Summary
여기, 선물이 공동 표현 공상 RNA 바이로이드 비 계 및 식물에 대 한 관심의 RNA를 포함 하 여 많은 양의 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 프로토콜 tRNA 리가. 주요 제품은 동질성을 정화를 용이 하 게 원형 분자 이다.
Abstract
RNA 생물학과 정교한 바이오 응용 프로그램에서 RNA 분자의 사용에 대 한 관심 증가, 재조합 RNAs의 다량을 생성 하는 방법을 제한 됩니다. 우리가 많은 양의 바이로이드 비 계 및 식물에 대 한 관심의 RNA를 포함 하는 공상 분자의 공동 식에 따라 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 프로토콜을 설명 하는 여기, tRNA 리가. Viroids는 상대적으로 작은, 비 코딩, 높은 베이스 결합 원형 RNAs 더 높은 식물에 전염성이 있다. 호스트 공장 tRNA 리가 중재 바이로이드 복제 동안 RNA circularization Avsunviroidae, 가지 잠재 바이로이드 (ELVd), 같은 가족에 속하는 viroids에 의해 보충 하는 효소 이다. 비록 ELVd 대장균에 복제 하지 않습니다, ELVd 전조 대장균 RNA 중 합 효소에 의해 복사할 효율적 이며 임베디드 귀상어 ribozymes 세균성 세포에 의해 처리 결과 단위체에 의해 circularized는 공동 표현된 tRNA 리가 놀라운 농도 도달입니다. ELVd 비 계에의 한 RNA의 삽입 당 세균성 문화 일반 실험실 조건에서의 재조합 RNA의 밀리 그램 수만의 생산 수 있습니다. RNA 제품의 주요 일부분 이다 원형, 가상 동질성을 재조합 RNA의 정화를 용이 하 게 하는 기능. 이 프로토콜에는 보완 DNA (cDNA)에 해당 하는 관심의 RNA는 사용 되는, 공동 가지 tRNA 리가 표현 하는 플라스 미드 따라 대장균을 변환 하는 식 플라스 미드에 ELVd cDNA의 특정 위치에 삽입 됩니다. 강력한 제정 발기인의 통제 아래 두 분자의 공동 식 대량의 재조합 RNA의 생산 리드. 재조합 RNA 세균 세포에서 추출 하 고 세균성 RNAs의 순환 활용의 대부분에서 분리 수 있습니다.
Introduction
DNA와 단백질, 대조적으로 많은 양의 RNA의 쉽게, 효율적이 고 비용 효율적인 생산을 위한 프로토콜 풍부 하지 않습니다. 그러나, 연구 및 산업 수요 또는 그들의 독특한 생물 속성1, 조사에 사용할 이러한 생체의 금액을 증가 정교한 매우 구체적인 aptamers로 그들의 사용을 포함 한 바이오 응용 프로그램 2, 치료제3또는 선택적인 농약4. 생체 외에서 전사 및 화학 합성 일반적으로 사용 됩니다 연구에서 RNA를 생산. 그러나, 이러한 방법은 제품의 대용량이 필요한 경우 중요 한 한계를 수반. 논리적 대안 살아있는 세포, 세포 동료 로부터 관심의 RNAs를 분리 하는 정화 과정 뒤의 내 인 성 전사 기계를 사용 하는 것입니다. 이 전략에 따라 방법은 실험실-친화 등의 세균성 세포에서 재조합 RNAs를 생산 하기 위해 개발 되었다 대장균5 나는 해양 보라색 광합성 알파-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. 세균에 재조합 RNA를 생성 하는 대부분의 메서드와 tRNA 또는 관심의 RNA가는 rRNA 삽입7같은 네이티브 매우 안정적인 RNA 발판의 표현에 의존. 이 여분의 RNA의 존재는8다운스트림 응용 프로그램 대 한 문제 경우 공상 분자에서 관심의 RNA를 공개의 필요성을 부과 한다. 재조합 RNA 생명 공학의 또 다른 개념은 재조합 ribonucleoprotein 단지는 원하는 제품 당 있을 수 있습니다 또는 보호 전략으로 관심9, RNA의 안정성을 증가 하는 데 사용의 생산 10. 마찬가지로, 원형 RNAs의 생산 또한 더 안정적인 제품11을 생성 하는 전략으로 제안 되었습니다.
우리는 최근 많은 양의 3 위의 개념에 참여 하는 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 새로운 방법을 개발: 매우 안정적인 원형 RNA 비 계에 대 한 관심의 RNA와의 공동 식의 삽입은 박테리아의 놀라운 금액에 축적 가능성이 복잡 한 안정 되어 있는 ribonucleoprotein를 생산 하는 상호 작용 단백질으로 재조합 RNA 세포12. 이전 개발, 달리 완전히 외계인 대장균, 즉 바이로이드 RNA 발판을 사용 했습니다. Viroids는 매우 특별 한 종류 (246-401 nt) 상대적으로 작은 의해 독점적으로 구성 되는 더 높은 식물의 전염 성 요원의 높은 베이스 결합 원형 RNA13. 흥미롭게도, viroids는 비 코딩 RNAs 그리고, 그들의 자신의 단백질에서 도움 없이, 그들은 감염 된 호스트14에서 복잡 한 감염 주기를 완료 수 있습니다. 이러한 사이클 핵 또는 엽록체, 바이로이드 가족에 따라 RNA RNA 복제 포함-Pospiviroidae 또는 Avsunviroidae각각-감염 된 식물 및 호스트 방어 반응의 회피를 통해 이동. Viroids는 자연, 누드 원형 RNA 되 고 감염 된 식물 세포의 적대 하는 환경에서 생존 하는 것 때문에 가장 안정적인 RNAs 중 평가 해야 합니다. 이 속성 viroids 건설 기계 바이오 접근에 재조합 RNA 안정화에 특히 적합 한 만들 수 있습니다. 또한, 새로운 메서드는 상호 작용 식물 단백질 바이로이드 발판의 공동 식 기반으로 합니다. Viroids는 호스트에 효소 촉매 과정의 다른 단계를 모집 롤링 원 메커니즘을 통해 복제 합니다. 특히 일부 viroids, 좀 더 구체적으로 그 가족 Avsunviroidae15에 속하는 ribozymes 또한 복제에 관련 된 포함 되어 있습니다. 바이로이드 종에 따라 바이로이드 RNAs의 전사는 RNA 중 합 효소 II 호스트나는 chloroplastic 인코딩 핵 RNA 중 합 효소 (NEP)에 의해 중재 됩니다. 바이로이드 RNA 처리 호스트에 의해 촉매 될 것 유형 III RNase, 비록 ribozymes oligomeric RNA와 viroids에서 중간체는 자기 복제 하는 동안 다니엘. 마지막으로, 결과 바이로이드 단위체는 circularized, 바이로이드 가족에 따라 호스트 DNA 리가 1 또는 tRNA 리가16,17의 chloroplastic isoform에 의해. 이 마지막 효소 가지 잠재 바이로이드 (ELVd)18등 가족 Avsunviroidae, viroids의 단위체 형태의 결 찰에 포함 된다.
가지 (지속의 총칭 melongena L.)에 의해 인정을 결정 하는 ELVd의 순서 및 구조 요구를 분석 하는 작업 과정에서 tRNA 리가 우리 대장균 에 두 분자의 공동 식에 따라 실험 시스템 설정 19. 우리 것으로 나타났습니다 그 단위 보다 더 긴 ELVd 증명서 자체 쪼개 효율적으로 임베디드 귀상어 ribozymes 통해 대장균 세포에 결과 바이로이드 단위체와 5'-수 산 기 2', 3'-phosphodiester 테르미니 했다 효율적으로 공동 표현된 가지 tRNA 리가 여 circularized. 더욱, 결과 원형 바이로이드의 RNA 생 rRNAs12의 초과 대장균에서 예기치 않은 높은 농도 도달. 복제 중간체의 부재가 세균 세포에서 ELVd RNA RNA 증폭의 부족을 표시. 흥미롭게도, 바이로이드 분자의 특정 위치에 분리 RNAs의 삽입 원형 바이로이드 파생 RNAs12의 축적에 온건한 영향을 미쳤다. 이러한 관측 우리가 많은 양의 재조합 박테리아에 RNAs 생산 하는 방법을 구상 했다. 이 방법에서는, cDNAs의 RNAs에 해당 ELVd cDNA에 삽입 하 고 결과 공상 RNA 강한 제정 발기인 통해 대장균 에서 표현 된다. 시스템 작동에 대 한 대장균 공동 가지 tRNA 리가 표현 하는 플라스 미드와 변형 될 해야 합니다. ELVd에서 파생 된 단위 보다 더 이상 사본 포함된 귀상어 ribozymes에 의해 처리 되 고 적절 한 테르미니와 결과 단위체는 인식 하 고 공동 표현된 tRNA 리가 여 circularized. 이러한 방법으로, 관심의 RNA 바이로이드 원형 분자의 구성 된 매우 안정적인 원형 발판에 삽입 됩니다. 이 재조합 공상 RNA는 대부분의 아마 더 tRNA 리가와 상호 작용을 통해 복잡 한 ribonucleoprotein의 형성에 의해 대장균 세포 안으로 안정. 이 메서드를 사용 하 여 (프로토콜 아래 참조), RNA aptamers, 헤어핀 RNAs 및 다른 구조화 된 RNAs 쉽게 일반 실험실 조건에서 대장균 문화의 리터 당 밀리 그램의 10의 금액에서 생산 되었고 복용 동질성을 정화 원형12의 장점입니다.
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Protocol
1. 플라스 미드 건설
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PCR에 의해 (또는) 반전 녹음 방송 RNA 서식 파일에서 시작 하는 경우에, PCR에 의해 증폭 식 플라스 미드에 있도록 5' 확장명이 뇌관을 사용 하 여 관심사의 RNA에 해당 하는 cDNA. 고 충실도 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 원치 않는 변이 방지.
- 깁슨 어셈블리20식 플라스 미드에는 cDNA를 삽입 하려면 다음 5' 확장 PCR 뇌관을 추가: 앞으로, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; 역, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X의 RNA의 터미널 끝에 뉴클레오티드를 동종을 나타냅니다.
- 30 품 어 98 ° c, s 10의 30 주기 다음 s 98 ° C, 30에서 55 ° C와 30에서 s s 72 ° C, 및 72 ° c.에서 10 분의 마지막 확장에
- 다이제스트 100 ng의 플라스 미드 pLELVd-BZB 10 U 유형 IIS 제한 효소 Bpi 의 0.5 ml에서 20 µ L 반응에서 37 ° C에서 1 시간을 위한 나 버퍼 G (10 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 m m MgCl2, 50 mM NaCl에 관 0.1 mg/mL BSA).
참고: 모든 플라스 미드는 해당 저자에 대 한 요청에 사용할 수 있습니다. Bpi 나는 Bbs 나. - 에 태 버퍼 (40 m m Tris, 20 m m 초 산, 1 m m EDTA, pH 7.2)에서 1 %agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR 및 소화 제품을 구분 합니다. 15 분 동안 젤 0.5 µ g/mL ethidium 평범한 사람 200 mL에 떨고 하 여 얼룩. UV transilluminator를 사용 하 여 DNA를 시각화 하 고 증폭 된 cDNA 및 Bpi 나 소화 플라스 미드 (2046 bp) 메스 블레이드를 사용 하 여 해당 하는 밴드를 잘라.
참고: Bpi 내가 pLELVd BZB의 소화는 또한 해당 LacZ 블루 화이트 기자 하 528 bp 상품을 출시 하였습니다. - 실리 카 젤 열 ( 테이블의 자료에 DNA 복구 키트 젤)을 사용 하 여 젤 조각에서 DNAs elute 그리고 spectrophotometric 분석에 의해 DNA 농도 계량.
- 깁슨 어셈블리 반응 증폭된 cDNA 및 소화 플라스 미드를 사용 하 여 설정 합니다. 사용 하 여 삽입 벡터 대 20의 3 어 금 니 과잉. 50 ° C에서 1 h incubate 고 실리 카 젤 열 (깨끗 한 DNA & 테이블의 재료에 집중 장치 키트)를 사용 하 여 반응 제품을 정화.
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Electroporate 관할에 깁슨 어셈블리 반응의 정화 제품을 사용 하 여 대장균 DH5α 셀. 다음 설정을 적용 1 mm electroporation 큐 벳을 사용 하 여: 1500 V 및 catabolite 억제로 슈퍼 최적화 된 국물에 37 ° C에서 1 시간에 대 한 5 양 품 (SOC; 20 g/L tryptone 5 g/L 효 모 추출 물, 0.5 g/L NaCl, 2.5 m m KCl, 10mm MgCl2 20 mM 포도 당, pH 7.0) 액체 매체와 Luria Bertani에 다음 확산 (LB; 10 g/L tryptone 5 g/L 효 모 추출 물, 10 g/L NaCl) 천 (1.5%) 플레이트 포함 50 µ g/mL 암 피 실린.
- 변환 된 대장균 에 해당 하는 식민지를 위한 화면 클론 가능성이 통합 삽입, electroporated 셀을 도금 하기 전에 15 분 확산 50 mg/mL의 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal)에서 30 µ L dimethylformamide입니다. 37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어
- 몇몇 백색 식민지를 선택 하 고 하룻밤 액체 LB 미디어에서 37 ° C에서 성장. 정화는 miniprep를 사용 하 여 플라스 미드 ( 재료의 표참조) 키트와 태 버퍼에 1 %agarose 젤 전기 영동에 의해 그들의 크기를 분석.
- PLELVd-BZB 제어에 비해 전기 이동 마이그레이션에 따라 가장 가능성이 재조합 플라스 미드를 선택 합니다. 뇌관 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3를 사용 하 여 연속 하 여 선택 된 플라스 미드의 순서를 확인 ', 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3'는 전체 식 카세트 pLELVd BZB에 측면.
참고: 이 플라스 미드의 cDNA에 의해 대체 되는 LacZ 표시와 함께 528 bp polylinker 포함 기억 하십시오. 제한 매핑 바로 재조합 플라스 미드를 선택 하는 데 도움이 있습니다.
2. RNA 식
- Co electroporate (1.6에서 조건 참조) 선택 된 대장균 변형대장균 BL21 (BL21 파생)와 pLELVd-BZB-파생 공동 익스프레스에 관심 및 플라스 미드 p15LtRnlSm의 RNA에 해당 하는 cDNA를 포함 하는 가지 tRNA 리가입니다. 대장균 부족 RNase III21, HT115(DE3)를 사용 하 여 긴 더블-좌초 지역 RNAs를 표현.
참고: 모두 RNA 관심과 tRNA 리가의 mRNA 대장균 RNA 중 합 효소에 의해 복사할 수 있습니다. 이 lysogen의 존재는 아무 해로운 효과 표현 T7 RNA 중 합 효소를 아니 DE3 lysogen 대장균 스트레인에 필요 합니다. - SOC 액체 매체에서 37 ° C에서 1 시간 배양 후 플레이트 50 µ g/mL 암 피 실린 및 34 µ g/mL 페니 파운드 고체 매체에 electroporated 박테리아. 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 식민지를 선택 하 고 접종 1 L 액체 훌륭한 국물 (TB) 매체의 250 mL를 삼각 플라스 크를 당황 하 게 (12 g/L tryptone 24 g/L 효 모 추출, 0.4% 글리세롤, 0.17 M KH2포4및 0.72 M K2HPO4), 포함 된 50 µ g/mL 암 피 실린 그리고 34 µ g/mL 페니입니다. 180 분당 회전 (rpm)에서 활기찬 동요와 37 ° C에서 품 어. 12에서 16 h 사이의 박테리아 문화 접종 후 수확.
3. RNA 추출 및 정화
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분석 목적을 위해 원하는 시간 지점에서 문화의 2 mL aliquots 걸릴 하 고 14000 x g 2 분 삭제는 상쾌한에 원심 vortexing에 의해 테 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 8.0, 그리고 1 mM EDTA)의 50 µ L에서 세포를 resuspend.
- 한 볼륨 (50 µ L) 페 놀 (물으로 포화와 pH 8.0 Tris HCl로 pH 8.0에 equilibrated)의 1:1 (v/v) 혼합의 추가 및 클로 프롬. 활발 한 vortexing에 의해 세포를 휴식 하 고 14000 x g에 5 분 동안 원심 분리 하 여 수성 및 유기 단계를 분리.
- 조심 스럽게 복구 총 세균 RNA를 포함 하는 수성 단계 (위).
참고: 준비 후속 분석을 위해-20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 대리점에서는 250 mL 원심 병 및 14000 x g 10 분 삭제 상쾌한에 셀 아래로 회전으로 문화를 부 어. 물 30 mL에 resuspending에 의해 세포를 씻어. 원심 분리기 튜브에 전송 및 동일한 조건 하에서 다시 셀 아래로 회전.
- 상쾌한 삭제 하 고 vortexing에 의해 착 색 인쇄기 버퍼 (50 mM Tris HCl, 산도 6.5, 150 m m NaCl, 0.2 m m EDTA) 10 mL에 셀을 resuspend.
참고: 이 시점에서 셀 다른 순간 정화 진행-20 ° C에서 냉동 수 있습니다. - 페 놀: 클로 프롬의 1 볼륨 (10 mL)을 추가 하 여 셀을 휴식 신선한 또는 해 동 세균성 준비를 사용 하 여 (단계 3.2 참조) 및 vortexing 적극적으로.
- 12000 x g에서 10 분 동안 centrifuge, 수성 단계를 복구 하 고 다시 동일한 조건 하에서 클로 프롬의 1 볼륨 (10 mL) 추출.
참고: RNA 준비는-20 ° C에이 시점에서 저장할 수 있습니다. -
또한 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 총 세균 RNA를 정화. 45 µ m 주사기 필터 및 1 mL diethylethanolamine (DEAE) 열 부하를 통해 RNA 준비를 필터링 합니다.
- 크로마토그래피 정화 1 mL/min의 유량에 액체 크로마토그래피 시스템을 사용 합니다. 로딩 하는 샘플을 하기 전에 equilibrate 크로마토그래피 버퍼의 10 mL와 함께 열 (단계 3.3 구성 참조).
- 샘플을 로드 하 고 10 mL 크로마토그래피 버퍼의 열을 씻어. RNA의 차입 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 6.5, 1 M NaCl, 0.2 mM EDTA) 20 mL와 함께 elute 고 1 mL aliquots를 수집 합니다.
참고: RNA는 신속 하 게 초기 분수에서 elutes. 열 추가 담긴 위해 다시 사용 될 수 있습니다. 이 위해, 물 10 mL로 열 세척 하 고 20% 에탄올에 4 ° C에서 저장 합니다.
- 원형 형태로 대장균 에서 축적 하는 RNA 재조합의 주요 부분부터 동질성12정화에 대 한이 속성 수 있는 이익이 되었다. 2 차원 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (2D 페이지) 비 변성 시키기 (8 M 요소) 조건12,22를 변성 시키기 결합 원형 RNAs는 선형에서 구분 합니다.
4. RNA 분석
- 5 %polyacrylamide 젤 준비 (37.5:1 acrylamyde:N, N'-methylenebisacrylamide, 대량 비율) TBE 버퍼 (89 mM Tris, 89 m m 붕, 2 mM EDTA) 포함 8 M 요소에.
- 1 볼륨 (20 µ L) 버퍼 (98 %formamide, 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.0025 %bromophenol 파랑 및 0.0025% 자일 렌 cyanol), 로드의 RNA 준비의 믹스 20 µ L 난방 블록에서 95 ° C에 1.5 분 동안 품 어 고 차가운 얼음에 스냅.
- Polyacrylamide 젤에 샘플을 로드 하 고는 전기 이동 법 젤 크기 (예를 들어, 200 V 2 m m 젤 2.5 h x 130 x 140 실행)에 따라 적절 한 조건에서 실행. 0.5 µ g/mL ethidium 평범한 사람에서 15 분 젤 얼룩, 물으로 세척 하 고 자외선에서 RNA를 시각화.
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Representative Results
ELVd 파생 시스템12을 사용 하 여 대장균 에서 재조합 RNA를 생성 하려면 관심의 RNA는 ELVd RNA 비 계에 투입 이다. 이 공상 RNA 가지 tRNA 리가 대장균에 따라 공동 표현 이다. 일단 처리 하 고 죽 습 circularized에서 관심의 RNA 돌출, 공상 원형 RNA 가능성이 세균 세포 ( 에 있는 현저한 농도 도달 공동 표현된 가지 효소와 복잡 한 ribonucleoprotein를 형성 그림 1). 따라서,이 시스템을 사용 하 여 재조합 RNA를 생성 하는 첫 번째 단계는 ELVd 시퀀스 변종 AJ536613에에서 T245-T246 ELVd cDNA의 특정 위치로 RNA에 해당 하는 cDNA를 삽입 이루어져 있다. 플라스 미드 pLELVd-BZB,이 polylinker 포함 된 위치 두 Bpi 로 내가 인식 사이트와 LacZ 블루/화이트 마커 유전자 용이 하 게이 삽입이 매우 효율적인 깁슨 어셈블리 방법20. 다양 한 변형된 대장균 원하는 재조합 플라스 미드는 LacZ 마커의 블루/화이트 심사에 의해 촉진 된 포함 된 복제 합니다. 플라스 미드는 이중 Bpi 나 소화 완료 되지 않았습니다 및 X-여자의 삽입 가능성이 생산 블루 식민지를 통합할 수 있는. 그림 2 는 다른 cDNAs 삽입 된 여러 재조합 플라스 미드의 전기 이동 분석. 이 플라스 미드 다른 마이그레이션 pLELVd BZB에 비해 표시. 참고는 pLELVd BZB 포함 LacZ 마커 (528 bp)는 cDNA의 RNA에 의해 대체 됩니다. 그래서, 비록이 삽입 된 cDNA의 크기에 따라 달라 집니다, 재조합 플라스 미드 일반적으로 마이그레이션할 제어 플라스 미드 (그림 2) 보다 더 빨리.
PLELVd-BZB-파생 상품의 RNAs에 해당 cDNAs를 포함 하는 공동-electroporate 대장균을 p15LtRnlSm 따라 사용 됩니다. 공동 변형 된 박테리아는 암 피 실린과 페니를 포함 하는 접시에 선택 됩니다. 그런 다음, 대장균 을 선택 클론 풍부한 TB 매체에 강한 동요와 37 ° C에서 재배 하는. 이 문화 상황에서의 RNA는 재조합 생산12최대화. 박테리아에서 재조합 RNA의 존재는 페 놀과 클로 프롬 버퍼 존재의 믹스와 함께 셀 하 고 페이지를 변성 시키기 RNA, 수성 버퍼에는 파티션을 분석에 의해 쉽게 모니터링할 수 있습니다. 그림 3 보기 ethidium 평범한 사람 얼룩이 polyacrylamide 젤 다른 대장균 에서 총 RNAs에 클론 분리 되었다. 그림 빈 ELVd에 해당 하는 강한 밴드와 관심의 다른 RNAs 삽입 된 공상 ELVd 형태를 보여준다. 흥미롭게도 우리는 원형 형태로 재조합 RNA의 주요 부분을 찾으십시오. 높은 이온 강도에 변성 조건에서 두 페이지의 조합을 사용 하 여, RNA 재조합의 메인 분수의 순환 수 있습니다 쉽게 관찰 (그림 4).
다운스트림 어플리케이션, 총 대장균 RNA 준비의 공상 ELVd RNA를 포함 하는 현재 프로토콜의 목표 수 있습니다. 그러나, 필요할 때, RNA 준비 수 수 추가 정화 음이온 교환 크로마토그래피에 의해. 그림 5 에 크로마 높은 이온 강도 (1 M NaCl)에서 낮은 이온 강도 (150 m m NaCl)에서 열 및 후속 차입에 대장균 RNA의 효율적인 보존을 보여 줍니다. RNA의 대부분 분수 2와 3에에서 수집 됩니다. 동질성을 재조합 RNA를 정화, 순환의 이점을 취할 수 있습니다. 원형 RNAs 조건22를 변성 시키기에 선형 그들의 대응에 대해 지연 됩니다. 이러한 RNAs ethidium 평범한 사람 얼룩이 후 젤에서 eluted 될 수 있습니다. 십자가와 같은 solubilizable polyacrylamide 젤을 사용 하 여 N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, 용이 하 게 많은 양의 재조합 RNAs (그림 6)의 정화.
그림 1: 대장균에서 재조합 RNA 생산 바이로이드 기반 시스템의 도식 적인 표현입니다. 관심의 RNA에 해당 하는 cDNA (는 98 nt 긴 RNA aptamer 시금치 체계에서) 플라스 미드 pLELVd-BZB에 삽입 됩니다. 대장균 은 공동 공동 가지 tRNA 리가 표현 하 pLELVd-BZB-파생 및 플라스 미드 p15LtRnlSm으로 변환입니다. 대장균, 공상 ELVd-시금치 RNA 사본 자체 쪼개진된 (빨간 화살촉) 바이로이드 귀상어 ribozymes에 의해 이다. 결과 단위체 공동 표현된 tRNA 리가 의해 인식 하 고 circularized. 원형 바이로이드 비 계는의 (녹색) RNA 돌출 재조합 RNA에 의하여 이루어져 있다. 대장균 가능성이 큰 금액을 재조합 RNA의 축적 tRNA 리가와 복잡 한 ribonucleoprotein의 안정화에서 유래한 다. 분할 뿐만 아니라 ELVd cDNA, 플라스 미드 pLELVd-BZB pUC 복제 원점 (pUC 오 라), 암 피 실린 선택 유전자 (앰프R), 대장균 murine 단백 (lpp) 발기인과 rRNA (rrnC) 터미네이터와는 LacZ 포함 표식입니다. 플라스 미드 p15LtRnlSm p15A 복제 원점 (p15A 오 라), 페니 저항 유전자 (CmR), 대장균 lpp 발기인 및 살 균 소 T7 전사 종결자 가지 tRNA 리가 cDNA 이외에 포함 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 관심의 다른 cDNAs를 포함 하는 pLELVd BZB 파생 식 플라스 미드의 전기 이동 분석. 플라스 미드에 ethidium 평범한 사람으로 물 했다 1 %agarose 젤 전기 이동 법으로 분리 되었다. 레인 1, 왼쪽; 구성 요소 중 일부의 kbp에서 크기와 DNA 마커 레인 2, pLELVd-BZB; 레인 3, pLELVd-BZB 파생 빈 ELVd; 표현 하 레인 4 ~ 7, pLELVd-BZB 파생 상품 RNA aptamer 시금치 (4 차선), streptavidin 바인딩 aptamer (5 레인), 연속 42 bp 더블-좌초 영역이 (6 레인), RNA 머리 핀과 3' 모자 독립적인 번역 증강 (인용) 식물의 표현 바이러스 (7 레인)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: RNA 재조합 대장균 바이로이드 기반 시스템을 사용 하 여에서 생산 됩니다. 총 RNAs 다른 대장균 에서 클론 페 놀: 클로 프롬 및 aliquots 변성 시키기 페이지 구분 처리에 의해 추출 되었다. Ethidium 평범한 사람으로 물 젤 표시 됩니다. 재조합 RNAs는 대장균 (A) BL21(DE3) (B) HT115(DE3)에서 생산 되었다. (A 와 B) 레인 1, 왼쪽;에 nt에 크기와 RNA 마커 레인 2, RNAs 대장균 클론에서 빈 ELVd 표현 하 (333 nt). (A) 차선 3, 4, 공상 ELVd 표현 하 대장균 클론에서 RNAs 형성 aptamer 시금치를 포함 된 (98 nt)와 streptavidin 바인딩 aptamer (42 nt), 각각. (B) 차선 3, 42 bp 길이의 두 배 좌초 RNA를 포함 하는 공상 ELVd 형태를 표현 하는 대장균 클론에서 RNAs 빨간색 화살표는 원형 재조합 RNAs를 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 재조합 RNA의 순환 바이로이드 기반 시스템을 사용 하 여 대장균 에서 생산. Aptamer 시금치를 포함 하는 공상 ELVd을 표현 하는 대장균 클론에서 총 RNAs 2D에서 높은 그리고 낮은 이온 강도에서 처음 페이지를 변성 시키기를 구분 했다. 젤 ethidium 평범한 사람으로 얼룩이 있었다. 파란색 화살표는 전기 이동 이동의 방향을 나타냅니다. 빨간색 화살표는 원형 두 개의 분판 동안 같은 크기의 선형 대응에서 선택적으로 지연 ELVd-시금치를 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: RNA 재조합의 컬럼에 정화 바이로이드 기반 시스템을 사용 하 여 대장균 에서 생산. 공상 ELVd 3를 생산 하는 대장균 클론에서 총 RNAs' 인용 (55 nt) 150 mM NaCl 존재 졌 DEAE 크로마토그래피 열에 로드 된. RNA는 eluted 1 M NaCl 존재. 크로마 mS/cm (오렌지 라인) 대 볼륨 254 nm (파란 선) 및 전도도에서 흡 광도 표시합니다. 컬럼에 분리 (평형, 주입, 세척, 차입 및 열 재생)의 다른 단계를 나타냅니다. 수집 된 분수 또한 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: RNA 재조합의 동질성을 정화 바이로이드 기반 시스템을 사용 하 여 대장균 에서 생산. 공상 ELVd 3를 생산 하는 대장균 클론에서 총 RNAs' 인용 DEAE-Sepharose 열을 사용 하 여 크로마토그래피에 의해 먼저 정화 하 고 다음 2D 페이지 구분 했다. 첫 번째 젤 조건 (8 M 요소, 버퍼 TBE)를 변성 시키기에서 실행 되었다. Ethidium 평범한 사람, 얼룩이 지기 후 젤 밴드 재조합 RNA의 원형 형태를 포함 하는 비 변성 시키기 조건 (버퍼 태) 하에서 실행 하는 두 번째 젤 상단에 옮겨 졌다. 두 번째 젤의 아크릴 아 미드와 상호 링크는 N, N'-포함 된 순수한 재조합 RNA 젤 조각의 가용 화를 허용 하는 bis (acryloyl) cystamine. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
ELVd 시퀀스 및 구조 요구 사항 가지 tRNA 리가 여 인식에 관련 된 연구를 하는 동안 우리 주의 원형 바이로이드의 예기치 않은 큰 축적에 비 호스트 대장균 에 두 분자의 공동 식 세균성 세포19에 양식입니다. 우리가 이해 하는 대장균 에 RNA 바이로이드의 큰 축적 아마 공동 표현 등 상대적으로 작은 매우 안정적인 RNA 분자의 결과 이었다 (333 nt), 높은 기반-결합, 원형 바이로이드, 그리고이 대 한 단백질 특정 바이로이드 높은 선호도 표시합니다. ELVd RNA 감염 된 공장17에 복제 하는 동안 그것의 circularization를 중재 하는 호스트 tRNA 리가 모집 해야 합니다. 비록 우리가 실험적인 확인을 하지 않아도, 우리는 두 분자 ribonucleoprotein 대장균 더 바이로이드의 RNA 안정화 및 박테리아의 리터 당 150mg의 현저한 농도 도달에 복잡 한 형성 예상 매우 rRNAs12등 생 RNAs의 그들을 초과 하는 문화. 이후 ELVd 대장균에 복제 하지 않습니다, 우리 권유 분리 RNA의 삽입 극적으로 바이로이드 파생 RNA의 축적에 영향을 미칠 않을 고 사실, 사건 이었다. 이 관찰은 우리가 여기 설명 하는 대장균 에서 재조합 RNA의 대량 생산 방법의 기초 이다. 메서드는 ELVd의 원형 RNA 분자를 사용 하 여 관심의 RNA 제시 하는 발판으로. 대장균에서 원형 ELVd 비 계를 생성 하려면 우리 바이로이드 귀상어 ribozyme의 중복 도메인 전조 RNA를 표현 해야 합니다. ELVd ribozymes 자체 대장균 에 매우 효율적으로 쪼개 고 결과 바이로이드 단위체는 인식 공동 표현된 tRNA 리가 여 circularized. TRNA 리가의 공동 식 시스템의 핵심 기능입니다. 이 특정 효소 공동 표현된12않으면 ELVd RNA는 거의 대장균 에서 감지 됩니다.
우리의 프로토콜에 플라스 미드 pLELVd-BZB 간단 하 고 효율적인 깁슨 어셈블리 위치 U245와 U246의 ELVd 사이 관심의 RNA에 해당 하는 cDNA를 삽입할 수 있습니다. 이 사이트는 대부분 ELVd 나 란24,25에 긴 머리 핀의 터미널 루프에 해당합니다. 이 특정 위치에 삽입은 관심의 RNA ELVd에 의해 형성 하는 매우 안정적인 발판에서 돌출 하 고 관심사의 RNA와 ELVd (그림 1) 사이 intramolecular 상호 작용을 하지 않도록 해야 합니다 홍보 해야 합니다. 우리 하지 ELVd 분자의 다른 위치에 대 한 관심의 RNA를 삽입의 효과 탐험 했습니다. 플라스 미드 p15LtRnlSm 가지 tRNA 리가의 공동 식 수 있습니다. RNAs는 제정 강한 대장균 의 통제 아래 두 플라스 미드에 복사할 발기인, 즉 murein 단백 (lpp). 이것은 시스템을 제정 유도의 필요와 함께. 그러나, 우리는 또한 살 균 소 T7 RNA 중 합 효소의 통제 tRNA 리가 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 유도할 수 있는 시스템을 표현 하는 유사한 플라스 미드 (p15tRnlSm)을 구축. 이 플라스 미드를 사용 하 여 재조합 하는 RNA의 축적만 발생 합니다 tRNA 리가 식의 유도 후 IPTG12를 추가 하 여. 현재 시스템에서 관심의 RNA tRNA 리가 p15A 복제 근원 가진 적당 한 복사 번호 플라스 미드에서 표현 하는 동안 pUC 복제 원점으로 높은 사본 수 플라스 미드에서 표현 된다. 복사 번호 변경 여부 두 플라스 미드는 시스템에 관련 된 RNA 지금까지 탐험 되지 않은 재조합의 축적을 향상 시킵니다. 시스템에 의해 승인의 RNA의 크기 범위는 체계적으로 되지 않은 작은 RNAs 논리적으로 큰 것 들 보다 더 높은 농도에 누적 될 것으로 예상 하지만, 조사.
왜 재조합 RNA vivo에서의 생산은 쉬운 이유 중 하나는 아마 대부분 RNA 분자의 본질적인 낮은 반감기 때문입니다. 우리의 시스템은이 문제에 외계인. 사실, 한 늦은 대장균 성장 단계에 재조합 RNA의 축적 거의 사라질12감소 하기 시작 합니다. 이렇게 하면 수확 셀 오른쪽 창에 찾으려고 하나. 관찰, 하지만,이 윈도우는 시스템을 친숙 하 게 하기에 충분 합니다. 그러나, 우리는 또한 관찰 최적의 창에 따라 특정 대장균 등 요인 스트레인, 조건 (동요, 플라스 크, 방송, 등.의 볼륨) 및 생리 단계는 박테리아의 성장 문화 매체 액체 문화를 시작 하는 데 사용. 사용 하 여 신선한 대장균 재조합 RNA 생산을 시작 하는 것이 좋습니다 이전 날을 주사 하 고 37 ° c.에 성장 격판덮개에서 식민지 수확 창 더 예측할 수 없는 게 냉장고에 접시를 저장. 우리는 박테리아 이쑤시개와 접시에서 고른 액체 문화를 시작 하 여 가장 일관 된 결과를 얻었다. 액체 사전 문화를 사용 하 여 포화, 경우에 특히 또한 드라이브 생산 프로토콜에 있는 가변성을.
정화에 관한 페 놀: 클로 프롬과 세균성 세포의 치료 세포를 휴식 하는 매우 효과적인 방식으로 이며 수성 단계에서 세균 총 RNA의 양적 복구에 대 한 수 있습니다. 재조합 RNA의 다운스트림 응용 프로그램에 따라이 수성 단계 또는 준비는 알코올이 수성 단계에서 RNA를 계기에서 결과 충분히 있을 수 있습니다. 더 정화가 필요한 경우, 음이온 교환 크로마토그래피를 DEAE 음이온 교환 칼럼 (그림 5)를 사용 하 여 좋습니다. 이 정화 단계 DNA와 수성 단계에서 분할 또한 세균성 대사 산물의 효율적 제거 가능 재조합 RNA의 다운스트림 응용 프로그램 경우 동질성을 정화, 바이로이드 파생 시스템에서 제공 하는 다른 방법에 비해 명확한 우위를. 재조합 RNA의 주요 일부 원형 형태로 생산 됩니다, 이후 활용이이 속성 세균 RNAs의 대부분에서 분리 취할 수 있습니다. 원형 RNAs 경험 같은 크기22의 선형 대응에 관하여 조건을 변성 시키기에 전기 이동 마이그레이션에 지연. 이 지연 때 RNA 낮은 이온 강도에서 electrophoresed에 더 발음 됩니다. 실제로, 또한 낮은 높은 차원 변성 페이지에 의해 분리 되었고 원형 RNAs 수 이온 힘 (그림 4). 전기 이동 별거 후 재조합 RNA 젤에서 eluted 해야 합니다. 아크릴의 가역 cross-linker의 사용과 같은 N, N'-많은 양의 RNA (그림 6)를 정화 하는 때에 특히 bis (acryloyl) cystamine23, 복구, 용이 하 게. 마지막으로, 만약 생산된 RNA의 다운스트림 응용 프로그램 바이로이드 비 계에서 관심의 RNA의 분리 요구, 우리의 프로토콜은 이전 방법에 어떤 특정 이점을 제공 하지 않습니다. 관심의 RNA ribozymes, DNAzymes의 사용 등 앞에서 설명한 전략의 일부를 사용 하 여 공상 분자에서 excised 해야 합니다 또는, 아마도 가장 효율적인 RNase H를 사용 하 여 두 개의 DNA oligonucleotides7에 의해 유도. 이 마지막 성가신 정화 단계를 피할 려 고, 우리에 부분적인 성공으로 비록 바이로이드 발판의 크기를 줄이기 위해 노력 했습니다. 바이로이드 삭제 양식을 사용 하 여 재조합 RNA의 주목할 만한 양을 생산 수 있었습니다 (175, 215, 246 nt) 축적12감소와 상관 바이로이드 발판의 삭제 증가 하지만.
합계에서는, 여기 프로토콜은 우리의 지식 이전 게시 방법의 수확량을 개선 하는 대장균 에서 재조합 RNA의 다량 생산 설명 합니다. 프로토콜은 관심 바이로이드 (ELVd) 비 계 및 가지 tRNA 리가, circularizes이 바이로이드에 감염 된 식물 효소에 삽입 대장균 RNA의 공동 식의 기반. 우리의 프로토콜의 독특한 특징은 RNA 원형 형태로, 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 동질성을 정화를 용이 하 게 하는 속성이 주로 생산 되는 재조합 이다. RNA는 일반 실험실 조건에서 대장균 문화의 리터 당 쉽게 생성 될 수 있다 재조합의 밀리 그램의 수만이 프로토콜을 사용 하 여.
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Disclosures
저자는이 프로토콜에서 설명 하는 기술 되었습니다 선언 특허 (미국 특허 제 EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).
Acknowledgments
이 작품은 BIO2017-83184-R 보조금과 BIO2017-91865-특급 스페인 정부의 드 많은, Innovación y 대학 (공동 자금된 페더 자금)에서 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Bpi I | Thermo Scientific | ER1011 | |
| Agarose | Conda | 8010 | D1 low EEO |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086,1000 | |
| Acetic acid | PanReac AppliChem | 131008.1214 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Ethidium bromide | PanReac AppliChem | A1152,0025 | 1% |
| Zymoclean Gel DNA Recovery | Zymo Research | D4001 | |
| NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-3300 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England BioLabs | E2621S | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4003 | |
| Eporator | Eppendorf | 4309000019 | |
| Escherichia coli DH5α | Invitrogen | 18265-017 | |
| Tryptone | Intron Biotechnology | Ba2014 | |
| Yeast extract | Intron Biotechnology | 48045 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | 131659.1211 | |
| Agar | Intron Biotechnology | 25999 | |
| Ampicillin | PanReac AppliChem | A0839,0010 | |
| X-gal | Duchefa | X1402.1000 | |
| N,N-Dimethylformamide | PanReac AppliChem | 131785.1611 | |
| NucloSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 22740588.250 | |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Novagen | 69387-3 | |
| Escherichia coli HT115(DE3) | Ref. Timmons et al., 2001 | ||
| Chloramphenicol | Duchefa | C 0113.0025 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1211 | 87% |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | 131509.1210 | |
| K2HPO4 | PanReac AppliChem | 122333.1211 | |
| HCl | PanReac AppliChem | 131020.1211 | |
| Phenol | Scharlau | FE04791000 | 90% |
| Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,1000 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiTrap DEAE Sepharose FF column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5055-01 | |
| ÄKTAprime plus liquid chromatography system | GE Healthcare Life Sciences | 11001313 | |
| Acrylamyde | PanReac AppliChem | A1089,1000 | 2K |
| N,N’-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279-100G | |
| Urea | PanReac AppliChem | 146392.1211 | |
| Boric acid | PanReac AppliChem | A2940,1000 | |
| Formamide | PanReac AppliChem | A0937,2500 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026-5G | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| N,N′-Bis(acryloyl)cystamine | Sigma-Aldrich | A4929-5G |
References
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