Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Storskalaproduksjon av rekombinant RNAs på en sirkulær stillaset med en Viroid-avledet System i Escherichia coli

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58472
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universitat Politècnica de València, Spain

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å produsere store mengder rekombinant RNA i Escherichia coli ved co uttrykker en chimeric RNA som inneholder RNA av interesse i en viroid stillaset og en plante tRNA ligase. Hovedproduktet er en sirkulær molekyl som forenkler rensing å homogenitet.

Abstract

Med økende interesse RNA biologi og bruk av RNA molekyler i avanserte bioteknologisk programmer, er metoder for å produsere store mengder av rekombinant RNAs begrenset. Her beskriver vi en protokoll for å produsere store mengder rekombinant RNA i Escherichia coli basert på co uttrykk for et chimeric molekyl som inneholder RNA av interesse i en viroid stillaset og en plante tRNA ligase. Viroids er relativt liten, ikke-koding, svært base-sammenkoblet sirkulære RNAs som er smittsom for høyere planter. Verten plante tRNA ligase er et enzym rekruttert av viroids som tilhører familien Avsunviroidae, som aubergine latente viroid (ELVd), for å megle RNA circularization under viroid replikering. Selv om ELVd replikerer ikke i E. coli, en ELVd forløper er effektivt transkribert av E. coli RNA polymerase og behandlet av den innebygde hammerhead ribozymes i bakterielle celler, og de resulterende monomerer er circularized av den co uttrykt tRNA ligase nådde en bemerkelsesverdig konsentrasjon. Innsetting av en rundt ELVd stillaset kan titalls milligram rekombinant RNA per liter bakteriell kultur i vanlig laboratorium. En viktigste brøkdel av RNA produktet er rund, en funksjon som forenkler rensing av rekombinant RNA til virtuelle homogenitet. I denne protokollen settes et komplementære DNA (cDNA) svarer til RNA rundt i en bestemt plassering av ELVd cDNA i et uttrykk plasmider som brukes, langs plasmider co uttrykke aubergine tRNA ligase, for å transformere E. coli. Co uttrykk for både molekyler under kontroll av sterke konstituerende arrangører fører til produksjon av store mengder av rekombinant RNA. Den rekombinante RNA kan utdraget fra bakterieceller og atskilt fra hoveddelen av bakteriell RNAs utnytter circularity sin.

Introduction

I motsetning til DNA og proteiner er protokoller for enkel, effektiv og kostnadseffektiv produksjon av store mengder RNA ikke rikelig. Men sofistikert forskning og industri etterspørsel økende mengder av disse biomolecules å undersøke deres unike biologiske egenskaper1, eller å være ansatt i bioteknologisk programmer, inkludert deres bruk som svært spesifikke aptamers 2, terapeutiske agenter3eller Selektiv plantevernmidler4. In vitro transkripsjon og syntese er vanlig i forskning for å produsere RNA. Men innebærer metodene viktige begrensninger når store mengder av produkter. Den logiske alternativet er å bruke endogene transkripsjon maskiner av levende celler, etterfulgt av en renselsesprosess skille RNAs rundt fra mobilnettet følgesvenner. Etter denne strategien, metoder har blitt utviklet til å produsere rekombinant RNAs i bakterielle celler, for eksempel lab-vennlig Escherichia coli5 eller den marine lilla phototrophic alpha-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. de fleste metoder for å produsere rekombinant RNA i bakterier stole på uttrykket av en innfødt svært stabile RNA skafottet, som en tRNA eller en rRNA, der RNA rundt er satt7. Dette medfører nødvendigheten av å slippe RNA rundt av chimeric molekylet, hvis ekstra RNA er et problem for nedstrøms programmer8. En annen begrep i rekombinant RNA bioteknologi er produksjonen av rekombinant ribonucleoprotein komplekser som kan være det ønskede produktet sådan eller brukes som en beskyttende strategi for å øke stabiliteten av RNA interesse9, 10. Tilsvarende har produksjon av sirkulære RNAs også blitt foreslått som en strategi for å generere mer stabil produkter11.

Vi har nylig utviklet en ny metode for å produsere store mengder rekombinant RNA i E. coli som deltar i tre av de ovennevnte begrepene: innsetting av RNA rundt i en svært stabile sirkulær RNA stillaset og co uttrykk for den rekombinant RNA med et samspill protein til trolig produsere en stabil ribonucleoprotein kompleks som akkumuleres i bemerkelsesverdig mengder i bakterielle celler12. I motsetning til tidligere utviklingen brukte vi en RNA stillaset helt fremmed for E. coli, nemlig en viroid. Viroids er en meget spesiell type smittestoffer høyere planter som er utelukkende konstituert av en relativt liten (246-401 nt) svært base-sammenkoblet sirkulær RNA13. Interessant, viroids er ikke-koding RNAs, og uten hjelp fra sine egne proteiner, de er kjøpedyktig fullstendig komplekse smittsomme sykluser i den infiserte verter14. Disse syklusene ta RNA-til-RNA replikering i kjerner eller chloroplasts, avhengig av viroid familien,Pospiviroidae eller Avsunviroidae, henholdsvis-bevegelse gjennom infiserte anlegget og unndragelse av verten defensive svaret. Viroids må være rangert blant de mest stabile RNAs i naturen, som følge av å være en naken sirkulær RNA og måtte overleve i det fiendtlige miljøet av anlegget infiserte celler. Denne egenskapen kan gjøre viroids spesielt egnet som stillaser å stabilisere rekombinant RNA i bioteknologisk tilnærminger. I tillegg er den nye metoden basert på co uttrykk for viroid stillaset med et samspill planteprotein. Viroids replikere gjennom en rullende sirkel mekanisme i som vert enzymer er rekruttert til å katalysere de ulike trinnene i prosessen. Spesielt noen viroids, mer spesifikt de som tilhører familien Avsunviroidae15, inneholder ribozymes som er også involvert i replikering. Avhengig av den viroid arten, er transkripsjon av viroid RNAs formidlet av verten RNA polymerase II eller den chloroplastic kjernefysiske-kodet RNA polymerase (NEP). Viroid RNA behandling synes å være katalysert av en vert type-III RNase, selv om i viroids med ribozymes oligomeric RNA mellomprodukter selv cleave under replikering. Til slutt, de resulterende viroid monomerer er circularized, avhengig av viroid familien, vert DNA ligase 1 eller chloroplastic isoformen av tRNA ligase16,17. Dette siste enzymet er involvert i ligation av de monomerisk viroids i familien Avsunviroidae, som aubergine latente viroid (ELVd)18.

På en jobb å analysere sekvensen og strukturelle kravene til ELVd som bestemmer anerkjennelse av aubergine (Solanum melongena L.) tRNA ligase, vi satt opp en eksperimentell system basert på co uttrykk for både molekyler i E. coli 19. vi merke til at lengre enn enheten ELVd transkripsjoner selv cleave effektivt i E. coli celler gjennom den innebygde hammerhead ribozymes og at de resulterende viroid monomerer med 5'-hydroksyl og 2, 3-phosphodiester termini var effektivt circularized av co uttrykt aubergine tRNA ligase. Enda mer, nådd den resulterende sirkulære viroid RNA et uventet høy konsentrasjon i E. coli, overstiger de av endogene rRNAs12. Fravær av replikering mellomprodukter indikerte mangel ELVd RNA-til-RNA forsterkning i disse bakterielle celler. Interessant, hadde innsetting av heterologous RNAs i en bestemt plassering av viroid molekyl en moderat effekt på akkumulering av sirkulære viroid-avledet RNAs12. Disse observasjonene gjort oss forestille en metode for å produsere store mengder av rekombinant RNAs i bakterier. I denne metoden cDNAs tilsvarer RNAs rundt settes inn i ELVd-cDNA og den resulterende chimeric RNA uttrykkes i E. coli gjennom en sterk konstituerende promoter. For at systemet skal fungere, må E. coli co forvandles med en plasmider å uttrykke den aubergine tRNA ligase. ELVd-avledet lengre enn enheten transkripsjon behandles av innebygde hammerhead ribozymes og de resulterende monomerer med de aktuelle termini gjenkjennes og circularized av co uttrykt tRNA ligase. På denne måten settes RNA rundt inn i en meget stabil sirkulær stillaset bestående av viroid sirkulær molekylet. Denne rekombinant chimeric RNA er trolig ytterligere stabiliseres i de E. coli cellene ved dannelsen av en ribonucleoprotein komplekse gjennom samspill med tRNA ligase. Denne metoden (se protokollen nedenfor), RNA aptamers, hårnål RNAs og andre strukturert RNAs er lett produsert i mengder titalls milligram per liter av E. coli kultur i vanlig laboratorium og renset til homogenitet tar Utnytt sirkularitet12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plasmider konstruksjon

  1. Forsterke av PCR (eller omvendt transkripsjon PCR hvis starter fra en RNA mal) cDNA tilsvarer RNA rundt med primere med 5' forlengelsen for å tillate forsamlingen uttrykk plasmider. For å unngå uønskede mutasjoner, bruk en høy-troskapen DNA polymerase.
    1. Sette på cDNA i uttrykket plasmider av Gibson montering20, legge følgende 5' filtyper til PCR primere: fremover, 5-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; omvendt, 5-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X representerer nukleotider homologe til terminal endene av RNA rundt.
    2. Inkuber for 30 s på 98 ° C, etterfulgt av 30 sykluser av 10 s på 98 ° C, 30 s ved 55 ° C og 30 s ved 72 ° C og filtypen siste 10 min på 72 ° C.
  2. Digest 100 ng av plasmider pLELVd-BZB med 10 U av typen IIS begrensning enzymet Bpi jeg 1t på 37 ° C i en 20 µL reaksjon i en 0,5 mL tube buffer G (10 mM Tris-HCl, pH 7.5 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl 0,1 mg/mL BSA).
    Merk: Alle plasmider er tilgjengelig på forespørsel til tilsvarende forfatteren. BPI Jeg tilsvarer Bbs jeg.
  3. Skill PCR og fordøyelse produktene med geleelektroforese i en 1% agarose gel TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM eddiksyre, 1 mM EDTA, pH 7.2). Stain gel i 15 min av risting i 200-mL 0,5 µg/mL ethidium bromide. Visualisere DNA ved hjelp av en UV-transilluminator og kuttet båndene tilsvarer den forsterkede cDNA og den Bpi jeg-fordøyd plasmider (2046 bp) ved hjelp av en skalpell blad.
    Merk: BPI Jeg fordøyelsen av pLELVd-BZB utgivelser et 528 bp produkt tilsvarer LacZ blå-hvit reporteren.
  4. Elute DNAs fra gel fragmenter bruker silica gel kolonner (gel DNA recovery kit i Tabellen for materiale) og kvantifisere DNA konsentrasjonen av Spektrofotometri analyse.
  5. Definere en Gibson montering reaksjon med forsterket cDNA og fordøyd plasmider. Bruk en 3-fold molar overskudd av sett inn versus vektor20. Inkuber 1t ved 50 ° C og rense reaksjon produktene bruker en silica gel kolonne (DNA ren & konsentrator kit i Tabellen for materiale).
  6. Bruk renset produkter av Gibson montering reaksjonen til electroporate kompetent E. coli DH5α celler. 1 mm electroporation cuvettes, bruk følgende innstillinger: 1500 V og 5 ms. Incubate 1t på 37 ° C i super optimalisert buljong med catabolite undertrykkelse (SOC; 20 finans tryptone, 5 finans gjærekstrakt, 0,5 g/L NaCl, 2,5 KCl, 10 mM MgCl2 20 mM glukose, pH 7.0) flytende medium og deretter spredt på Luria-Bertani (LB; 10 g/L tryptone, 5 finans gjærekstrakt, 10 g/L NaCl) agar (1,5%) plater som inneholder 50 µg/mL ampicillin.
    1. Til skjermen for koloniene tilsvarer transformert E. coli spre kloner som trolig innsatsen, 15 min før plating electroporated cellene, 30 µL av 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) i vannistedenfor. Inkuber plater overnatting på 37 ° C.
  7. Plukk flere hvite kolonier og vokse over natten på 37 ° C i flytende LB medier. Rense plasmider bruker en miniprep kit (se Tabell for materiale) og analysere størrelsene av geleelektroforese i en 1% agarose gel TAE buffer.
  8. Velg den passende rekombinant plasmider basert på electrophoretic migrasjon sammenlignet med kontrollen pLELVd-BZB. Bekreft sekvensen av den valgte plasmider sekvensering med primere 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3 "og 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' som flanke hele uttrykket kassetten i pLELVd-BZB.
    Merk: Husk at denne plasmider inneholder en 528 bp-polylinker med LacZ markøren som erstattes av cDNA rundt. Begrensning kartlegging kan hjelpe for å velge rett rekombinant plasmider.

2. RNA uttrykk

  1. Co-electroporate (se betingelser i 1.6) belastning den valgte E. coli (E. coli BL21 eller en BL21 derivat) med den pLELVd-BZB-deriverte som inneholder cDNA tilsvarer RNA av interesse og plasmider p15LtRnlSm co uttrykke den aubergine tRNA ligase. Bruk E. coli HT115(DE3), som mangler RNase III21, uttrykke RNAs med lang double-strandet regioner.
    Merk: Begge RNA av interesse og tRNA ligase mRNA er transkribert av E. coli RNA polymerase. Ingen DE3 lysogen å uttrykke T7 RNA polymerase kreves i E. coli belastningen, selv om tilstedeværelsen av denne lysogen har ingen skadelige effekter.
  2. Plate electroporated bakterier i LB solid medium som inneholder 50 µg/mL ampicillin og 34 µg/mL chloramphenicol etter 1t inkubasjon på 37 ° C i SOC flytende medium. Ruge over natten på 37 ° C.
  3. Plukke en koloni og vaksinere en 1 L forvirret Erlenmeyer kolbe med 250 mL flytende kjempefint kjøttkraft (TB) medium (12 finans tryptone, 24 finans gjær ekstrakt, 0,4% glyserol, 0,17 M KH2PO4og 0,72 M K2HPO4), som inneholder 50 µg/mL ampicillin og 34 µg/mL chloramphenicol. Ruge på 37 ° C med kraftig risting på 180 omdreininger per minutt (rpm). Høste bakterier mellom 12 og 16 h etter kultur vaksinering.

3. RNA utvinning og rensing

  1. For analytiske formål, ta 2 mL dele kultur på ønsket tid points sentrifuge 14.000 x g i 2 min. Forkast nedbryting og resuspend cellene i 50 µL av TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 og 1 mM EDTA) av vortexing.
    1. Legge ett volum (50 µL) av en 1:1 (v/v) blanding av fenol (mettet med vann og equilibrated ved pH 8.0 med Tris-HCl, pH 8.0) og kloroform. Bryte cellene ved energisk vortexing og Skill vandige og organiske faser med sentrifugering i 5 min 14.000 x g.
    2. Nøye gjenopprette vandig faser (øvre) som inneholder totalt bakteriell RNA.
      Merk: Preparater kan lagres på 20 ° C for senere analyse.
  2. For skytevåpen formål, hell kultur i en 250 mL sentrifuge flaske og Nedspinning celler 14.000 x g for 10 min. Forkast nedbryting. Vask cellene av resuspending i 30 mL vann. Overføre til en sentrifuge rør og Nedspinning celler igjen under like forhold.
  3. Forkast nedbryting og resuspend cellene i 10 mL kromatografi bufferen (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 150 mM NaCl, 0.2 mM EDTA) av vortexing.
    Merk: Foreløpig kan celler være frosset om 20 ° C til å fortsette med rensing når som helst andre.
  4. Bruker en frisk eller tinte bakteriell forberedelse, bryte celler ved å legge til 1-volum (10 mL) av fenol: kloroform (se trinn 3.2) og vortexing kraftig.
  5. Sentrifuge for 10 min 12 000 x g, gjenopprette den vandige fasen og pakk ut med 1 volum (10 mL) på kloroform under like forhold.
    Merk: RNA utarbeidelse kan lagres på 20 ° C på dette punktet.
  6. Videre rense totale bakteriell RNA ved anion exchange kromatografi. Filtrere RNA forberedelse gjennom et 45 µm sprøyte filter og belastningen på kolonnevis 1 mL diethylethanolamine (DEAE).
    1. For kromatografi rensing, bruker du et flytende kromatografi system på en strømningshastighet på 1 mL/min. Før eksempel lasting equilibrate kolonnen med 10 mL kromatografi bufferen (se trinn 3.3 for sammensetning).
    2. Belaste prøven og vaske kolonnen med 10 mL kromatografi bufferen. Elute RNA med 20 mL elueringsbufferen (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 1 M NaCl, 0.2 mM EDTA) og samle 1 mL dele.
      Merk: RNA raskt elutes i første fraksjoner. Kolonnen kan være re-anvendt for ytterligere renselser. For dette, vask kolonnen med 10 mL vann og lagre på 4 ° C i 20% etanol.
  7. Siden en stor del av rekombinant RNA akkumuleres i E. coli i en sirkulær form, kan denne egenskapen være profittert for rensing homogenitet12. Skille sirkulære RNAs fra lineær motstykket av todimensjonal polyakrylamid gel geleelektroforese (2D side) ikke-denaturing og denaturing (8 M urea) forhold12,22.

4. RNA analyse

  1. Forbered en 5% polyakrylamid gel (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, masse ratio) i TBE buffer (89 mM Tris, 89 mM borsyre, 2 mM EDTA) som inneholder 8 M urea.
  2. Mix 20 µL av RNA preparater med 1-volum (20 µL) til å laste buffer (98% formamide, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.0025% bromophenol blå og 0.0025% xylen cyanol), ruge for 1,5 minutter til 95 ° C i en oppvarming blokk og feste kule på is.
  3. Last eksemplene i polyakrylamid gel og løpe geleelektroforese for riktig forhold avhengig av gel dimensjonene (f.ekskjøre 140 x 130 x 2 mm gelé 2,5 t 200 V). Stain gel i 15 min i 0,5 µg/mL ethidium bromide, vask med vann og visualisere RNA under UV-lys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å produsere rekombinant RNA i E. coli bruker ELVd-avledet systemet12, podet RNA rundt inn i en ELVd RNA stillaset. Denne chimeric RNA er co uttrykt langs den aubergine tRNA ligase i E. coli. Når behandlet, kløyvde og circularized, danner chimeric sirkulær RNA, som RNA rundt stikker sannsynlig en ribonucleoprotein kompleks med co uttrykt aubergine enzymet som bemerkelsesverdig konsentrasjon i bakterieceller ( Figur 1). Følgelig består første skritt for å produsere rekombinant RNA bruker dette systemet av innsetting cDNA tilsvarer RNA rundt på en bestemt plassering i ELVd cDNA, T245-T246 i ELVd-sekvensen varianten AJ536613. Plasmider pLELVd-BZB, som inneholder en polylinker på denne posisjon med to Bpi jeg anerkjennelse områder og et LacZ blå/hvit markør gen, forenkler denne innsetting av svært effektiv Gibson montering metoden20. Utvalg av transformert E. coli kloner som inneholder ønsket rekombinant plasmider er tilrettelagt av blå/hvit screening av LacZ markør. Plasmider som den doble Bpi jeg fordøyelsen var ufullstendige og kan ikke innlemme sett inn trolig produsere blå koloniene i nærvær av X-gal. Figur 2 viser electrophoretic analyse av flere rekombinant plasmider som forskjellige cDNAs ble satt inn. Disse plasmider viser forskjellige overføringer sammenlignet med pLELVd-BZB. Merk at pLELVd-BZB inneholder LacZ markøren (528 bp) som er erstattet av cDNA tilsvarer RNA rundt. Så, selv om dette er avhengig av størrelsen på den innsatte cDNA, rekombinant plasmider vanligvis overføre raskere enn kontroll plasmider (figur 2).

PLELVd-BZB-derivater som inneholder cDNAs tilsvarer RNAs rundt brukes langs p15LtRnlSm til co-electroporate E. coli. Co transformert bakterier velges på plater som inneholder ampicillin og chloramphenicol. Deretter valgt E. coli kloner dyrkes på 37 ° C med sterk agitasjon i rike TB medium. Under denne kultur forhold maksimert produksjon av rekombinant RNA er12. Tilstedeværelsen av rekombinant RNA i bakterier kan lett overvåkes av bryte cellene med en blanding av fenol og kloroform i nærvær av en buffer og analysere RNA, hvilke partisjoner i vandig buffer, av denaturing siden. Figur 3 viser ethidium bromide farget polyakrylamid gels i som totalt RNAs fra forskjellige E. coli kloner ble skilt. Bildene viser sterk band som tilsvarer tom ELVd og chimeric ELVd skjemaer som forskjellige RNAs rundt ble satt inn. Interessant finner vi en stor del av rekombinant RNA som sirkulær form. Bruke en kombinasjon av to sider under denaturing forhold på høyt og lavt ioniske styrke, kan circularity av viktigste delen av rekombinant RNA lett observeres (Figur 4).

Avhengig av programmet nedstrøms, den totale E. coli RNA forberedelse som inneholder den chimeric ELVd-RNA rundt kan være målet for gjeldende protokollen. Men når nødvendig, kan RNA utarbeidelse videre renses anion exchange kromatografi. Chromatogram i figur 5 viser effektiv oppbevaring av E. coli RNA på kolonnen lav ioniske styrke (150 mM NaCl) og påfølgende elueringsrør høy ioniske styrke (1 M NaCl). De fleste av de samles i fraksjoner 2 og 3. For å rense den rekombinante RNA til homogenitet, kan nytte av sirkularitet tas. Sirkulære RNAs er forsinket med hensyn til sine lineær kolleger i denaturing forhold22. Disse RNAs kan være elut fra gel etter ethidium bromide farging. Bruk av en solubilizable polyakrylamid gel, som de krysskoblet med N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, forenkler rensing av store mengder av rekombinant RNAs (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av det viroid-systemet å produsere rekombinant RNA i E.coli. CDNA tilsvarer RNA rundt (de 98 nt lange RNA aptamer spinat i ordningen) settes inn i plasmider pLELVd-BZB. E. coli er co transformert med pLELVd-BZB-derivater og plasmider p15LtRnlSm co uttrykke aubergine tRNA ligase. I E. coli, chimeric ELVd-spinat RNA transkripsjon er selv kløyvde (rød pilspisser) av viroid hammerhead ribozymes. Den resulterende monomer er anerkjent av co uttrykt tRNA ligase og circularized. Den rekombinante RNA består av en sirkulær viroid stillaset som stikker RNA rundt (i grønt). Akkumulering av rekombinant RNA til store mengder i E. coli sannsynlig resultat av stabilisering av ribonucleoprotein med tRNA ligase. I tillegg til delt ELVd cDNA, plasmider pLELVd-BZB inneholder en pUC replikering opprinnelse (pUC ori), en ampicillin utvalg genet (AmpR), E. coli murine lipoprotein (lpp) arrangøren og rRNA (rrnC) terminator og LacZ markør. Plasmider p15LtRnlSm inneholder en p15A replikering opprinnelse (p15A ori), et chloramphenicol motstand gen (CmR), E. coli lpp arrangøren og en phage T7 transkripsjon terminator, i tillegg til aubergine tRNA ligase cDNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Electrophoretic analyse av pLELVd-BZB-avledet uttrykk plasmider som inneholder forskjellige cDNAs rundt. Plasmider ble skilt av geleelektroforese i en 1% agarose gel som var farget med ethidium bromide. Lane 1, DNA markør med størrelser i kbp noen komponenter på venstre. Lane 2, pLELVd-BZB; Lane 3, pLELVd-BZB derivat å uttrykke en tom ELVd; baner 4 til 7, pLELVd-BZB derivater å uttrykke RNA aptamer spinat (lane 4), streptavidin bindende aptamer (lane 5), en RNA hårnål med en sammenhengende 42 bp double-strandet region (lane 6) og de 3 cap-uavhengig oversettelse enhancer (SITERE) av en plante virus (lane 7). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Rekombinant RNA produsert i E. coli ved hjelp av viroid-baserte systemet. Totalt RNAs fra forskjellige E. coli kloner ble hentet av behandling med fenol: kloroform og dele med denaturing siden. Gels med ethidium bromide vises. Rekombinant RNAs ble produsert i E. coli (A) BL21(DE3) og (B) HT115(DE3). (A og B) baner 1, RNA markør med størrelser i nt til venstre; kjørefelt 2, RNAs fra E. coli kloner å uttrykke en tom ELVd (333 nt). (A) baner 3 og 4, RNAs fra E. coli kloner å uttrykke en chimeric ELVd skjemaet som inneholder aptamer spinat (98 nt) og streptavidin bindende aptamer (42 nt), henholdsvis. (B) Lane 3, RNAs fra en E. coli klone å uttrykke et chimeric ELVd skjema som inneholder en 42 bp lang dobbel strandet RNA. Røde piler peker til de sirkulære rekombinant RNAs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Circularity av rekombinant RNA produsert i E. coli ved hjelp av viroid-baserte systemet. Totalt RNAs fra en E. coli klone å uttrykke en chimeric ELVd som inneholder aptamer spinat var atskilt med 2D denaturing siden først under høy og deretter lav ioniske styrke. Geléer var farget med ethidium bromide. De blå pilene viser retninger av electrophoretic migrasjon. Den røde pilen peker på sirkulære ELVd-spinat er selektivt forsinket fra lineær motstykket til samme størrelse under to separasjonene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Brukt kromatografiske rensing av en rekombinant RNA produsert i E. coli ved hjelp av viroid-baserte systemet. Totalt RNAs fra en E. coli -klone som produserer en chimeric ELVd-3' SITERE (55 nt) ble lastet på en DEAE kromatografi kolonne som ble vasket i nærvær av 150 mM NaCl. RNA ble elut i nærvær av 1 M NaCl. Chromatogram viser absorbans ved 254 nm (blå linjen) og ledningsevne i mS/cm (oransje linje) versus volum. De ulike trinnene av brukt kromatografiske separasjon (balanse, injeksjon, vask, elueringsrør og kolonnen regenerering) angis. Samlet fraksjoner er også indikert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Rensing å homogenitet av en rekombinant RNA produsert i E. coli ved hjelp av viroid-baserte systemet. Totalt RNAs fra en E. coli -klone som produserer en chimeric ELVd-3' SITERE ble først renset ved kromatografi bruker en DEAE-Sepharose-kolonne og deretter atskilt med 2D-siden. Første gel ble kjørt under denaturing betingelser (8 M urea, buffer TBE). Etter med ethidium bromide ble gel bandet som inneholder sirkulær form av rekombinant RNA overført til toppen av en andre gel som ble kjørt under ikke-denaturing tilstand (buffer TAE). Akrylamid i andre gel var krysskoblet med N, N'-bis (acryloyl) cystamine, som solubilization av gel fragment som inneholder den rene rekombinant RNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens forskning ELVd sekvensen og struktur krav involvert i erkjennelsen av aubergine tRNA ligase, la vi merke til at co uttrykk for både molekyler i ikke-vert E. coli førte til en uventede store opphopning av viroid runde skjemaer i bakterieceller19. Vi forsto at store akkumulering av viroid RNA i E. coli sannsynligvis var konsekvensen av co uttrykke en svært stabile RNA molekylet, som den relativt liten (333 nt), svært basert-sammenkoblet, sirkulære viroid og et protein som denne bestemt viroid viser høy affinitet. ELVd RNA må rekruttere vert tRNA ligase å megle sin circularization under replikering i infiserte anlegget17. Selv om vi ikke har eksperimentell bekreftelse, forventer vi at begge molekyler danner en ribonucleoprotein kompleks i E. coli som ytterligere stabiliserer viroid RNA og tillater nå bemerkelsesverdig konsentrasjonen av 150 mg per liter bakteriell kultur som sterkt overstiger de av endogene RNAs, som rRNAs12. Siden ELVd ikke replikerer i E. coli, tenkte vi at innsetting av en heterologous ikke skulle dramatisk påvirke opphopning av viroid-avledet RNA og, faktisk, det var tilfelle. Denne observasjonen er grunnlaget for metoden å produsere store mengder rekombinant RNA i E. coli som beskriver vi her. Metoden bruker sirkulær RNA molekylet av ELVd som et stillas som RNA av interesse er presentert. For å produsere en sirkulær ELVd stillaset i E. coli, trenger vi å uttrykke en forløper RNA med duplisert domenet viroid hammerhead ribozyme. ELVd ribozymes selv cleave svært effektivt i E. coli og de resulterende viroid monomerer gjenkjennes og circularized av co uttrykt tRNA ligase. Co uttrykk for tRNA ligase er en viktig funksjon av systemet. ELVd RNA oppdages knapt i E. coli med mindre dette enzymet er co uttrykt12.

I vår protokollen kan plasmider pLELVd-BZB sette inn cDNA tilsvarer RNA rundt av enkel og effektiv Gibson montering mellom posisjoner U245 og U246 av ELVd. Dette nettstedet tilsvarer terminal løkken av en lang hairpin i de mest sannsynlige ELVd konformasjon24,25. Innsetting i denne bestemte posisjonen må fremme at RNA rundt stikker fra svært stabil stillaset dannet av ELVd og må unngå intramolekylære samspillet mellom RNA rundt og ELVd (figur 1). Vi har ikke utforsket effekten av innsetting RNA interesse for alternativ posisjoner av ELVd molekyl. Plasmider p15LtRnlSm lar co uttrykk for aubergine tRNA ligase. RNAs er transkribert i begge plasmider under kontroll av en konstituerende sterk E. coli promoter, nemlig murein lipoprotein (lpp). Dette gjør systemet konstituerende uten behov for induksjon. Men vi kan også bygge en lignende plasmider (p15tRnlSm) å uttrykke tRNA ligase under kontroll av phage T7 RNA polymerase i et isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induserbart system. Bruker denne plasmider, oppstår akkumulering av rekombinant RNA bare etter innledningen av tRNA ligase uttrykk ved å legge IPTG12. I dagens system uttrykt RNA av interesse fra en høy kopi nummer plasmider med pUC replikering opprinnelse, mens tRNA ligase uttrykkes fra en moderat kopi nummer plasmider med p15A replikering opprinnelse. Om endre kopien antall både plasmider involvert i systemet forbedrer opphopning av rekombinant RNA ikke har blitt undersøkt så langt. Størrelsen dataområdet RNA rundt innrømmet av systemet er ikke systematisk undersøkt heller, selv om små RNAs er logisk ventet å samle til høyere konsentrasjoner enn større markeder.

En av grunnene til hvorfor produksjon av rekombinant RNA i vivo ikke er lett er sannsynligvis på grunn av iboende lav halveringstiden av RNA molekyler. Vårt system er ikke fremmed for dette problemet. Faktisk på en sen E. coli voksende fase, begynner akkumulering av rekombinant å redusere for å forsvinne nesten12. Dette styrker å finne høyre vinduet å høste celler. Vi observert, skjønt, at dette vinduet er stor nok til at systemet blir brukervennlig. Men vi også observert at vinduet optimal avhenger av mange faktorer, inkludert den bestemt E. coli belastning, kultur medium, vekstforhold (agitasjon, volumet av flasken, lufting, etc.) og fysiologiske scenen av bakterier brukes til å starte flytende kulturen. Vi anbefaler at du starter rekombinant RNA produksjonen med fersk E. coli kolonier fra en plate inokulert gårsdagen og vokst på 37 ° C. Lagre plater i kjøleskapet gjør vinduet harvest mer uforutsigbart. Vi fikk mest konsekvente resultater ved å starte flytende kulturer med bakterier plukket fra en plate med en tannpirker. Bruk av en flytende pre kultur, kjører spesielt hvis mettet, også til variasjon i produksjon-protokollen.

Om rensing, behandling av bakterielle celler med fenol: kloroform er en svært effektiv måte å bryte cellene og gir kvantitative utvinning av totale bakteriell RNA i den vandige fasen. Avhengig av nedstrøms anvendelse av rekombinant RNA, kan denne vandige fasen eller blandingen som fremskynde RNA fra denne vandige fasen med en alkohol være nok. Hvis ytterligere rensing er nødvendig, anbefaler vi anion exchange kromatografi bruker en DEAE anion exchange kolonne (figur 5). Dette rensing trinnet gir effektiv fjerning av DNA og bakteriell metabolitter som også partisjonert i den vandige fasen. Hvis nedstrøms anvendelse av rekombinant RNA krever rensing å homogenitet, tilbyr viroid-avledet systemet en klar fordel i forhold til andre metoder. Siden en viktigste brøkdel av rekombinant RNA er produsert som en sirkulær form, kan nytte av denne egenskapen tatt å skille det fra hoveddelen av bakteriell RNAs. Sirkulære RNAs oppleve en forsinkelse i electrophoretic migrasjon i denaturing betingelser med hensyn til de lineære kolleger på samme størrelse22. Denne forsinkelsen er tydeligere når RNA er electrophoresed under nedre ioniske styrke. I praksis, sirkulære RNAs kan også blitt adskilt av todimensjonal denaturing side under høyt og lavt ioniske styrker (Figur 4). Etter electrophoretic separasjon, må den rekombinante RNA være elut fra gel. Bruk av en reversibel kryss-linker av akrylamid, som N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, forenkler utvinning, spesielt når rensende store mengder RNA (figur 6). Til slutt, hvis nedstrøms av den produsert programkravene separasjon av RNA rundt skafottet viroid, tilbyr ikke våre protokollen noen bestemt fordel å metodene. RNA rundt må kreditert i chimeric molekylet bruker noen av de tidligere beskrevet strategiene, som bruk av ribozymes, DNAzymes, eller muligens mest effektive, bruk av RNase H guidet av to DNA oligonucleotides7. Prøver å unngå dette siste trinnet tungvint rensing, har vi arbeidet med å redusere størrelsen på viroid skafottet, men med delvis suksess. Vi kunne produsere betydelige mengder av rekombinant bruker viroid slettet skjemaer (175 og 215 246 nt) men økende sletting av viroid stillaset korrelert med minkende akkumulering12.

I sum, er her en protokoll beskrevet for å produsere store mengder rekombinant RNA i E. coli som, til vår kunnskap, forbedrer avkastningen av tidligere publiserte metoder. Protokollen er basert co uttrykk i E. coli av den rundt i en viroid (ELVd)-stillaset og aubergine tRNA ligase, enzymet som circularizes denne viroid i infiserte planter. Et karakteristisk trekk ved våre protokollen er at rekombinant RNA produseres hovedsakelig som en sirkulær form, en egenskap som forenkler rensing å homogenitet for nedstrøms programmer. Bruker denne protokollen titusener av milligram rekombinant RNA enkelt kan produseres per liter E. coli kultur i vanlig laboratorieforhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at teknologien beskrevet i denne protokollen er patentert (oss Patent nr. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd BIO2017-83184-R og BIO2017-91865-EXP fra den spanske Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (co finansiert ble tildelt und fond).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F530S
Bpi I Thermo Scientific ER1011
Agarose Conda 8010 D1 low EEO
Tris PanReac AppliChem A1086,1000
Acetic acid PanReac AppliChem 131008.1214
EDTA Sigma-Aldrich E5134-500G
Ethidium bromide PanReac AppliChem A1152,0025 1%
Zymoclean Gel DNA Recovery Zymo Research D4001
NanoDrop ThermoFisher Scientific ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England BioLabs E2621S
DNA Clean & Concentrator Zymo Research D4003
Eporator Eppendorf 4309000019
Escherichia coli DH5α Invitrogen 18265-017
Tryptone Intron Biotechnology Ba2014
Yeast extract Intron Biotechnology 48045
NaCl PanReac AppliChem 131659.1211
Agar Intron Biotechnology 25999
Ampicillin PanReac AppliChem A0839,0010
X-gal Duchefa X1402.1000
N,N-Dimethylformamide PanReac AppliChem 131785.1611
NucloSpin Plasmid Macherey-Nagel 22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3) Novagen 69387-3
Escherichia coli HT115(DE3) Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol Duchefa C 0113.0025
Glycerol PanReac AppliChem 122329.1211 87%
KH2PO4 PanReac AppliChem 131509.1210
K2HPO4 PanReac AppliChem 122333.1211
HCl PanReac AppliChem 131020.1211
Phenol Scharlau FE04791000 90%
Chloroform PanReac AppliChem A3691,1000
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column GE Healthcare Life Sciences 17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system GE Healthcare Life Sciences 11001313
Acrylamyde PanReac AppliChem A1089,1000 2K
N,N’-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich M7279-100G
Urea PanReac AppliChem 146392.1211
Boric acid PanReac AppliChem A2940,1000
Formamide PanReac AppliChem A0937,2500
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026-5G
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine Sigma-Aldrich A4929-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
  2. Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
  3. Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise? Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
  4. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4 (2017).
  5. Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
  6. Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).
  7. Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
  8. Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
  9. El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
  10. Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).
  11. Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
  12. Daròs, J. -A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).
  13. Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , Springer International Publishing Switzerland. 295-322 (2016).
  14. Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
  15. Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
  16. Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
  17. Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
  18. Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
  19. Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  21. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  22. Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
  23. Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
  24. Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
  25. López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).

Tags

Biokjemi problemet 141 rekombinant RNA sirkulære RNA viroid tRNA ligase RNA aptamer Escherichia coli
Storskalaproduksjon av rekombinant RNAs på en sirkulær stillaset med en Viroid-avledet System i <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cordero, T., Aragonés, V.,… More

Cordero, T., Aragonés, V., Daròs, J. A. Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (141), e58472, doi:10.3791/58472 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter