Summary
यहां प्रस्तुत दो तरीकों कि व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है फाइब्रिन थक्का संरचना पर बीटा-amyloid के प्रभाव का विश्लेषण कर रहे हैं । शामिल एक इन विट्रो फाइब्रिन थक्का, थक्का turbidity और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तरीकों के बाद बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल है ।
Abstract
यह लेख इन विट्रो फाइब्रिन थक्के में पैदा करने के लिए तरीके प्रस्तुत करता है और स्पेक्ट्रोमेट्री और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) द्वारा थक्का गठन और संरचना पर बीटा-amyloid (Aβ) प्रोटीन के प्रभाव का विश्लेषण । Aβ, जो अल्जाइमर रोग (AD) में amyloid समुच्चय neurotoxic रूपों, फाइब्रिनोजेन के साथ बातचीत करने के लिए दिखाया गया है । इस Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत फाइब्रिन थक्का संरचनात्मक रूप से असामान्य और fibrinolysis के लिए प्रतिरोधी बनाता है. फाइब्रिन थक्के में Aβ-प्रेरित असामान्यताओं microinfarcts, सूजन, साथ ही साथ, सेरेब्रल amyloid angiopathy (CAA) के रूप में विज्ञापन विकृति के मस्तिष्कवाहिकीय पहलुओं के लिए भी योगदान कर सकते हैं । विज्ञापन विकृति में neurovascular घाटे की संभावित महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए, यौगिकों जो बाधित कर सकते है या कम Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत चिकित्सकीय मूल्य का वादा किया है विकासशील । इन विट्रो विधियों द्वारा फाइब्रिन थक्का गठन आसानी से किया जा सकता है और व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन चिकित्सकीय यौगिकों के विकास के लिए संभावित रूप से उपयोगी उपकरण हैं. यहां प्रस्तुत फाइब्रिन थक्का के इन विट्रो पीढ़ी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है, साथ ही Aβ और Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत अवरोधकों के प्रभाव का विश्लेषण । थक्का turbidity परख तेजी से है, अत्यधिक reproducible और एक साथ कई शर्तों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, Aβ-फाइब्रिनोजेन अवरोधकों की बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है । इस स्क्रीनिंग से हिट यौगिकों और उनके फाइब्रिन थक्का वास्तुकला SEM का उपयोग करने के Aβ प्रेरित संरचनात्मक विषमताओं को सुधारने की क्षमता के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है । इन अनुकूलित प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता यहां TDI-२७६०, एक हाल ही में पहचान Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत अवरोध करनेवाला का उपयोग कर प्रदर्शन किया है ।
Introduction
अल्जाइमर रोग (AD), एक neurodegenerative बुजुर्ग रोगियों में संज्ञानात्मक गिरावट के लिए अग्रणी रोग, predominately असामान्य बीटा से उठता है-amyloid (Aβ) अभिव्यक्ति, एकत्रीकरण और ख़राब मंजूरी neurotoxicity 1 में जिसके परिणामस्वरूप, 2. Aβ समुच्चय और विज्ञापन3, सटीक रोग विकृति अंतर्निहित तंत्र के बीच अच्छी तरह से जुड़ाव के बावजूद4अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं । सबूत बढ़ाने से पता चलता है कि neurovascular घाटे प्रगति और5विज्ञापन की गंभीरता में एक भूमिका निभाते हैं, के रूप में Aβ सीधे संचार प्रणाली6के घटकों के साथ सूचना का आदान प्रदान । Aβ फाइब्रिनोजेन7,8, जो भी दोनों विज्ञापन रोगियों और माउस मॉडल9,10,11में Aβ जमा करने के लिए स्थानीयकरण के साथ एक उच्च संबंध बातचीत की है । इसके अलावा, Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत असामान्य फाइब्रिन-थक्का गठन और संरचना, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से fibrinolysis9,12के लिए प्रतिरोध लाती है । एक विज्ञापन के इलाज में चिकित्सकीय संभावना है, Aβ और फाइब्रिनोजेन13,14के बीच बातचीत बाधा द्वारा संचार घाटे को समाप्त । हम इसलिए, कई छोटे उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग और औषधीय रसायन विज्ञान13,14के दृष्टिकोण का उपयोग कर Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत बाधा यौगिकों की पहचान की । Aβ-फाइब्रिनोजेन संपर्क अवरोधकों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए, हम इन विट्रो फाइब्रिन थक्का गठन: थक्का turbidity परख और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM)14के विश्लेषण के लिए दो तरीकों अनुकूलित ।
थक्का turbidity परख यूवी दिखाई स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर फाइब्रिन थक्का गठन की निगरानी के लिए एक सीधे आगे और तेजी से विधि है । फाइब्रिन थक्का रूपों के रूप में, प्रकाश तेजी से बिखरा हुआ है और समाधान के turbidity बढ़ जाती है । इसके विपरीत जब Aβ मौजूद होता है तो फाइब्रिन का थक्का की संरचना बदल जाती है, और मिश्रण की turbidity कम हो जाती है (चित्रा १). Aβ-प्रेरित विषमताओं से थक्का turbidity को बहाल करने की क्षमता के लिए निरोधात्मक यौगिकों के प्रभाव का आकलन किया जा सकता है । जबकि turbidity परख कई शर्तों के तेजी से विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, यह थक्का आकार और संरचना पर सीमित जानकारी प्रदान करता है । SEM, जिसमें ठोस वस्तुओं की स्थलाकृति इलेक्ट्रॉन जांच से पता चला है, थक्का15,16,17,18 और के आकलन के 3 डी वास्तुकला के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है कैसे Aβ की उपस्थिति और /या निरोधात्मक यौगिकों कि संरचना9,14बदल । दोनों स्पेक्ट्रोमेट्री और SEM शास्त्रीय प्रयोगशाला तकनीक है कि विभिंन प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया गया है, उदाहरण के लिए, spectrophotometry amyloid एकत्रीकरण19,20की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है । इसी तरह, SEM भी अल्जाइमर के प्लाज्मा से गठित फाइब्रिन थक्का का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, पार्किंसंस और thromboembolic स्ट्रोक रोगियों21,22,23. यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक reproducible और तेजी से तरीके से फाइब्रिन-थक्का गठन का आकलन करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं ।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल की तैयारी के लिए निर्देश प्रदान करता है एक इन विट्रो फाइब्रिन-थक्का दोनों के साथ और बिना Aβ. यह भी फाइब्रिन थक्का गठन और संरचना पर Aβ के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए तरीकों का विवरण । Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत के निषेध को मापने के लिए इन दो तरीकों की प्रभावशीलता TDI-२७६०, एक छोटे निरोधात्मक यौगिक14का उपयोग कर प्रदर्शित किया जाता है । इन तरीकों, दोनों व्यक्तिगत और एक साथ, की अनुमति के लिए तेजी से और सीधा विश्लेषण इन विट्रो फाइब्रिन थक्का गठन.
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Protocol
1. aβ ४२ और फाइब्रिनोजेन के विश्लेषण के लिए तैयार करना
- lyophilized पाउडर से तैयार monomeric aβ ४२
- गर्म aβ ४२ पाउडर कमरे के तापमान के लिए और 30 एस के लिए १,५०० x g पर नीचे स्पिन ।
- बर्फ के १०० µ एल जोड़ें ठंडा hexafluoroisopropanol (HFIP) प्रति ०.५ मिलीग्राम aβ ४२ पाउडर और बर्फ पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
चेतावनी: उपयोग देखभाल जब HFIP हैंडलिंग और एक रासायनिक हुड में सभी चरणों का प्रदर्शन । - 20 µ एल aliquots तैयार करें और फिल्मों के लिए एक रासायनिक डाकू में हवा शुष्क 2-3 एच फिल्मों में संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c ।
- 10 मिनट के लिए एक स्नान sulfoxide में आंदोलन द्वारा ताजा dimethyl DMSO (sonicator) के 10 µ एल में monomeric aβ ४२ फिल्म का पुनर्गठन कमरे के तापमान पर ।
- जोड़ें १९० µ ५० मिमी tris (hydroxymethyl) aminomethane (tris) बफर (पीएच ७.४) और पिपेट ऊपर और नीचे धीरे से एल ।
- 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर २०,८१७ x g पर केंद्रापसारक द्वारा प्रोटीन समुच्चय निकालें ।
- रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर supernatant मशीन और अगले दिन २०,८१७ x g पर 4 ° c पर समाधान के लिए 20 मिनट के लिए किसी भी आगे प्रोटीन समुच्चय त्यागना ।
- उपाय aβ ४२ bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख द्वारा एकाग्रता । सीरियल पतला शुद्ध गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) से 1 मिलीग्राम/एमएल के लिए ०.०६२५ मिलीग्राम/एक प्रोटीन मानक बनाने के लिए, तपसिल में एक बहु अच्छी तरह से थाली के कुओं के लिए प्रत्येक मानक के 10 µ एल जोड़ें । पतला Aβ नमूने 1:4 और तपसिल में कुओं के लिए 10 µ एल जोड़ें । बीसीए सॉल्यूशंस A और B को मिक्स करें और प्रत्येक वेल में २०० µ l को जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन और ५६२ एनएम पर एक प्लेट रीडर पर पढ़ें । बर्फ पर शेष Aβ समाधान रखें और turbidity परख और SEM के लिए इस तैयारी का उपयोग करें ।
- फाइब्रिनोजेन समाधान तैयार करें
- उपाय 20 एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में lyophilized फाइब्रिनोजेन पाउडर के मिलीग्राम और पुनः निलंबित पूर्व के साथ 20 मिमी hydroxyethylpiperazine एतान sulfonic एसिड (HEPES) बफर (पीएच ७.४) के 2 मिलीलीटर गर्म ।
- 10 मिनट के लिए एक ३७ ° c पानी स्नान में मशीन ।
- एक ०.२ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान. 4 डिग्री सेल्सियस से समाधान ले लो और फाइब्रिनोजेन समुच्चय या पूर्व मौजूदा फाइब्रिन को दूर करने के लिए ०.१ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फिर से फिल्टर.
- बीसीए की परख करके फाइब्रिनोजेन एकाग्रता को मापने । चरण 1.1.8 से निर्देशों का पालन करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर शेष फाइब्रिनोजेन समाधान रखें और turbidity परख और SEM के लिए इस तैयारी का उपयोग करें ।
2. थक्का Turbidity परख
- ९६-खैर प्लेट के प्रत्येक प्रयोगात्मक अच्छी तरह से करने के लिए, चरण 1.1.8 से 30 µ m aβ ४२ समाधान के 20 µ एल जोड़ें ताकि अपनी अंतिम एकाग्रता ३.० µ मीटर बफर के २०० µ एल में है । ५० mM Tris बफर (pH ७.४) में 5% DMSO का एक ही वॉल्यूम जोड़ें ९६-वेल प्लेट में कुओं के बफर नियंत्रण के लिए ।
नोट: इस कदम पर ४२ aβ की सटीक मात्रा महत्वपूर्ण नहीं है । कम एकाग्रता की तैयारी के लिए, एक उच्च मात्रा इस्तेमाल किया जा सकता है, और थक्का गठन बफर की मात्रा समायोजित किया जा सकता है । अंतिम मात्रा २०० µ एल रहना चाहिए । - यदि परीक्षण निरोधात्मक यौगिकों, DMSO के रूप में काम कर एकाग्रता के लिए यौगिक पतला । aβ ४२ के साथ कुओं के लिए एक नियंत्रण के लिए यौगिक या अकेले DMSO जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण ।
नोट: aβ ४२ समाधान अच्छी तरह के तल पर एक असतत छोटी बूंद फार्म चाहिए, यौगिक या DMSO सीधे छोटी बूंद के केंद्र में pipetted किया जाना चाहिए । - थक्का गठन बफर में कदम 1.2.4 से फाइब्रिनोजेन स्टॉक समाधान पतला (20 मिमी HEPES बफर (पीएच ७.४), 5 मिमी CaCl2, और १३७ मिमी NaCl) और यह aβ ४२ युक्त और नियंत्रण कुओं ९६-वेल प्लेट के लिए जोड़ें । फाइब्रिनोजेन समाधान की मात्रा को समायोजित करें ताकि इसकी अंतिम एकाग्रता १.५ µ m कुल २०० µ l प्रतिक्रिया मात्रा में हो जाता है । पिपेट धीरे समाधान और बुलबुले बनाने से बचने । एक घूर्णन मंच पर मिलाते हुए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली मशीन ।
ध्यान दें: फाइब्रिनोजेन समाधान की मात्रा अपने शेयर एकाग्रता के आधार पर भिंन हो सकते हैं, लेकिन एक अच्छी तरह से में कुल मात्रा १७० µ एल जबकि मशीन होना चाहिए । - ५० यू/एमएल का स्टॉक सॉल्यूशन बनाने के लिए ddH2ओ में व्यावसायिक रूप से शुद्ध thrombin पाउडर को भंग करके thrombin सॉल्यूशन तैयार करें । का उपयोग करने से पहले सीधे 20 मिमी HEPES बफर (पीएच ७.४) में काम समाधान 5 U/
- मशीन के 30 मिनट के बाद, एक साथ thrombin समाधान (5 U/एमएल) के 30 µ l जोड़ें ९६ में फाइब्रिनोजेन समाधान में अच्छी तरह से थाली २.३ मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके चरण से । thrombin के अलावा तुरंत थक्का गठन शुरू होगा । इसलिए, बुलबुले बनाने से बचने के लिए देखभाल के साथ फाइब्रिनोजेन समाधान के केंद्र में सीधे thrombin जोड़ें.
नोट: thrombin की गतिविधि प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच भिन्न हो सकते हैं, साथ ही thrombin बहुत सारे. सही करने के लिए मजबूत थक्के उत्पादन आवश्यक एकाग्रता empirically निर्धारित किया जा सकता है । - thrombin के अलावा तुरंत बाद एक प्लेट रीडर पर इन विट्रो थक्का में के अवशोषण पढ़ें । 10 मिनट के पाठ्यक्रम पर ३५० एनएम पर अवशोषक उपाय, हर 30-60 एस कमरे के तापमान पर पूरे परख करते हैं ।
नोट: कुछ अवरोधक यौगिकों ३५० एनएम पर समाधान अवशोषक बदल सकते हैं, जो मामले में turbidity ४०५ एनएम पर मापा जा सकता है ।
3. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
- थक्का, निर्धारण, और धुलाई की तैयारी
- संदंश का उपयोग करते हुए एक 12-अच्छी तरह से या 24-well प्लेट में साफ सिलिकॉन ग्लास सर्कल कवर स्लाइड (12 मिमी) रखें ।
- थक्का गठन बफर में फाइब्रिनोजेन तैयार करते हैं । विवरण के लिए प्रोटोकॉल चरण १.२ देखें ।
- फाइब्रिन थक्का संरचना पर Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत अवरोधकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, turbidity परख (चरण 2) के लिए वर्णित के रूप में मशीन के लिए निर्देशों का पालन करें । हमेशा नियंत्रण कुओं जो दोनों Aβ और अवरोधकों के अभाव में फाइब्रिनोजेन होते शामिल हैं ।
- पिपेट ८० कवर स्लाइड पर कदम 3.1.3 से फाइब्रिनोजेन मिश्रण के µ एल । धीरे से समाधान फैलाएं ताकि यह कवर स्लाइड पर समान रूप से वितरित हो ।
- thrombin स्टॉक पतला (५० u/एमएल) 20 मिमी HEPES में २.५ u/एमएल और 20 µ एल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए खारा बफर मिश्रण के बिना फाइब्रिनोजेन समाधान करने के लिए के केंद्र के लिए सीधे जोड़ें ।
नोट: यदि आवश्यक हो, एक उच्च thrombin काम एकाग्रता (5 यू/एमएल) इस्तेमाल किया जा सकता है । - कवर 12 एक प्लास्टिक के ढक्कन के साथ अच्छी तरह से थाली और यह 30-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें ।
- जबकि थक्के प्रतिक्रिया चल रहा है, निर्जलीकरण और निर्धारण समाधान तैयार करते हैं । सोडियम cacodylate बफर (०.१ मीटर, पीएच ७.४) तैयार करें । सोडियम cacodylate बफर में 10% glutaraldehyde स्टॉक समाधान पतला (०.१ मीटर, पीएच ७.४) glutaraldehyde के एक 2% काम समाधान बनाने के लिए । इन सभी समाधानों को बर्फ पर रखें । ताजा पतला glutaraldehyde (2%) 1 सप्ताह के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जब ठीक से 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में संग्रहीत ।
- डबल आसुत जल में निरपेक्ष इथेनॉल (१००%) पतला (८०%, ५०%, और 20% इथेनॉल) । इन इथेनॉल समाधान और निरपेक्ष इथेनॉल रखें (बर्फ पर १००%) ।
चेतावनी: सोडियम cacodylate और glutaraldehyde हैंडलिंग जब देखभाल का उपयोग करें, एक रासायनिक हुड में इन चरणों का प्रदर्शन. - 30 मिनट के बाद, धीरे से दो बार बर्फ ठंडा सोडियम cacodylate बफर (०.१ मीटर) के साथ थक्के धो लें । प्रत्येक अच्छी तरह से है कि थक्का पूरी तरह से जलमग्न है बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें । एक ढक्कन के साथ अच्छी तरह से थाली कवर और यह कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए छोड़ दें । 2 मिनट के बाद, धीरे से एक 1 मिलीलीटर पिपेट या संकीर्ण स्टेम हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर बफर निकालें । एक बार दोहराएं ।
- बर्फ ठंडा glutaraldehyde के साथ थक्के फिक्स (2%) । बर्फ पर अच्छी तरह से थाली रखते हुए, प्रत्येक अच्छी तरह से 2% glutaraldehyde के आसपास 2-3 मिलीलीटर जोड़ें । सुनिश्चित करें कि थक्के पूरी तरह जलमग्न हैं । कवर और 30 मिनट के लिए बर्फ पर थाली छोड़ दें ।
- 30 मिनट के बाद, धीरे से एक अच्छी तरह से glutaraldehyde को हटाने और सोडियम cacodylate बफर (2 मिनट, दो बार) ऊपर वर्णित के रूप में (०.१ मीटर) का उपयोग कर थक्के धोने । अच्छी तरह से बर्फ पर थाली रखो ।
- थक्का और महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने की धारावाहिक निर्जलीकरण
- बर्फ के एक वर्गीकृत श्रृंखला में थक्के निर्जलीकरण-शीत इथेनॉल कदम 3.1.8 में तैयार धोया (20%, ५०%, ८०%, १००%, और again100%) 5 मिनट प्रत्येक के लिए । प्रत्येक इथेनॉल श्रृंखला के लिए, 2-3 मिलीलीटर जोड़ें, यकीन है कि थक्के जलमग्न कर रहे हैं । कवर और बर्फ पर गर्मी ।
- प्रत्येक इथेनॉल कदम के बाद, एक 1 मिलीलीटर पिपेट या डिस्पोजेबल पिपेट ड्रॉपर का उपयोग कर इथेनॉल समाधान निकालें । एथेनॉल को पूरी तरह से न निकालें । सुनिश्चित करें कि थक्का सतह हवा के संपर्क में नहीं है ।
नोट: निरपेक्ष इथेनॉल में निर्जलीकरण (१००%) दो बार प्रदर्शन किया जाना चाहिए । - जबकि नमूना अंतिम १००% इथेनॉल में जलमग्न रखते हुए, एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर (सीपीडी) को हस्तांतरण । एक सीपीडी नमूना धारक या सीपीडी कक्ष में स्लाइड स्थानांतरित करने के लिए एक वॉशर के साथ एक कवर स्लिप धारक का प्रयोग करें । प्रत्येक स्लाइड के बीच कम से एक वॉशर रखें ।
- सीपीडी चैंबर से कवर स्लाइड बाहर ले जाओ और यह एक SEM पर माउंट कार्बन टेप का उपयोग कर स्टब ।
- धूम कोटिंग और इमेजिंग
- धूम कोटिंग चैंबर के लिए SEM ठूंठ के साथ सभी नमूनों स्थानांतरण ।
- धूम एक वैक्यूम धूम कोट का उपयोग कर, सोने/पैलेडियम या ऐसे कार्बन के रूप में अंय प्रवाहकीय सामग्री, से कम 20 एनएम कोट ।
नोट: हम सोने के 18 एनएम का उपयोग किया है/ धूम कोटिंग ४५ एस के लिए प्रदर्शन किया था और कोटिंग गति 4 Å/धूम लेपित नमूने स्थिर रहे है जब कुछ हफ्तों के लिए कमरे के तापमान पर एक शुष्क वातावरण में ठीक से रखा । SEM विश्लेषण कभी भी किया जा सकता है । - एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन 4 केवी पर SE2 डिटेक्टर से सुसज्जित माइक्रोस्कोप पर छवियों का अधिग्रहण ।
नोट: इस छवि सेट में छवि पिक्सेल आकार 13 एनएम से सीमा-31 एनएम ।
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Representative Results
इन विट्रो थक्के (turbidity) परख में, एंजाइम thrombin सट फाइब्रिनोजेन, जिसके परिणामस्वरूप फाइब्रिन नेटवर्क24के गठन में । इस फाइब्रिन थक्का गठन समाधान के माध्यम से गुजर प्रकाश के बिखरने का कारण बनता है, वृद्धि हुई turbidity में जिसके परिणामस्वरूप (चित्रा 1), पढ़ने की अवधि के अंत से पहले पठारी (चित्रा 2, हरा). जब फाइब्रिनोजेन aβ ४२ की उपस्थिति में मशीन था, समाधान के turbidity की कमी हुई, वक्र के साथ लगभग आधे की अधिकतम ऊंचाई तक पहुंचने कि अकेले फाइब्रिनोजेन (चित्रा 2a, नीला) । हाल ही में एक प्रकाशन में, Aβ एकत्रीकरण ब्लॉकर्स की एक श्रृंखला संश्लेषित और उनके Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत को बाधित करने की क्षमता के लिए मूल्यांकन किया गया, यौगिक TDI-२७६०14की पहचान । हम अपने अध्ययन में TDI-२७६० का इस्तेमाल किया है Aβ-फाइब्रिनोजेन संपर्क ब्लॉक । जैसा कि पहले बताया, TDI-२७६० की उपस्थिति में, Aβ के प्रभाव को उन्नत किया गया था, के रूप में turbidity Aβ अकेले (चित्रा 2a, लाल) के साथ तुलना में अधिक था. TDI का प्रभाव-२७६० पृष्ठभूमि turbidity के कारण होने के लिए प्रकट नहीं होता है के रूप में यौगिक फाइब्रिन थक्का turbidity जब Aβ अनुपस्थित था (चित्रा 2a, बैंगनी) नहीं बदला । इन विट्रो थक्के turbidity परख यहां वर्णित एक तेजी से और सरल तरीका है जिसके द्वारा फाइब्रिन-थक्का गठन और कारकों है कि उस प्रक्रिया को क्षीणन हो सकता है मनाया जा सकता है । GPRP, जो फाइब्रिन मोनोमर घुंडी के साथ हस्तक्षेप के माध्यम से फाइब्रिन बहुलकीकरण के साथ हस्तक्षेप करने के लिए जाना जाता है-होल इंटरेक्शन18,25 turbidity परख (चित्रा बी1) के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । पहले रिपोर्टों के साथ संगत25, GPRP पेप्टाइड की उपस्थिति के साथ, फाइब्रिन थक्का turbidity के रूप में अपनी अनुपस्थिति के साथ फाइब्रिन थक्का गठन की तुलना में काफी कम हो गया था (चित्रा बीसी, ब्लू बनाम ग्रीन).
turbidity परख ऊपर वर्णित के रूप में एक ही प्रोटोकॉल और शर्तों के बाद, फाइब्रिन थक्के उपस्थिति और Aβ और/या TDI-२७६० की अनुपस्थिति में तैयार थे । थक्के तो निर्धारण, निर्जलीकरण, महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने, और सोने-धूम कोटिंग (चित्रा 1) द्वारा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए संसाधित किया गया । केवल thrombin और CaCl2 की उपस्थिति में फाइब्रिनोजेन एक फाइब्रिन मेष का गठन, लंबी और intercalated धागे के साथ फाइब्रिन के रूप में अच्छी तरह के रूप में बड़ा बंडलों (3 ए आंकड़ा) । जब Aβ मौजूद था, फाइब्रिन धागे पतले हो गए, कई चिपचिपा का झुरमुट के साथ/Aβ प्रेरित संरचनात्मक विषमता (चित्र बी) का संकेत समुच्चय । turbidity परख परिणामों के अनुरूप, TDI-२७६० आंशिक रूप से Aβ-प्रेरित परिवर्तन से फाइब्रिन थक्का की संरचना बहाल, के रूप में कम के झुरमुट मौजूद थे (आंकड़ा 3सी) । turbidity परख के साथ साथ, SEM हद और Aβ की गुणवत्ता से पता चलता है फाइब्रिन थक्का गठन करने के लिए प्रेरित परिवर्तन, साथ ही साथ एक निरोधात्मक यौगिक की प्रभावशीलता, TDI-२७६० ।
चित्रा 1 : turbidity परख और SEM द्वारा फाइब्रिन थक्का विश्लेषण के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । योजनाबद्ध फाइब्रिन थक्का विश्लेषण में शामिल कदम और फाइब्रिन थक्का turbidity और संरचनात्मक स्थलाकृति पर Aβ के प्रभाव से पता चलता है । SEM छवियां (नीचे बाएं) के पैमाने पर सलाखों के 2 µm है और आवर्धन 10, 000X है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : प्रभाव का मापन aβ पर ४२ इन विट्रो फाइब्रिन थक्का गठन by turbidity परख. (क) फाइब्रिनोजेन उपस्थिति और aβ ४२ की अनुपस्थिति में मशीन था । थक्का गठन thrombin द्वारा प्रेरित किया गया था, समाधान की वृद्धि हुई turbidity में जिसके परिणामस्वरूप (हरा). ४२ aβ की उपस्थिति में, फाइब्रिन थक्का असामान्य रूप से संरचित, घटी हुई turbidity (नीला) में जिसके परिणामस्वरूप था. यौगिक TDI-२७६० या DMSO फाइब्रिनोजेन समाधान के साथ, दोनों के साथ और aβ ४२ के बिना मशीन थे । TDI-२७६० बहाल aβ ४२-प्रेरित turbidity की कमी (लाल) सामांय थक्का गठन (बैंगनी) बदलने के बिना । (ख) एक ज्ञात fibrinolysis अवरोधक के turbidity, GPRP भी इस परख के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में मापा गया था । फाइब्रिनोजेन उपस्थिति और १.५ µ एम GPRP और turbidity thrombin जोड़ने के बाद मापा की अनुपस्थिति में मशीन था । aβ ४२ के समान, फाइब्रिन थक्का गठन के turbidity GPRP की उपस्थिति में काफी कम हो गया था (ब्लू बनाम ग्रीन). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : Aβ-प्रेरित असामान्यताओं के फाइब्रिन थक्का वास्तुकला के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ. फाइब्रिन थक्का संरचना की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ शुद्ध फाइब्रिनोजेन से प्राप्त (A), फाइब्रिनोजेन + aβ ४२ (B), फाइब्रिनोजेन + Aβ42 + TDI-२७६० (C). थक्का गठन मिश्रण करने के लिए thrombin और CaCl2 जोड़कर शुरू किया गया था । संरचनात्मक विश्लेषण से पता चला कि aβ ४२ की उपस्थिति में गठन थक्के पतले हैं और असामान्य रूप से अपने आप फाइब्रिनोजेन की तुलना में झुरमुट । TDI-२७६०, जो aβ ४२-फाइब्रिनोजेन बातचीत को बाधित करने के लिए जाना जाता है, आंशिक रूप से फाइब्रिन थक्का के aβ ४२ प्रेरित संरचनात्मक विषमता को सही किया । स्केल बार 1 µm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
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Discussion
तरीकों यहां वर्णित एक reproducible और तेजी से फाइब्रिन थक्का गठन का आकलन करने का मतलब है इन विट्रो मेंप्रदान करते हैं । इसके अलावा, प्रणाली की सादगी कैसे Aβ फाइब्रिन थक्का गठन और अपेक्षाकृत सीधे आगे की संरचना को प्रभावित करता है की व्याख्या करता है । इस लैब पिछले प्रकाशन में, यह दिखाया गया है कि इन परख के लिए उनके Aβ-फाइब्रिनोजेन13,14संपर्क को बाधित करने की क्षमता के लिए यौगिकों का परीक्षण किया जा सकता है । इन दो परख, संश्लेषित यौगिकों की एक श्रृंखला का उपयोग करने Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत को बाधित करने की क्षमता के लिए विश्लेषण किया गया । दरअसल, थक्का turbidity परख उन जो चिकित्सीय क्षमता है करने के लिए हिट यौगिकों के पूल संकीर्ण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, नहीं सभी यौगिकों कि Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत को बाधित कर सकते हैं के रूप में भी फाइब्रिन थक्का गठन बहाल कर सकते हैं.
वहां turbidity परख कि समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है या इस तकनीक के उपयोग की सीमा के कुछ पहलुओं हैं । प्रमुख सीमा है कि वहां प्रयोगों है कि परिणामों की व्याख्या जटिल हो सकता है के बीच कुछ बदलाव हो सकता है । इस भिन्नता के कुछ thrombin गतिविधि के कारण हो रहा है. thrombin गतिविधि के लिए समस्या निवारण के लिए, उपयोगकर्ताओं Aβ और परीक्षण यौगिकों के साथ प्रयोग शुरू करने से पहले थक्का-गठन गतिविधि के लिए thrombin के कई सांद्रता परीक्षण कर सकते हैं । यहां प्रस्तुत प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, Aβ, फाइब्रिनोजेन के अभाव में, पृष्ठभूमि turbidity घटता फाइब्रिन बहुलकीकरण की वजह से कर रहे है का संकेत है कि स्तर के ऊपर समाधान के turbidity वृद्धि नहीं करता है । हालांकि, Aβ एक एकत्रीकरण-प्रवण पेप्टाइड और कमरे के तापमान या ३७ डिग्री सेल्सियस (कई घंटे) पर एक बहुत लंबे समय के लिए रखा जब Aβ समाधान की एक उच्च एकाग्रता है जो वृद्धि हुई turbidity में परिणाम हो सकता है fibrillar समुच्चय फार्म कर सकते हैं । यदि प्रभाव एक Aβ समाधान है कि कमरे के तापमान या गर्म पर समय की लंबी अवधि के लिए संग्रहीत किया गया है विश्लेषण, समाधान की एकत्रीकरण की स्थिति संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल में हौसले से तैयार Aβ और फाइब्रिनोजेन समाधानों का उपयोग किया जाता है, जो एकत्रीकरण संबंधी मुद्दों को समाप्त करना चाहिए । तथापि, इन तैयारियों की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए इनका संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा आकलन किया गया है. इसके अतिरिक्त, वाणिज्यिक Aβ पेप्टाइड का एक नया बहुत का उपयोग करते समय, oligomerization और oligomers की मात्रा की हद तक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए. क्योंकि बहुत पेप्टाइड गुणवत्ता और अनुरूप समुच्चय और monomeric Aβ, जो निश्चित रूप से oligomerization दर को प्रभावित करता है के अनुपात में बहुत भिंनता हो सकती है । यह oligomerization के लिए मशीनिंग से पहले Aβ समाधान (बीसीए विधि) की एकाग्रता की जांच करने के लिए सलाह दी जाती है । इन परिवर्तनों को कम से कम करने के लिए, हम oligomer गठन प्रतिक्रिया के लिए Aβ समाधान के ०.१ मिलीग्राम/एमएल का उपयोग करने की कोशिश की ।
क्योंकि यह परख भी तापमान और गति के रूप में छोटे पर्यावरणीय परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है, विभिंन प्रयोगों से turbidity रीडिंग एक साथ विश्लेषण नहीं किया जाना चाहिए । इसका मतलब यह है कि शर्तों कि तुलना की जा सकती है की संख्या कुओं की संख्या है कि thrombin एक साथ एक मल्टीचैनल पिपेट (यानी, 12) के साथ जोड़ा जा सकता है द्वारा सीमित है । उपयोगकर्ताओं को भी पता होना चाहिए कि चिपचिपापन या बफ़र्स और परीक्षण यौगिकों में रंग एक उच्च पृष्ठभूमि turbidity करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, फाइब्रिन थक्का से संकेत अस्पष्ट और प्रयोग मुश्किल की व्याख्या कर रही है । नियंत्रण के सभी प्रत्येक प्रयोग में शामिल कर रहे हैं हालांकि, अगर पृष्ठभूमि संकेत turbidity अवशोषक फेरबदल कर रहा है, यह आसानी से निर्धारित करने के लिए संभव होना चाहिए.
turbidity परख कि फाइब्रिन थक्का के गठन Aβ द्वारा रुकावट है और इसके अलावा अगर अवरोध करनेवाला यौगिकों इस प्रभाव को कम कर सकते है के बारे में जानकारी प्रदान करता है । हालांकि, यह कैसे फाइब्रिन थक्का की संरचना Aβ और/या हिट यौगिकों के जवाब में बदल गया है पता नहीं चलता है । इस सवाल SEM द्वारा संबोधित किया जा सकता है, के रूप में यह थक्का वास्तुकला के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है । SEM एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है और नियमित रूप से शुद्ध फाइब्रिनोजेन या प्लाज्मा से थक्का संरचना visualizing के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, SEM विश्लेषण के लिए पारंपरिक थक्का तैयार करने की प्रक्रिया जटिल और समय लेने वाली हो सकती है । इसके अलावा, विभिन्न अनुसंधान समूहों के बीच प्रोटोकॉल में छोटे अंतर यह24परिणाम दोहराने के लिए चुनौतीपूर्ण बना सकते हैं. इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए इस अनुकूलित प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, जिसके साथ Aβ के प्रभाव पतले फाइब्रिन किस्में और प्रोटीन के झुरमुट प्रेरित करने के लिए मनाया जा सकता है (चित्रा 3). के रूप में turbidity परख के साथ देखा, TDI-२७६० Aβ के प्रभाव को समाप्त, फाइब्रिन बंडलों की विशिष्ट संरचना (चित्रा 3) बहाल ।
वहां SEM नमूना तैयारी में कुछ कदम हैं, जो भी समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है । फाइब्रिनोजेन (०.५ µ मीटर या उससे कम) के बहुत कम सांद्रता का उपयोग करते समय, थक्के कांच की स्लाइड से दृढ़ता से अनुलग्न नहीं किए जा सकते हैं और इसे निर्धारण/धुलाई चरणों के दौरान दूर धोया जा सकता है । फाइब्रिनोजेन की कम सांद्रता का उपयोग कर, thrombin और निर्धारण के अलावा के बीच थक्का गठन समय, कई घंटे तक बढ़ाया जा सकता है, के रूप में यह थक्का स्थिरता में वृद्धि हो सकती है । इसके अलावा, उपयोगकर्ताओं को दोनों turbidity और SEM परख के लिए उच्च शक्ति फॉस्फेट बफर या फास्फेट का उपयोग करने से बचना चाहिए, फॉस्फेट आयनों के रूप में कैल्शियम की मध्यस्थता थक्का गठन की प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. अगर किसी अंय उच्च थक्का गठन और SEM विश्लेषण के लिए बफर युक्त नमक का उपयोग, निर्धारण के बाद, धुलाई कदम भी ठंड ddH2ओ के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
फाइब्रिन के थक्के के रूप में गैर-प्रवाहकीय नमूनों की SEM विश्लेषण जैसे, सोना, पैलेडियम, चांदी या कार्बन चार्ज कणों के साथ कोटिंग की आवश्यकता है । कोटिंग मोटाई SEM इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण कारक है, क्योंकि यह संभव है कि एक बहुत मोटी धातु कोटिंग फाइब्रिन थक्का के अल्ट्रा संरचना सतह स्थलाकृति मुखौटा कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल में, पतले सोने/पैलेडियम कोटिंग (कम से 20 एनएम) धूम कोटिंग के लिए उपयोग किया जाता है । से कम 20 एनएम मोटाई प्राप्त करने के लिए, sputtering 4 Å की एक कोटिंग दर के साथ ४५ एस के लिए किया गया था/ इस पतली कोटिंग (18 एनएम) फाइब्रिन विधानसभा की सतह सुविधाओं मुखौटा प्रकट नहीं होता है । हालांकि, अगर थक्का की अल्ट्रा संरचना मास्किंग के बारे में चिंतित, कार्बन कोटिंग सोने के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता/पैलेडियम, के रूप में यह सामग्री पर कोटिंग अणुओं के कम "टाप" छोड़ देंगे ।
जबकि ध्यान यहां Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत पर किया गया है, इस प्रोटोकॉल को आसानी से फाइब्रिन थक्का के साथ अंय प्रोटीन या यौगिकों की बातचीत का विश्लेषण संशोधित किया जा सकता है । इन निर्देशों के बाद, जांचकर्ताओं को इन विट्रो फाइब्रिन थक्का गठन और इन सुव्यवस्थित थक्का-turbidity परख और SEM प्रोटोकॉल के साथ विश्लेषण करने में पुन: पेश करने में सक्षम होना चाहिए । के रूप में पहले प्रकाशित अवरोधक यौगिक TDI-२७६० के साथ यहां दिखाया गया है, इन तरीकों बहुमूल्य फाइब्रिन थक्का गठन है कि आगे दोनों विट्रो में और vivo मेंअध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक Masanori कावासाकी, Kazuyoshi Aso, और माइकल Foley त्रिकोणीय संस्थागत चिकित्सकीय खोज संस्थान (TDI), Aβ के संश्लेषण के लिए ंयूयॉर्क-फाइब्रिनोजेन संपर्क अवरोधकों और उनके बहुमूल्य सुझावों से धंयवाद । लेखक भी सहायक चर्चा के लिए Strickland लैब के सदस्यों को धंयवाद । यह काम NIH ग्रांट NS104386, अल्जाइमर ड्रग डिस्कवरी फाउंडेशन, और Robertson चिकित्सीय विकास निधि के लिए H.A., NIH ग्रांट NS50537, त्रि-संस्थागत चिकित्सकीय खोज संस्थान, अल्जाइमर्स ड्रग डिस्कवरी फाउंडेशन, के द्वारा समर्थित था ऩुदीन परिवार फाउंडेशन, और जॉन ए Herrmann एस॰एस॰ के लिए
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
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