder hoge en lage Ionische sterktes (Figuur 4). Na elektroforetische scheiding, moet de recombinante RNA worden geëlueerd van de gel. Het gebruik van een omkeerbaar cross-linker van acrylamide, zoals N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, bevordert herstel, vooral wanneer grote hoeveelheden van RNA (Figuur 6) te zuiveren. Tot slot, als downstream toepassing van de geproduceerde RNA vraagt om scheiding van het RNA van belang vanaf de steiger Viroïde, ons protocol biedt geen geen bijzonder voordeel aan vorige methoden. Het RNA van belang moet worden weggesneden uit het chimeer molecuul met behulp van enkele van de eerder beschreven strategieën, zoals het gebruik van ribozymes, DNAzymes, of eventueel efficiëntste, het gebruik van RNase H begeleid door twee DNA oligonucleotides7. Proberen te voorkomen dat deze laatste omslachtig zuivering stap, hebben we gewerkt aan het proberen om de grootte van de Viroïde steiger, hoewel met gedeeltelijk succes. We konden produceren bekende hoeveelheden van recombinante RNA Viroïde verwijderd formulieren (175, 215 en 246 nt) maar toenemende verwijderingen van de steiger Viroïde gecorreleerd met afnemende accumulatie12.

Kortom, wordt hier een protocol beschreven voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNA in E. coli die, om onze kennis, het rendement van eerder gepubliceerde methoden verbetert. Het protocol is gebaseerd op co expressie in E. coli van het RNA van belang ingevoegd in een steiger Viroïde (ELVd) en de aubergine tRNA ligase, het enzym dat circularizes deze Viroïde in geïnfecteerde planten. Een onderscheidend kenmerk van ons protocol is dat recombinant die RNA wordt voornamelijk geproduceerd als een ronde vorm, een eigenschap die zuivering aan homogeniteit voor downstream toepassingen vergemakkelijkt. Met behulp van dit protocol tientallen milligram van recombinant die RNA kan gemakkelijk worden geproduceerd per liter van E. coli cultuur in normale laboratoriumomstandigheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat de technologie die wordt beschreven in dit protocol is gepatenteerd (ons Patent Nr. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door subsidies BIO2017-83184-R en BIO2017-91865-EXP uit de Spaanse Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (medegefinancierd FEDER-fondsen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F530S
Bpi I Thermo Scientific ER1011
Agarose Conda 8010 D1 low EEO
Tris PanReac AppliChem A1086,1000
Acetic acid PanReac AppliChem 131008.1214
EDTA Sigma-Aldrich E5134-500G
Ethidium bromide PanReac AppliChem A1152,0025 1%
Zymoclean Gel DNA Recovery Zymo Research D4001
NanoDrop ThermoFisher Scientific ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England BioLabs E2621S
DNA Clean & Concentrator Zymo Research D4003
Eporator Eppendorf 4309000019
Escherichia coli DH5α Invitrogen 18265-017
Tryptone Intron Biotechnology Ba2014
Yeast extract Intron Biotechnology 48045
NaCl PanReac AppliChem 131659.1211
Agar Intron Biotechnology 25999
Ampicillin PanReac AppliChem A0839,0010
X-gal Duchefa X1402.1000
N,N-Dimethylformamide PanReac AppliChem 131785.1611
NucloSpin Plasmid Macherey-Nagel 22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3) Novagen 69387-3
Escherichia coli HT115(DE3) Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol Duchefa C 0113.0025
Glycerol PanReac AppliChem 122329.1211 87%
KH2PO4 PanReac AppliChem 131509.1210
K2HPO4 PanReac AppliChem 122333.1211
HCl PanReac AppliChem 131020.1211
Phenol Scharlau FE04791000 90%
Chloroform PanReac AppliChem A3691,1000
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column GE Healthcare Life Sciences 17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system GE Healthcare Life Sciences 11001313
Acrylamyde PanReac AppliChem A1089,1000 2K
N,N’-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich M7279-100G
Urea PanReac AppliChem 146392.1211
Boric acid PanReac AppliChem A2940,1000
Formamide PanReac AppliChem A0937,2500
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026-5G
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine Sigma-Aldrich A4929-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
  2. Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
  3. Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise? Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
  4. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4 (2017).
  5. Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
  6. Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).
  7. Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
  8. Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
  9. El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
  10. Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).
  11. Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
  12. Daròs, J. -A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).
  13. Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , Springer International Publishing Switzerland. 295-322 (2016).
  14. Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
  15. Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
  16. Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
  17. Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
  18. Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
  19. Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  21. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  22. Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
  23. Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
  24. Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
  25. López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).

Tags

Biochemie kwestie 141 Recombinant RNA circulaire RNA Viroïde tRNA ligase RNA aptamer Escherichia coli
De grootschalige productie van recombinante RNAs op een circulaire steiger met behulp van een systeem van Viroïde afkomstige in <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cordero, T., Aragonés, V.,… More

Cordero, T., Aragonés, V., Daròs, J. A. Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (141), e58472, doi:10.3791/58472 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter