Summary
Aqui apresentados são dois métodos que podem ser usados individualmente ou em combinação para analisar o efeito da beta-amiloide na estrutura do coágulo de fibrina. Incluído é um protocolo para criar um em vitro coágulo de fibrina, seguido pelo coágulo turbidez e microscopia eletrônica métodos.
Abstract
Este artigo apresenta métodos para gerar coágulos de fibrina em vitro e analisando o efeito da proteína de beta-amiloide (Aβ) na formação de coágulos e estrutura por espectrometria e microscopia eletrônica (SEM). Aβ, que forma neurotóxicos agregados amiloides na doença de Alzheimer (AD), foi mostrado para interagir com o fibrinogênio. Essa interação de Aβ-fibrinogênio faz o coágulo de fibrina estruturalmente anormal e resistente a fibrinólise. Induzida por aβ anormalidades na coagulação fibrina também podem contribuir para aspectos cerebrovasculares da patologia AD tais como microinfarcts, inflamação, bem como, Angiopatia amiloide cerebral (CAA). Dado o papel potencialmente crítico dos défices neurovasculares na patologia AD, desenvolvimento de compostos que podem inibir ou diminuir a interação de Aβ-fibrinogênio tem valor terapêutico promissor. Métodos in vitro pelo qual fibrina formação do coágulo pode ser facilmente e sistematicamente avaliada são potencialmente úteis ferramentas para o desenvolvimento de compostos terapêuticos. Apresentado aqui é um protocolo otimizado para in vitro geração do coágulo de fibrina, bem como a análise do efeito dos inibidores de interação Aβ e Aβ-fibrinogênio. O ensaio de turbidez do coágulo é rápida, altamente reprodutível e pode ser usado para testar várias condições simultaneamente, permitindo a seleção de um grande número de inibidores de Aβ-fibrinogênio. Sucesso compostos desta seleção podem ser mais avaliados por sua capacidade de amenizar induzida por Aβ anormalidades estruturais da arquitetura do coágulo de fibrina usando SEM. A eficácia destes protocolos otimizado é demonstrada aqui usando TDI-2760, um inibidor de interação de Aβ-fibrinogênio recentemente identificado.
Introduction
A doença de Alzheimer (AD), uma doença neurodegenerativa, levando ao declínio cognitivo em pacientes idosos, predominantemente decorre anormal expressão de beta-amiloide (Aβ), agregação e liberação prejudicada, resultando em neurotoxicidade1, 2. apesar da associação bem caracterizada entre agregados Aβ e AD3, os mecanismos precisos subjacentes a patologia da doença não são bem compreendidas4. Aumentando a evidência sugere que os défices neurovascular desempenham um papel na progressão e gravidade da AD5, como Aβ interage diretamente com os componentes do sistema circulatório6. Aβ tem uma interação de alta afinidade com fibrinogênio7,8, que localiza também aos depósitos Aβ em pacientes AD e rato modelos9,10,11. Além disso, a interação de Aβ-fibrinogênio induz a formação do coágulo de fibrina anormal e estrutura, bem como resistência a fibrinólise9,12. Uma possibilidade terapêutica no tratamento de AD, está aliviando o déficit circulatório, inibindo a interação entre Aβ e fibrinogênio13,14. Nós, portanto, identificamos vários pequenos compostos, inibindo a interação de Aβ-fibrinogênio usando alto throughput triagem e química medicinal abordagens13,14. Para testar a eficácia de inibidores de interação Aβ-fibrinogênio, nós aperfeiçoamos a dois métodos de análise de em vitro formação de coágulos de fibrina: coagular ensaio de turbidez e digitalização de microscopia eletrônica de varredura (MEV)14.
Ensaio de turbidez de coágulo é um método direto e rápido para monitorar a formação de coágulos de fibrina usando espectroscopia UV-visível. Como o coágulo de fibrina, formas, luz é cada vez mais dispersos e a turbidez da solução aumenta. Inversamente, quando Aβ está presente, a estrutura do coágulo de fibrina é alterada, e a turvação da mistura é reduzida (Figura 1). O efeito inibitório compostos pode ser avaliado para o potencial de restaurar o coágulo turbidez de anormalidades Aβ-induzida. Enquanto o ensaio de turbidez permite análise rápida de várias condições, fornece informações limitadas sobre a forma de coágulo e estrutura. SEM, em que a topografia de objetos sólidos é revelada pela sonda de elétron, permite a análise da arquitetura 3D do coágulo16,15,17,18 e a avaliação de como a presença de Aβ e / ou compostos inibitórios altera essa estrutura9,14. Tanto espectrometria e SEM são técnicas clássicas de laboratório que foram usadas para diversos fins, por exemplo, espectrofotometria usada para monitorar a agregação amiloide19,20. Da mesma forma, SEM também é usado para analisar o coágulo de fibrina formado a partir do plasma do Alzheimer, Parkinson e AVC tromboembólico pacientes21,22,23. Os protocolos aqui apresentados são otimizados para avaliar a formação do coágulo de fibrina de forma rápida e reprodutível.
O protocolo seguinte fornece as instruções para a preparação de um em vitro -coágulo de fibrina com e sem Aβ. Ele também detalha os métodos para analisar o efeito de Aβ na formação do coágulo de fibrina e estrutura. A eficácia destes dois métodos para medir a inibição da interação Aβ-fibrinogênio é demonstrada usando TDI-2760, um pequeno compostos inibitórios14. Esses métodos, tanto individualmente e em conjunto, permitem uma análise rápida e simples de em vitro formação de coágulos de fibrina.
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Protocol
1. preparação de Aβ42 e fibrinogênio para análise
- Preparar Aβ42 monomérica de pó liofilizado
- Aquecer Aβ42 pó a temperatura ambiente e rotação para baixo a 1.500 x g, durante 30 s.
- Adicionar 100 µ l de gelado hexafluoroisopropanol (HFIP) por 0,5 mg de pó de Aβ42 e incube por 30 min no gelo.
Cuidado: Tenha cuidado ao manusear HFIP e executar todas as etapas em uma capa de química. - Preparar 20 alíquotas µ l e deixe o que ar seco em uma capa química para 2-3 h. filmes filmes pode ser armazenado a-20 ° C.
- Reconstitua o monomérico Aβ42 filme em 10 µ l de fresco dimetilsulfóxido (DMSO) por agitação em um sonicador de banho durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Adicione µ l 190 de 50 mM tris (hidroximetil) aminometano (Tris) de tampão (pH 7,4) e pipetar para cima e para baixo suavemente.
- Remova os agregados de proteínas por centrifugação a 20.817 x g a 4 ° C por 20 min.
- Incubar o sobrenadante a 4 ° C durante a noite e no dia seguinte centrifugar a solução a 20.817 x g a 4 ° C por 20 min descartar qualquer outra agregados de proteína.
- Medir a concentração de Aβ42 por ensaio de bicinchoninic ácido (BCA). Serial diluído purificada albumina de soro bovino (BSA) de 1 mg/mL de 0,0625 mg/mL para produzir um padrão de proteína, adicionar 10 µ l de cada norma aos poços de uma placa multi bem em triplicado. Diluir as amostras Aβ 1:4 e adicionar 10 µ l nos poços em triplicado. Misture BCA soluções A e B e adicionar 200 µ l de cada poço. Incubar durante 30 min a 37 ° C e um leitor de placa no 562 a ler nm. Manter o restante da solução Aβ no gelo e usar esta preparação para o ensaio de turbidez e SEM.
- Preparar a solução de fibrinogênio
- Medir a 20 mg de pó liofilizado fibrinogênio em um tubo de 15 mL e ressuspender com 2ml pré-aquecido de 20 mM hidroxietilpiperazina etano sulfônico (HEPES) de tampão (pH 7,4).
- Incube em banho-maria 37 ° C por 10 min.
- Filtrar a solução através de um filtro de seringa 0,2 µm e armazenar a 4 ° C por 30 min. Retire a solução de 4 ° C e o filtro novamente através de filtro de seringa 0.1 µm para remover agregados de fibrinogênio ou pré-existente, fibrina.
- Medir a concentração de fibrinogênio por ensaio BCA. Siga as instruções da etapa 1.1.8. Manter o restante da solução fibrinogênio a 4 ° C e use esta preparação para o ensaio de turbidez e SEM.
2. coágulo turbidez ensaio
- A cada poço experimental da placa de 96 poços, adicione 20 µ l de solução de Aβ42 30 µM da etapa 1.1.8 para que sua concentração final é 3,0 µM em 200 µ l de buffer. Adicione o mesmo volume de 5% DMSO em tampão de 50 mM Tris (pH 7,4) para tamponar poços de controle da placa de 96 poços.
Nota: O volume exato de Aβ42 neste passo não é importante. Para as preparações de baixa concentração, um volume mais elevado pode ser usado, e o volume de reserva de formação do coágulo pode ser ajustado. O volume final deve permanecer 200 µ l. - Se testes compostos inibitórios, dilua o composto para a concentração de trabalho como DMSO. Adicionar composto ou DMSO sozinho para um controle de poços com Aβ42 e misture bem.
Nota: Solução de Aβ42 deve formar uma discreta da gota no fundo do poço, o composto ou DMSO deve ser pipetado diretamente para o centro da gota. - Diluir a solução-mãe da etapa 1.2.4 no buffer de formação do coágulo fibrinogênio (tampão HEPES de 20 mM (pH 7,4), 5 mM CaCl2e 137 mM NaCl) e adicioná-lo ao Aβ42 contendo e controle de poços da placa de 96 poços. Ajuste o volume da solução de fibrinogênio para que sua concentração final torna-se 1,5 µM em volume de reação total 200 µ l. Adicionar a solução lentamente e evitar a formação de bolhas. Incube a placa à temperatura ambiente por 30 min tremendo em uma plataforma giratória.
Nota: O volume da solução de fibrinogênio pode variar dependendo de sua concentração das ações, mas o volume total em cada bem deve ser 170 µ l durante a incubação. - Prepare a solução de trombina, dissolvendo o pó de trombina comercialmente purificado em ddH2O tornar-se uma solução stock de 50 U/mL. Dilua a solução de trabalho 5 U/mL em tampão HEPES 20 mM (pH 7,4) diretamente antes da utilização.
- Após 30 min de incubação, simultaneamente adicione 30 µ l de solução de trombina (5 U/mL) para as soluções de fibrinogênio na placa de 96 poços de 2.3 etapa usando uma pipeta multicanal. Adição de trombina iniciará imediatamente a formação de coágulos. Portanto, adicione trombina diretamente para o centro da solução de fibrinogênio com cuidado para evitar a formação de bolhas.
Nota: A atividade de trombina pode variar entre condições experimentais, bem como lotes de trombina. A concentração correta necessária para produzir robustamente coágulos pode ter que ser determinado empiricamente. - Leia a absorvância do coágulo em vitro em um leitor de placa imediatamente após a adição de trombina. Medir a absorvância a 350 nm, ao longo de 10 min, cada 30-60 s. realizar o ensaio inteiro à temperatura ambiente.
Nota: Alguns compostos inibidor podem alterar a absorvância da solução a 350 nm, em que caso a turbidez pode ser medido em 405 nm.
3. microscopia eletrônica
- Preparação de coágulo, fixação e lavagem
- Lugar limpo siliconizado círculo capa lâminas (12 mm) em uma placa bem-12 ou 24-bem usando fórceps.
- Prepare o fibrinogênio no buffer de formação do coágulo. Ver protocolo passo 1.2 para obter detalhes.
- Para avaliar o efeito dos inibidores de interação Aβ-fibrinogênio na estrutura do coágulo de fibrina, siga as instruções para a incubação, conforme descrito para o ensaio de turbidez (etapa 2). Sempre incluem poços de controle que contêm fibrinogênio na ausência de Aβ e inibidores.
- Pipete 80 µ l da mistura da etapa 3.1.3 nas corrediças de capa de fibrinogênio. Delicadamente, espalhe a solução para que é uniformemente distribuída no slide capa.
- Diluir o estoque de trombina (50 U/mL) em solução salina HEPES buffer de 20 mM a uma concentração final de 2,5 U/mL e adicionar 20 µ l, diretamente para o centro de para a solução de fibrinogênio sem misturar.
Nota: Se necessário, uma maior concentração de trabalho de trombina (5 U/mL) pode ser usada. - Cobrir a placa de 12 com uma tampa de plástico e deixá-lo em temperatura ambiente por 30-60 min.
- Enquanto a reação de coagulação está executando, prepare soluções de desidratação e fixação. Prepare o tampão de cacodylate de sódio (0,1 M, pH 7,4). Dilua a solução de glutaraldeído 10% das ações no buffer de cacodylate de sódio (0,1 M, pH 7,4) tornar-se um 2% solução de glutaraldeído a trabalhar. Manter todas essas soluções no gelo. Recentemente diluída de glutaraldeído (2%) deve ser usado dentro de 1 semana, quando devidamente armazenado em geladeira a 4 ° C.
- Dilua o etanol absoluto (100%) em água bidestilada (20%, 50% e 80% de etanol). Manter estas soluções de etanol e o etanol absoluto (100%) no gelo.
Cuidado: tenha cuidado ao manusear o cacodylate de sódio e glutaraldeído, execute estas etapas em uma capa de química. - Após 30 min, delicadamente lave duas vezes os coágulos com buffer de cacodylate gelada de sódio (0,1 M). Adicione 2 mL de tampão de para cada poço, tal que o coágulo está completamente submersa. Cobrir a placa bem com uma tampa e deixe por 2 min à temperatura ambiente. Depois de 2 min, retire com cuidado o buffer usando uma pipeta de 1 mL ou pipeta de transferência tronco estreito. Repeti uma vez.
- Corrigi os coágulos com glutaraldeído gelado (2%). Mantendo a placa bem no gelo, adicione cerca de 2-3 mL de glutaraldeído 2% a cada poço. Assegure-se de que os coágulos estão completamente submersos. Cubra e deixe a placa no gelo por 30 min.
- Após 30 min, delicadamente Retire o glutaraldeído de cada poço e lave os coágulos usando o buffer de cacodylate de sódio (0,1 M) como descrito acima (2 min, duas vezes). Manter a placa bem no gelo.
- Desidratação serial de coágulo e ponto crítico de secagem
- Desidrate os coágulos em uma série graduada de lavagens de etanol gelado preparado na etapa 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100% e again100%) por 5 min cada. Para cada série de etanol, adicione 2-3 mL, certificando-se que os coágulos são submergidos. Cobrir e incubar no gelo.
- Após cada etapa de etanol, remova a solução de etanol utilizando uma pipeta de 1 mL ou conta-gotas pipeta descartável. Não remova completamente o etanol. Certifique-se que a superfície do coágulo não é exposta ao ar.
Nota: Desidratação de etanol absoluto (100%) deve ser realizada duas vezes. - Mantendo a amostra submergida no final 100% de etanol, transferi para um ponto crítico secador (CPD). Use um porta-amostras CPD ou titular de uma lamela com uma máquina de lavar para a transferência de slides para a câmara CPD. Coloque pelo menos uma arruela entre cada slide.
- Leve deslize a tampa da câmara de CPD e montá-lo em um esboço SEM usando fita de carbono.
- Salpicar o revestimento e a imagem latente
- Transferi todas as amostras com esboço SEM à câmara de revestimento por pulverização catódica.
- Por pulverização catódica revestir a menos de 20 nm de ouro/paládio ou outros materiais condutores, tais como carbono, usando um aplicador de vácuo por pulverização catódica.
Nota: Nós usamos 18 nm do revestimento de ouro/paládio. O revestimento por pulverização catódica foi realizado por 45 s e a velocidade de revestimento foi 4 Å / s. Sputter revestido de amostras são estáveis quando mantidos adequadamente em um ambiente seco à temperatura ambiente por algumas semanas. SEM análise pode ser realizada a qualquer momento. - Adquirir imagens em um microscópio eletrônico, equipado com o detector de SE2 em 4 kV.
Nota: O tamanho de pixel da imagem nesta imagem definir intervalo de 13 nm nm-31.
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Representative Results
No em vitro ensaio (turbidez) de coagulação, a trombina enzima cliva fibrinogênio, resultando na formação do fibrina rede24. Esta formação do coágulo de fibrina provoca a dispersão da luz que passa através da solução, resultando em maior turbidez (Figura 1), platô antes do final do período de leitura (Figura 2, verde). Quando o fibrinogênio foi incubado na presença de Aβ42, diminuiu a turvação da solução, com a curva, atingindo uma altura máxima de cerca de metade do fibrinogênio sozinho (Figura 2A, azul). Em recente publicação, uma série de bloqueadores de agregação de Aβ foram sintetizados e avaliados por sua capacidade de inibir a interação de Aβ-fibrinogênio, identificando o composto da TDI-276014. Nós usamos TDI-2760 em nosso estudo para bloquear a interação de Aβ-fibrinogênio. Como relatado anteriormente, na presença de TDI-2760, o efeito de Aβ foi amenizada, como a turbidez foi superior com Aβ sozinho (Figura 2A, vermelho). O efeito da TDI-2760 não parece ser devido à turbidez de fundo como o composto não alterou a turbidez do coágulo de fibrina quando Aβ estava ausente (Figura 2A, roxo). O em vitro coagulação ensaio de turbidez descrito aqui é um método rápido e simples, pela qual coágulo de fibrina-formação e fatores que podem atenuar esse processo podem ser observados. GPRP, que é conhecido por interferir na polimerização da fibrina através de interferindo com fibrina monômero botão-buraco interações18,25 pode ser usado como um controle positivo para o ensaio de turbidez (Figura 2B). Consistente com os anteriores relatórios25, com a presença de peptídeo GPRP, a turbidez do coágulo de fibrina foi significativamente reduzida em comparação com a formação do coágulo de fibrina com sua ausência (Figura 2B, verdes azuis vs).
Seguindo o mesmo protocolo e condições como o ensaio de turbidez acima descrito, coágulos de fibrina foram preparados na presença e na ausência de Aβ e/ou TDI-2760. Os coágulos foram então processados para microscopia eletrônica pela fixação, desidratação, secagem de ponto crítico e revestimento de ouro-por pulverização catódica (Figura 1). Fibrinogênio na presença de apenas trombina e CaCl2 formou uma malha de fibrina, com fios alongados e intercalados de fibrina, bem como pacotes maiores (Figura 3A). Quando Aβ estava presente, os fios de fibrina tornou-se mais finos, com vários grupos/agregados pegajosos, indicando induzida por Aβ anormalidades estruturais (Figura 3B). Consistente com os resultados do ensaio de turbidez, TDI-2760 parcialmente restaurado a estrutura do coágulo de fibrina de Aβ induzido por alterações, como aglomerados menos estavam presentes (Figura 3 C). Juntamente com o ensaio de turbidez, SEM revela a extensão e a qualidade das alterações induzidas pelo Aβ para formação do coágulo de fibrina, bem como a eficácia de um composto inibitório, TDI-2760.
Figura 1 : Representação esquemática da análise de coágulo de fibrina por ensaio de turbidez e SEM. O diagrama esquemático mostra as etapas envolvidas na análise do coágulo de fibrina e o efeito de Aβ na turbidez do coágulo de fibrina e topografia estrutural. As barras de escala de imagens SEM (inferior esquerdo) são 2 µm e a ampliação é de 10, 000 X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Medição do efeito Aβ42 em in vitro formação do coágulo de fibrina por ensaio de turbidez. (A) fibrinogênio foi incubado na presença e na ausência de Aβ42. Formação do coágulo foi induzida pela trombina, resultando em maior turbidez da solução (verde). Na presença de Aβ42, o coágulo de fibrina anormalmente foi estruturado, resultando em diminuição da turbidez (azul). O composto TDI-2760 ou DMSO foram incubados com a solução de fibrinogênio, com e sem Aβ42. TDI-2760 restaurado induzida por Aβ42 diminuição da turbidez (vermelho) sem alterar a formação do coágulo normal (roxo). (B) a turbidez de um inibidor da fibrinólise conhecido, GPRP também foi medido como um controle positivo para este ensaio. Fibrinogênio foi incubado na presença e na ausência de 1,5 µM GPRP e a turbidez medido após a adição de trombina. Semelhante ao Aβ42, a turbidez da formação do coágulo de fibrina foi significativamente reduzida na presença de GPRP (azul e verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Scanning electron micrografias de anormalidades Aβ-induzida à arquitetura do coágulo de fibrina. Digitalização de micrografias de elétrons da estrutura do coágulo de fibrina obtidos de fibrinogênio purificado (A), fibrinogênio + Aβ42 (B), fibrinogênio + Aβ42 + TDI-2760 (C). Formação do coágulo foi iniciada pela adição de trombina e CaCl2 à mistura. A análise estrutural revelou que coágulos formados na presença de Aβ42 são mais finos e anormalmente agrupados em comparação com fibrinogênio, por si só. TDI-2760, que é conhecido por inibir a interação de Aβ42-fibrinogênio, parcialmente corrigida a anormalidade estrutural de Aβ42 induzido do coágulo de fibrina. Barra de escala é 1 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os métodos descritos aqui fornecem um meio rápido e reprodutível de avaliação fibrina coágulo formação em vitro. Além disso, a simplicidade do sistema torna a interpretação de como Aβ afeta a formação do coágulo de fibrina e estrutura relativamente simples e direta. Na publicação anterior deste laboratório, foi mostrado que estes ensaios podem ser usados para testar compostos por sua capacidade de inibir a interação de Aβ-fibrinogênio13,14. Usando esses dois ensaios, uma série de compostos sintetizados foram analisados para a capacidade de inibir a interação de Aβ-fibrinogênio. Na verdade, o ensaio de turbidez do coágulo pode ser usado para estreitar o pool de compostos de sucesso para aqueles que têm potencial terapêutico, como nem todos os compostos que podem inibir a interação de Aβ-fibrinogênio também podem restaurar a formação do coágulo de fibrina.
Existem alguns aspectos do ensaio turbidez que podem requerer a solução de problemas ou limitar os usos desta técnica. A grande limitação é que pode haver algumas variações entre as experiências que podem complicar a interpretação dos resultados. Alguns desta variação é ser devido a atividade da trombina. Para solucionar o problema para a atividade de trombina, os usuários podem testar várias concentrações de trombina para atividade de formação do coágulo antes de começar a experimentação com compostos Aβ e teste. Nas condições experimentais aqui apresentadas, Aβ, na ausência de fibrinogênio, não aumentar a turvação da solução acima de níveis de fundo indicando que observada turbidez curvas são devido a polimerização da fibrina. No entanto, Aβ é um peptídeo propensas a agregação e uma maior concentração da solução Aβ quando mantido durante muito tempo a temperatura ambiente ou a 37 ° C (várias horas) pode formar agregados fibrillar que podem resultar em maior turbidez. Se analisando o efeito de uma solução Aβ que foi armazenada por longos períodos de tempo à temperatura ambiente ou mais quente, o status de agregação da solução pode ser determinado por microscopia eletrônica de transmissão. O protocolo descrito aqui, soluções preparadas de Aβ e fibrinogênio são utilizadas, que deve eliminar problemas de agregação. No entanto, para garantir a qualidade destas preparações eles foram avaliados por microscopia eletrônica de transmissão. Além disso, ao usar muito novo comercial peptídeo Aβ, a extensão da oligomerização e quantidade de oligômeros deve ser avaliada por microscopia eletrônica de transmissão. Porque pode haver variação de lote para lote na qualidade de peptídeo e a proporção de agregados pré-formadas e Aβ monomérica, que certamente afeta a taxa de oligomerização. É aconselhável verificar a concentração da solução Aβ (método BCA) antes da incubação para oligomerização. Para minimizar essas variações, nós tentamos usar pelo menos de 0,1 mg/mL de solução Aβ para reação de formação do oligómero.
Porque este ensaio também é sensível a pequenas mudanças ambientais, como temperatura e movimento, leituras de turbidez de diferentes experiências não devem ser analisadas juntos. Isto significa que o número de condições que podem ser comparados é limitado pelo número de poços a trombina pode ser simultaneamente adicionada para com uma pipeta multicanal (i. e., 12). Os usuários também devem estar cientes de que viscosidade ou cor nos amortecedores e compostos de teste pode levar a uma turbidez de fundo elevado, obscurecendo o sinal do coágulo de fibrina e dificultando a interpretação do experimento. No entanto, se todos os controles estão incluídos em cada experimento, seria possível determinar facilmente se o sinal de fundo está alterando a absorvância de turbidez.
O ensaio de turbidez fornece informações sobre se a formação do coágulo de fibrina é prejudicada pela Aβ e além disso se compostos inibidor podem aliviar este efeito. No entanto, ele não revelam como a estrutura do coágulo de fibrina é alterada em resposta a Aβ e/ou compostos de bater. Esta questão pode ser resolvida com SEM, como este permite a visualização directa da arquitetura do coágulo. SEM é uma técnica bem estabelecida e é usada rotineiramente para visualizar a estrutura do coágulo de fibrinogênio purificado ou de plasma. No entanto, o processo de preparação do coágulo tradicional para análise SEM pode ser complicado e demorado. Além disso, pequenas diferenças entre grupos de pesquisa diferentes protocolos podem torná-lo difícil de replicar resultados24. Para resolver esses problemas foi desenvolvido este protocolo otimizado, com o qual o efeito de Aβ para induzir mais finos fios de fibrina e aglomerados de proteína podem ser observados (Figura 3). Como pode ser visto com o ensaio de turbidez, TDI-2760 alivia o efeito de Aβ, restaurando a estrutura típica de feixes de fibrina (Figura 3).
Existem alguns passos na preparação da amostra a SEM, que também poderá requerer a solução de problemas. Ao usar concentrações muito baixas de fibrinogênio (0,5 µM ou menos), os coágulos podem não ser firmemente ligados à lâmina de vidro e pode ser danificado/lavado afastado durante as etapas de fixação/lavagem. Se usando baixas concentrações de fibrinogênio, tempo de formação do coágulo, entre a adição de trombina e fixação, pode ser aumentada até várias horas, como isso pode aumentar a estabilidade do coágulo. Também, os usuários devem evitar usando tampão de fosfato de alta resistência ou tamponada fosfato salina para a turbidez e ensaios SEM, como íons de fosfato podem interferir com o processo de formação do coágulo mediada por cálcio. Se usando qualquer outro sal de alto contendo tampão para a formação de coágulos e SEM análise, após a fixação, etapas de lavagem, também deve ser realizada com frio ddH2O.
SEM análise de amostras não-condutor, tais como coágulos de fibrina requer revestimento com partículas carregadas como, ouro, paládio, prata ou carbono. Espessura de revestimento é um fator importante na geração de imagens SEM, como é possível que um revestimento de metal muito grosso pode mascarar a topografia da superfície ultraestrutura do coágulo de fibrina. Neste protocolo, fino revestimento de ouro/paládio (menos de 20 nm) são utilizados para revestimento por pulverização catódica. Para atingir a espessura de menos de 20 nm, a pulverização catódica foi feito para 45 s com uma taxa de revestimento de 4 Å / s. Este revestimento fino (18 nm) não aparece para mascarar as características da superfície de montagem de fibrina. No entanto, se preocupado com a ultraestrutura do coágulo de mascaramento, revestimento de carbono pode ser usado como uma alternativa ao ouro/paládio, como ele vai deixar menos "ilhas" de moléculas de revestimento sobre o material.
Enquanto aqui o foco tem sido sobre a interação de Aβ-fibrinogênio, este protocolo pode ser facilmente modificado para analisar a interação de proteínas ou outros compostos com o coágulo de fibrina. Seguindo estas instruções, investigadores devem ser capazes de reproduzir em vitro formação de coágulos de fibrina e realizar análises com esses ensaio aerodinâmico coágulo-turbidez e SEM protocolos. Como mostrado aqui com o inibidor publicado anteriormente composto TDI-2760, esses métodos fornecem informações valiosas sobre a formação de coágulos de fibrina que pode ser aplicada a mais de estudos in vitro e em vivo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Autores agradecer Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso e Michael Foley de Tri-institucional Therapeutics Discovery Institute (TDI), Nova York para a síntese dos inibidores de interação Aβ-fibrinogênio e suas valiosas sugestões. Os autores também agradecer membros do laboratório Strickland para discussão útil. Este trabalho foi financiado pelo NIH grant NS104386, Drug Discovery Foundation do Alzheimer e fundo de desenvolvimento terapêutico Robertson para H.A., NIH conceder NS50537, Tri-institucional Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Fundação da família de Rudin e John A. Herrmann para S.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
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