Summary
Hier sind zwei Methoden, die einzeln oder in Kombination verwendet werden können, um die Wirkung von Beta-Amyloid auf Fibrin Gerinnsel Struktur zu analysieren. Enthalten ist ein Protokoll für die Schaffung einer in Vitro Fibrin Gerinnsel, gefolgt von Gerinnsel Trübung und Rasterelektronenmikroskopie Methoden.
Abstract
Dieser Artikel stellt Methoden zur Erzeugung von in Vitro Fibrin Gerinnsel und Analyse der Wirkung von Beta-Amyloid (Aβ)-Protein auf Bildung von Blutgerinnseln und Struktur durch Spektrometrie und Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Aβ, die neurotoxischen Amyloid Aggregate bei der Alzheimer-Krankheit (AD) bildet, hat sich gezeigt, zur Interaktion mit Fibrinogen. Dieses Zusammenspiel von Aβ-Fibrinogen macht das Fibrin-Gerinnsel strukturell abnorme und Fibrinolyse. Aβ-induzierte Anomalien in Fibrin Blutgerinnung können auch dazu beitragen, zerebrovaskuläre Aspekte der AD Pathologie wie Microinfarcts, Entzündungen sowie zerebralen Amyloid-Angiopathie (CAA). Angesichts der potenziell kritische Rolle der neurovaskulären Defizite in der AD-Pathologie, hat Verbindungen hemmen oder vermindern die Aβ-Fibrinogen-Interaktion zu entwickeln vielversprechenden therapeutischen Wert. In-vitro- Methoden nach dem Fibrin Gerinnselbildung leicht und systematisch beurteilt werden kann sind potenziell nützliche Werkzeuge für die Entwicklung von therapeutischen Substanzen. Hier vorgestellten ist ein optimierte Protokoll für in-vitro- Erzeugung von Fibrin-Gerinnsel sowie Analyse der Wirkung von Aβ und Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitoren. Die Gerinnsel Trübung Assay ist schnelle und hoch reproduzierbare und kann verwendet werden, um mehrere Bedingungen gleichzeitig testen, zulassend die Vorführung einer großen Zahl von Aβ-Fibrinogen-Inhibitoren. Hit-Verbindungen aus diesem Screening können weiter für ihre Fähigkeit, Aβ-induzierte strukturelle Anomalien der Fibrin-Gerinnsel-Architektur mit SEM verbessern ausgewertet werden Die Wirksamkeit dieser optimierte Protokolle ist hier demonstriert mit TDI-2760, eine neu identifizierte Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitor.
Introduction
Alzheimer-Krankheit (AD), ergibt sich eine Neurodegenerative Erkrankung führt zu kognitiven Verfall bei älteren Patienten, überwiegend aus abnorme Beta-Amyloid (Aβ) Ausdruck, Aggregation und eingeschränkter Freiraum was zu Neurotoxizität1, 2. trotz der gut-gekennzeichneten Assoziation zwischen Aβ-Aggregate und AD3, sind die genauen Mechanismen der Krankheit-Pathologie nicht gut verstanden4. Erhöhung der Beweis schlägt vor, dass neurovaskuläre Defizite bei der Progression und Schweregrad der AD5, eine Rolle spielen wie Aβ direkt mit den Komponenten des Herz-Kreislauf-System6 interagiert. Aβ hat eine hohe Affinität Interaktion mit Fibrinogen7,8, die auch zu Aβ Ablagerungen bei Alzheimer-Patienten und Maus Modelle9,10,11lokalisiert. Darüber hinaus induziert die Aβ-Fibrinogen-Interaktion abnorme Fibrin-Klumpenbildung sowie Struktur und Widerstand gegen die Fibrinolyse9,12. Eine therapeutische Möglichkeit bei der Behandlung von AD, ist Kreislauf Defizite durch die Hemmung der Interaktion zwischen Aβ und Fibrinogen13,14Linderung. Wir, identifiziert daher mehrere kleine Verbindungen hemmen die Aβ-Fibrinogen-Interaktion mit Hochdurchsatz-Screening und medizinische Chemie Ansätze13,14. Um die Wirksamkeit von Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitoren zu testen, haben wir zwei Methoden für die Analyse von in-vitro- Bildung von Blutgerinnseln Fibrin optimiert: Blutgerinnung Trübung Assay und Scannen Rasterelektronenmikroskopie (SEM)14.
Gerinnsel Trübung-Assay ist eine unkomplizierte und schnelle Methode zur Überwachung der Bildung von Blutgerinnseln Fibrin mit UV-VIS Spektroskopie. Als das Fibrin-Gerinnsel wird zunehmend Formen, Licht gestreut und die Trübung der Lösung erhöht. Umgekehrt, wenn Aβ vorhanden ist, die Struktur der das Fibrin-Gerinnsel wird geändert, und die Trübung des Gemisches wird reduziert (Abbildung 1). Die Wirkung von hemmenden Verbindungen kann das Potenzial Gerinnsel Trübung von Aβ-induzierte Anomalien wiederherstellen beurteilt werden. Während die Trübung Assay für die schnelle Analyse von mehreren Bedingungen ermöglicht, informiert es begrenzt auf die Gerinnsel Form und Struktur. SEM, in dem die Topographie von festen Körpern von Elektron Sonde offenbart, ermöglicht die Analyse der 3D-Architektur der Gerinnsel15,16,17,18 und die Bewertung wie das Vorhandensein von Aβ und und/oder hemmende Verbindungen verändert die Struktur9,14. Beide Spektrometrie und SEM sind klassische Labor-Techniken, die für verschiedene Zwecke verwendet wurden, z. B. Spektralphotometrie dient zur Überwachung von Amyloid Aggregation19,20. Ebenso dient SEM auch Fibrin Gerinnsel gebildet aus dem Plasma von Alzheimer, Parkinson und thromboembolische Schlaganfall Patienten21,22,23zu analysieren. Die hier vorgestellten Protokolle sind für die Beurteilung der Fibrin-Gerinnselbildung in einer reproduzierbaren und schnelle Art und Weise optimiert.
Das folgende Protokoll enthält die Anweisungen für die Zubereitung von einer in-Vitro Fibrin-Gerinnsel sowohl mit als auch ohne Aβ. Es beschreibt auch die Methoden, um die Wirkung von Aβ auf Bildung von Blutgerinnseln Fibrin und Struktur zu analysieren. Die Wirksamkeit dieser beiden Methoden für die Messung der Hemmung der Aβ-Fibrinogen Interaktion wird demonstriert mit TDI-2760, eine kleine hemmende Verbindung14. Diese Methoden können sowohl einzeln als auch gemeinsam, für schnelle und einfache Analyse von in-vitro- Bildung von Blutgerinnseln Fibrin.
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Protocol
1. Vorbereitung des Aβ42 und Fibrinogen zur Analyse
- Bereiten Sie Monomere Aβ42 aus gefriergetrockneten Pulver
- Warm Aβ42 Pulver auf Raumtemperatur und Spin down bei 1.500 x g für 30 s.
- Fügen Sie 100 µL der eiskalte Hexafluoroisopropanol (HFIP hinzu) pro 0,5 mg Aβ42 Pulver und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.
Achtung: Vorsicht beim Umgang mit HFIP und führen Sie alle Schritte in einer chemischen Kapuze. - Bereiten Sie 20 µL Aliquots und lassen Sie die Filme Luft trocken in einem chemischen Abzug für 2-3 h. Filme bei-20 ° c gelagert werden können
- Rekonstruieren Sie Monomere Aβ42 Film in 10 µL des frischen Dimethyl Sulfoxid (DMSO) durch Agitation in einem Bad Sonikator für 10 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 190 µL 50 mM Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane (Tris) Puffer (pH 7,4) und pipette vorsichtig nach oben und unten.
- Entfernen Sie die Protein-Aggregate durch Zentrifugation bei 20.817 x g bei 4 ° C für 20 Minuten.
- Übernachtung den Überstand bei 4 ° C inkubieren und nächsten Tag Zentrifugieren Sie die Lösung bei 20.817 x g bei 4 ° C für 20 Minuten, jede weitere Protein-Aggregate zu verwerfen.
- Bicinchoninic Säure (BCA) Assay messen Sie Aβ42 Konzentration. Serielle verdünnte gereinigt Rinderserumalbumin (BSA) von 1 mg/mL 0,0625 mg/ml, einen Protein-Standard zu produzieren, fügen Sie 10 µL jeder Norm in die Vertiefungen von Multi-well-Platte in dreifacher Ausfertigung. Aβ Proben 1:4 zu verdünnen und die Brunnen in dreifacher Ausfertigung 10 µL hinzufügen. BCA Lösungen A und B und 200 µL in jede Vertiefung. 30 min bei 37 ° C inkubieren und lesen auf einer Platte Leser bei 562 nm. Halten Sie die restliche Aβ-Lösung auf dem Eis und verwenden Sie diese Vorbereitung für Trübung Assay und SEM.
- Fibrinogen Lösung vorbereiten
- 20 mg gefriergetrockneten Fibrinogen Pulver in ein 15 mL Röhrchen zu messen und wieder mit vorgewärmten 2 mL 20 mM Hydroxyethylpiperazine Ethan Sulfonsäure (HEPES) Puffer (pH 7,4) aussetzen.
- Im Wasserbad 37 ° C für 10 min inkubieren.
- Lösung durch einen 0,2 µm Spritze Filter filtern und speichern bei 4 ° C für 30 Minuten. Nehmen Sie die Lösung von 4 ° C und Filter wieder durch 0,1 µm Spritze Filter, Fibrinogen Aggregate zu entfernen oder bereits vorhandene Fibrin.
- Messen Sie die Fibrinogen Konzentration von BCA-Assay. Befolgen Sie die Anweisungen ab Schritt 1.1.8. Halten Sie die restliche Fibrinogen-Lösung bei 4 ° C und verwenden Sie diese Vorbereitung für Trübung Assay und SEM.
(2) Gerinnsel Trübung Assay
- Fügen Sie in jede experimentelle Vertiefung der 96-Well-Platte 20 µL 30 µM Aβ42 Lösung aus Schritt 1.1.8 hinzu, so dass die Endkonzentration 3,0 µM in 200 µL des Puffers ist. Fügen Sie das gleiche Volumen von 5 % DMSO in 50 mM Tris-Puffer (pH 7,4), Kontroll-Vertiefungen in der 96-Well-Platte zu puffern.
Hinweis: Das genaue Volumen der Aβ42 bei diesem Schritt ist nicht wichtig. Für niedrige Konzentration Vorbereitungen ein höheres Volumen kann verwendet werden, und die Lautstärke des Puffers Gerinnsel-Bildung. Das Endvolumen sollte 200 µL bleiben. - Verdünnen Sie hemmende Verbindungen zu testen, die Verbindung zur Arbeit Konzentration als DMSO. Fügen Sie zusammengesetzte oder DMSO allein für ein Steuerelement in die Vertiefungen mit Aβ42 und gut mischen.
Hinweis: Aβ42 Lösung sollte einen diskrete Tropfen an der Unterseite des Brunnens, die Verbindung zu bilden oder DMSO sollte direkt in der Mitte des Tropfenabscheiders pipettiert werden. - Die Fibrinogen-Stammlösung aus Schritt 1.2.4 Blutgerinnsel Bildung Puffer verdünnen (20 mM HEPES-Puffer (pH-Wert 7,4), 5 mM CaCl2und 137 mM NaCl) und fügen Sie es in Aβ42 Eindämmung und Kontrolle Vertiefungen der 96-Well-Platte. Stellen Sie die Lautstärke der Fibrinogen-Lösung, so dass die Endkonzentration 1,5 µM in insgesamt 200 µL Reaktionsvolumen wird. Pipette die Lösung langsam und vermeiden Sie Luftblasen bilden. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 min schütteln auf einer rotierenden Plattform.
Hinweis: Das Volumen der Fibrinogen-Lösung variieren je nach Konzentration Lager, aber das Gesamtvolumen in jedem gut 170 µL während der Inkubation werden sollte. - Thrombin-Lösung durch Auflösen von kommerziell gereinigten Thrombin Pulver in DdH2O eine Stammlösung von 50 U/mL zu bereiten. Auf die 5 U/mL Arbeitslösung in 20 mM HEPES-Puffer (pH 7,4) direkt vor dem Gebrauch verdünnen.
- Fügen Sie nach 30 min Inkubation gleichzeitig 30 µL Thrombin-Lösung (5 U/mL hinzu) in die Fibrinogen-Lösungen in der 96-Well-Platte aus Schritt 2.3 mit Mehrkanal-Pipette. Zugabe von Thrombin wird sofort die Bildung von Blutgerinnseln einleiten. Aus diesem Grund fügen Sie Thrombin direkt in der Mitte der Fibrinogen-Lösung mit Sorgfalt, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden hinzu.
Hinweis: Die Aktivität von Thrombin kann zwischen experimentellen Bedingungen sowie Thrombin viel variieren. Die richtige Konzentration erforderlich, um robust Klumpen produzieren müssen empirisch ermittelt werden. - Lesen Sie die Absorption von in-vitro- Gerinnsel auf eine Platte Leser sofort nach dem Thrombin hinzufügen. Messung der Extinktion bei 350 nm im Laufe von 10 Minuten, alle 30-60 S. führen die gesamte Probe bei Raumtemperatur.
Hinweis: Einige Inhibitor-Verbindungen ändern können die Extinktion der Lösung bei 350 nm, in dem Fall die Trübung, bei 405 gemessen werden nm.
3. die Rasterelektronenmikroskopie
- Vorbereitung der Gerinnsel, Fixierung und waschen
- Hotel sauber silikonisiert Kreis Abdeckung Objektträger (12 mm) in einer 12-Well oder 24-Well-Platte mit Pinzette.
- Fibrinogen in Blutgerinnsel Bildung Puffer vorzubereiten. Siehe Protokoll Schritt 1.2 für Details.
- Um die Wirkung von Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitoren auf Fibrin Gerinnsel Struktur zu bewerten, befolgen Sie die Anweisungen für die Inkubation, wie für die Trübung Assay (Schritt2) beschrieben. Immer auch Kontroll-Vertiefungen die Fibrinogen in der Abwesenheit von Aβ und Inhibitoren enthalten.
- Pipette 80 µL der Fibrinogen-Mischung aus Schritt 3.1.3 auf den Cover-Folien. Sanft verteilt die Lösung, so dass es gleichmäßig auf der Abdeckung Folie verteilt wird.
- Verdünnen Sie Thrombin-Lager (50 U/mL) in 20 mM HEPES gepufferten Kochsalzlösung, eine Endkonzentration von 2,5 U/mL zu und fügen Sie 20 µL direkt ins Zentrum von Fibrinogen-Lösung hinzu, ohne sich zu vermischen.
Hinweis: Bei Bedarf kann eine höhere Thrombin arbeiten Konzentration (5 U/mL) verwendet werden. - 12-Well-Platte mit einem Kunststoffdeckel und lassen Sie es bei Raumtemperatur für 30-60 Minuten.
- Während Gerinnung Reaktion läuft, bereiten Sie Austrocknung und Fixierung Lösungen vor. Natrium Cacodylate Puffer (0,1 M, pH 7,4) vorzubereiten. Verdünnen Sie 10 % Glutaraldehyd Stammlösung in Natrium-Cacodylate-Puffer (0,1 M, pH 7,4), einen 2 % Lösung von Glutaraldehyd arbeiten zu machen. Halten Sie diese Lösungen auf Eis. Frisch verdünnten Glutaraldehyd (2 %) sollte verwendet werden, innerhalb von 1 Woche, bei sachgemäßer Lagerung im Kühlschrank bei 4 ° C.
- Verdünnen Sie absoluten Ethanol (100 %) in doppelt destilliertem Wasser (80 %, 50 % und 20 % Ethanol). Bewahren Sie diese Ethanol Lösungen und absolute Ethanol (100 %) auf dem Eis.
Achtung: Vorsicht beim Umgang mit Natrium Cacodylate und Glutaraldehyd, führen Sie diese Schritte in einer chemischen Kapuze. - Waschen Sie nach 30 min die Klumpen mit eiskalten Natrium Cacodylate Puffer (0,1 M) zweimal vorsichtig. Fügen Sie 2 mL des Puffers in jede Vertiefung, sodass das Gerinnsel vollständig eingetaucht sind. Decken Sie die well-Platte mit einem Deckel ab und lassen Sie ihn für 2 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach 2 min vorsichtig den Puffer mit einer 1-mL-Pipette oder schmalen Stiel Transferpipette. Einmal wiederholen.
- Befestigen Sie die Klumpen mit eiskalten Glutaraldehyd (2 %). Halten die well-Platte auf dem Eis, fügen Sie etwa 2-3 mL 2 % Glutaraldehyd in jede Vertiefung. Sicherstellen Sie, dass die Klumpen vollständig eingetaucht sind. Decken Sie ab und die Platte für 30 min auf Eis.
- Nach 30 min sanft entfernen Sie das Glutaraldehyd aus jedem Brunnen zu und waschen Sie die Klumpen mit Natrium Cacodylate Puffer (0,1 M), wie oben (2 min, zweimal) beschrieben. Halten Sie die well-Platte auf dem Eis.
- Serielle Austrocknung der Gerinnsel und kritischer Punkt-Trocknung
- Entwässern Sie die Klumpen in eine abgestufte Reihe von eiskaltem Ethanol Wäschen in Schritt 3.1.8 (20 %, 50 %, 80 %, 100 % und again100 %) für 5 min zubereitet. Fügen Sie für jede Serie Ethanol 2-3 mL, sicherstellen, dass die Klumpen untergetaucht sind. Decken Sie und inkubieren Sie auf Eis.
- Entfernen Sie nach jedem Schritt Ethanol die Ethanol-Lösung mit einer 1-mL-Pipette oder Einweg-Pipette Pipette. Entfernen Sie das Ethanol nicht vollständig. Sicherstellen Sie, dass die Gerinnsel Oberfläche nicht Luft ausgesetzt ist.
Hinweis: Dehydrierung in absoluten Ethanol (100 %) sollte zweimal durchgeführt werden. - Halten Sie die Probe in das endgültige 100 % Ethanol getaucht und auf einen kritischen Punkt Trockner (CPD) übertragen. Verwenden Sie ein CPD-Probenhalter oder ein Deckglas Halter mit einer Unterlegscheibe für die Folien in der CPD-Kammer zu übertragen. Legen Sie mindestens eine Unterlegscheibe zwischen den einzelnen Folien.
- Nehmen Sie die Abdeckung Folie aus der CPD-Kammer und an ein SEM-Stub mit Kohlenstoff Klebeband befestigen.
- Sputter-Beschichtung und Bildgebung
- Übertragen Sie alle Proben mit SEM Stub auf der Sputter-Beschichtungskammer.
- Sputter-Beschichtung weniger als 20 nm Gold/Palladium oder anderen leitfähigen Materialien wie Karbon, mit einem Vakuum Sputter Coater.
Hinweis: Wir haben verwendet 18 nm Gold/Palladium-Beschichtung. Die Sputter-Beschichtung erfolgte für 45 s und die Beschichtung Geschwindigkeit war 4 Å / S. Sputter beschichteten Proben sind stabil, wenn Sie richtig in trockener Umgebung bei Raumtemperatur einige Wochen lang zur Verfügung. SEM-Analyse kann jederzeit durchgeführt werden. - Abrufen von Bildern auf einem Rasterelektronenmikroskop, ausgestattet mit dem SE2-Detektor bei 4 kV.
Hinweis: Die Bildgröße Pixel in diesem Bild stellen Bereich von 13 nm-31 nm.
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Representative Results
In der in-vitro- Gerinnung (Trübung) Assay spaltet das Enzym Thrombin Fibrinogen, was zur Bildung von Fibrin Netzwerk24. Diese Bildung von Blutgerinnseln Fibrin verursacht Streuung des Lichtes durch die Lösung, was zu erhöhten Trübung (Abbildung 1), plateauing vor dem Ende der Lesung Periode (Abbildung 2, grün). Wenn die Fibrinogen in Anwesenheit von Aβ42 inkubiert wurde, die Trübung der Lösung verringert, mit der Kurve erreichen eine maximale Höhe von etwa der Hälfte der Fibrinogen allein (Abbildung 2A, blau). In einer kürzlich erschienenen Publikation wurden eine Reihe von Aβ-Aggregation-Blocker synthetisiert und für ihre Fähigkeit, hemmen die Aβ-Fibrinogen-Interaktion, Ermittlung der zusammengesetzten TDI-276014bewertet. Wir haben in unserer Studie TDI-2760 verwendet, Aβ-Fibrinogen Interaktion blockieren. Wie zuvor, im Beisein von TDI-2760, die Wirkung von berichtet wurde Aβ gelindert, da die Trübung über mit Aβ allein (Abbildung 2A, rot) lag. Die Wirkung des TDI-2760 scheint nicht durch Trübung Hintergrund als die Verbindung die Fibrin Gerinnsel Trübung unverändert blieb als Aβ abwesend (Abbildung 2A, lila) war. Der in-vitro- Gerinnung Trübung Assay hier beschrieben ist eine schnelle und einfache Methode, durch welche Fibrin-Gerinnsel Bildung und Faktoren, die diesen Prozess dämpfen können beobachtet werden können. GPRP, die bekanntlich mit Fibrin Polymerisation durch Fibrin Monomer Knopf-Loch Interaktionen18,25 stören stören kann als Positivkontrolle für die Trübung-Assay (Abb. 2 b) verwendet werden. Einklang mit der früheren Berichte25, mit der Anwesenheit von GPRP Peptid, wurde die Fibrin Gerinnsel Trübung deutlich reduziert im Vergleich zu der Bildung von Blutgerinnseln Fibrin mit seiner Abwesenheit (Abb. 2 b, grün blau Vs).
Nach dem gleichen Protokoll und Bedingungen wie oben beschriebenen Trübung-Assay wurden Fibrin Gerinnsel in an- und Abwesenheit von Aβ und/oder TDI-2760 vorbereitet. Die Klumpen waren dann für Elektronenmikroskopie von Fixierung, Austrocknung, kritischer Punkt-Trocknung und Gold-Sputter-Beschichtung (Abbildung 1) verarbeitet. Fibrinogen in Anwesenheit von nur Thrombin und CaCl2 bildete ein Fibrin-Netz, mit länglichen und eingefügten Fäden von Fibrin sowie größere Bündel (Abb. 3A). Als Aβ anwesend war, wurde die Fibrin-Fäden dünner, mit mehreren klebrigen Klumpen/Aggregate Aβ-induzierte strukturelle Anomalien (Abb. 3 b) angibt. In Übereinstimmung mit der Trübung Untersuchungsergebnisse, TDI-2760 teilweise restauriert die Struktur der das Fibrin-Gerinnsel von Aβ-induzierte Veränderungen, da weniger Klumpen wurden (Abb. 3 C). Zusammen mit der Trübung Assay zeigt SEM das Ausmaß und die Qualität der Aβ-induzierte Veränderungen zur Bildung von Blutgerinnseln Fibrin sowie die Wirksamkeit der eine hemmende Verbindung, TDI-2760.
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Fibrin Gerinnsel Analyse von Trübung Assay und SEM Schaltplan zeigt die Schritte beim Fibrin Gerinnsel Analyse und die Wirkung von Aβ Fibrin Gerinnsel Trübung und strukturelle Topographie. Der Maßstabsbalken SEM Bilder (unten links) sind 2 µm und die Vergrößerung ist 10, 000 X. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Messung der Wirkung Aβ42 auf in-vitro- Fibrin Klumpenbildung durch Trübung Assay. (A) Fibrinogen wurde in an- und Abwesenheit von Aβ42 inkubiert. Bildung von Blutgerinnseln wurde durch Thrombin, wodurch erhöhte Trübung der Lösung (grün) induziert. In Anwesenheit von Aβ42 wurde das Fibrin-Gerinnsel ungewöhnlich strukturiert, was zu verminderten Trübung (blau). Die zusammengesetzten TDI-2760 oder DMSO inkubiert mit der Fibrinogen-Lösung sowohl mit als auch ohne Aβ42. TDI-2760 wiederhergestellt Aβ42-induzierte Abnahme der Trübung (rot) ohne Veränderung der normalen Gerinnselbildung (lila). (B) die Trübung von einem bekannten Fibrinolyse-Inhibitor, GPRP wurde auch als Positivkontrolle für dieser Assay gemessen. Fibrinogen wurde in an- und Abwesenheit von 1,5 µM GPRP und die Trübung gemessen nach dem Hinzufügen von Thrombin inkubiert. Ähnlich wie bei Aβ42, wurde die Trübung der Bildung von Blutgerinnseln Fibrin deutlich reduziert im Beisein von GPRP (blau und grün). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Scanning Electron Mikrographen von Aβ-induzierte Anomalien zu Fibrin Gerinnsel Architektur. Scanning Electron Mikrographen Fibrin Gerinnsel Struktur von gereinigten Fibrinogen (A), Fibrinogen + Aβ42 erhalten (B), Fibrinogen + Aβ42 + TDI-2760 (C). Bildung von Blutgerinnseln wurde initiiert, indem Sie die Mischung Thrombin und CaCl2 hinzufügen. Die strukturelle Analyse ergab, dass Klumpen gebildet in Anwesenheit von Aβ42 dünner und ungewöhnlich aufgehäuften im Vergleich zu Fibrinogen von selbst sind. TDI-2760, die bekanntlich Aβ42 Fibrinogen Interaktion zu hemmen, korrigiert teilweise die Aβ42 induzierten strukturellen Anomalie der Fibrin-Gerinnsel. Maßstab ist 1 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die hier beschriebenen Methoden bieten eine reproduzierbare und schnelles Mittel zur Bewertung der Fibrin Gerinnsel Bildung in Vitro. Darüber hinaus macht die Einfachheit des Systems die Interpretation der Auswirkungen Aβ die Bildung von Blutgerinnseln Fibrin und Struktur relativ geradlinig. In dieser Übungseinheit früheren Publikation zeigte sich, dass diese Tests verwendet werden, können um Verbindungen für ihre Fähigkeit, hemmen die Aβ-Fibrinogen Interaktion13,14testen. Mit diesen beiden Assays, einer Reihe von synthetisierten Verbindungen für die Fähigkeit, hemmen die Aβ-Fibrinogen-Interaktion analysiert wurden. Eigentlich kann der Gerinnsel Trübung Assay, den Pool hit Verbindungen zu denen therapeutisches Potenzial haben zu verengen, da nicht alle Verbindungen, die die Interaktion von Aβ-Fibrinogen hemmen können auch, Bildung von Blutgerinnseln Fibrin wiederherstellen können verwendet werden.
Es gibt ein paar Aspekte der Trübung Assays, die erfordern, Fehlerbehebung oder beschränken die Verwendung dieser Technik. Die größte Beschränkung ist, daß es einige Unterschiede zwischen der Experimente, die die Interpretation der Ergebnisse erschweren können. Einige dieser Variante ist es, aufgrund der Thrombin-Aktivität werden. Um für Thrombin Tätigkeit zu beheben, können Benutzer mehrere Konzentrationen von Thrombin zur Bildung von Blutgerinnseln Tätigkeit vor Beginn der Experimente mit Aβ und Test-Verbindungen testen. Unter den experimentellen Bedingungen, die hier vorgestellten erhöht Aβ, in Ermangelung von Fibrinogen, nicht die Trübung der Lösung über Hintergrund-Niveaus, die darauf hinweist, die beobachtet, dass Fibrin Polymerisation Trübung Kurven zustehen. Jedoch Aβ ist eine Aggregation neigende Peptid und eine höhere Konzentration von Aβ-Lösung, wenn bei Raumtemperatur oder 37 ° C (mehrere Stunden) für eine sehr lange Zeit gehalten bilden fibrillären Aggregate erhöhte Trübung verursachen. Wenn dem Effekt eine Aβ-Lösung analysieren, die für längere Zeit bei Zimmertemperatur oder wärmer gelagert wurde, kann der Status der Aggregation der Lösung von Transmissions-Elektronenmikroskopie ermittelt werden. In dem hier beschriebenen Protokoll werden frisch zubereitete Aβ und Fibrinogen Lösungen verwendet, die sollten Aggregation Probleme zu beseitigen. Um die Qualität dieser Präparate sind sie jedoch durch Transmissions-Elektronenmikroskopie untersucht worden. Darüber hinaus sollten bei der Verwendung von einer neue Menge gewerbliche Aβ-Peptid das Ausmaß der Oligomerisierung und Menge der Oligomere von Transmissions-Elektronenmikroskopie bewertet werden. Da gäbe es viel zu viel Variation in Peptid Qualität und Verhältnis von vorgeformten Aggregate und Monomeren Aβ, was sicherlich die Oligomerisierung Rate auswirkt. Es ist ratsam, die Konzentration von Aβ-Lösung (BCA-Methode) vor der Inkubation für Oligomerisierung zu überprüfen. Um diese Schwankungen zu minimieren, haben wir versucht, mit mindestens 0,1 mg/mL Aβ-Lösung für Oligomer Bildung Reaktion.
Da dieser Test auch auf kleine Veränderungen der Umwelt wie Temperatur und Bewegung reagiert, sollte Trübung Lesungen aus verschiedenen Experimenten nicht zusammen analysiert werden. Dies bedeutet, dass die Anzahl der Bedingungen, die verglichen werden kann begrenzt ist durch die Anzahl der Bohrungen, dass Thrombin kann gleichzeitig hinzugefügt werden mit einer Mehrkanal-Pipette (i.e., 12). Benutzer sollte auch darauf achten, dass die Viskosität oder die Farbe in den Puffer und Testverbindungen zu einer hohen Hintergrund Trübung führen kann verdeckt das Signal das Fibrin-Gerinnsel und erschwert die Auslegung des Experiments. Wenn alle Steuerelemente in jedem Experiment enthalten sind, sollte es jedoch kann man leicht feststellen, ob Hintergrundsignal ist die Trübung Extinktion zu verändern.
Die Trübung Assay enthält Informationen, ob Bildung von Fibrin-Gerinnsel durch Aβ behindert wird und außerdem wenn Inhibitor Verbindungen dieser Effekt lindern können. Aber es nicht enthüllen, wie die Struktur der das Fibrin-Gerinnsel in Reaktion auf Aβ geändert wird und/oder Verbindungen getroffen. Diese Frage kann von SEM, angesprochen werden, denn dies ermöglicht eine direkte Visualisierung der Gerinnsel Architektur. SEM ist eine gut etablierte Methode und wird routinemäßig zur Visualisierung von Gerinnsel Struktur von gereinigten Fibrinogen oder Plasma verwendet. Der traditionelle Gerinnsel Vorbereitungsprozess für SEM-Analyse kann jedoch kompliziert und zeitaufwändig. Darüber hinaus können kleine Unterschiede in den Protokollen zwischen verschiedenen Forschungsgruppen anspruchsvolle Ergebnisse24replizieren machen. Zur Behebung dieser Probleme wurde diese optimierte Protokoll entwickelt, mit denen können die Wirkung von Aβ, dünner Fibrin Stränge zu induzieren und Klumpen von Proteinen (Abbildung 3) beobachtet werden. Wie mit der Trübung Test gesehen, lindert TDI-2760 die Wirkung von Aβ, wiederherstellen die typische Struktur der Fibrin-Bundles (Abbildung 3).
Es gibt ein paar Schritte in die SEM Probenvorbereitung, die auch zur Fehlerbehebung benötigen. Bei sehr geringen Konzentrationen von Fibrinogen (0,5 µM oder weniger), die Klumpen möglicherweise nicht auf den Objektträger fest zugeordnet und kann beschädigt/gewaschen entfernt während der Fixierung/Waschschritte. Wenn niedrige Konzentrationen von Fibrinogen, kann das Blutgerinnsel Bildung Mal zwischen den Zusatz von Thrombin und Fixierung, bis zu mehreren Stunden erhöht werden da dies die Gerinnsel Stabilität verstärken kann. Auch sollten Benutzer mit hochfesten Phosphatpuffer oder Phosphat gepufferte Kochsalzlösung für die Trübung und SEM-Assays, als Kalzium-vermittelten Gerinnsel Entstehungsprozess Phosphat-Ionen stören können. Wenn mit einem anderen hohen Salz mit Puffer für die Bildung von Blutgerinnseln und SEM-Analyse nach der Fixierung, sollte Waschschritten auch mit kalten DdH2O. durchgeführt werden
SEM-Analyse von nicht-leitende Proben wie Fibrin Gerinnsel erfordert Beschichtung mit geladenen Teilchen wie Gold, Palladium, Silber oder Kohlenstoff. Schichtdicke ist ein wichtiger Faktor in der SEM-Bildgebung, wie es möglich ist, dass eine sehr dicke Metallbeschichtung der Oberflächentopographie Ultra-Struktur von Fibrin-Gerinnsel überdecken kann. In diesem Protokoll dünne Gold/Palladium-Beschichtung (weniger als 20 nm) sind für Sputter-Beschichtung verwendet. Um weniger als 20 nm Dicke zu erreichen, das Sputtern erfolgte für 45 s mit einer Beschichtung von 4 Å / s. Diese dünne Schicht (18 nm) wird nicht angezeigt, um die Oberflächeneigenschaften der Fibrin-Versammlung zu maskieren. Jedoch wenn besorgt über die Ultra-Struktur des Gerinnsels Maskierung, Carbon Beschichtung als Alternative zu Gold/Palladium, einsetzbar als es weniger "Inseln" der Beschichtung Moleküle auf das Material verlassen wird.
Während der Fokus liegt hierbei auf der Aβ-Fibrinogen-Interaktion wurde, kann dieses Protokoll leicht geändert werden, um die Interaktion von anderen Proteinen oder Verbindungen mit Fibrin-Gerinnsel zu analysieren. Nach diesen Anweisungen sollte Ermittler in der Lage zu reproduzieren in Vitro Fibrin Klumpenbildung und Analysen mit diesen optimierten Gerinnsel-Trübung Assay und SEM Protokolle durchführen. Wie hier gezeigt, mit dem zuvor veröffentlichten Inhibitor zusammengesetzte TDI-2760, diese Verfahren liefern wertvolle Informationen über die Bildung von Blutgerinnseln Fibrin, die weitere angewendet werden können, Studien in Vitro und in Vivo.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Autoren danken Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso und Michael Foley von Tri-Institutionelle Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York für die Synthese von Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitoren und ihre wertvollen Anregungen. Autoren auch danken Mitgliedern des Strickland Labor für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde von NIH Grant NS104386, der Alzheimers Drug Discovery Foundation und Robertson therapeutische Entwicklungsfonds für H.A., unterstützt NIH grant NS50537, Tri-Institutionelle Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation und John A. Herrmann für S.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
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