Summary
フィブリン凝固組織に及ぼす β-アミロイドを分析する個別にまたは組み合わせて使用することができます 2 つの方法は、ここで紹介します。続いて、体外フィブリン血栓を作成する血栓濁度及び走査電子顕微鏡法に含まれている、プロトコルです。
Abstract
この記事は、体外のフィブリン塊の生成と分光法による β アミロイド (a β) 蛋白が血栓形成と構造に及ぼす影響の分析走査電子顕微鏡 (SEM) の方法を紹介します。アルツハイマー病 (AD) における神経毒性アミロイド凝集体を形成、a β は、フィブリノゲンと対話する示されています。この a β フィブリノーゲン相互作用構造的異常および線溶に強いフィブリン血栓になります。A β によるフィブリン凝固異常などけばけば、AD 病理脳血管側面に貢献するかもしれないまた、炎症だけでなく、脳アミロイドアンギオパチー (CAA)。AD 病理脳血管障害の可能性のある重要な役割を与え、有望な治療上の価値は、抑制したり、a β フィブリノーゲン相互作用を軽減する化合物の開発。どのフィブリンによる血栓形成を簡単かつ体系的に評価する培養方法は、治療化合物の開発の潜在的に有用ツールです。ここに提示すると、a β と β フィブリノーゲンの相互作用阻害剤の効果の解析と同様にフィブリン血栓の生成体外に最適化されたプロトコルです。血栓の濁度測定は急速な再現性の高い、多数 a β フィブリノーゲン阻害剤のスクリーニングを可能にする同時に、複数の条件をテストする使用ことができます。A β による SEM. を使用してフィブリン血栓建築の構造的な異常を改善する能力をこのスクリーニングからヒット化合物をさらに評価できます。これらの最適化されたプロトコルの有効性を TDI-2760、最近同定された a β フィブリノーゲン相互作用阻害剤を使用してここで示します。
Introduction
アルツハイマー病 (AD)、高齢患者における認知機能の低下につながる神経変性疾患主に起こる異常な β アミロイド (a β) 式、集計および神経毒性1,の結果障害クリアランスから2。 a β の凝集体と広告3のよ特徴付けられた協会、にもかかわらず病の病理の基礎となる正確なメカニズムの理解4ではありません。証拠が増えている神経血管障害が進行と広告5の重症度の役割を果たすこと a β は直接循環システム6のコンポーネントと対話します。A β フィブリノーゲン7、は8、AD 患者でマウス モデル9,10,11a β 預金も鈍痛と高親和性の相互作用があります。さらに、線溶9,12への抵抗と同様、異常なフィブリン血栓形成と構造、a β フィブリノーゲンの相互作用を誘導します。循環障害、a β とフィブリノゲン13,14間の相互作用を阻害することによって広告の治療 1 つの治療可能性を軽減すること。我々 は、したがって、高スループット スクリーニングと医薬品化学アプローチ13,14a β フィブリノーゲンの相互作用を阻害するいくつかの小さな化合物を識別されます。A β フィブリノーゲン相互作用阻害剤の有効性をテストするためフィブリン血栓形成の in vitro解析の 2 つの方法を最適化: 濁度分析、走査電子顕微鏡 (SEM)14を凝固します。
血栓濁度測定は、紫外可視分光法を用いたフィブリン血栓形成を監視するための単純明快かつ迅速な方法です。フォーム、光はますますフィブリン血栓として散らばっているし、ソリューションの濁度を増加させます。逆に、a β が存在する場合フィブリン血栓の構造を変更すると、および混合物の濁度が減少 (図 1)。A β による異常から血栓の濁度を復元する潜在的な阻害物質の影響を評価できます。濁度測定は、複数の条件の迅速分析できますが、塊形状と構造に関する限定的な情報を提供します。血栓15,16,17,18 3 D アーキテクチャの方法の評価分析を SEM では、電子プローブによってソリッド オブジェクトの形状が明らかになる可能 a β の存在とあるいは阻害化合物は、その構造9,14を変更します。両方の様々 な目的のために使用されている古典的な実験技術は、SEM 分析法、吸光光度法をアミロイド凝集19,20を監視に使用するたとえば。同様に、SEM は、またパーキンソン病や血栓塞栓性脳卒中患者21,22,23アルツハイマー病のプラズマから形成されるフィブリン血栓を分析する使用されます。ここに示すプロトコルは、再現性と迅速な方法でフィブリン血栓形成の評価に最適です。
次のプロトコルは、体外フィブリン-血栓と a β なしの準備のための手順を提供します。また、フィブリン血栓形成と構造の a β の効果を分析する方法の詳細します。TDI-2760、小さな阻害化合物14を使用して a β フィブリノーゲンの相互作用の阻害を測定するためのこれらの 2 つの方法の有効性を示します。これらのメソッドを個別と一緒はフィブリン血栓形成の in vitroの迅速かつ簡単ですが解析できるように。
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Protocol
1. 分析のため Aβ42 とフィブリノーゲンの準備
- 凍結乾燥粉末から単量体 Aβ42 を準備します。
- 30 1,500 × g で部屋の温度とスピンする Aβ42 パウダーを暖まる s。
- Aβ42 粉末 0.5 mg 当たり冷たい hexafluoroisopropanol (HFIP) の 100 μ L を追加し、氷で 30 分間インキュベートします。
注意: HFIP を処理するときに注意をして、化学のフードのすべての手順を実行します。 - 20 μ L の因数と 2-3 h. フィルムの化学フード乾燥フィルム空気は-20 ° C で保存できるようにを準備します。
- 室温で 10 分間お風呂超音波発生装置の撹拌によって新鮮なジメチルスルホキシド (DMSO) を 10 μ l 添加の単量体の Aβ42 映画を再構成します。
- 50 mM トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) バッファー (pH 7.4) の 190 μ L を追加し、そっと上下にピペットします。
- 4 ° c 20 分 20,817 × g で遠心分離によるタンパク質凝集体を削除します。
- タンパク質凝集体を破棄、さらに一晩、翌日遠心 4 ° C で 20,817 x g で 20 分間の 4 ° C で上清を孵化させなさい。
- ビシンコニン酸 (BCA) 法による Aβ42 濃度を測定します。シリアル希薄精製ウシ血清アルブミン (BSA) 1 mg/mL から 0.0625 mg/ml 蛋白質の標準、3 通のウェル プレートの井戸に各標準の 10 μ L を追加します。A β サンプル 1:4 希釈し、3 通の井戸に 10 μ L を追加します。BCA ソリューション A と B を混ぜて、200 μ L を各ウェルに追加します。37 ° C で 30 分間インキュベートし、562 のプレート リーダーで読む nm。氷の上の残りの a β ソリューションを維持し、濁度測定および SEM のためのこの準備を使用
- フィブリノゲン溶液を調製します。
- 15 mL チューブにフィブリノゲンを凍結乾燥粉末の 20 mg を測定し、予め温めておいた 2 mL の 20 mM hydroxyethylpiperazine エタン スルホン酸 (HEPES) バッファー (pH 7.4) を持つ再中断します。
- 10 分の 37 ° C の水浴で孵化させなさい。
- 0.2 μ m のシリンジ フィルターを通してソリューションをフィルターし、30 分のための 4 ° C で保存します。フィブリノゲン集計を削除する再び 0.1 μ m シリンジ フィルターを通して 4 ° C とフィルターからソリューションを取るまたは既存のフィブリン。
- BCA アッセイ フィブリノーゲン濃度を測定します。1.1.8 の手順の指示に従います。4 ° C で残りのフィブリノゲン溶液を維持し、濁度測定および SEM のためのこの準備を使用
2. 血栓濁度測定
- 96 ウェル プレートの実験も、その最終濃度が 200 μ L バッファーの 3.0 μ M、ステップ 1.1.8 から 30 μ M Aβ42 溶液 20 μ L を追加します。96 ウェル プレートでコントロール井戸をバッファーに 50 mM Tris バッファー (pH 7.4) で 5 %dmso の同じボリュームを追加します。
注: この手順で Aβ42 の正確な量は重要ではありません。低濃度の準備のために高いボリュームを使用できますと血栓形成バッファーのボリュームを調整することができます。最終巻 200 μ L のままする必要があります。 - 阻害物質をテストする場合は希釈作業濃度 DMSO への化合物です。追加化合物または DMSO だけで Aβ42 とよく混ぜると井戸を制御するため。
注: Aβ42 ソリューションだけでなく、化合物の下部に離散液滴を形成する、または DMSO は液滴のセンターに直接戻必要があります。 - 血栓形成バッファーのステップ 1.2.4 からフィブリノゲン原液を希釈 (20 mM HEPES 緩衝液 (pH 7.4) 5 mM CaCl2、および 137 mM NaCl) 96 ウェル プレートの Aβ42 を含む、コントロールの井戸に追加。その最終濃度反応容量 200 μ L で 1.5 μ M になるように、フィブリノーゲン溶液の量を調整します。ゆっくりとソリューションをピペットし、泡の形成を避けるため。板振動回転プラットフォーム上で 30 分間室温で孵化させなさい。
注: フィブリノゲン溶液のボリュームはその在庫の濃度によって異なりますが、各容量も潜伏中 170 μ L をする必要があります。 - DdH2O 50 U/mL の原液を作るための商業的精製トロンビン粉末を溶解することにより、トロンビン溶液を準備します。直接使用する前に 20 mM HEPES 緩衝液 (pH 7.4) の 5 U/mL 作業ソリューションに希釈します。
- インキュベーションの 30 分後に同時にマルチ チャンネル ピペットを使用してステップ 2.3 から 96 ウェル プレートでフィブリノゲン ソリューションにトロンビン溶液 (5 U/mL) を 30 μ L を追加します。トロンビン添加はすぐに血栓形成を開始します。したがって、泡の形成を避けるために注意を払ってのフィブリノゲン溶液のセンターに直接トロンビンを追加します。
注: トロンビンの活動は、トロンビンの多くと同様に、実験条件によって異なります。確実の塊を生産するために必要な正しい濃度は経験的に定められる必要があります。 - 体外血栓トロンビン添加の直後プレート リーダーで吸光度をお読みください。350 で吸光度を測定、すべての 30-60 s. 実行室温で全体アッセイの 10 分のコース上の nm。
注: いくつかの阻害剤の化合物可能性があります変更するソリューション吸光度 350 nm、405 で、ケース、濁度を測定できる nm。
3. 走査電子顕微鏡観察
- 血栓、固定および洗濯の準備
- 場所の清潔さは、鉗子を使用して 12、または 24 ウェル プレートにガラス サークル カバー スライド (12 mm) をケイ化。
- 血栓形成バッファー中のフィブリノゲンを準備します。詳細についてはプロトコル手順 1.2 を参照してください。
- A β フィブリノーゲン相互作用阻害剤のフィブリン血栓構造に及ぼす影響を評価するには、濁度分析 (ステップ 2) のとおり培養の指示に従います。常に a β と阻害剤の不在中のフィブリノゲンを含む制御井戸があります。
- カバー スライド ステップ 3.1.3 からフィブリノーゲン混合物の 80 μ L をピペットします。ソリューションが優しく広がるカバー スライドに均等に分布しています。
- トロンビン株式 (50 U/mL) を最終濃度 2.5 U/mL に 20 mM HEPES 緩衝生理食塩水に希釈し、混合せずフィブリノゲン ソリューションの中心に直接 20 μ L を追加します。
注: 必要な場合、高いトロンビン使用濃度 (5 U/mL) が使用できます。 - プラスチック製ふた付け 12 ウェル プレートをカバーし、30-60 分の室温でそれを残します。
- 凝固反応が実行されていると、脱水症状や固定のソリューションを準備します。ナトリウム cacodylate バッファー (0.1 M、pH 7.4) を準備します。ナトリウム cacodylate バッファー (0.1 M、pH 7.4) 2% グルタルアルデヒドのソリューションの作業をするために 10% グルタルアルデヒド原液を希釈します。氷の上のすべてのこれらのソリューションをしてください。1 週間以内たて希薄グルタルアルデヒド (2%) を使用する必要があります正しく 4 ° C で冷蔵庫で保存するとき
- 無水エタノール (100%) 二重蒸留水 (80%、50%、20% エタノール) で希釈します。これらのエタノール溶液とエタノール (100%) 氷の上にしてください。
注意: ナトリウム cacodylate とグルタルアルデヒドを処理するときに注意をして、化学のフードでこれらの手順を実行します。 - 30 分後 2 回冷たいナトリウム cacodylate バッファー (0.1 M) と血栓は水洗い。血栓が完全に浸漬するよう、各ウェルにバッファーの 2 mL を追加します。ふた付きウェル プレートをカバーし、室温で 2 分間それを残します。2 分後に 1 mL ピペットや狭い幹転送ピペットを使用してバッファーを慎重に取り外します。もう一度繰り返します。
- 冷たいグルタルアルデヒド (2%) で、血栓を固定します。ウェル プレート氷の上を維持し、各ウェルに 2% グルタルアルデヒドの約 2-3 mL を追加します。血栓が完全に水中に沈むかどうかを確認します。カバーし、30 分間氷の上プレートを残してください。
- 30 分後に優しく各ウェルから、グルタルアルデヒドを削除し、(2分、2 回) 上記のようにナトリウム cacodylate バッファー (0.1 M) を使用して血栓を洗います。氷の上のウェル プレートを保ちます。
- 血栓と臨界点乾燥のシリアルの脱水
- 冷たいエタノールの洗浄ステップ 3.1.8 (20%、50%、80%、100%、again100%) 5 分で準備の一連の階級における血栓を脱水します。エタノール系列ごとに、血栓が水中に沈むことを確かめる 2-3 mL を追加します。カバーし、氷の上を孵化させなさい。
- 各エタノール ステップ後エタノール 1 mL ピペットまたは使い捨てピペット スポイトを使用してを削除します。エタノールを完全に削除しないでください。血栓表面は空気に公開されませんを確認します。
注: 無水エタノール (100%) で脱水を 2 回実行する必要があります。 - サンプルの最後の 100% エタノールに浸漬したまま、臨界点乾燥機 (CPD) に転送します。CPD 室にスライドを転送するため、洗濯機で CPD の試料ホルダーまたはカバー スリップ ホルダーを使用します。各スライドの間に少なくとも 1 つの洗濯機を配置します。
- CPD 室からカバー スライドを取り出し、カーボン テープを使用して SEM スタブでそれをマウントします。
- スパッタ コーティングとイメージング
- スパッタ コーティング室に SEM の半券の提示ですべてのサンプルを転送します。
- スパッタ コート未満 20 nm の金/パラジウムまたは他の導電性材料、真空スパッタ塗布装置による炭素など。
注: 我々 は 18 を使用している金/パラジウム コーティングの nm。スパッタ コーティングを行った 45 s と塗装速度だった 4 Å/s. スパッタ コーティング サンプルが数週間室温乾燥した環境で正しく保持するとき安定しています。SEM 分析をいつでも実行できます。 - 4 SE2 検出器搭載の走査型電子顕微鏡の画像を取得 kV。
注:この画像でイメージのピクセル サイズは、13 nm 31 nm から範囲を設定します。
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Representative Results
体外(濁度) アッセイを凝固、酵素トロンビンは、フィブリノゲン、フィブリン ネットワーク24の形成の結果を裂きます。このフィブリン血栓形成濁り (図 1)、(図 2緑) 読書期間の終わりの前に頭打ちで、その結果、ソリューションを通過する光の散乱が発生します。曲線の約半分の高さの最大値に達すると、溶液の濁度が減少したとき、フィブリノゲンはだった Aβ42 の存在下で培養した、フィブリノゲン単独で (図 2 a、青) のこと。最近の出版物で a β の凝集のブロッカーのシリーズを合成し、複合 TDI 276014を識別する a β フィブリノーゲンの相互作用を阻害する能力を評価しました。本研究では a β フィブリノーゲンの対話をブロックする TDI 2760 を使いました。TDI-2760 の存在下での効果を以前は、報告された a β は濁度が a β だけで (図 2 a、赤) より高いほどに改善。化合物として背景の濁度に起因する変化しなかったフィブリン血栓濁度 (図 2 a、紫) 欠席した a β は、TDI 2760 の効果は表示されません。生体外でここで説明した濁度測定を凝固、形成とそのプロセスを減衰させることができる要因をフィブリン血栓によってを観察できる迅速かつ簡単な方法です。フィブリン モノマー ノブ穴相互作用18,25との干渉によってフィブリン重合の邪魔をする知られている GPRP は、濁度測定 (図 2 b) 肯定的な制御として使用できます。以前のレポートの25GPRP ペプチドの存在と一貫したフィブリン血栓濁度大幅減少 (図 2 b, 青対緑) 不在でフィブリン血栓形成と比較するとしました。
次の同じプロトコルおよび上記濁度測定条件では、フィブリン血栓を a β や TDI 2760 の有無で調製しました。血栓は、固定、脱水、臨界点乾燥、金スパッタ コーティング (図 1)、電子顕微鏡用処理されました。フィブリノーゲンがトロンビンおよび CaCl2のみの存在下では、大きい束 (図 3 a) と同様にフィブリンの細長いとインターカ レートのスレッドでのフィブリン メッシュを形成しました。A β が存在したときフィブリン スレッドがいくつか付箋の塊/骨材 a β による構造異常 (図 3 b) を示す、薄くなった。濁度の測定結果と一致して、TDI 2760 部分的復元フィブリン血栓の構造 a β による変化から、少ない塊はあたかも存在 (図 3 C)。濁度測定と SEM は、範囲およびフィブリン血栓形成、a β による変更の品質だけでなく、TDI 2760 阻害化合物の有効性を明らかにします。
図 1: 濁度測定および SEM によるフィブリン血栓分析の概略図回路図は、フィブリン血栓濁度と構造地形にフィブリン血栓分析に必要な手順と a β の効果を示しています。2 μ m であり、倍率は 10、SEM 像 (左下) の縮尺記号 000 X。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:体外に及ぼす影響 Aβ42 の測定濁度法によるフィブリン血栓形成します。(A)フィブリノゲンは Aβ42 の有無で培養しました。ソリューション (緑) の濁りで、その結果、トロンビンによる血栓形成を惹起されました。Aβ42 の存在下では、フィブリン血栓は異常構成された濁度低下 (青) の結果が。化合物の TDI 2760 または DMSO フィブリノゲン ソリューションでは、Aβ42 と培養。TDI 2760 は、濁度は、通常の血栓形成 (紫) を変更することがなく (赤) の Aβ42 による減少を復元しました。(B)知られている線溶系阻害剤、GPRP の濁度はまたこの試金のための肯定的な制御として測定しました。フィブリノーゲンは 1.5 μ M GPRP とトロンビンを追加した後測定した濁度の有無で孵化します。Aβ42 と同様に、フィブリン血栓形成の濁度大幅減少 GPRP (緑と青) が存在しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: A β による異常フィブリン血栓アーキテクチャの電子顕微鏡写真をスキャンします。精製されたフィブリノゲン(A)、フィブリノーゲン + Aβ42 から取得したフィブリン塊構造の電子顕微鏡写真をスキャン(B)、フィブリノーゲン + Aβ42 + TDI-2760 (C)。血栓形成は、トロンビンおよび CaCl2を混合物に追加することによって開始されました。構造解析では、Aβ42 の存在下で形成された血栓が薄く、異常周辺固定支持自体、フィブリノゲンと比較を明らかにしました。TDI-2760 Aβ42 フィブリノゲンの相互作用を阻害するため知られている部分的にフィブリン血栓による Aβ42 構造異常を修正しました。スケール バーは 1 μ m ですこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
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Discussion
ここで説明する方法は、フィブリン血栓形成の in vitro評価の再現性と迅速な手段を提供します。さらに、システムのシンプルさは、フィブリン血栓形成と構造比較的ストレートに a β がどのように影響するかの解釈です。この演習の前の文書で a β フィブリノーゲン相互作用13,14を禁じる機能のための化合物をテストするこれらの試金を使えることが示されました。これらの 2 つの試金を使用して、合成化合物のシリーズは a β フィブリノーゲンの相互作用を阻害する能力を分析しました。実際には、血栓の濁度測定は、a β フィブリノーゲンの相互作用を阻害することができますすべての化合物は、フィブリン血栓形成を復元することも治療の可能性があるものにヒット化合物のプールを狭く使用できます。
濁度測定のトラブルシューティングが必要な場合がありますまたはこの技術の使用を制限するいくつかの側面があります。主な制限は、実験結果の解釈を複雑にする可能性がありますのいくつかのバリエーションがあることです。このバリエーションのいくつかは、トロンビン活性に起因するとは。トロンビン活性のトラブルシューティングについては、ユーザーは a β とテストの化合物との実験を開始する前に血栓形成活動のトロンビンの複数の濃度をテストできます。ここに示す実験条件の下で a β、フィブリノゲンの不在で増加しないフィブリン重合による濁度曲線が観測バック グラウンド レベルを示す上記溶液の濁度。しかし、a β が凝集しやすいペプチド、高濃度 β ソリューション室温または 37 ° C (数時間) で非常に長い時間続けたときの濁りを引き起こす維凝集体を形作ることができます。時間暖かいまたは室温で長期間保存されている a β ソリューション効果の分析、ソリューションの凝集状態が電子顕微鏡によって決定できます。ここで説明したプロトコル、作りたての a β とフィブリノーゲンのソリューションが使用集計上の問題を排除する必要があります。ただし、これらの製剤の品質を確保するため彼らは透過型電子顕微鏡により評価されている.さらに、商業 a β ペプチドの新しいロットを使用している場合、透過電子顕微鏡によるオリゴマーの量および重合程度が評価されなければなりません。ペプチド品質と前もって形成された集計と確かに重合率に影響を与える単量体の a β の比率でロットごとに変動がある可能性があります。重合インキュベートする前に a β ソリューション (BCA 法) の濃度を確認することをお勧めします。これらの変化を最小限に抑えるためにオリゴマー形成反応の少なくとも 0.1 mg/mL の a β 溶液を使用してみました。
この試金は温度やモーションなど小さな環境の変化に敏感でもあるのでさまざまな実験から濁度測定を一緒に分析できないする必要があります。つまり、比較することができる条件の数は限られている井戸の数によってそのトロンビン同時に追加できるマルチ チャンネル ピペットで (すなわち。、12)。ユーザーには、フィブリン血栓からの信号を遮ると、実験の解釈を困難にまたその粘性またはバッファーおよび試験化合物の色は高いバック グラウンドの濁度につながる注意すべき。ただし、すべてのコントロールは、各実験で含まれている場合、バック グラウンド信号は濁度吸光度を変更するかどうかを容易に判断することが可能する必要があります。
濁度測定は、a β によるフィブリン血栓の形成を阻害するかどうかに関する情報を提供し、さらに阻害剤化合物は、この効果を軽減できる場合。ただし、これをない a β に対するフィブリン血栓の構造を変更する方法を明らかにするや化合物にヒットしません。この質問は、SEM、血栓アーキテクチャの直接可視化のことで対処できます。SEM は十分に確立された技術と精製フィブリノゲンやプラズマから血栓構造を可視化するため日常的に使用します。ただし、SEM 分析のための伝統的な血栓準備プロセスは複雑で時間がかかるすることができます。さらに、プロトコルで異なる研究グループ間の小さな違いは、結果24を複製するために挑戦することができます。これらの問題に対処するため、薄くフィブリン鎖を誘発する a β の効果とタンパク質の塊観察できる (図 3) この最適化されたプロトコルを開発しました。濁度分析に見られるように、TDI 2760 はフィブリン バンドル (図 3) の典型的な構造を復元する a β の効果を軽減します。
SEM のサンプル準備、トラブルシューティングが必要な場合がありますまた、いくつかの手順があります。フィブリノゲンの非常に低濃度で使用する場合 (0.5 μ M 以下)、血栓スライド ガラスにしっかりと接続されていないあり、破損している洗浄離れて中に固定/洗浄のステップ。フィブリノゲンの低濃度を使用している場合血栓形成時間トロンビン添加と固定の間される最大数時間と増加これは血塊の安定性を高める可能性があります。また、ユーザーは、リン酸イオンはカルシウムを介する血栓形成プロセスを妨げる可能性がある、濁度と SEM の試金、高強度リン酸バッファーまたはリン酸緩衝生理食塩水を使用しないでください。いずれかに固定、術後後血栓形成と SEM 分析用のバッファーを含む他の高い塩を使用している場合手順を洗浄も行わなければならない冷たい ddH2o.
フィブリン血栓など非導べ電性試料の SEM 分析など、金、パラジウム、銀、炭素粒子のコーティングが必要です。膜厚は SEM イメージングの重要な要因に非常に厚い金属コーティングがフィブリン血栓の超構造の凹凸を隠すことができることが可能です。このプロトコルでは薄い金/パラジウム コーティング (未満 20 nm)、スパッタ コーティングに使用されます。未満 20 nm の厚さを達成する 45 のため行われたスパッタリング コーティング率 4 s Å/s。この薄いコーティング (18 nm) フィブリン アセンブリのサーフェス フィーチャをマスクに表示されません。ただし、血栓の超構造をマスキングについて懸念している場合、炭素コーティングは、素材に塗装分子の少ない「島」が残りますので金/パラジウムの代わりとして使用できます。
ここでの焦点は、a β フィブリノーゲンの相互作用にしてきましたが、フィブリン血栓とその他のタンパク質や化合物の相互作用を分析するこのプロトコルを容易に変更することができます。これらの指示に従って、調査官を体外フィブリン血栓形成を再現し、これらの合理化された血栓濁度測定と SEM プロトコル分析を実行できる必要があります。図では、以前に発行された阻害化合物として TDI-2760、これらのメソッドは、さらに適用できるフィブリン血栓形成に関する貴重な情報研究in vitroとin vivoの両方を提供します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、川崎正憲、和義麻生とトライ機関治療薬探索研究所 (TDI)、a β フィブリノーゲン相互作用阻害剤の合成のためのニューヨークおよび彼らの貴重な提案からマイケル ・ フォーリーをありがとうございます。著者には、役に立つ議論のストリックランド研究室のメンバーもありがとうございました。この作業によって支えられた NIH グラント NS104386、アルツハイマー病の薬発見財団、ロバートソン治療開発基金内接、NIH を与える NS50537、トライ制度治療薬探索研究所アルツハイマー病の薬発見財団ルーディン財団と s. s. のジョン a. ハーマン
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
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