Summary
المقدمة هنا هي اثنين من الأساليب التي يمكن استخدامها منفردة أو مجتمعة لتحليل أثر بيتا-اميلويد على هيكل فيبرينوجين جلطة. وشملت بروتوكول لإنشاء في المختبر فيبرينوجين جلطة، تليها التعكر تجلط والمجهر الإلكتروني المسح أساليب.
Abstract
تعرض هذه المقالة طرق لتوليد في المختبر فيبرينوجين جلطات وتحليل تأثير بروتين اميلويد بيتا (Aβ) على تشكيل جلطة وهيكل بقياس الطيف الكتلي والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM). لقد ثبت Aβ، التي تشكل مجاميع اميلويد الأعصاب في مرض الزهايمر (AD)، للتفاعل مع الفيبرينوجين. يجعل هذا التفاعل Aβ-الفيبرينوجين تجلط فيبرينوجين هيكلياً غير طبيعي ومقاومة ل fibrinolysis. التشوهات الناجمة عن Aβ في تخثر فيبرينوجين قد تسهم أيضا في جوانب المخية الباثولوجي الإعلانية مثل ميكروينفاركتس، التهاب، فضلا عن أنجيوباثي اميلويد الدماغي (هيئة الطيران المدني). نظراً للدور الحاسم يحتمل أن العجز في نيوروفاسكولار في الباثولوجيا الإعلانية، تطوير المركبات التي يمكن أن تمنع أو تقلل من التفاعل Aβ-الفيبرينوجين له قيمة علاجية واعدة. في المختبر الأساليب التي فيها فيبرينوجين تشكيل جلطة يمكن بسهولة ومنهجية تقييم أدوات يمكن أن تكون مفيدة لتطوير المركبات العلاجية. قدم هنا بروتوكول أمثل لجيل في المختبر من جلطة فيبرينوجين، فضلا عن تحليل لتأثير مثبطات التفاعل Aβ و Aβ-الفيبرينوجين. مقايسة التعكر تجلط السريع، واستنساخه بدرجة عالية، ويمكن استخدامها لاختبار شروط متعددة في وقت واحد، مما يسمح لفحص عدد كبير من مثبطات Aβ-الفيبرينوجين. ويمكن تقييم ضرب المركبات من هذا الفحص كذلك لقدرتها على التخفيف من التشوهات الهيكلية المستحثة Aβ فيبرينوجين جلطة البنية باستخدام sem. وأظهرت فعالية هذه البروتوكولات الأمثل هو هنا استخدام TDI-2760، مثبط تفاعل Aβ-الفيبرينوجين التي تم تحديدها مؤخرا.
Introduction
مرض الزهايمر (AD)، مرض الأعصاب مما يؤدي إلى التدهور المعرفي في المرضى المسنين، يغلب عليها الطابع ينبع من التعبير (Aβ) بيتا-اميلويد الشاذ والتجميع والتخليص البصر أدى إلى تسمم1، 2-على الرغم من الرابطة تميز جيدا بين المجاميع Aβ والإعلان3، الآليات الدقيقة الكامنة وراء باثولوجيا المرض ليست مفهومة جيدا4. تزايد الأدلة تقترح أن العجز neurovascular تلعب دوراً في تطور وشدة5من الإعلان، كما Aβ تتفاعل مباشرة مع مكونات نظام الدورة الدموية6. وقد Aβ إلى تفاعل عالية تقارب مع الفيبرينوجين7،8، الذي يموضع أيضا رواسب Aβ المرضى الإعلانية والماوس نماذج9،،من1011. وعلاوة على ذلك، يدفع التفاعل Aβ-الفيبرينوجين تشكيل جلطة فيبرينوجين الشاذ والهيكل، فضلا عن مقاومة فيبرينوليسيس9،12. أحد الاحتمالات العلاجية في علاج الإعلانية، هو التخفيف من حدة العجز في الدورة الدموية عن طريق تثبيط التفاعل بين13،Aβ والفيبرينوجين14. ولذلك، حددنا عدة مركبات الصغيرة التي تعوق التفاعل Aβ-الفيبرينوجين باستخدام فحص إنتاجية عالية والكيمياء الطبية النهج13،14. لاختبار فعالية مثبطات التفاعل Aβ-الفيبرينوجين، نحن الأمثل طريقتين للتحليل في المختبر فيبرينوجين جلطة تشكيل: تجلط التعكر المقايسة، وفحص المجهر الإلكتروني (SEM)14.
تجلط التعكر المقايسة أسلوب مستقيم إلى الأمام والسريع لرصد فيبرينوجين جلطة تكوين باستخدام مطيافية الأشعة فوق البنفسجية-المرئية. متزايدة مبعثرة تجلط فيبرينوجين أشكال، الخفيفة ويزيد من التعكر للحل. على العكس من ذلك، عندما Aβ غير موجود، يتم تغيير هيكل تجلط فيبرينوجين، وتقليل التعكر المخلوط (الشكل 1). ويمكن تقييم تأثير المركبات المثبطة لإمكانية استعادة التعكر جلطة من التشوهات الناجمة عن Aβ. حين المقايسة التعكر يسمح للتحليل السريع لظروف متعددة، فإنه يوفر معلومات محدودة عن تجلط الشكل والهيكل. ووزارة شؤون المرأة، التي كشفت طبوغرافية الأجسام الصلبة بمسبار الإلكترون، يسمح بتحليل بنية ثلاثية الأبعاد بجلطة15،16،،من1718 وتقييم كيفية وجود Aβ و المركبات المثبطة أو يغير هذا الهيكل9،14. كل قياس الطيف الكتلي ووزارة شؤون المرأة هي التقنيات المختبرية الكلاسيكية التي استخدمت لأغراض مختلفة، على سبيل المثال، كانت تستخدم لرصد تراكم اميلويد19،20. وبالمثل، يستخدم أيضا وزارة شؤون المرأة لتحليل فيبرينوجين جلطة تكونت من البلازما من مرض الزهايمر، باركنسون والسكتة الدماغية انصماميه المرضى21،،من2223. البروتوكولات المقدمة هنا هي الأمثل لتقييم تكوين فيبرينوجين جلطة بطريقة سريعة واستنساخه.
ويوفر البروتوكول التالي التعليمات الخاصة بإعداد في المختبر فيبرينوجين-كلوت على حد سواء مع ودون Aβ. أنها أيضا تفاصيل أساليب لتحليل تأثير Aβ على تشكيل جلطة فيبرينوجين والهيكل. هو أظهرت فعالية هاتين الطريقتين لقياس تثبيط التفاعل Aβ-الفيبرينوجين باستخدام مؤشر التجارة والتنمية-2760، مجمع مثبطة صغيرة14. هذه الأساليب، كل على حدة ومعا، تسمح بتحليل في المختبر فيبرينوجين جلطة تشكيل سريع ومباشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد Aβ42 والفيبرينوجين للتحليل
- إعداد Aβ42 أحادي من مسحوق المجففة بالتبريد
- الحارة مسحوق Aβ42 إلى درجة حرارة الغرفة وتدور إلى أسفل في 1,500 س ز لمدة 30 ثانية.
- إضافة 100 ميليلتر من المثلج هيكسافلورويسوبروبانول (هفيب) لكل 0.5 ملغ مسحوق Aβ42 واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
تحذير: استخدام الرعاية عند التعامل مع هفيب وتنفيذ كافة الخطوات في غطاء كيميائية. - إعداد 20 ميليلتر مختبرين واسمحوا يمكن تخزين أفلام الهواء الجاف في غطاء كيميائية للأفلام حاء 2-3 عند-20 درجة مئوية.
- إعادة تشكيل الفيلم Aβ42 أحادي في 10 ميليلتر من جديد ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) بإثارة الشغب في سونيكاتور حمام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة ميليلتر 190 من 50 مم تريس (هيدروكسيميثيل) أمينوميثاني (تريس) المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4) و "الماصة؛" صعودا وهبوطاً بلطف.
- إزالة المجاميع البروتين بالطرد المركزي في 20,817 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- احتضان المادة طافية في 4 درجات مئوية لليوم التالي وبين عشية وضحاها الطرد المركزي الحل في س 20,817 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتجاهل أي مزيد من المجاميع البروتين.
- قياس تركيز Aβ42 بمقايسة حمض (اتفاق التعاون الأساسي) بيسينتشونينيك. مسلسل تمييع تنقية البقري ألبومين المصل (BSA) من 1 ملغ/مل إلى 0.0625 mg/mL إنتاج معيار بروتين، وإضافة 10 ميليلتر لكل معيار على الآبار للوحة متعددة جيدا في ثلاث نسخ. تمييع عينات Aβ 1:4 وإضافة 10 ميليلتر للآبار في ثلاث نسخ. مزيج حلول اتفاق التعاون الأساسي A و B وإضافة 200 ميليلتر لكل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية والقراءة على قارئ لوحة في 562 شمال البحر الأبيض المتوسط. يبقى الحل Aβ المتبقية على الجليد واستخدم هذا الإعداد للمقايسة التعكر ووزارة شؤون المرأة.
- إعداد حل الفيبرينوجين
- قياس 20 ملغ مسحوق الفيبرينوجين المجففة بالتبريد في أنبوب 15 مل وإعادة تعليق العمل بحرارة قبل 2 مل 20 مم هيدروكسييثيلبيبيرازيني الإيثان حمض السلفونيك (حبيس) المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4).
- احتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تصفية الحل من خلال عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إخراج الحل من 4 درجة مئوية وتصفية مرة أخرى من خلال 0.1 ميكرومتر محقن تصفية لإزالة الركام الفيبرينوجين أو فيبرينوجين الموجودة مسبقاً.
- قياس تركيز الفيبرينوجين بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي. اتبع الإرشادات من الخطوة 1.1.8. يبقى الحل الفيبرينوجين المتبقية في 4 درجات مئوية، واستخدم هذا الإعداد للمقايسة التعكر ووزارة شؤون المرأة.
2. تجلط التعكر الإنزيم
- لكل بئر تجريبية من لوحة 96، حسنا، إضافة 20 ميليلتر من 30 ميكرومتر Aβ42 الحل من الخطوة 1.1.8 حيث يكون تركيزه النهائي ميكرومتر 3.0 في 200 ميليلتر من المخزن المؤقت. إضافة نفس الحجم من [دمس] 5% في المخزن المؤقت تريس 50 مم (درجة الحموضة 7.4) المخزن المؤقت الآبار التحكم في لوحة 96-جيدا.
ملاحظة: حجم Aβ42 الدقيق في هذه الخطوة غير هامة. التحضيرات تركيز منخفض، يمكن استخدام حجم أكبر، ويمكن تعديل حجم المخزن المؤقت تشكيل جلطة. ينبغي أن تبقى وحدة التخزين النهائي 200 ميليلتر. - إذا كان اختبار المركبات المثبطة، تمييع المجمع لتركيز العمل ك [دمس]. إضافة مجمع أو [دمس] وحدها لعنصر تحكم إلى الآبار مع Aβ42 ومزيج جيد.
ملاحظة: ينبغي أن تشكل الحل Aβ42 الحبرية منفصل في أسفل البئر، المجمع أو [دمس] ينبغي أن يكون بيبيتيد مباشرة إلى مركز الحبرية. - تمييع الحل الفيبرينوجين الأسهم من الخطوة 1.2.4 في المخزن المؤقت لتشكيل جلطة (20 مم حبيس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4)، 5 مم كاكل2و 137 مم كلوريد الصوديوم) وإضافته إلى آبار Aβ42 المحتوية على والتحكم من لوحة 96-جيدا. ضبط حجم الصوت لحل الفيبرينوجين حيث يصبح تركيزه النهائي 1.5 ميكرومتر في الحجم الإجمالي 200 رد فعل ميليلتر. "الماصة؛" الحل ببطء وتجنب تشكيل الفقاعات. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تهتز على منصة الدورية.
ملاحظة: قد يختلف حجم الحل الفيبرينوجين اعتماداً على تركيز المخزون، ولكن كذلك ينبغي أن يكون الحجم الإجمالي في كل ميليلتر 170 أثناء الحضانة. - تحضير حل ثرومبين بتذويب مسحوق ثرومبين المنقي تجارياً في ddH2س جعل حل أسهم من 50 يو/مليلتر. تمييع للحل العامل U/mL 5 في المخزن المؤقت حبيس 20 مم (درجة الحموضة 7.4) مباشرة قبل الاستخدام.
- بعد 30 دقيقة من الحضانة، في نفس الوقت إضافة 30 ميليلتر ثرومبين الحل (5 U/mL) إلى حلول الفيبرينوجين في لوحة 96-جيدا من 2.3 خطوة باستخدام ماصة متعددة القنوات. إضافة ثرومبين ستشرع فورا تشكيل جلطة. ولذلك، إضافة ثرومبين مباشرة إلى مركز الحل الفيبرينوجين بعناية لتجنب تشكيل الفقاعات.
ملاحظة: يمكن أن تختلف نشاط ثرومبين بين الظروف التجريبية، فضلا عن الكثير من ثرومبين. تركيز الصحيحة اللازمة لإنتاج قوة جلطات قد يتحدد تجريبيا. - قراءة امتصاص جلطة في المختبر على قارئ لوحة فور إضافة ثرومبين. قياس امتصاص 350 نانومتر على مدى 10 دقيقة، كل 30-60 س. إجراء فحص كامل في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: قد يغير بعض مركبات مثبطات امتصاص الحل في 350 نانومتر، التي يمكن قياس الحالة التعكر في 405 نانومتر.
3-المسح الضوئي المجهر الإلكتروني
- إعداد تجلط، والتثبيت، والغسيل
- مكان نظيف siliconized الزجاج دائرة تغطية الشرائح (12 ملم) في لوحة جيدا 12 أو 24-جيدا باستخدام الملقط.
- إعداد الفيبرينوجين في المخزن المؤقت لتشكيل جلطة. انظر البروتوكول الخطوة 1، 2 للحصول على التفاصيل.
- لتقييم تأثير مثبطات التفاعل Aβ-الفيبرينوجين على هيكل فيبرينوجين جلطة، اتبع الإرشادات للحضانة كما هو موضح للمقايسة التعكر (الخطوة 2). وتشمل دائماً الآبار عنصر التحكم الذي يحتوي على الفيبرينوجين في غياب Aβ ومثبطات.
- "الماصة؛" ميليلتر 80 من خليط الفيبرينوجين من الخطوة 3.1.3 على الشرائح الغطاء. بلطف نشر الحل حيث أن يكون موزعاً على الشريحة الغطاء.
- تمييع ثرومبين الأسهم (50 U/mL) إلى 20 مم حبيس مخزنة المحلول الملحي بتركيز 2.5 U/mL نهائي وإضافة 20 ميليلتر مباشرة إلى مركز لحل الفيبرينوجين بدون خلط.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن استخدام عامل ثرومبين أعلى تركيز (5 U/mL). - تغطية لوحة 12-جيدا مع غطاء بلاستيكي وتترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة.
- أثناء تشغيل تخثر رد فعل، إعداد حلول الجفاف والتثبيت. إعداد المخزن المؤقت كاكوديلاتي الصوديوم (0.1 م، درجة الحموضة 7.4). تمييع 10 ٪ glutaraldehyde حل الأسهم في المخزن المؤقت كاكوديلاتي الصوديوم (0.1 م، درجة الحموضة 7.4) جعل 2% يعمل حل جلوتارالديهيدي. الاحتفاظ بجميع هذه الحلول على الجليد. ينبغي أن تستخدم glutaraldehyde الطازج المخفف (2 في المائة) خلال أسبوع واحد، عندما المخزنة بشكل صحيح في ثلاجة عند 4 درجة مئوية.
- تمييع الإيثانول المطلق (100%) في الماء المقطر مزدوجة (الإيثانول 80%، 50% و 20%). تبقى هذه الحلول الإيثانول والايثانول المطلق (100%) على الجليد.
تحذير: استخدام العناية عند التعامل مع كاكوديلاتي الصوديوم و glutaraldehyde، تنفيذ هذه الخطوات في غطاء كيميائية. - وبعد 30 دقيقة، بلطف تغسل الجلطات مع الصوديوم المثلج كاكوديلاتي المخزن المؤقت (0.1 M) مرتين. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت لكل بئر أن هو تماما مغمورة الجلطة. تغطية لوحة جيدا مع غطاء واتركه لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 2 دقيقة، بلطف بإزالة المخزن المؤقت باستخدام ماصة 1 مل أو ماصة نقل الجذعية الضيقة. كرر مرة واحدة.
- إصلاح الجلطات مع glutaraldehyde المثلج (2 في المائة). حفظ لوحة جيدا على الجليد، إضافة حوالي 2-3 مل من 2 ٪ glutaraldehyde لكل بئر. تأكد من الجلطات مغمورة تماما. تغطية وترك اللوحة على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- بعد 30 دقيقة، إزالة جلوتارالديهيدي من كل بئر بلطف ويغسل الجلطات استخدام المخزن المؤقت كاكوديلاتي الصوديوم (0.1 M) كما هو موضح أعلاه (2 دقيقة، مرتين). تبقى لوحة جيدا على الجليد.
- الجفاف المسلسل من جلطة وتجفيف نقطة حرجة
- يذوي الجلطات في سلسلة متدرجة من الإيثانول المثلج يغسل إعدادها في الخطوة 3.1.8 (20% و 50%، 80%، 100% و again100%) لمدة 5 دقائق. لكل سلسلة الإيثانول، إضافة 2-3 مل، مع التأكد من الجلطات مغمورة. تغطية واحتضان على الجليد.
- بعد كل خطوة الإيثانول، إزالة الحل الإيثانول باستخدام ماصة 1 مل أو ماصة المتاح بالقطارة. لا تقم بإزالة الإيثانول تماما. تأكد من أن السطح جلطة لا يتعرض للهواء.
ملاحظة: ينبغي إجراء الجفاف في الإيثانول المطلق (100%) مرتين. - مع الاحتفاظ بعينه الغارقة في الإيثانول 100% النهائي، نقل إلى نقطة حرجة مجفف (وثيقة البرنامج القطري). استخدم حامل نموذج وثيقة البرنامج القطري أو صاحب كشف الغطاء مع غسالة لنقل الشرائح إلى قاعة وثيقة البرنامج القطري. ضع الغسالة واحداً على الأقل بين كل شريحة.
- إخراج الشريحة غلاف من قاعة وثيقة البرنامج القطري وجبل على كعب SEM استخدام الشريط الكربون.
- تفل طلاء والتصوير
- نقل جميع العينات مع كعب روتين وزارة شؤون المرأة إلى قاعة طلاء الرش.
- معطف الرش أقل من 20 نيوتن متر من الذهب/البلاديوم أو غيرها من المواد موصلة، مثل الكربون، استخدام المغطى الرش فراغ.
ملاحظة: لقد استخدمنا 18 نيوتن متر طلاء الذهب/البلاديوم. أنجز طلاء الرش ل 45 s وسرعة الطلاء كان 4 س. الرش المغلفة العينات هي مستقرة عند الاحتفاظ بشكل صحيح في بيئة جاف في درجة حرارة الغرفة لبضعة أسابيع. ويمكن إجراء تحليل وزارة شؤون المرأة في أي وقت. - الحصول على الصور في المسح الإلكتروني المجهري مجهزة بكاشف SE2 في 4 كيلو فولت.
ملاحظة: تعيين حجم بكسل الصورة في هذه الصورة مجموعة من 13 نانومتر nm-31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في في المختبر تخثر الإنزيم (التعكر)، كليفس ثرومبين الإنزيم الفيبرينوجين، أسفر عن تشكيل شبكة فيبرينوجين24. يسبب هذا تشكيل جلطة فيبرينوجين تشتت الضوء يمر من خلال الحل، نتج عنه زيادة تعكر (الشكل 1)، مخفري قبل نهاية فترة القراءة (الشكل 2، الأخضر). عندما كان المحتضنة الفيبرينوجين حضور Aβ42, انخفضت التعكر للحل، مع منحنى التوصل إلى أقصى ارتفاع لما يقرب من نصف من الفيبرينوجين وحدها (الشكل 2A، الأزرق). في منشور صدر مؤخرا، سلسلة Aβ التجميع محصرات توليف وتقييم قدرتهم على تحول دون تفاعل Aβ-الفيبرينوجين، تحديد مؤشر التجارة والتنمية-2760 مجمع14. أننا استخدمنا TDI-2760 في دراستنا لمنع التفاعل Aβ-الفيبرينوجين. كما ذكرت سابقا، حضور TDI-2760، الأثر حدث تحسن Aβ، كما التعكر كان أعلى من Aβ وحدها (الشكل 2A، الأحمر). لا يظهر تأثير TDI 2760 بسبب تعكر الخلفية كالمجمع لم تتغير التعكر تجلط فيبرينوجين عندما Aβ كان غائبا (الشكل 2A، الأرجواني). في المختبر تخثر الإنزيم التعكر الموصوفة هنا هو طريقة سريعة وبسيطة بجلطة-فيبرينوجين التي يمكن ملاحظتها تشكيل والعوامل التي قد تخفف من هذه العملية. يمكن استخدام جبرب، الذي يعرف بأن يتدخل في البلمرة فيبرينوجين عن طريق التداخل مع فيبرينوجين مونومر مقبض حفرة التفاعلات18،25 كعنصر إيجابي للمقايسة التعكر (الشكل 2). يتفق مع وقت سابق تقارير25، مع وجود الببتيد جبرب، التعكر تجلط فيبرينوجين انخفضت انخفاضا كبيرا بالمقارنة مع تشكيل فيبرينوجين جلطة مع غيابها (الشكل 2B، مقابل الأزرق الأخضر).
عقب نفس البروتوكول والشروط المقايسة التعكر الموصوفة أعلاه، أعدت فيبرينوجين جلطات في وجود وغياب Aβ و/أو مؤشر التجارة والتنمية-2760. ثم جهزت الجلطات الميكروسكوب الإلكتروني قبل التثبيت، الجفاف، وتجفيف نقطة حرجة، وطلاء الذهب-الرش (الشكل 1). الفيبرينوجين حضور ثرومبين وكاكل2 فقط شكلت شبكة فيبرينوجين، مع المواضيع ممدود والمقحم فيبرينوجين، فضلا عن حزم أكبر (الشكل 3A). عندما حضر Aβ، أصبحت المواضيع فيبرينوجين أرق، مع عدة لزجة كتل/المجاميع التي تشير إلى التشوهات الهيكلية الناجمة عن Aβ (الشكل 3B). متسقة مع نتائج الفحص التعكر، TDI-2760 جزئيا استعادة هيكل تجلط فيبرينوجين من التغييرات المستحثة Aβ، كما كانت أقل من كتل (الشكل 3 جيم). جنبا إلى جنب مع المقايسة التعكر، وزارة شؤون المرأة يكشف مدى ونوعية التغييرات المستحثة Aβ لتشكيل جلطة فيبرينوجين، فضلا عن فعالية مجمع المثبطة، TDI-2760.
الشكل 1 : التمثيل التخطيطي فيبرينوجين جلطة التحليل التعكر المقايسة و sem. التخطيطي يبين الخطوات التي تنطوي عليها في تحليل تجلط فيبرينوجين وتأثير Aβ فيبرينوجين جلطة التعكر والطوبوغرافيا الهيكلية. أشرطة حجم الصور ووزارة شؤون المرأة (أسفل اليسار) 2 ميكرومتر والتكبير هو 10، 000 X. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : قياس تأثير Aβ42 على في المختبر فيبرينوجين جلطة تشكيل بمقايسة التعكر. (أ) كان المحتضنة الفيبرينوجين في وجود وغياب Aβ42. حملت تشكيل جلطة ثرومبين، نتج عنه زيادة تعكر الحل (أخضر). حضور Aβ42، قسمت طبيعي تجلط فيبرينوجين، أدى إلى انخفاض تعكر (أزرق). كانت المحتضنة TDI-2760 مجمع أو [دمس] مع الحل الفيبرينوجين، على حد سواء مع ودون Aβ42. مؤشر التجارة والتنمية-2760 استعادة المستحثة Aβ42 نقصان التعكر (أحمر) دون تغيير تشكيل جلطة عادي (الأرجواني). (ب) كما تم قياس التعكر مثبط المعروفة فيبرينوليسيس، جبرب كعنصر إيجابي لهذا التحليل. وكان المحتضنة الفيبرينوجين في وجود وغياب 1.5 ميكرومتر جبرب والتعكر تقاس بعد إضافة ثرومبين. تعكر فيبرينوجين جلطة تشكيل مماثلة إلى Aβ42, كان انخفاضا كبيرا حضور جبرب (الأزرق مقابل الأخضر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : فحص ميكروجرافس إلكترون من التشوهات الناجمة عن Aβ فيبرينوجين جلطة البنية. مسح ميكروجرافس إلكترون فيبرينوجين جلطة هيكل تم الحصول عليها من المنقي الفيبرينوجين (A)، الفيبرينوجين + Aβ42 (ب)، الفيبرينوجين + Aβ42 + TDI-2760 (ج). وبدأ تشكيل جلطة بإضافة ثرومبين وكاكل2 إلى الخليط. التحليل البنيوي كشفت أن الجلطات التي شكلت حضور Aβ42 أرق وتحبب خفيف عادي بالمقارنة مع الفيبرينوجين بحد ذاته. مؤشر التجارة والتنمية-2760، الذي يعرف بتحول دون تفاعل Aβ42-الفيبرينوجين، جزئيا تصحيح التشوهات الهيكلية Aβ42 المستحث تجلط فيبرينوجين. هو شريط مقياس 1 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأساليب الموصوفة هنا توفر وسيلة سريعة واستنساخه لتقييم فيبرينوجين جلطة تشكيل في المختبر. وعلاوة على ذلك، بساطة النظام يجعل تفسير كيف يؤثر Aβ فيبرينوجين جلطة تكوين وهيكل نسبيا على التوالي إلى الأمام. في منشور سابق هذا المعمل، وقد تبين أنه يمكن استخدام هذه الاختبارات لاختبار المركبات لقدرتها على تحول دون ال Aβ-الفيبرينوجين تفاعل13،14. باستخدام هذه الاختبارات اثنين، تم تحليل سلسلة من المركبات المركبة للقدرة على تحول دون تفاعل Aβ-الفيبرينوجين. في الواقع، يمكن استخدامها المقايسة التعكر تجلط لتضييق مجموعة مركبات تصل إلى تلك التي تملك إمكانات علاجية، كما يمكن أيضا استعادة ليست كل المركبات التي يمكن أن تحول دون تفاعل Aβ-الفيبرينوجين فيبرينوجين جلطة تشكيل.
وهناك بضعة جوانب من مقايسة التعكر الذي قد يتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها أو تحد من استخدام هذا الأسلوب. القيد الرئيسي هو أنه يمكن أن تكون هناك بعض الاختلافات بين هذه التجارب التي قد تؤدي إلى تعقيد تفسير النتائج. بعض من هذا الاختلاف أن يكون سبب نشاط ثرومبين. لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للنشاط ثرومبين، المستخدمين يمكن اختبار تركيزات متعددة من ثرومبين لنشاط تكوين جلطة قبل بداية التجريب مع مركبات Aβ والاختبار. في ظل الظروف التجريبية المعروضة هنا، Aβ، في غياب الفيبرينوجين، لا زيادة تعكر الحل أعلاه مستويات الخلفية مما يشير إلى أن لاحظ المنحنيات التعكر سبب البلمرة فيبرينوجين. ومع ذلك، Aβ ببتيد معرضة لتجميع وأعلى تركيز لحل Aβ عند الاحتفاظ بها لفترة طويلة جداً في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية (عدة ساعات) يمكن أن تشكل مجاميع فيبريلار مما قد يتسبب في زيادة تعكر. إذا كان تحليل التأثير حلاً Aβ الذي تم تخزينه لفترات طويلة من الزمن في درجة حرارة الغرفة أو أكثر دفئا، يمكن تحديد حالة تجميع الحل مجهر إلكتروني. في البروتوكول هو موضح هنا، يتم استخدام الحلول Aβ والفيبرينوجين الطازجة، التي ينبغي القضاء على تراكم القضايا. ومع ذلك، لضمان جودة هذه الأعمال التحضيرية أنها احتسبت مجهر إلكتروني. بالإضافة إلى ذلك، عند استخدام جديدة الكثير من التجارية Aβ الببتيد، وينبغي تقييم مدى أوليجوميريزيشن وكمية ليغومرات مجهر إلكتروني. لأنه قد يكون هناك تباين الكثير بالكثير في نوعية الببتيد ونسبة المجاميع بريفورميد و Aβ أحادي، يؤثر بالتأكيد بمعدل أوليجوميريزيشن. فمن المستحسن للتحقق من تركيز Aβ الحل (طريقة اتفاق التعاون الأساسي) قبل تفرخ أوليجوميريزيشن. لتقليل هذه الاختلافات، حاولنا استخدام مالا يقل عن 0.1 مغ/مل من محلول Aβ oligomer تشكيل رد فعل.
لأن هذا التحليل أيضا حساسة للتغيرات البيئية الصغيرة مثل درجة الحرارة والحركة، أن لم يتم تحليلها التعكر قراءات من تجارب مختلفة معا. وهذا يعني أن يقتصر عدد الشروط التي يمكن مقارنة عدد من الآبار التي ثرومبين يمكن في نفس الوقت إضافة إلى مع ماصة متعددة القنوات (أي.، 12). ينبغي أن يكون المستخدمين أيضا تدرك أن اللزوجة أو اللون في المخازن المؤقتة واختبار المركبات يمكن أن يؤدي إلى تعكر خلفية عالية، تحجب الإشارة من جلطة فيبرينوجين وصعوبة تفسير للتجربة. ومع ذلك، إذا لم يتم تضمين كافة عناصر التحكم في كل تجربة، سيكون من الممكن سهولة تحديد إذا كانت الإشارات الخلفية هو تغيير امتصاص التعكر.
والرزن التعكر يوفر معلومات حول ما إذا كان تشكيل جلطة فيبرينوجين يعوقها Aβ وعلاوة على ذلك إذا كانت مركبات مثبطات يمكن التخفيف من هذا الأثر. بيد أنها لم تكشف عن كيف يتم تغيير هيكل تجلط فيبرينوجين ردا على Aβ و/أو ضرب المركبات. يمكن معالجة هذه المسألة بوزارة شؤون المرأة، كما يسمح هذا التصور مباشرة من بنية جلطة. ووزارة شؤون المرأة هو تقنية راسخة وتستخدم بشكل روتيني لتصور هيكل جلطة من الفيبرينوجين المنقي أو من البلازما. ومع ذلك، يمكن أن تكون عملية إعداد تجلط التقليدية لتحليل وزارة شؤون المرأة معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً. وعلاوة على ذلك، الاختلافات الصغيرة في البروتوكولات بين المجموعات البحثية المختلفة يمكن أن تجعل من التحدي لتكرار النتائج24. لمعالجة هذه القضايا تم وضع هذا البروتوكول الأمثل الذي أثر Aβ لحمل أرق الليفين، وكتل من البروتين يمكن ملاحظتها (الشكل 3). كما رأينا مع المقايسة التعكر، TDI-2760 يخفف من تأثير Aβ، استعادة هيكل نموذجي لحزم الفيبرين (الشكل 3).
وهناك بضع خطوات في إعداد نموذج وزارة شؤون المرأة، التي قد تتطلب أيضا استكشاف الأخطاء وإصلاحها. عند استخدام تركيزات منخفضة جداً من الفيبرينوجين (0.5 ميكرون أو أقل)، الجلطات قد لا تكون ملحقة بشدة على الشريحة الزجاجية، ويمكن أن يكون معطوباً أو غسلها بعيداً خلال خطوات التثبيت/الغسيل. في حالة استخدام تركيزات منخفضة من الفيبرينوجين، الوقت تشكيل الجلطة، بين إضافة ثرومبين والتثبيت، يمكن زيادة تصل إلى عدة ساعات، كما قد يزيد ذلك من استقرار الجلطة. يجب تجنب المستخدمين أيضا، استخدام قوة عالية الفوسفات المخزن المؤقت أو المالحة الفوسفات مخزنة لكل من التعكر وفحوصات ووزارة شؤون المرأة، أيونات الفوسفات قد تتداخل مع عملية تشكيل جلطة الكالسيوم بوساطة. إذا كان استخدام أي الأخرى عالية الملح الذي يحتوي على المخزن المؤقت لتشكيل جلطة وتحليل وزارة شؤون المرأة، بعد التثبيت، الغسيل خطوات ينبغي أيضا إجراء مع ddH الباردة2o.
وزارة شؤون المرأة تحليل عينات غير موصل مثل جلطات فيبرينوجين يتطلب طلاء مع الجسيمات المشحونة مثل الذهب أو البلاديوم أو الفضة أو الكربون. سمك الطلاء عامل هام في مجال التصوير ووزارة شؤون المرأة، كما أنه من الممكن أن طلاء معدني كثيف جداً يمكن أن تخفي التضاريس السطحية الترا-هيكل من جلطة فيبرينوجين. في هذا البروتوكول، رقيقة طلاء الذهب/البلاديوم (أقل من 20 nm) وتستخدم لطلاء الرش. لتحقيق أقل من 20 نانومتر سمك، اﻷخرق حدث بالنسبة 45 s بمعدل 4 طلاء/s. هذا الطلاء رقيقة (18 nm) لا يبدو أن تخفي ملامح الجمعية فيبرينوجين السطحية. ومع ذلك، إذا بالقلق حول إخفاء الترا-هيكل الجلطة، يمكن استخدام طلاء الكربون كبديل للذهب/البلاديوم، كما أنه سيغادر أقل "الجزر" لطلاء جزيئات المواد.
وبينما انصب التركيز هنا على التفاعل Aβ-الفيبرينوجين، يمكن تعديل هذا البروتوكول سهولة لتحليل التفاعل بين البروتينات أو المركبات الأخرى مع تجلط فيبرينوجين. اتباع هذه الإرشادات، المحققين ينبغي أن يكون قادراً على إنتاج في المختبر فيبرينوجين جلطة تشكيل والقيام بتحليل هذه المقايسة التعكر تجلط مبسطة وبروتوكولات وزارة شؤون المرأة. كما هو موضح هنا مع مثبط المنشورة سابقا مجمع TDI-2760، هذه الأساليب توفير معلومات قيمة فيما يتعلق بتشكيل جلطة فيبرينوجين التي يمكن تطبيقها لمواصلة الدراسات في المختبر و في فيفو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون كاواساكي ماسانوري واسو كازويوشي مايكل فولي من معهد ديسكفري المداواة الثلاثية المؤسسية (TDI) ونيويورك لتوليف مثبطات التفاعل Aβ-الفيبرينوجين ومقترحاتهم القيمة. يشكر المؤلفون أيضا أعضاء المختبر ستريكلاند لمناقشة مفيدة. تم دعم هذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة منحة NS104386، ومؤسسة اكتشاف المخدرات مرض الزهايمر، وصندوق التنمية العلاجية روبرتسون إتش، المعاهد الوطنية للصحة منح NS50537، المعهد اكتشاف العلاجات ثلاثي المؤسسية، "مؤسسة اكتشاف المخدرات" مرض الزهايمر، مؤسسة عائلة Rudin، وهيرمان جون أ عن س. س.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
