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Biochemistry

Production à grande échelle d’ARN Recombinant sur un échafaudage circulaire utilisant un système dérivé de Viroid chez Escherichia coli

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58472
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universitat Politècnica de València, Spain

Summary

Nous présentons ici un protocole pour produire de grandes quantités d’ARN recombiné dans Escherichia coli en exprimant conjointement un ARN chimérique qui contient de l’ARN d’intérêt à un échafaudage viroïde et une usine ligase d’ARNt. Le produit principal est une molécule circulaire qui facilite la purification jusqu'à homogénéité.

Abstract

Avec un intérêt croissant dans biologie des ARN et de l’utilisation de molécules d’ARN dans des applications biotechnologiques sophistiquées, les méthodes pour produire de grandes quantités d’ARN recombinant sont limités. Nous décrivons ici un protocole pour produire de grandes quantités d’ARN recombiné dans Escherichia coli , basé sur la co-expression de molécule chimérique qui contient de l’ARN d’intérêt dans un échafaudage viroïde et une usine de ligase d’ARNt. Viroïdes sont relativement petites, non codante, fortement couplé base ARN circulaire qui est infectieux aux plantes supérieures. L’hôte plante tRNA ligase est une enzyme recrutée par les viroïdes qui appartiennent à la famille Avsunviroidae, tels que l' aubergine viroid latent (ELVd), comme médiateur circularization RNA lors de la réplication viroïde. Bien que ELVd ne se répliquent pas dans e. coli, un précurseur ELVd est efficacement transcrits par l’ARN polymérase d’e. coli et traité par les ribozymes hammerhead embarqués dans des cellules bactériennes et les monomères résultants sont prospectés par la ligase d’ARNt exprimée conjointement pour atteindre une concentration remarquable. L’insertion d’un ARN d’intérêt dans l’échafaudage ELVd permet la production de dizaines de milligrammes de recombinant RNA par litre de culture bactérienne dans des conditions de laboratoire réguliers. Une fraction principale du produit RNA est circulaire, une fonctionnalité qui facilite la purification de l’ARN recombiné à l’homogénéité de virtuelle. Dans le présent protocole, un ADN (cDNA) complémentaire correspondant à l’ARN d’intérêt est inséré dans une position particulière du cDNA ELVd dans un plasmide d’expression qui est utilisé, le long du plasmide d’exprimer conjointement aubergine ligase d’ARNt, pour transformer les e. coli. La co-expression de ces deux molécules sous le contrôle des promoteurs constitutifs fortes mène à la production de grandes quantités de l’ARN recombiné. L’ARN recombiné peut être extrait des cellules bactériennes et séparé de la majeure partie des ARN bactérien en profitant de sa circularité.

Introduction

Contrairement à l’ADN et les protéines, les protocoles pour simple, efficace et rentable de production de grandes quantités d’ARN ne sont pas abondantes. Cependant, recherche et industrie demande augmentant les montants de ces biomolécules pour étudier leurs propriétés biologiques uniques1ou devant être utilisés dans sophistiquée des applications biotechnologiques, y compris leur utilisation comme aptamères hautement spécifiques 2, agents thérapeutiques3ou pesticides sélectifs4. Transcription in vitro et synthèse chimique sont couramment utilisés en recherche pour produire des RNA. Cependant, ces méthodes entraînent des limitations importantes lorsque de grandes quantités de produits sont nécessaires. L’alternative logique consiste à utiliser la machinerie de transcription endogène des cellules vivantes, suivie d’un processus de purification pour séparer les compagnons cellulaires de l’ARN d’intérêt. Suite à cette stratégie, des méthodes ont été développées pour produire des ARN recombinants dans des cellules bactériennes, telles que le laboratoire de l’environnement Escherichia coli5 ou la marine violet phototrophe alpha-protéobactérie Rhodovolum sulfidophilum 6. la plupart des méthodes pour produire des ARN recombiné dans les bactéries s’appuient sur l’expression d’un échafaudage de RNA extrêmement stable indigène, tels qu’un ARNt ou un ARNr, dans lequel l’ARN d’intérêt est inséré7. Cela impose la nécessité de libérer l’ARN d’intérêt hors de la molécule chimérique, si la présence d’ARN supplémentaire est un problème pour les applications en aval à8. Un autre concept en recombinant biotechnologie RNA est la production des complexes ribonucléoprotéiques recombinant qui peut être le produit désiré en soi ou utilisés comme une stratégie de protection pour augmenter la stabilité de l’ARN d’intérêt9, 10. De même, la production d’ARN circulaire a également été suggérée comme une stratégie visant à générer la plus stable de produits11.

Nous avons récemment développé une nouvelle méthode pour produire de grandes quantités d’ARN recombiné dans e. coli qui participe à trois des concepts ci-dessus : l’insertion de l’ARN d’intérêt dans un échafaudage de RNA circulaire très stable et la co-expression de la ARN recombiné avec une protéine d’interaction pour produire probablement un complexe ribonucléoprotéique stable qui s’accumule en quantités remarquables dans bacterial cells12. Par contraste avec les développements précédents, nous avons utilisé un échafaudage de RNA totalement étranger à e. coli, à savoir un viroïde. Viroïdes sont un type très particulier d’agents infectieux des plantes supérieures qui sont exclusivement constitués par une relativement petite (nt 246-401) fortement couplé base circulaire RNA13. Fait intéressant, les viroïdes sont non-coding RNAs et, sans aide de leurs propres protéines, ils sont capables de remplir des cycles complexes infectieuses dans les hôtes infectés14. Ces cycles incluent la réplication de l’ARN-à-ARN dans les noyaux ou les chloroplastes, selon la famille du viroïde —Pospiviroidae ou Avsunviroidae, respectivement — mouvement à travers la plante infectée et l’évasion de la réponse défensive de l’hôte. Viroïdes doivent être classés parmi les ARN plus stables dans la nature, par suite d’avoir un ARN circulaire nue et devoir survivre dans l’environnement hostile des cellules végétales infectés. Cette propriété peut rendre les viroïdes particulièrement adapté comme les échafaudages pour stabiliser recombinant RNA dans les approches biotechnologiques. En outre, la nouvelle méthode s’inspire de la co-expression de l’échafaud viroïde avec une interaction protéine végétale. Viroïdes se répliquent via un mécanisme de cercle roulant dans quel hôte enzymes sont recrutés pour catalyser les différentes étapes du processus. Notamment certains viroïdes, plus particulièrement ceux qui appartiennent à la famille Avsunviroidae15contiennent des ribozymes également impliqués dans la réplication. Selon l’espèce viroïde, transcription du viroïde RNAs est médiée par l’hôte de l’ARN polymérase II ou le chloroplaste codées ARN polymérase (NEP). Traitement du viroïde RNA semble être catalysée par un hôte type III RNase, bien que dans les viroïdes ribozymes ARN oligomériques intermédiaires cleave automatique lors de la réplication. Enfin, les monomères viroïde qui en résultent sont prospectés, selon la famille du viroïde, par la hôte DNA ligase 1 ou l’isoforme chloroplastique de tRNA ligase16,17. Cette dernière enzyme est impliquée dans la ligature des formes monomères des viroïdes appartenant à la famille Avsunviroidae, tels que l' aubergine viroid latent (ELVd)18.

Dans le cadre d’un travail d’analyser les exigences structurelles et séquence de ELVd qui déterminent la reconnaissance de l’aubergine (Solanum melongena L.) ligase d’ARNt, nous avons mis en place un système expérimental basé sur la co-expression de ces deux molécules chez e. coli 19. nous avons remarqué que transcriptions ELVd plus-que-unit cleave automatique efficacement dans les cellules d’Escherichia coli par les ribozymes hammerhead incorporé et que les résultante monomères viroïde avec 5'-hydroxyle et 2', 3'-phosphodiester termini était prospectés efficacement par la ligase d’ARNt aubergine conjointement exprimé. Plus encore, l’ARN viroïde circulaire qui en résulte atteint une concentration élevée inattendue chez e. coli, supérieures à celles de l' endogène rRNA12. Absence d’intermédiaires de réplication a indiqué manque d’amplification ELVd ARN-à-ARN dans ces cellules bactériennes. Fait intéressant, insertion de RNAs hétérologues dans une position particulière de la molécule du viroïde avait un effet modéré sur l’accumulation de l' ARN circulaire viroïde dérivés12. Ces observations nous a fait imaginer une méthode pour produire de grandes quantités de recombinaison ARN chez les bactéries. Dans cette méthode, l’ADNc correspondant à l’ARN d’intérêt sont insérés dans le cDNA ELVd et l’ARN chimérique qui en résulte est exprimée chez e. coli par un promoteur constitutif fort. Pour le système fonctionne, e. coli doit être transformé conjointement avec un plasmide d’exprimer la ligase tRNA aubergine. La transcription de plus-que-unit ELVd-dérivé est traitée par les ribozymes hammerhead embarqués et les monomères qui en résulte avec la termini appropriée sont reconnus et prospectés par la ligase tRNA conjointement exprimé. De cette façon, l’ARN d’intérêt est insérée dans un échafaudage circulaire très stable composé de la molécule circulaire viroïde. Cet ARN chimérique recombinant est très probablement encore stabilisé à l’intérieur des cellules d’Escherichia coli par la formation d’un complexe grâce à l’interaction avec la ligase d’ARNt ribonucléoprotéique. En utilisant cette méthode (voir le protocole ci-dessous), RNA aptamères, hairpin RNAs et autres ARN structurés ont été produites en quantités de dizaines de milligrammes par litre de culture d’e. coli dans des conditions de laboratoire réguliers et purifiée jusqu'à homogénéité prenant facilement avantage de circularité12.

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Protocol

1. Construction de plasmide

  1. Amplification par PCR (ou par transcription inverse PCR si partant d’un modèle de RNA) l’ADNc correspondant à l’ARN d’intérêt en utilisant des amorces avec extension de 5' pour permettre à l’Assemblée dans le plasmide d’expression. Pour éviter des mutations indésirables, utilisez une ADN polymérase haute fidélité.
    1. Pour insérer l’ADNc dans le plasmide d’expression par Gibson Assemblée20, ajoutez les extensions suivantes 5' pour les amorces PCR : vers l’avant, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; inverse, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X représente les nucléotides homologues aux extrémités terminales de l’ARN d’intérêt.
    2. Incuber pendant 30 s à 98 ° C, suivi de 30 cycles de 10 s à 98 ° C, 30 s à 55 ° C et 30 s à 72 ° C et une extension finale de 10 min à 72 ° C.
  2. Digest 100 ng de plasmide pLELVd-BZB avec 10 U de l’enzyme de restriction de type IIS Bpi j’ai pendant 1 h à 37 ° C dans une réaction de 20 µL dans un 0,5 mL tube dans un tampon G (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl 0,1 mg/mL de BSA).
    Remarque : Tous les plasmides sont disponibles sur demande à l’auteur correspondant. BPI J’ai équivaut à Bbs je.
  3. Séparer les produits de la digestion et PCR par électrophorèse sur un gel d’agarose de 1 % dans un tampon TAE (40 mM Tris, 20 mM d’acide acétique, EDTA 1 mM, pH 7,2). Souillez le gel pendant 15 min en secouant dans 200 mL 0,5 µg/mL de bromure d’éthidium. Visualiser l’ADN à l’aide d’un Transilluminateur UV et couper les bandes correspondant à l’ADNc amplifié et le Bpi j’ai digéré plasmide (bp 2046) à l’aide d’une lame de bistouri.
    Remarque : BPI J’ai la digestion des pLELVd-BZB libère également un produit bp 528 correspondant au journaliste LacZ bleu-blanc.
  4. Éluer les ADN des fragments gel à l’aide de colonnes de gel de silice (gel kit de récupération d’ADN dans la Table des matières) et mesurer la concentration d’ADN par analyse spectrophotométrique.
  5. Mettre en place une réaction de l’Assemblée de Gibson à l’aide de l’ADNc amplifié et le plasmide digéré. Utiliser un excès molaire 3 voies de l’insert par rapport à vecteur20. Incuber pendant 1 heure à 50 ° C et purifier les produits de la réaction à l’aide d’une colonne de gel de silice (ADN propre & kit de concentrateur dans la Table des matières).
  6. Utiliser les produits purifiés de la réaction de l’Assemblée de Gibson à oligonucléotides compétente e. coli DH5α cellules. À l’aide de cuves d’électroporation de 1 mm, appliquer les paramètres suivants : 1 500 V et 5 Mme incuber pendant 1 h à 37 ° C dans la bouillon super optimisé avec la répression catabolique (SOC ; tryptone 20 g/L, extrait de levure 5 g/L, 0,5 g/L de NaCl, KCl, 10 mM MgCl2 2,5 mM 20 mM de glucose, pH 7,0) milieu liquide et puis propagation sur Luria-Bertani (LB, tryptone 10 g/L, extrait de levure 5 g/L, 10 g/L de NaCl) plaques contenant 50 ampicilline de µg/mL de gélose (1,5 %).
    1. Pour dépister les colonies correspondant à transformé e. coli clones qui probablement constituée de l’insert, 15 min avant l’électroporation des cellules, de placage diffuser 30 µL de 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) dans diméthylformamide. Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C.
  7. Choisissez plusieurs colonies blanches et se développer pendant une nuit à 37 ° C dans un milieu liquide LB. Purifier les plasmides en utilisant un miniprep kit (voir Table des matières) et analyser leurs tailles par électrophorèse sur un gel d’agarose de 1 % dans un tampon TAE.
  8. Sélectionnez le plasmide recombinant probablement basé sur la migration électrophorétique par rapport au contrôle pLELVd-BZB. Confirmer la séquence du plasmide sélectionné par séquençage à l’aide d’amorces 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' et 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' qui flanquent la cassette d’expression tout en pLELVd-BZB.
    Remarque : N’oubliez pas que ce plasmide contienne un polylinker bp 528 avec le marqueur LacZ qui est remplacé par le cDNA d’intérêt. Cartographie de restriction peut aider à sélectionner les plasmides recombinants droite.

2. Expression de l’ARN

  1. Co-electroporate (voir conditions au point 1.6) le certains e. coli souche (e. coli BL21 ou un dérivé BL21) avec le pLELVd-BZB-dérivé qui contient l’ADNc correspondant à l’ARN d’intérêt et le plasmide p15LtRnlSm exprimer conjointement le aubergine ligase d’ARNt. Utiliser les e. coli HT115(DE3), qui manque de RNase III21, pour exprimer RNAs avec régions de long double-brin.
    Remarque : Les deux l’ARN d’intérêt et la ligase tRNA ARNm sont transcrits par l’ARN polymérase d’e. coli . Aucun lysogène DE3 à express ARN polymérase T7 n’est requise dans la souche e. coli , bien que la présence de cette lysogène n’a aucun effet nuisible.
  2. Après 1 h d’incubation à 37 ° C dans un milieu liquide SOC, plaque électroporation de bactéries dans le milieu solid LB contenant 50 µg/mL ampicilline et 34 chloramphénicol µg/mL. Incuber une nuit à 37 ° C.
  3. Prélever une colonie et ensemencer un 1 L dérouté erlenmeyer de 250 ml de liquide bouillon formidable (TB) milieu (12 g/L tryptone, 24 g/L extrait de levure, 0,4 % de glycérol, 0,17 M KH2PO4et 0,72 M K2HPO4), contenant 50 ampicilline µg/mL et 34 µg/mL au chloramphénicol. Incuber à 37 ° C sous agitation vigoureuse à 180 tours / minute (tr/min). Récolter des bactéries entre 12 et 16 h après l’inoculation de la culture.

3. purification et Extraction de l’ARN

  1. À des fins analytiques, prendre 2 ml de la culture aux points temps désiré et centrifuger à 14 000 x g pendant 2 min. jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 50 µL de tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 et 1 mM EDTA) au vortex.
    1. Ajouter un volume (50 µL) d’un mélange de 1:1 (v/v) de phénol (saturé d’eau et équilibrées à pH 8.0 avec Tris-HCl, pH 8,0) et le chloroforme. Briser les cellules au vortex vigoureux et séparer les phases aqueuses et organiques par centrifugation pendant 5 min à 14 000 x g.
    2. Soigneusement récupérer les phases aqueuses (en haut) qui contient de l’ARN bactérien total.
      Remarque : Les préparations peuvent être stockées à-20 ° C pour une analyse ultérieure.
  2. Fins préparative, versez la culture dans un flacon de 250 mL Centrifugeuse et la centrifuger les cellules à 14 000 x g pendant 10 min. jetez surnageant. Laver les cellules par resuspendant dans 30 mL d’eau. Transférer dans un tube à centrifuger et faire tourner les cellules à nouveau dans les mêmes conditions.
  3. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de tampon par chromatographie (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0. 2 mM EDTA) au vortex.
    Remarque : En ce moment, les cellules peuvent être congelés à-20 ° C à procéder à la purification à tout autre moment.
  4. En utilisant une préparation bactérienne fraîche ou décongelée, briser les cellules en ajoutant 1 volume (10 mL) de phénol : chloroforme (Voir l’étape 3.2) et mélangé au vortex vigoureusement.
  5. Centrifuger pendant 10 min à 12 000 x g, récupérer la phase aqueuse et réextraire et 1 volume (10 mL) de chloroforme dans les mêmes conditions.
    Remarque : La préparation d’ARN peut être stockée à-20 ° C à ce stade.
  6. Encore purifier l’ARN bactérien total par chromatographie échangeuse d’anions. Filtrer la préparation d’ARN grâce à une seringue-filtre m 45 et la charge sur une colonne de diethylethanolamine (DEAE) de 1 mL.
    1. Pour la purification par chromatographie, utilisent un système de chromatographie en phase liquide à un débit de 1 mL/min. Avant l’échantillon de chargement, équilibrer la colonne avec 10 mL de tampon par chromatographie (Voir l’étape 3.3 pour la composition).
    2. Charger l’échantillon et laver la colonne avec 10 mL de tampon par chromatographie. Éluer RNA avec 20 mL de tampon d’élution (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 1 M NaCl, 0. 2 mM EDTA) et recueillir des aliquotes de 1 mL.
      Remarque : RNA élué rapidement dans les fractions initiales. La colonne peut être réutilisée pour plus amples des purifications. Pour cela, laver la colonne avec 10 mL d’eau et conserver à 4 ° C à 20 % d’éthanol.
  7. Depuis la majeure partie de la recombinaison que RNA s’accumule chez e. coli dans une forme circulaire, cette propriété peut être profitée pour la purification d’homogénéité12. Séparer les ARN circulaires les homologues linéaires par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à deux dimensions (PAGE 2D) combinant non dénaturants et dénaturation (8 M urée) conditions12,22.

4. analyse de l’ARN

  1. Préparer un gel de polyacrylamide de 5 % (37.5:1 acrylamyde :N, N'- methylenebisacrylamide, rapport de masse) en TBE tampon (89 mM Tris, d’acide borique 89 mM, 2 mM EDTA) contenant 8 M urée.
  2. Mélanger 20 µL de préparations d’ARN et 1 volume (20 µL) de chargement d’un tampon (98 % formamide, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM, bleu de bromophénol 0,0025 % et 0,0025 % de xylène cyanol), incuber pendant 1,5 minutes à 95 ° C dans un bloc chauffant et snap refroidir sur glace.
  3. Charger les échantillons dans le gel de polyacrylamide et exécuter l’électrophorèse à des conditions appropriées en fonction des dimensions de gel (par exemple, exécutez 140 x 130 x 2 mm gels pour 2,5 h à 200 V). Souillez le gel pendant 15 min dans le bromure d’éthidium 0,5 µg/mL, laver avec de l’eau et visualiser les RNA sous la lumière UV.

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Representative Results

Pour produire le recombinant RNA chez e. coli en utilisant le système dérivé de ELVd12, l’ARN d’intérêt est greffée sur un échafaudage ELVd ARN. Cet ARN chimérique est exprimé conjointement le long de la ligase d’ARNt aubergine chez e. coli. Une fois traitées, clivés et prospectés, l’ARN circulaire chimérique, qui dépasse de l’ARN d’intérêt, constitue sans doute une ribonucléoprotéine complexe avec l’enzyme aubergine conjointement exprimée qui atteint une concentration remarquable dans les cellules bactériennes ( Figure 1). Par conséquent, la première étape pour produire des ARN recombiné à l’aide de ce système consiste à insérer l’ADNc correspondant à l’ARN d’intérêt dans une position particulière dans le cDNA ELVd, T245-T246 dans la variante de séquence ELVd AJ536613. Plasmide pLELVd-BZB, qui contient un polylinker sur cette position avec deux Bpi j’ai reconnaissance sites et un gène bleu/blanc marqueur LacZ, facilite cette insertion par l’Assemblée de Gibson très efficace méthode20. Sélection de transformé e. coli clones contenant les plasmides recombinants désirées est facilitée par la projection de bleu/blanc de marqueur LacZ. Plasmides dans lequel la double Bpi j’ai digestion était incomplet et pas incorporer les colonies de bleu susceptibles de produire des insert en présence de le X-gal. La figure 2 illustre l’analyse électrophorétique des plusieurs plasmides recombinants dans lequel différents ADNc ont été insérés. Ces plasmides montrent différentes migrations par rapport aux pLELVd-BZB. Notez que pLELVd-BZB contient le marqueur LacZ (528 bp) qui est remplacé par l’ADNc correspondant à l’ARN d’intérêt. Donc, bien que cela dépende de la taille de l’ADNc inséré, les plasmides recombinants migrent habituellement plus rapidement que le plasmide contrôle (Figure 2).

Les pLELVd-BZB-dérivés qui contiennent les ADNc correspondant à l’ARN d’intérêt sont utilisés le long de la p15LtRnlSm à co-electroporate e. coli. Bactéries co transformées sont sélectionnés sur des plaques contenant de l’ampicilline et chloramphénicol. Choisis ensuite, e. coli clones sont cultivées à 37 ° C avec agitation forte dans le milieu riche de TB. Dans ce conditions de culture, la production de la recombinaison QU'ARN est maximisée12. La présence de l’ARN recombiné dans les bactéries peut être facilement contrôlée par briser les cellules avec un mélange de phénol et de chloroforme en présence d’une mémoire tampon et l’analyse de l’ARN, les partitions dans le tampon aqueux, en dénaturant la PAGE. Voir la figure 3 du bromure d’éthidium coloré dans lequel ARN total de différentes e. coli clones ont été séparés des gels de polyacrylamide. Les photos montrent des bandes fortes qui correspondent aux ELVd vide et chimérique ELVd formes dans lesquelles différents ARN d’intérêt ont été insérés. Fait intéressant, nous trouvons une fraction importante de l’ARN recombiné comme forme circulaire. En utilisant une combinaison de deux PAGEs dans des conditions de dénaturation à force ionique haute et basse, la circularité de la fraction principale de la recombinante RNA peut être facilement observée (Figure 4).

Selon l’application en aval, le total d’e. coli RNA préparation qui contient l’ELVd-ARN chimérique d’intérêt peut être l’objectif du protocole actuel. Toutefois, lorsque nécessaire, la préparation d’ARN peut être purifiée davantage par chromatographie échangeuse d’anions. Chromatogramme de la Figure 5 montre le maintien efficace de e. coli RNA sur la colonne à faible force ionique (NaCl 150 mM) et d’élution ultérieure à force ionique élevée (1 M NaCl). La plupart de l’ARN sont recueillis dans les fractions 2 et 3. Pour purifier l’ARN recombiné jusqu'à homogénéité, on peut prendre avantage de circularité. ARN circulaire est retardées par rapport à leurs homologues linéaires en dénaturant des conditions22. Ces ARN peut être éluée du gel après coloration au bromure d’éthidium. L’utilisation d’un gel de polyacrylamide solubilizable, tels que ceux avec N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, facilite la purification d’une grande quantité d’ARN recombinant (Figure 6).

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique du viroïde-système pour produire un ARN recombiné dans e. coli. L’ADNc correspondant à l’ARN d’intérêt (le 98 nt-long RNA aptamère épinards dans le schéma) est inséré dans le plasmide pLELVd-BZB. E. coli est transformé conjointement avec le p15LtRnlSm pLELVd-BZB-DERIVE et plasmide d’exprimer conjointement aubergine ligase d’ARNt. Dans E. coli, le transcrit chimérique ELVd-épinards est autonome clivées (flèches rouges) par le viroïde hammerhead ribozymes. Le monomère qui en résulte est reconnu par la ligase tRNA conjointement exprimé et prospecté. L’ARN recombiné se compose d’un échafaudage circulaire viroïde d'où dépasse l’ARN d’intérêt (en vert). Accumulation de l’ARN recombiné à de grandes quantités chez e. coli probable résulte de la stabilisation de la ribonucléoprotéine complexe avec ligase d’ARNt. Outre la scission ELVd cDNA, plasmide pLELVd-BZB contient une origine de réplication pUC (pUC ori), un gène de sélection de l’ampicilline (AmpR), le promoteur de lipoprotéines murin (lpp) d’e. coli et terminator ARNr (rrnC) et le gène LacZ marqueur. P15LtRnlSm de plasmide contient une origine de réplication p15A (ori p15A), un gène de résistance de chloramphénicol (CmR), le promoteur d’e. coli lpp et un terminateur de transcription phage T7, en plus de l’aubergine tRNA ligase ADNc. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : l’analyse électrophorétique des plasmides d’expression dérivés du pLELVd-BZB qui contiennent différents ADNc d’intérêt. Plasmides sont séparés par électrophorèse dans un gel d’agarose à 1 % qui était taché avec du bromure d’éthidium. Lane 1, marqueur d’ADN avec des tailles en kbp de certains des composants sur la gauche ; allée 2, pLELVd-BZB ; piste 3, dérivé de pLELVd-BZB à exprimer une ELVd vide ; voies de 4 à 7, dérivés pLELVd-BZB à exprimer l’aptamère RNA épinards (piste 4), l’aptamère de liaison streptavidine (piste 5), une épingle à cheveux de RNA avec une zone contiguë 42 bp double-brin (voie 6) et la 3' traduction chapeau-indépendante enhancer (CITE) d’une plante virus (voie 7). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : ARN recombiné produite par e. coli en utilisant le système viroïde. ARN total clones différents d’e. coli ont été extraits par un traitement au phénol : chloroforme et aliquotes séparés par dénaturation PAGE. Gels colorés au bromure d’éthidium sont indiqués. ARN recombinant ont été produites en BL21 (DE3) de e. coli (A) et (B) HT115(DE3). (A et B) 1 voies, marqueur de RNA avec tailles dans nt à gauche ; voies 2, ARN de clones d’e. coli pour exprimer une ELVd vide (333 nt). (A) pistes 3 et 4, ARN de clones d’e. coli pour exprimer une chimère ELVd forment contenant l’aptamère épinards (98 nt) et l’aptamère de liaison streptavidine (42 nt), respectivement. (B) voie 3, ARN d’un clone d’e. coli pour exprimer une forme de ELVd chimérique contenant un ARN double brin 42 de Pb. Flèches rouges indiquent l’ARN recombinant circulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Circularité de l’ARN recombiné produite par e. coli en utilisant le système viroïde. ARN total d’un clone d’e. coli pour exprimer une ELVd chimérique qui contient l’aptamère épinards ont été séparés par 2D dénaturation PAGE tout d’abord sous haute puis sous faible force ionique. Les gels ont été colorés avec du bromure d’éthidium. Les flèches bleues indiquent les directions de la migration électrophorétique. La flèche rouge pointe vers le ELVd-épinards circulaire qui sont sélectivement retardée des homologues linéaires de même taille lors des séparation deux des. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Purification par chromatographie d’un recombinant RNA produite par e. coli en utilisant le système viroïde. ARN total d’un clone d’e. coli qui produit une chimère ELVd-3' CITE (55 nt) ont été chargés sur une colonne de chromatographie DEAE qui a été lavée en présence de NaCl 150 mM. RNA est éluée en présence de 1 NaCl M. Le chromatogramme montre l’absorbance à 254 nm (ligne bleue) et la conductivité en mS/cm (ligne orange) versus volume. Les différentes étapes de la séparation chromatographique (régénération de l’équilibration, injection, lavage, élution et colonne) sont indiqués. Fractions collectées sont également indiquées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Purification à l’homogénéité d’un recombinant RNA produite par e. coli en utilisant le système viroïde. ARN total d’un clone d’e. coli qui produit une chimère ELVd-3' CITE étaient d’abord purifiée par chromatographie sur une colonne de DEAE-Sépharose et puis séparé par PAGE 2D. Premier gel a été exécuté sous dénaturer des conditions (8 M urée, tampon TBE). Après coloration au bromure d’éthidium, la bande de gel qui contienne la forme circulaire de l’ARN recombiné a été transférée vers le haut d’un deuxième gel qui a été exécuté sous condition de non-dénaturisation (tampon TAE). L’acrylamide du deuxième gel a été réticulé avec N, N'-cystamine bis (acryloyl), qui a permis la solubilisation du fragment gel contenant l’ARN recombiné pure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Tout en cherchant la séquence ELVd et exigences de structure impliquées dans la reconnaissance de la ligase tRNA aubergine, nous avons remarqué que la co-expression de chacune des molécules dans les non-hôtes de e. coli a conduit à une accumulation importante inattendue du viroïde circulaire formules dans les cellules bactériennes,19. Nous avons compris que la grande accumulation du viroïde RNA chez e. coli est très probablement la conséquence d’exprimer conjointement une molécule d’ARN très stable, telles que la relativement faible (333 nt), fortement basée appariés, viroïde circulaire et une protéine pour lesquelles cela viroïde particulier affiche haute affinité. ELVd ARN doit recruter la ligase d’ARNt hôte pour atténuer son circularization lors de la réplication dans la plante infectée17. Bien que nous n’avons pas de confirmation expérimentale, nous prévoyons que les deux molécules forment un complexe chez e. coli qui stabilise le viroïde RNA et permet de rejoindre la remarquable concentration de 150 mg par litre de bactérien ribonucléoprotéique culture très supérieure à celles des ARN endogènes, telles que le rRNA12. Étant donné que ELVd ne réplique pas chez e. coli, nous avons pensé que l’insertion d’un ARN hétérologue n’allait pas affecter considérablement l’accumulation de l’ARN viroïde-dérivé et, en fait, c’était le cas. Cette observation est la base de la méthode pour produire de grandes quantités de recombinant RNA chez e. coli que nous décrivons ici. La méthode utilise la molécule d’ARN circulaire de ELVd comme un échafaudage sur lequel est présenté l’ARN d’intérêt. Pour produire un échafaudage ELVd circulaire chez e. coli, nous devons lui exprimer un précurseur RNA avec le double domaine du viroïde hammerhead ribozyme. ELVd ribozymes cleave automatique très efficacement chez e. coli et les monomères viroïde qui en résultent sont reconnus et prospectés par la ligase tRNA conjointement exprimé. La co-expression de la ligase tRNA est un élément clé du système. ELVd ARN est difficilement détecté chez e. coli à moins que cette enzyme particulière est exprimée conjointement12.

Dans notre protocole, plasmide pLELVd-BZB permet d’insérer l’ADNc correspondant à l’ARN d’intérêt par l’Assemblée de Gibson simple et efficace entre les positions U245 et U246 de ELVd. Ce site correspond à la boucle terminale d’une longue épingle à cheveux présent dans le plus probable ELVd conformation24,25. Insertion dans cette position particulière doit promouvoir que l’ARN d’intérêt émerge de l’échafaud très stable formé par ELVd et qu’il doit éviter une interaction intramoléculaire entre l’ARN d’intérêt et ELVd (Figure 1). Nous n’avons pas exploré l’effet de l’insertion de l’ARN d’intérêt dans les autres positions de la molécule ELVd. Plasmide p15LtRnlSm permet la co-expression de la ligase tRNA aubergine. RNAs sont transcrits dans les deux plasmides sous le contrôle d’un fort constitutive e. coli promoteur, à savoir des lipoprotéines de muréine (lpp). Cela rend le système constitutive sans avoir besoin de l’induction. Cependant, nous construisons également un plasmide similaire (p15tRnlSm) pour exprimer la ligase tRNA sous le contrôle de la phage T7 RNA polymérase dans un système induisible d’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). À l’aide de ce plasmide, accumulation de l’ARN recombiné se produit seulement après induction de l’expression de tRNA ligase en ajoutant l’IPTG12. Dans le système actuel, l’ARN d’intérêt est exprimé d’un plasmide de nombre élevé de copies avec une origine de réplication pUC, tandis que la ligase tRNA est exprimée d’un plasmide numéro de copie modérée avec une origine de réplication p15A. Si modifier le nombre de copies les deux plasmides impliqués dans le système améliore l’accumulation de la recombinante RNA n’a pas été explorée jusqu’ici. La gamme de taille de l’ARN d’intérêt reconnu par le système n’a pas été systématiquement étudiés soit, bien que les petits ARN devraient logiquement s’accumuler à des concentrations plus élevées que les grandes quantités.

Une des raisons pourquoi la production d’ARN recombiné in vivo n’est pas facile est très probablement en raison de la demi-vie intrinsèque faible des molécules d’ARN. Notre système n’est pas étranger à ce problème. En fait, à une fin d’e. coli phase de plus en plus, accumulation d’ARN recombiné commence à diminuer pour disparaître pratiquement12. Cela oblige à trouver la fenêtre de droite de récolter les cellules. Nous avons observé, cependant, que cette fenêtre est assez grande pour rendre le système sympathique. Cependant, nous avons également observé que la fenêtre optimale dépend de nombreux facteurs, y compris le particulier e. coli de souche, milieu de culture, de plus en plus des conditions (agitation, volume de la fiole, aération, etc..) et le stade physiologique de la bactérie permet de démarrer la culture liquide. Nous recommandions de commencer la production d’ARN recombinante aide frais e. coli des colonies sur une plaque inoculé la veille et cultivées à 37 ° C. Ranger les assiettes dans le réfrigérateur rend la fenêtre de récolte plus imprévisible. Nous avons obtenu les résultats les plus cohérents en démarrant des cultures liquides avec bactéries choisies dans une plaque avec un cure-dent. L’utilisation d’un liquide pré-culture, particulièrement si saturé, conduit également à la variabilité dans le protocole de production.

Au sujet de la purification, traitement des cellules bactériennes avec du phénol : chloroforme est une manière très efficace pour briser les cellules et permet la récupération quantitative de l’ARN bactérien total dans la phase aqueuse. Selon l’application en aval de la recombinante RNA, cette phase aqueuse ou l’établissement qui résulte de la précipitation de l’ARN de cette phase aqueuse avec un alcool peut suffire. Si une purification est nécessaire, nous vous recommandons de chromatographie échangeuse d’anions à l’aide d’une colonne échangeuse d’anion DEAE (Figure 5). Cette étape de purification permet une élimination efficace de l’ADN et des métabolites bactériens qui aussi divisé dans la phase aqueuse. Si l’application en aval de l’ARN recombiné requiert purification jusqu'à homogénéité, le système dérivé viroïde offre un avantage évident par rapport aux autres méthodes. Puisqu’une fraction principale de l’ARN recombiné est produite sous une forme circulaire, avantage de cette propriété peut être prise pour séparer de la majeure partie des ARN bactérien. ARN circulaire expérimenter un délai dans la migration électrophorétique en dénaturer des conditions en ce qui concerne les homologues linéaires de la même taille22. Ce retard est plus prononcé lorsque l’ARN est grande sous basse force ionique. Dans la pratique, peut d’ARN circulaire également été séparés en deux dimensions PAGE dénaturation sous haute et basse des forces ioniques (Figure 4). Après séparation par électrophorèse, l’ARN recombiné doit être élué du gel. L’utilisation d’un réticulant réversible de l’acrylamide, tels que N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, facilite la récupération, notamment lorsque la purification de grandes quantités de l’ARN (Figure 6). Enfin, si l’application en aval de l’ARN produit réclame la séparation de l’ARN d’intérêt de l’échafaud viroïde, notre protocole n’offre aucun avantage particulier aux méthodes précédentes. L’ARN d’intérêt doit être excisé de la molécule chimérique en utilisant certaines des stratégies décrites précédemment, telles que l’utilisation des ribozymes, ADNzymes ou, peut-être plus efficace, l’utilisation de la RNase H guidé par deux ADN oligonucléotides7. Essayant d’éviter cette dernière étape de purification lourde, nous avons travaillé à tenter de réduire la taille de l’échafaudage viroïde, mais avec un succès partiel. Nous avons été en mesure de produire des quantités notables d’ARN recombiné à l’aide de formes viroïde supprimé (175, 215 et 246 nt) mais augmentant les destructions de l’échafaudage viroïde corrélée avec une diminution de l’accumulation de12.

En somme, un protocole est décrit ici pour produire de grandes quantités d’ARN recombiné dans e. coli qui, à notre connaissance, améliore le rendement des méthodes publiées antérieurement. Le protocole est basé de co-expression chez e. coli de l’ARN d’intérêt inséré dans un échafaudage viroid (ELVd) et la ligase d’ARNt aubergine, l’enzyme qui circularizes ce viroïde chez les plants infectés. Un trait distinctif de notre protocole est que recombinant que RNA est produit principalement comme une forme circulaire, une propriété qui facilite la purification jusqu'à homogénéité pour applications en aval. Utilisant ce protocole des dizaines de milligrammes de recombinant que RNA peut être facilement produite par litre de culture d’e. coli dans des conditions de laboratoire réguliers.

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Disclosures

Les auteurs déclarent que la technologie décrite dans le présent protocole a été breveté (nous brevet no. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les subventions BIO2017-83184-R et BIO2017-91865-EXP de l’espagnol Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (fonds de cofinancement FEDER).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F530S
Bpi I Thermo Scientific ER1011
Agarose Conda 8010 D1 low EEO
Tris PanReac AppliChem A1086,1000
Acetic acid PanReac AppliChem 131008.1214
EDTA Sigma-Aldrich E5134-500G
Ethidium bromide PanReac AppliChem A1152,0025 1%
Zymoclean Gel DNA Recovery Zymo Research D4001
NanoDrop ThermoFisher Scientific ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England BioLabs E2621S
DNA Clean & Concentrator Zymo Research D4003
Eporator Eppendorf 4309000019
Escherichia coli DH5α Invitrogen 18265-017
Tryptone Intron Biotechnology Ba2014
Yeast extract Intron Biotechnology 48045
NaCl PanReac AppliChem 131659.1211
Agar Intron Biotechnology 25999
Ampicillin PanReac AppliChem A0839,0010
X-gal Duchefa X1402.1000
N,N-Dimethylformamide PanReac AppliChem 131785.1611
NucloSpin Plasmid Macherey-Nagel 22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3) Novagen 69387-3
Escherichia coli HT115(DE3) Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol Duchefa C 0113.0025
Glycerol PanReac AppliChem 122329.1211 87%
KH2PO4 PanReac AppliChem 131509.1210
K2HPO4 PanReac AppliChem 122333.1211
HCl PanReac AppliChem 131020.1211
Phenol Scharlau FE04791000 90%
Chloroform PanReac AppliChem A3691,1000
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column GE Healthcare Life Sciences 17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system GE Healthcare Life Sciences 11001313
Acrylamyde PanReac AppliChem A1089,1000 2K
N,N’-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich M7279-100G
Urea PanReac AppliChem 146392.1211
Boric acid PanReac AppliChem A2940,1000
Formamide PanReac AppliChem A0937,2500
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026-5G
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine Sigma-Aldrich A4929-5G

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Biochimie numéro 141 recombinaison ARN ARN circulaire viroïde ligase d’ARNt RNA aptamère Escherichia coli
Production à grande échelle d’ARN Recombinant sur un échafaudage circulaire utilisant un système dérivé de Viroid chez <em>Escherichia coli</em>
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Cordero, T., Aragonés, V., Daròs, J. A. Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (141), e58472, doi:10.3791/58472 (2018).

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