Summary
여기에 제시 된 분석 섬유 소 혈전 구조에 베타-아 밀 로이드의 효과 개별적으로 또는 조합에서 사용할 수 있는 두 가지 방법이 있습니다. 생체 외에서 섬유 소 혈전, 만드는 뒤에 병 탁도 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법 방법 포함 된 프로토콜이입니다.
Abstract
이 문서는 체 외 섬유 소 혈전 생성 및 분석 하 여 응고 형성 및 구조에 베타-아 밀 로이드 (Aβ) 단백질의 효과 분석 하 고 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 대 한 방법을 선물 한다. Aβ, Alzheimer의 질병 (광고)에서 신경 녹말 체 집계를 형성, fibrinogen 상호 작용을 보였다. 이 Aβ fibrinogen 상호 작용 구조적으로 비정상적인 fibrinolysis에 저항 하 고 섬유 소 혈전을 만든다. 섬유 소는 혈액 응고에 이상이 Aβ 유도 또한 microinfarcts, 같은 광고 병 리의 뇌혈관 측면에 기여할 수 있습니다 염증, 뿐만 아니라, 대뇌 아 밀 로이드 angiopathy (CAA). 광고 병리학 neurovascular 적자의 잠재적으로 중요 한 역할을 감안할 때, 유망한 치료 가치는 억제 또는 Aβ fibrinogen 상호 작용을 줄일 수 있는 화합물을 개발. 생체 외에서 메서드는 섬유 소에 의해 응고 형성 평가 될 수 있다 쉽고 체계적으로 치료 화합물 개발을 위한 잠재적으로 유용한 도구입니다. 여기는 섬유 소 혈전의 생성 생체 외에서 Aβ 및 Aβ fibrinogen 상호 작용 억제제의 효과의 분석에 대 한 최적화 된 프로토콜이입니다. 병 탁도 분석 결과 신속 하 고 매우 재현 이며 Aβ fibrinogen 억제제의 다 수의 심사에 대 한 수 있도록 여러 조건을 동시에, 테스트를 사용할 수 있습니다. 이 심사에서 히트 화합물 더 SEM.를 사용 하 여 섬유 소 혈전 아키텍처의 구조 이상 Aβ 유도 개량 하는 능력에 대 한 평가 이러한 최적화 된 프로토콜의 효과 TDI-2760, 최근 확인 된 Aβ fibrinogen 상호 작용 억제제를 사용 하 여 여기 보여 줍니다.
Introduction
Alzheimer의 질병 (광고), 신경 질환 노인 환자에서 인지 감소에 이어지는 주로 비정상적인 베타-아 밀 로이드 (Aβ) 식, 집계 및 장애인된 클리어런스 neurotoxicity1, 의 결과에서 발생 2. Aβ 집계 및 광고3사이 잘 특징이 협회에도 불구 하 고 근본적인 질병 병 리 정확한 메커니즘은 잘 이해4. 증거를 증가 제안 Aβ6순환 시스템 구성 요소와 직접 상호 작용으로 neurovascular 적자 진행 및 광고5, 심각도에 역할을 재생 합니다. Aβ는 fibrinogen7,8, 또한 광고 환자 및 마우스 모델9,,1011Aβ 예금 localizes와 높은 선호도 상호 작용. 또한, Aβ fibrinogen 상호 작용 fibrinolysis9,12저항 뿐만 아니라 비정상적인 섬유 소 혈전 형성 및 구조, 유도합니다. 광고, 치료 한 치료 가능성 Aβ 및 fibrinogen13,14사이 상호 작용을 억제 함으로써 순환 적자 경감 이다. 우리는, 그러므로, 높은 처리량 검열 및의 약 화학 접근13,14를 사용 하 여 Aβ fibrinogen 상호 작용을 억제 하는 여러 작은 화합물 확인. Aβ-fibrinogen 상호 작용 억제제의 효능을 테스트 하려면 우리 섬유 소 혈전 형성 체 외에서 의 분석을 위한 두 가지 방법을 최적화: 응고 탁도 분석 결과 및 스캐닝 전자 현미경 (SEM)14.
병 탁도 분석 결과 섬유 소 혈전 형성 UV 보이는 분광학을 사용 하 여 모니터링을 위한 스트레이트-앞으로 및 빠른 방법입니다. 섬유 소 혈전으로 형태, 빛은 점점 더 흩어져 하 고 솔루션의 탁도 증가 한다. 반대로, Aβ 있으면, 섬유 소 혈전의 구조 변경 및 혼합물의 탁도 감소 된다 (그림 1). 억제 화합물의 효과 병 탁 Aβ 유도 이상에서 복원 가능성에 대 한 평가 될 수 있습니다. 탁도 분석 결과 여러 조건의 신속한 분석에 대 한 수 있으며, 병 모양 및 구조에 제한 된 정보를 제공 합니다. SEM, 솔리드 객체의 지형 전자 조사에 의해 밝혀 수 응고15,16,,1718 의 3 차원 구조 분석 방법의 평가 대 한 Aβ의 존재와 또는 억제 화합물 그 구조9,14변경 합니다. 두 분석 및 SEM는 다양 한 목적을 위해 사용 된 고전적인 실험실 기술, 예, 분 광 광도 법 녹말 체 집계19,20모니터링을 위해 사용 됩니다. 마찬가지로, SEM 분석 파 킨 슨 병 및 thromboembolic 치기 환자21,,2223Alzheimer, 플라즈마에서 형성 된 섬유 소 병 하도 사용 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 재현 하 고 빠른 방식으로 섬유 소 혈전 형성 평가 적합 합니다.
다음 프로토콜 생체 외에서 섬유 소-응고를 모두와 함께 Aβ 없이 준비에 대 한 지침을 제공합니다. 그것은 또한 섬유 소 혈전 형성과 구조에 Aβ의 효과 분석 하는 방법을 자세히 설명 합니다. Aβ-fibrinogen 상호 작용의 억제를 측정 하기 위한이 두 가지 방법의 효과 TDI-2760, 작은 억제 화합물14를 사용 하 여 보여 줍니다. 이 방법을 개별적으로 함께, 섬유 소 혈전 형성 체 외에서 의 신속 하 고 간단 분석 허용.
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Protocol
1. 분석을 위한 Aβ42 및 Fibrinogen의 준비
- 동결 건조 된 분말에서 단위체 Aβ42 준비
- 1500 x g 30에 내려 실내 온도와 회전 Aβ42 분말을 따뜻한 s.
- Aβ42 분말의 0.5 밀리 그램 당 100 µ L의 얼음 hexafluoroisopropanol (HFIP)를 추가 하 고 얼음에 30 분 동안 품 어.
주의: HFIP을 처리할 때 주의 사용 하 고 화학 후드에 있는 모든 단계를 수행. - 20 µ L aliquots 고 영화 공기 건조에 2-3 헤 영화에 대 한 화학 후드-20 ° c.에 저장 될 수 있다 준비
- 실 온에서 10 분 동안 목욕 sonicator에 동요 하 여 신선한 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 10 µ L에서 단위체 Aβ42 영화를 다시 구성.
- 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) 버퍼 (pH 7.4)의 190 µ L을 추가 하 고 부드럽게 위아래로 플라스틱.
- 20 분 동안 4 ° C에서 20,817 x g에서 원심 분리 하 여 단백질 집계를 제거 합니다.
- 4 ° C에서 상쾌한 하룻밤을 위해 품 어 고 다음날 원심 단백질 집계 더 이상 삭제 20 분 4 ° C에서 20,817 x g에서 솔루션.
- Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과를 Aβ42 농도 측정 한다. 직렬 희석 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 1 mg/mL에서 0.0625 mg/mL 단백질 표준 생산, 3 중에서 다 잘 접시의 우물에 각 표준의 10 µ L을 추가 하 게 정화. Aβ 샘플 1: 4을 묽 게 하십시오 고 3 중에 우물에 10 µ L를 추가 합니다. BCA 솔루션 A와 B를 혼합 하 고 추가 200 µ L 각 잘. 37 ° C에서 30 분 동안 품 어와 읽기 562에서 플레이트 리더에 nm. 얼음에 나머지 Aβ 솔루션을 유지 하 고 탁도 분석 결과 및 SEM.에 대 한이 준비를 사용 하 여
- Fibrinogen 솔루션 준비
- 15 mL 튜브에 fibrinogen 동결 건조 된 분말의 20 밀리 그램을 측정 하 고 다시 20 m m hydroxyethylpiperazine 탄 술 폰 산 (HEPES) 버퍼 (pH 7.4) 미리 데워 진된 2 mL와 함께 일시 중단.
- 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 품 어.
- 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 저장 합니다. 솔루션 4 ° C, 필터에서 밖으로 다시 0.1 µ m 주사기 필터를 통해 fibrinogen 집계를 제거 하거나 기존 섬유 소.
- BCA 분석 결과를 fibrinogen 농도 측정 한다. 1.1.8 단계에서 지침을 따릅니다. 4 ° C에서 나머지 fibrinogen 솔루션을 유지 하 고 탁도 분석 결과 및 SEM.에 대 한이 준비를 사용 하 여
2. 병 탁도 분석 결과
- 그것의 최종 농도 버퍼의 200 µ L에서 3.0 µ M 96 잘 접시의 각 실험 잘 하려면 단계 1.1.8에서에서 30 µ M Aβ42 솔루션의 20 µ L를 추가 합니다. 50 mM Tris 버퍼 (pH 7.4) 96 잘 접시 웰 스 제어 버퍼에 5 %DMSO 동일한 볼륨을 추가 합니다.
참고:이 단계에서 Aβ42의 정확한 볼륨 중요 하지 않습니다. 낮은 농도 준비에 대 한 높은 볼륨을 사용할 수 있습니다, 그리고 응고 형성 버퍼의 볼륨을 조정할 수 있습니다. 마지막 볼륨 200 µ L을 유지 한다. - 억제 화합물을 테스트 하는 경우 희석 DMSO로 작업 농도에 화합물. 추가 화합물 또는 DMSO 우물 Aβ42와 잘 혼합 하는 컨트롤에 대 한 혼자.
참고: Aβ42 솔루션 우물, 화합물의 하단에 이산 물방울을 형성 한다 또는 DMSO는 물방울의 센터에 직접 pipetted 한다. - 단계 1.2.4 응고 형성 버퍼에서에서 fibrinogen 재고 솔루션을 희석 (20 mM HEPES buffer (pH 7.4), 5mm CaCl2, 그리고 137 mM NaCl) 96 잘 접시의 Aβ42 포함 하 고 제어 우물에 추가. 되도록의 최종 농도 1.5 µ M에 총 200 µ L 반응 fibrinogen 솔루션의 볼륨을 조정 합니다. 플라스틱 솔루션 천천히 하 고 거품 형성 방지. 회전 하는 플랫폼에 흔들어 30 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 품 어.
참고: fibrinogen 솔루션의 볼륨의 재고 농도 따라 다를 수 있습니다 있지만 각 총 볼륨 잘 부 화 하면서 170 µ L 해야한다. - DdH2O 50 U/mL의 재고 솔루션에서 상업적으로 순화 된 트 롬 빈 분말을 용 해 하 여 트 롬 빈 솔루션을 준비 합니다. 20 mM HEPES 버퍼 (pH 7.4)에 직접 사용 하기 전에 5 U/mL 작업 솔루션을 희석.
- 외피의 30 분 후 동시에 트 롬 빈 솔루션 (5 U/mL)의 30 µ L에 추가 96 잘 접시에서 fibrinogen 솔루션 단계 2.3 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여에서. 트 롬 빈의 추가 즉시 응고 형성을 시작 합니다. 따라서, 거품 형성 되지 않도록 주의와 fibrinogen 솔루션의 중심에 직접 트 롬 빈을 추가 합니다.
참고: 트 롬 빈 활동 사이 실험 조건, 트 롬 빈 많이 달라질 수 있습니다. 튼튼하게 혈전을 생성 하는 데 필요한 정확한 농도 경험적으로 결정 할 수 있습니다. - 트 롬 빈 추가 직후 플레이트 리더에 시험관에 응고의 흡 광도 읽으십시오. 350에서 흡 광도 측정 10 분, 매 30-60 미 수행 실 온에서 전체 분석 결과의 과정을 통해 nm.
참고: 일부 억제제 화합물 350 솔루션 흡 광도 변경할 수 있는 경우 탁도 405에서 측정 될 수 있다 nm nm.
3. 스캐닝 전자 현미경 검사 법
- 응고, 고정, 및 세척의 준비
- 깨끗 한 장소 시 집게를 사용 하 여 12 음 또는 24-잘 접시에 유리 원형 커버 슬라이드 (12mm).
- Fibrinogen 응고 형성 버퍼를 준비 합니다. 자세한 내용은 프로토콜 단계를 1.2를 참조 하십시오.
- 섬유 소 혈전 구조에 Aβ fibrinogen 상호 작용 억제제의 효과 평가 하려면 탁도 분석 결과 (2 단계)에 대 한 설명 된 대로 부 화에 대 한 지침을 따르십시오. 항상 fibrinogen Aβ와 억제제의 부재에서를 포함 하는 컨트롤 웰 스를 포함 합니다.
- 표지 슬라이드에 단계 3.1.3에서에서 fibrinogen 혼합물의 80 µ L 플라스틱 부드럽게 커버 슬라이드에 균등 하 게 분배 되도록 솔루션을 확산.
- 트 롬 빈 재고 (50 U/mL) 2.5 U/mL의 최종 농도 20 mM HEPES 버퍼링 염 분으로 묽 게 하십시오 고 fibrinogen 솔루션의 중심에 직접 혼합 하지 않고 20 µ L를 추가 합니다.
참고: 필요한 경우 높은 트 롬 빈 작업 농도 (5 U/mL) 사용할 수 있습니다. - 12-잘 접시 플라스틱 뚜껑으로 커버 하 고 30-60 분 동안 실내 온도에 그것을 두고.
- 응고 반응을 실행 하는 동안 탈수 및 고정 솔루션을 준비 합니다. 나트륨 cacodylate 버퍼 (0.1 m M, pH 7.4)을 준비 합니다. 나트륨 cacodylate 버퍼 (0.1 m M, pH 7.4) 2%도 솔루션을 작동 하 게 하려면 10%도 재고 솔루션을 희석. 얼음에 이러한 모든 솔루션을 유지. 1 주 이내 갓 희석된도 (2%)를 사용 해야 제대로 4 ° c.에는 냉장고에 저장 하는 경우
- 두 배 증류수 (80%, 50%, 20% 에탄올)에 절대 에탄올 (100%)을 희석. 이러한 에탄올 솔루션 및 얼음에 절대 에탄올 (100%)를 유지.
주의: 나트륨 cacodylate와 글을 처리할 때 주의 사용 화학 후드에이 단계를 수행 하십시오. - 30 분 후 부드럽게 씻어 얼음 나트륨 cacodylate 버퍼 (0.1 m M)와 혈전 두 번. 혈전 완전히 빠져들 것 같은 각 잘을 버퍼의 2 개 mL를 추가 합니다. 뚜껑 잘 플레이트 커버 하 고 실내 온도에 2 분 동안 그것을 둡니다. 2 분 후 1 mL 피 펫 또는 좁은 줄기 전송 피 펫을 사용 하 여 버퍼를 제거 부드럽게 합니다. 한 번 반복 합니다.
- 얼음도 (2%)와 혈전을 수정 합니다. 얼음에 잘 접시를 유지, 각 음에 2%도 약 2-3 mL를 추가 합니다. 혈전 완전히 빠져들 다는 것을 확인 하십시오. 커버 하 고 30 분 동안 얼음에 접시를 두고.
- 30 분 후 부드럽게 각 우물에서 고도 제거 하 고 혈전 (2 분, 두 번) 위에서 설명한 대로 나트륨 cacodylate 버퍼 (0.1 m M)를 사용 하 여 세척. 얼음에 잘 접시를 유지.
- 응고 및 한계점 건조의 직렬 탈수
- 5 분 동안 단계 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100%, 및 again100%)에서 준비 얼음 에탄올 세척의 등급된 시리즈에서 혈전을 탈수. 각 에탄올 시리즈는 혈전 잠긴 것을 확인 하는 2-3 mL를 추가 합니다. 커버 하 고 얼음에 품 어.
- 각 에탄올 단계 후 1 mL 피 펫 또는 일회용 피펫은 스포이드를 사용 하 여 에탄올 솔루션을 제거 합니다. 에탄올을 완전히 제거 하지 마십시오. 응고 표면 공기에 노출 되지 않습니다 있는지 확인 합니다.
참고: 탈수 절대 에탄올 (100%)에 두 번 수행 되어야 한다. - 최종 100% 에탄올에 빠져들 샘플을 유지 하면서 중요 한 포인트 드라이어 (일일) 전송. 일일 비용 챔버로 슬라이드를 전송 하기 위한 세탁기와 일일 비용 샘플 홀더 또는 커버 슬립 홀더를 사용 합니다. 각 슬라이드 사이 적어도 한 세탁기 배치.
- 일일 약 실에서 커버 슬라이드 밖으로가 고 탄소 테이프를 사용 하 여 sem의 스텁에 마운트.
- 스퍼터 코팅과 이미징
- 스퍼터 코팅 챔버를 sem의 스텁 함께 모든 샘플을 전송 합니다.
- 스퍼터 코트 20 미만 nm 금/팔라듐 또는 탄소, 진공 스퍼터 coater를 사용 하 여 같은 다른 전도성 물자의.
참고: 우리는 18 사용 금/팔라듐 코팅의 nm. 스퍼터 코팅 45 수행한 s와 코팅 속도 4 Å / s. 스퍼터 코팅 샘플은 몇 주 동안 실내 온도에 건조 한 환경에 제대로 보관 하면 안정. SEM 분석은 언제 든 지 수행할 수 있습니다. - 이미지 스캐닝 전자 현미경 4 SE2 검출기 장착에 kV.
참고: 이 이미지에는 이미지 픽셀 크기 13 nm-31 nm에서 범위를 설정합니다.
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Representative Results
시험관에 응고 (탁도) 분석 결과, 효소 트 롬 빈 섬유 소 네트워크24의 형성의 결과로 fibrinogen 앞. 이 섬유 소 혈전 형성 증가 탁도 (그림 1), (그림 2, 그린) 독서 기간의 끝 전에 頭 打 ち 상태에 따른 해결책을 통과 하는 빛의 산란을 발생 합니다. fibrinogen Aβ42의 알을 품는, 솔루션의 탁도 감소, 약 절반의 최대 높이 도달 하는 곡선 (그림 2A, 블루) 혼자 fibrinogen의. 최근 간행물에서 Aβ 집계 차단제의 시리즈는 합성 되었고 복합 TDI-276014식별 Aβ fibrinogen 상호 작용을 억제 하기 위해 그들의 능력에 대 한 평가. Aβ-fibrinogen 상호 작용을 차단 하는 TDI-2760 우리의 연구에 사용 했습니다. 마찬가지로 이전, TDI-2760, 존재의 효과, 탁도 Aβ 혼자 (그림 2A, 레드) 보다 더 높은 Aβ ameliorated 했다. TDI-2760의 효과 화합물으로 탁도 배경 때문에 변경 하지 않은 섬유 소 병 탁 Aβ (그림 2A, 보라색) 결 석 때 표시 되지 않습니다. 생체 외에서 탁도 분석 결과 여기에 설명 된 응고는 섬유 소 혈전에 의해 형성 및 그 과정을 약화 수 있습니다 요소는 관찰 될 수 있다 신속 하 고 간단한 방법입니다. 섬유 소 섬유 소 단위체 손잡이 구멍 상호 작용18,25 방해를 통해 중 합 방해 알려져 있다 GPRP 탁도 분석 결과 (그림 2B)에 대 한 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 이전 보고서25, GPRP 펩 티 드의 존재와 일치 섬유 소 병 탁도 상당히 감소 되었다 (그림 2B, 블루 vs 녹색)의 부재와 섬유 소 혈전 형성에 비해.
동일한 프로토콜 및 탁도 분석 결과 위에서 설명한 조건, 섬유 소 혈전 존재 및 Aβ TDI-2760의 부재에 준비 되었다. 혈전 고정, 탈수, 임계점 건조, 그리고 골드 스퍼터 코팅 (그림 1)에 의해 전자 현미경 검사 법에 대 한 처리 했다. 트 롬 빈과 CaCl2 존재 fibrinogen 큰 번들 (그림 3A) 뿐만 아니라 섬유 소의 길쭉한 및 삽입 된 섬유 소 메시 형성. Aβ 현재 때, 섬유 소 스레드 여러 스티커 덩어리/집계 Aβ 유도 구조 이상 (그림 3B)를 나타내는 얇은, 되었다. 탁도 분석 결과와 일치, TDI-2760 부분적으로 섬유 소 혈전의 구조에서에서 복원 변경 Aβ 유도, 적은 덩어리 처럼 제시 (그림 3 C). 탁도 분석 결과 함께 SEM 범위와 Aβ을 이용한 섬유 소 혈전 형성, 변경의 품질 뿐만 아니라 억제 화합물, TDI-2760의 효과 보여준다.
그림 1 : 탁도 분석 결과 및 SEM.에 의해 섬유 소 혈전 분석의 도식 표현 회로도 섬유 소 병 탁도 및 구조 지형에 섬유 소 혈전 분석에 관련 된 단계 및 Aβ의 효과 보여 줍니다. 2 µ m의 SEM 이미지 (왼쪽 아래) 규모 바 배율을 이며 10, 000 X. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 생체 외에서 에 Aβ42 효과의 측정 탁도 분석 결과 의해 섬유 소 혈전 형성. (A) Fibrinogen 존재 및 Aβ42의 부재에 알을 품는. 혈전 형성 증가 탁도 솔루션 (녹색)의 결과 트 롬 빈에 의해 유도 했다. Aβ42, 존재 섬유 소 혈전은 비정상적으로 구조화, 줄된 탁 (블루) 결과. 복합 TDI-2760 또는 DMSO fibrinogen 솔루션을 모두와 함께 Aβ42 없이 알을 품 했다. TDI-2760 Aβ42 유발 감소 정상 응고 형성 (보라색)를 변경 하지 않고 탁도 (빨간색)의 복원. (B)는 알려진된 fibrinolysis 억제제, GPRP의 탁도 또한이 분석 결과 대 한 긍정적인 통제로 측정 되었다. Fibrinogen 존재 및 1.5 µ M GPRP와 트 롬 빈을 추가한 후 측정 하는 탁도의 부재에 알을 품는. Aβ42와 마찬가지로, 섬유 소 혈전 형성의 탁도 크게 감소 되었다 GPRP (녹색 대 파란색) 존재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Aβ 유도 이상 섬유 소 혈전 아키텍처의 전자 현미경 스캐닝. 순화 fibrinogen (A), fibrinogen + Aβ42에서에서 얻은 섬유 소 혈전 구조의 전자 현미경 검사 (B), fibrinogen + Aβ42 + TDI-2760 (C). 트 롬 빈과 CaCl2 혼합물에 추가 하 여 응고 형성 시작 되었다. 구조 분석 혈전 형성 Aβ42의 존재는 얇고 비정상적으로 이멀전의 자체로 fibrinogen에 비해 공개. TDI-2760, Aβ42 fibrinogen 상호 작용을 억제 하기 위해 알려져, 부분적으로 Aβ42 유도 구조적 이상이 섬유 소 혈전의 수정. 눈금 막대는 1 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 방법을 섬유 소 혈전 형성에서 체 외에서평가의 재현성 및 빠른 수단을 제공 합니다. 또한, 시스템의 단순은 섬유 소 혈전 형성 및 구조 상대적으로 곧장 앞으로 미치는 Aβ의 해석. 이 연구소의 이전 게시, 그것은 화합물 Aβ fibrinogen 상호 작용13,14을 억제 하기 위해 그들의 능력에 대 한 테스트를 이러한 분석을 사용할 수 있는 표시 했다. 이 두 가지 분석 실험을 사용 하 여, 합성된 화합물의 시리즈 Aβ fibrinogen 상호 작용을 억제 하는 기능에 대 한 분석 했다. 실제로,로 Aβ fibrinogen 상호 작용을 억제할 수 있는 모든 화합물 섬유 소 혈전 형성을 복원할 수도 있습니다 치료 잠재력 하는 히트 화합물의 수영장을 좁히는 병 탁도 분석 결과 사용할 수 있습니다.
문제 해결을 요구 하거나이 기술의 사용을 제한 하는 탁도 분석 결과의 몇 가지 측면을 확인 하 고 있습니다. 주요 한계는 실험 결과의 해석을 복잡 하 게 만들 수 있습니다 그 사이 몇 가지 유사 콘텐츠 수 있습니다. 이 변화의 일부는 트 롬 빈 활동 때문에 이다. 트 롬 빈 활동에 대 한 문제를 해결 하려면 사용자가 여러 농도의 트 롬 빈 응고 형성 활동 Aβ과 테스트와 실험을 시작 하기 전에 테스트할 수 있습니다. 여기에 제시 된 실험 조건에서 Aβ, fibrinogen, 없을 경우에는 증가 하지 배경 수준 나타내는 탁도 커브는 섬유 소 합 관찰 위의 솔루션의 탁도. 그러나, Aβ는 집계 경향이 펩 티 드 이며 실내 온도 또는 37 ° C (몇 시간)에 아주 긴 시간 동안 간직 될 때 Aβ 솔루션의 높은 농도 증가 탁도 발생할 수 있습니다 원 집계를 형성할 수 있다. Aβ 솔루션을 실내 온도에 또는 따뜻한 시간의 오랜 기간 동안 저장 된 효과 분석 하는 경우 솔루션의 집계 상태 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 확인할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜에서 갓된 Aβ 및 fibrinogen 솔루션은 집계 문제를 제거 해야 합니다 사용 됩니다. 그러나, 이러한 준비의 품질을 보장 하기 위해 그들은 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 평가 되어 있다. 또한, 상업 Aβ 펩 티 드의 새로운 많이 사용 하는 경우 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 올리고의 수량 및 oligomerization의 정도 평가 한다. 때문에 펩 티 드 품질과 미리 형성한 집계 및 확실히 oligomerization 속도 영향을 미치는 단위체 Aβ의 비율에 많은 많은 변화를 있을 수 있습니다. 그것은 oligomerization에 대 한 잠복기 전에 Aβ 솔루션 (BCA 방법)의 농도 확인 하는 것이 좋습니다. 이러한 변화를 최소화 하기 위해 우리는 올리고 머 형성 반응에 대 한 Aβ 솔루션의 적어도 0.1 mg/mL를 사용 하 여 시도.
이 분석 결과 또한 온도 및 모션 같은 작은 환경 변화에 민감한, 때문에 다른 실험에서 탁도 수치가 함께 분석 하지 합니다. 즉, 비교 될 수 있는 조건의 수 제한 우물의 수로는 트 롬 빈 추가할 수 있습니다 동시에 멀티 채널 피 펫으로 (즉., 12). 사용자는 또한 섬유 소 혈전에서 신호를 왜곡 하 고 실험의 해석을 어렵게 그 점도 또는 버퍼 및 시험 화합물에서 높은 배경 탁으로 이어질 수 있습니다 알고 있어야 한다. 그러나, 각 실험에 포함 된 모든 컨트롤의 경우 그것은 쉽게 배경 신호는 탁도 흡 광도 변경 하는 경우 확인 가능 해야 것 이다.
탁도 분석 결과 Aβ에 의해 섬유 소 혈전의 형성을 방해 하는 여부에 대 한 정보를 제공 하 고 또한 억제제 화합물이이 효과 완화 수 있는 경우. 그러나, 그것 않습니다 하지 Aβ에 섬유 소 혈전의 구조는 변경 하는 방법을 공개 및/또는 화합물을 명 중. 이로써 응고 아키텍처의 직접 시각화로 sem의에 의해이 질문을 해결할 수 있습니다. Sem의 잘 설립 된 기술 이며 정기적으로 정화 fibrinogen 또는 플라즈마 응고 구조를 시각화에 대 한 사용. 그러나, SEM 분석을 위한 전통적인 응고 준비 과정 복잡 하 고 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 또한, 작은 차이 프로토콜에서 다른 연구 그룹 복제 결과24도전 하 만들 수 있습니다. 이러한 문제를 해결 하려면이 최적화 된 프로토콜, 개발 되었다는 얇은 섬유 소 가닥을 유도 하는 Aβ의 효과 단백질의 덩어리로 관찰 될 수 있다 (그림 3). 탁도 분석 결과와 본 TDI-2760 Aβ, 섬유 소 번들 (그림 3)의 전형적인 구조를 복원의 효과를 완화 한다.
SEM 샘플 준비, 또한 문제 해결 필요로 할 수 있는 몇 가지 단계가 있습니다. Fibrinogen의 매우 낮은 농도 사용 하는 경우 (0.5 µ M 또는 더 적은)는 혈전 유리 슬라이드에 단단히 고정 되어 있을 수 있습니다 그리고 수 손상/세척 멀리 고정/세척 단계 동안. Fibrinogen의 낮은 농도 사용 하는 경우 응고 형성 시간 사이 트 롬 빈의 추가 및 고정, 늘릴 수 있습니다 몇 시간까지이 응고 안정성을 증가 수 있습니다. 또한, 사용자가 피해 야 한다 탁도 및 SEM 분석 실험, 고 강도 인산 염 버퍼 또는 인산 염 버퍼 식 염 수를 사용 하 여 인산 염 이온 칼슘 중재 응고 형성 과정을 방해 수 있습니다. 고정, 후 응고 형성 및 SEM 분석에 대 한 버퍼를 포함 하는 다른 높은 소금 사용 하는 경우 세척 단계도 수행 해야 감기 ddH2o.
섬유 소 혈전 등 비 전도성 샘플의 SEM 분석 등, 금, 팔라듐은 또는 탄소 입자와 코팅을 요구 한다. 코팅 두께 매우 두꺼운 금속 코팅 섬유 소 혈전의 울트라 구조 표면 지형 마스크 수 수 SEM 이미지에서 중요 한 요소입니다. 이 프로토콜에 얇은 골드/팔라듐 코팅 (20 nm) 스퍼터 코팅에 사용 됩니다. 20 nm 두께 달성 하기 위해 45 이루어졌다는 스퍼터 링 코팅 속도 4 s Å / s. 이 얇은 코팅 (18 nm) 섬유 소 어셈블리의 표면 기능 마스크 표시 되지 않습니다. 그러나, 울트라-구조는 응고의 마스크에 대 한 우려, 소재에 코팅 분자의 적은 "독도"를 떠날 것 이다 그것으로 탄소 코팅 골드/팔라듐을 사용할 수 있습니다.
초점 여기 Aβ fibrinogen 상호 작용에 있다, 하는 동안이 프로토콜 섬유 소 혈전 다른 단백질 또는 화합물의 상호작용을 분석 하기 쉽게 수정할 수 있습니다. 이러한 지침에 따라 수 사관 섬유 소 혈전 형성 생체 외에서 복제 하 고 이러한 유선형된 응고-탁도 분석 결과와 sem의 프로토콜 분석을 수행을 수 있어야 합니다. 다음과 같이 이전에 게시 억제제와 복합 TDI-2760,이 메서드는 추가로 적용 될 수 있는 섬유 소 혈전 형성에 관한 귀중 한 정보 연구 체 외에서 그리고 vivo에서모두 제공.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 마사 노리 가와사키가 즈 요 시 아소, 그리고 마이클 폴 리 트라이 기관 치료제 발견 연구소 (TDI), Aβ-fibrinogen 상호 작용 억제제의 합성에 대 한 뉴욕 및 그들의 귀중 한 제안에서 감사합니다. 저자는 또한 유용한 토론에 대 한 스 트 릭 랜드 연구소의 회원을 감사합니다. 이 작품에 의해 지원 되었다 NIH 그랜트 NS104386, 질병의 약물 발견 재단, 그리고 로버트 슨 치료 개발 기금 랭에 대 한 NIH 부여 NS50537, 트라이 기관 치료제 디스커버리 연구소 Alzheimer 약물 발견 재단, Rudin 가족 재단과 S.S.의 존 A. 에르난데스
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
