Summary
Presenteras här är två metoder som kan användas enskilt eller i kombination för att analysera effekten av beta-amyloid på fibrin clot struktur. Inkluderat är ett protokoll för att skapa en in vitro- fibrin clot, följt av koagel grumlighet och scanning electron microscopy metoder.
Abstract
Denna artikel presenterar metoder för att generera i vitro fibrin blodproppar och analysera effekten av beta-amyloid (Aβ) protein på koagelbildning och struktur av spektrometri och svepelektronmikroskopi (SEM). Aβ, som bildar neurotoxiska amyloid aggregat i Alzheimers sjukdom (AD), har visats interagera med fibrinogen. Denna Aβ-fibrinogen interaktion gör fibrin koagel strukturellt avvikande och resistenta mot fibrinolys. Aβ-inducerad avvikelser i fibrin koagulering kan också bidra till cerebrovaskulär aspekter av AD patologin såsom microinfarcts, inflammation, liksom, cerebral amyloid angiopati (CAA). Tanke på potentiellt kritiska rollen av neurovaskulära underskott i AD patologi, har utveckla föreningar som kan hämma eller minska Aβ-fibrinogen interaktionen lovande terapeutiskt värde. In vitro metoder genom vilka fibrin koagelbildning kan enkelt och systematiskt utvärderas är potentiellt användbara verktyg för att utveckla terapeutiska föreningar. Presenteras här är en optimerad protokoll för in vitro- generation av fibrin koagel, samt analys av effekten av Aβ och Aβ-fibrinogen interaktion hämmare. Clot grumlighet analysen är snabb, mycket reproducerbara och kan användas för att testa flera villkor samtidigt, vilket möjliggör screening av stora antal av Aβ-fibrinogen-hämmare. Hit föreningar från denna screening kan utvärderas ytterligare för sin förmåga att lindra Aβ-inducerad strukturella avvikelser av fibrin clot arkitektur med hjälp av SEM. Effektiviteten av dessa optimerade protokoll framgår här använder TDI-2760, en nyligen identifierade Aβ-fibrinogen interaktion hämmare.
Introduction
Alzheimers sjukdom (AD), en neurodegenerativ sjukdom som leder till kognitiv försämring hos äldre patienter, huvudsakligen uppkommer onormala beta-amyloid (Aβ) uttryck, aggregering och nedsatt clearance vilket resulterar i neurotoxicitet1, 2. de exakta mekanismerna bakom sjukdomen patologin trots välkarakteriserad associationen mellan Aβ-aggregat och AD3, inte är förstådda4. Ökande bevis föreslår att neurovaskulära underskott spelar en roll i progression och svårighetsgraden av AD5, som Aβ interagerar direkt med komponenter av cirkulationssystemet6. Aβ har en hög affinitet interaktion med fibrinogen7,8, som också lokaliserar till Aβ avlagringar i både AD patienter och mus modeller9,10,11. Dessutom inducerar Aβ-fibrinogen interaktionen onormal fibrin-koagelbildning och struktur, samt resistens mot fibrinolys9,12. En terapeutisk möjlighet vid behandling av AD, är att lindra cirkulatoriska underskott genom att hämma interaktionen mellan Aβ och fibrinogen13,14. Vi identifierade därför flera små föreningar att hämma den Aβ-fibrinogen interaktion med hög genomströmning screening och läkemedelskemi metoder13,14. För att testa effekten av Aβ-fibrinogen interaktion hämmare, optimerad vi två metoder för analys av in vitro- fibrin koagelbildning: koagulera grumlighet assay och scanning electron microscopy (SEM)14.
Clot grumlighet analysen är en enkel och snabb metod för att övervaka fibrin koagelbildning med hjälp av UV-synliga spektroskopi. Som fibrin koagel former, ljus är alltmer utspridda och turbiditeten av lösningen ökar. Omvänt, när Aβ är närvarande, fibrin koagel struktur ändras och turbiditeten av blandningen minskar (figur 1). Effekten av hämmande föreningar kan bedömas för potential att återställa propp turbiditet från Aβ-inducerad avvikelser. Medan grumlighet analysen möjliggör snabb analys av flera villkor, ger det begränsad information på propp form och struktur. SEM, där topografin av fasta föremål avslöjas av elektron probe, möjliggör analys av 3D arkitekturen av koagel15,16,17,18 och bedömningen av hur förekomsten av Aβ och / eller hämmande substanser förändrar det struktur9,14. Både spektrometri och SEM är klassiskt laboratorietekniker som har använts för olika ändamål, exempelvis spektrofotometri används för övervakning av amyloid aggregering19,20. Likaså används SEM också för att analysera fibrin koagel bildas av plasma från Alzheimer, Parkinson och tromboembolisk stroke patienter21,22,23. De protokoll som presenteras här är optimerade för att bedöma fibrin-koagelbildning i ett reproducerbart och snabbt sätt.
Följande protokoll finns instruktioner för beredning av ett in vitro- fibrin-clot både med och utan Aβ. Det Detaljer också metoder för att analysera effekten av Aβ fibrin koagelbildning och struktur. Effektiviteten hos dessa två metoder för att mäta hämning av Aβ-fibrinogen interaktionen demonstreras med TDI-2760, en litet hämmande förening14. Dessa metoder, möjliggör både individuellt och tillsammans, snabb och enkel analys av in vitro- fibrin koagelbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av Aβ42 och Fibrinogen för analys
- Förbereda monomer Aβ42 från frystorkat pulver
- Varm Aβ42 pulver till rumstemperatur och snurra ner vid 1500 x g i 30 s.
- Tillsätt 100 µL av iskall hexafluoroisopropanol (Bovallstrand) per 0,5 mg Aβ42 pulver och inkubera i 30 min på is.
Varning: Var försiktig vid hantering av Bovallstrand och utföra alla steg i en kemisk huva. - Förbereda 20 µL portioner och låt filmer luften torr i en kemisk huva för 2-3 h. filmer kan förvaras vid-20 ° C.
- Rekonstituera monomer Aβ42 film i 10 µL av färska dimetyl sulfoxid (DMSO) genom agitation i ett bad någon sonikator under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 190 µL av 50 mM tris (hydroxymetyl) aminometan (Tris) buffert (pH 7,4) och Pipettera försiktigt upp och ner.
- Ta bort protein aggregaten genom centrifugering vid 20,817 x g vid 4 ° C i 20 min.
- Inkubera supernatanten vid 4 ° C för över natten och nästa dag Centrifugera lösningen vid 20,817 x g vid 4 ° C i 20 min om du vill ignorera eventuella ytterligare protein aggregat.
- Mäta Aβ42 koncentration av bicinchoninic syra (BCA) analys. Seriell utspädd renad bovint serumalbumin (BSA) från 1 mg/mL 0.0625 mg/ml producera en protein-standard, Lägg till 10 µL av varje standard och brunnarna flera platta i tre exemplar. Späd prover som är Aβ 1:4 och Lägg till 10 µL brunnarna i tre exemplar. Blanda BCA lösningar A och B och tillsätt 200 µL till varje brunn. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C och läsa på en skylt läsare på 562 nm. Håll återstående Aβ lösningen på is och använda detta preparat för grumlighet assay och SEM.
- Förbereda Fibrinogen lösning
- Mät 20 mg frystorkade fibrinogen pulver i en 15 mL tub och slamma med pre värmde 2 mL av 20 mM hydroxyethylpiperazine etan sulfonsyra (HEPES) buffert (pH 7,4).
- Inkubera i ett vattenbad på 37 ° C i 10 min.
- Filtrera lösningen genom ett 0,2 µm spruta filter och förvaras vid 4 ° C i 30 min. Ta ut lösningen från 4 ° C och filtrera igen genom 0.1 µm spruta filter ta bort fibrinogen aggregat eller befintliga fibrin.
- Mätning av fibrinogen-koncentrationen av BCA assay. Följ instruktionerna från steg 1.1.8. Håll återstående fibrinogen lösningen vid 4 ° C och använda detta preparat för grumlighet assay och SEM.
2. clot grumlighet Assay
- Till varje experimentella brunn plattan med 96 brunnar, tillsätt 20 µL av 30 µM Aβ42 lösning från steg 1.1.8 så att dess slutliga koncentration är 3,0 µM i 200 µL buffert. Tillsätt samma volym av 5% DMSO i 50 mM Tris buffert (pH 7,4) att buffra kontrollbrunnar i plattan med 96 brunnar.
Observera: Den exakta volymen av Aβ42 vid detta steg är inte viktigt. En högre volym kan användas för låg koncentration preparat, och volymen av koagel bildas bufferten kan justeras. Den slutliga volymen bör förbli 200 µL. - Om testning hämmande föreningar, späd föreningen till arbetande koncentrationen som DMSO. Lägg till förening eller DMSO ensam för en kontroll till brunnarna med Aβ42 och blanda väl.
Obs: Aβ42 lösning bör bilda en diskret droplet på botten av brunnen, föreningen eller DMSO bör vara pipetteras direkt in i centrera av droplet-programmet. - Späd fibrinogen stamlösning från steg 1.2.4 i blodpropp formation buffert (20 mM HEPES buffert (pH 7,4), 5 mM CaCl2och 137 mM NaCl) och Lägg till Aβ42 som innehåller och kontrollbrunnar av plattan med 96 brunnar. Volymen av fibrinogen lösningen så att dess slutliga koncentration blir 1,5 µM i totalt 200 µL reaktionsvolym. Pipettera lösningen långsamt och undvika bildar bubblor. Inkubera plattan i rumstemperatur i 30 min skakar på en roterande plattform.
Obs: Volymen fibrinogen lösning kan variera beroende på dess lager koncentration, men den totala volymen i varje bör väl 170 µL medan inkubation. - Förbereda trombin lösning genom att lösa upp kommersiellt renat trombin pulver i ddH2O göra en stamlösning 50 U/ml. Späd till 5 U/mL arbetslösning till 20 mM HEPES buffert (pH 7,4) direkt före användning.
- Efter 30 min inkubering, tillsätt samtidigt 30 µL av trombin lösning (5 U/mL) i fibrinogen lösningarna i plattan med 96 brunnar från steg 2.3 använda flerkanalspipett. Tillsats av trombin kommer omedelbart att inleda koagelbildning. Därför lägga till trombin direkt in i centrera av fibrinogen lösningen med omsorg för att undvika bildar bubblor.
Obs: Aktiviteten av trombin kan variera mellan experimentella förhållanden, liksom trombin massor. Rätt koncentration krävs för att kraftfullt producera blodproppar kan behöva bestämmas empiriskt. - Läs absorbansen av in vitro- propp på en tallrik läsare omedelbart efter trombin tillägg. Mät absorbansen vid 350 nm under loppet av 10 min, varje 30-60 s. utför hela analysen vid rumstemperatur.
Obs: Vissa hämmare föreningar kan förändra lösningen absorbansen vid 350 nm, i vilket fall turbiditeten kan mätas vid 405 nm.
3. svepelektronmikroskopi
- Beredning av koagel, fixering och tvätt
- Plats ren silikoniserad cirkel locket objektglas (12 mm) i en 12-väl eller 24 brunnar plattan med hjälp av tången.
- Förbereda fibrinogen i blodpropp formation buffert. Se protokoll steg 1.2 för detaljer.
- För att utvärdera effekten av Aβ-fibrinogen interaktion-hämmare på fibrin clot struktur, följ instruktionerna för inkubering som beskrivs för grumlighet analysen (steg 2). Inkludera alltid kontrollbrunnar som innehåller fibrinogen i avsaknad av både Aβ och hämmare.
- Pipettera 80 µL av fibrinogen blandningen från steg 3.1.3 på omslaget bilderna. Försiktigt sprida lösningen så att den fördelas jämnt i täcka bilden.
- Späd trombin lager (50 U/mL) i 20 mM HEPES buffrad koksaltlösning till en slutlig koncentration på 2,5 U/mL och tillsätt 20 µL direkt till centrum till fibrinogen lösningen utan att blanda.
Obs: Om så krävs, kommer en högre trombin arbetande koncentration (5 U/mL) kan användas. - Täcka 12-väl plattan med en plast lock och lämna den i rumstemperatur i 30-60 min.
- Medan koagulering reaktion körs, förbereda uttorkning och fixering lösningar. Förbereda natrium cacodylate buffert (0.1 M, pH 7,4). Späd 10 procentig glutaraldehyd stamlösning i natrium cacodylate buffert (0.1 M, pH 7,4) att göra en 2% arbetar lösning av glutaraldehyd. Hålla alla dessa lösningar på is. Nymalen utspädda glutaraldehyd (2%) bör användas inom 1 vecka, vid rätt förvaring i kylskåp vid 4 ° C.
- Späd absolut etanol (100%) i dubbel destillerat vatten (80%, 50% och 20% etanol). Hålla dessa etanol lösningar och absolut etanol (100%) på is.
Varning: var försiktig vid hantering av natrium cacodylate och glutaraldehyd, utför dessa steg i en kemisk huva. - Efter 30 min, försiktigt tvätta blodproppar med iskall natrium cacodylate buffert (0,1 M) två gånger. Tillsätt 2 mL av bufferten till varje brunn så att proppen är helt nedsänkt. Täcker väl plattan med ett lock och låt den stå 2 min i rumstemperatur. Efter 2 min, och ta försiktigt bort det buffert som med en 1 mL pipett eller smala stammen överföring pipett. Upprepa en gång.
- Fixa blodproppar med iskall glutaraldehyd (2%). Hålla väl plattan på is, tillsätt cirka 2-3 mL 2% glutaraldehyd i varje brunn. Kontrollera att blodproppar är helt nedsänkt. Täck och låt plattan på is i 30 min.
- Efter 30 min, försiktigt bort glutaraldehyd från varje brunn och tvätta de blodproppar som använder natrium cacodylate buffert (0,1 M) som beskrivits ovan (2 min, två gånger). Hålla väl plattan på is.
- Seriell uttorkning av koagel och kritisk punkt torkning
- Torka av blodproppar i en graderad serie iskall etanol tvättar bereddes i steg 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100% och again100%) för 5 min varje. För varje etanol-serien, tillsätt 2-3 mL, att se till att blodproppar är nersänkta. Täcka och inkubera på is.
- Efter varje etanol steg bort om etanol lösningen med en 1 mL pipett eller disponibla pipett dropper. Ta inte bort etanol helt. Kontrollera att koagel ytan inte utsätts för luft.
Obs: Uttorkning i absolut etanol (100%) bör utföras två gånger. - Samtidigt hålla provet nedsänkt i den slutliga 100% etanolen, överföra till en kritisk punkt torktumlare (CPD). Använd en CPD provhållaren eller täckglas innehavare med en bricka för att överföra bilderna till CPD kammaren. Placera minst en bricka mellan varje bild.
- Ta ut täcka bilden från CPD kammaren och montera den på en SEM påbörjad med kol tejp.
- Sputter beläggning och imaging
- Överföra alla prover med SEM påbörjad till fräsande beläggning kammaren.
- Fräsande päls mindre än 20 nm guld/palladium eller andra ledande material, såsom kol, med hjälp av ett vakuum fräsande bestrykare.
Obs: Vi har använt 18 nm guld/palladium beläggning. Fräsande beläggningen utfördes för 45 s och beläggning hastigheten var 4 Å / s. fräsande belagda prover är stabil när den förvaras ordentligt i torr miljö i rumstemperatur i några veckor. SEM analys kan utföras när som helst. - Skaffa bilder på ett svepelektronmikroskop utrustad med SE2 detektorn på 4 kV.
Obs: Pixel bildstorlek i den här bilden ange intervall från 13 nm-31 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro- koagulation (grumlighet) analys klyver av enzymet trombin fibrinogen, vilket resulterar i bildandet av fibrin nätverk24. Detta fibrin koagelbildning orsakar spridning av det ljus som passerar genom den lösningen, vilket resulterar i ökad grumlighet (figur 1), plateauing före utgången av perioden läsning (figur 2, grön). När fibrinogen var inkuberas i närvaro av Aβ42, turbiditeten lösning minskade, med kurvan når en maximal höjd på ungefär hälften av fibrinogen ensam (figur 2A, blå). I en senaste publikation, var en serie av Aβ aggregering blockerare syntetiseras och bedömts för sin förmåga att hämma Aβ-fibrinogen samspelet, att identifiera den sammansatta TDI-276014. I vår studie har vi använt TDI-2760 för att blockera Aβ-fibrinogen interaktion. Som rapporterats tidigare, i närvaro av TDI-2760, effekten av var Aβ förbättras, som turbiditeten var högre än med Aβ ensam (figur 2A, röd). Effekten av TDI-2760 verkar inte bero på bakgrunden grumlighet som föreningen inte ändra fibrin clot turbiditeten när Aβ var frånvarande (figur 2A, lila). I in vitro- koagulering grumlighet-analysen som beskrivs här är en snabb och enkel metod av som fibrin-propp bildas och faktorer som kan dämpa den processen kan observeras. GPRP, som är kända för att störa fibrin polymerisation via stör fibrin monomer knopp-håls interaktioner18,25 kan användas som en positiv kontroll för grumlighet analysen (figur 2B). Överensstämmer med de tidiga rapporter25, med närvaro av GPRP peptid, fibrin clot turbiditeten minskade signifikant jämfört med det fibrin koagelbildning med sin frånvaro (figur 2B, blå vs grön).
Efter den samma protokoll och villkor som turbiditet analysen ovan, bereddes fibrin blodproppar i närvaro och frånvaro av Aβ eller TDI-2760. Blodproppar bearbetades sedan för elektronmikroskopi av fixering, uttorkning, kritisk punkt torkning och guld-fräsande beläggning (figur 1). Fibrinogen i närvaro av endast trombin och CaCl2 bildade en fibrin mesh, med långsträckt och ortodoxas trådar av fibrin samt större buntar (figur 3A). När Aβ var närvarande, blev fibrin trådar tunnare, med flera klibbiga klumpar/aggregat som indikerar Aβ-inducerad strukturella avvikelser (figur 3B). Linje med grumlighet analysens resultat, TDI-2760 återställd delvis strukturen av fibrin koagel från Aβ-inducerad förändringar, eftersom färre klumpar var närvarande (figur 3 C). Tillsammans med grumlighet analysen avslöjar SEM omfattningen och kvaliteten av Aβ-inducerad förändringar till fibrin koagelbildning, liksom effektiviteten av en hämmande förening, TDI-2760.
Figur 1 : Schematisk framställning av fibrin clot analys av grumlighet assay och SEM. Schematiskt visar de olika stegen i fibrin clot analys och effekten av Aβ fibrin clot grumlighet och strukturella topografi. Skala barerna på SEM-bilder (nederst till vänster) är 2 µm och förstoringen är 10, 000 X. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Mätning av effekten Aβ42 på in vitro- fibrin koagelbildning av grumlighet assay. (A) Fibrinogen var inkuberas i närvaro och frånvaro av Aβ42. Koagelbildning förmåddes av trombin, som resulterar i ökad grumlighet av lösningen (grön). I närvaro av Aβ42 strukturerades fibrin koagel onormalt, vilket resulterar i försämrad turbiditet (blå). Den sammansatta TDI-2760 eller DMSO inkuberades med fibrinogen lösningen, både med och utan Aβ42. TDI-2760 restaurerade Aβ42-inducerad minskning av grumlighet (röd) utan att ändra den normala koagelbildning (lila). (B) grumligheten av en känd fibrinolys-hämmare, GPRP mättes också som positiv kontroll för denna analys. Fibrinogen var inkuberas i närvaro och frånvaro av 1,5 µM GPRP och turbiditeten mätt efter tillsats av trombin. Liknar Aβ42, turbiditeten av fibrin koagelbildning minskade avsevärt i närvaro av GPRP (blå kontra grön). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Skannar elektronmikrografier av Aβ-inducerad avvikelser till fibrin clot arkitektur. Scanning elektronmikrografier fibrin clot struktur erhållits från renat fibrinogen (A), fibrinogen + Aβ42 (B), fibrinogen + Aβ42 + TDI-2760 (C). Koagelbildning inleddes genom att lägga till trombin och CaCl2 till blandningen. Den strukturella analysen visade att blodproppar bildas i närvaro av Aβ42 är tunnare och onormalt klampade jämfört med fibrinogen av sig själv. TDI-2760, som är kända för att hämma Aβ42-fibrinogen interaktion, korrigerade delvis Aβ42 inducerad strukturella abnormitet av fibrin koagel. Skalstapeln är 1 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderna som beskrivs här ger ett reproducerbara och snabba sätt att bedöma fibrin koagel bildas i vitro. Enkelheten i systemet gör dessutom tolkningen av hur Aβ påverkar fibrin koagelbildning och struktur relativt rakt fram. I denna lab's tidigare publikation visades att dessa analyser kan användas för att testa föreningar för sin förmåga att hämma Aβ-fibrinogen interaktion13,14. Använder dessa två analyser, en serie av syntetiserade föreningar analyserades för förmågan att hämma Aβ-fibrinogen interaktionen. Faktiskt, clot grumlighet analysen kan användas för att begränsa poolen av träff föreningar som har terapeutiska potential, eftersom inte alla föreningar som kan hämma Aβ-fibrinogen interaktionen kan även återställa fibrin koagelbildning.
Det finns några aspekter av grumlighet analysens som kräva felsökning eller begränsa användningen av denna teknik. Den största begränsningen är att det kan finnas vissa variationer mellan de experiment som kan komplicera tolkningen av resultaten. Några av denna variation är att vara tack vare aktiviteten trombin. När du felsöker för trombin aktivitet, kan användare testa flera koncentrationer av trombin för koagelbildning aktivitet före början experimenterande med Aβ och test föreningar. Under experimentella förhållanden presenteras här ökar Aβ, i avsaknad av fibrinogen, inte turbiditeten av lösningen ovan bakgrundsnivåer som anger som observerats grumlighet kurvor är på grund av fibrin polymerisation. Dock Aβ är en aggregering-benägen peptid och en högre koncentration av Aβ lösning när den förvaras under mycket lång tid vid rumstemperatur eller 37 ° C (flera timmar) kan bilda fibrillar aggregat vilket kan resultera i ökad grumlighet. Om analysera effekten en Aβ-lösning som har lagrats under lång tid i rumstemperatur eller varmare, kan aggregering status av lösningen bestämmas genom transmissionselektronmikroskopi. I protokollet som beskrivs här, används nylagade Aβ och fibrinogen lösningar, som bör eliminera aggregering frågor. Dock för att säkerställa kvaliteten på dessa preparat har de utvärderats av transmissionselektronmikroskopi. Dessutom, när du använder en ny massa kommersiella Aβ peptid, bör omfattningen av oligomerisering och kvantitet av oligomerer bedömas av transmissionselektronmikroskopi. Eftersom det kan finnas parti till parti variationer i peptid kvalitet och förhållandet av förformade ballast och monomer Aβ, som säkerligen påverkar oligomerisering. Det är lämpligt att kontrollera koncentrationen av Aβ lösning (BCA metod) innan ruvning för oligomerisering. För att minimera dessa variationer, försökte vi med minst 0,1 mg/mL av Aβ lösning för oligomer bildandet reaktion.
Eftersom denna analys är också känslig för små förändringar i miljön såsom temperatur och motion, bör grumlighet avläsningar från olika experiment inte analyseras tillsammans. Detta innebär att antalet villkor som kan jämföras är begränsad av antalet brunnar att trombin kan samtidigt läggas till med en flerkanalspipett (dvs., 12). Användare bör också vara medveten att viskositet eller färg i buffertar och test föreningar kan leda till en hög bakgrund grumlighet, skymmer signalen från fibrin koagel och försvårar tolkningen av experimentet. Dock om alla kontroller ingår i varje experiment, bör det vara möjligt att lätt avgöra om bakgrund signal förändrar grumlighet absorbansen.
Turbiditet analysen ger information om huruvida bildandet av fibrin koagel hindras av Aβ och vidare om hämmare föreningar kan lindra denna effekt. Det dock inte avslöja hur strukturen av fibrin koagel ändras som svar på Aβ eller träffa föreningar. Denna fråga kan tas upp av SEM, eftersom detta möjliggör direkt visualisering av koagel arkitektur. SEM är en väletablerad teknik och används rutinmässigt för att visualisera clot struktur från renat fibrinogen eller plasma. Dock kan traditionella clot förberedelseprocessen för SEM-analys vara komplicerade och tidsödande. Dessutom kan små skillnader i protokoll mellan olika forskargrupper gör det utmanande att replikera resultaten24. För att hantera dessa frågor utvecklades detta optimerade protokoll, som effekten av Aβ inducera tunnare fibrin delarna och klumpar av protein kan observeras (figur 3). Som sett med grumlighet analysen, lindrar TDI-2760 effekten av Aβ, återställa den typiska strukturen av fibrin buntar (figur 3).
Det finns några steg i SEM provpreparering, som kan också kräva felsökning. När du använder mycket låga koncentrationer av fibrinogen (0,5 µM eller mindre), blodproppar kan inte sättas fast glasskiva och kan vara skadat/tvättas bort under stegen fixering/tvätt. Om använder låga koncentrationer av fibrinogen, kan koagel bildas tiden, mellan tillsats av trombin och fixering, ökas upp till flera timmar, eftersom det kan öka clot stabilitet. Dessutom bör användare undvika att använda höghållfasta fosfatbuffert eller fosfatbuffrad saltlösning för både grumlighet och SEM-analyser, eftersom fosfat joner kan störa kalcium-medierad clot bildandet processen. Om du använder någon annan hög salthalt som innehåller buffert för koagelbildning och SEM analys, efter fixering, bör tvättning steg också utföras med kall ddH2O.
SEM analys av icke-ledande prover såsom fibrin blodproppar kräver beläggning med laddade partiklar såsom, guld, palladium, silver eller kol. Skikttjocklek är en viktig faktor i SEM imaging, som det är möjligt att en mycket tjock metallbeläggning kan maskera ultra-struktur ytans topografi fibrin koagel. I detta protokoll, tunna guld/palladium beläggning (mindre än 20 nm) används för fräsande beläggning. För att uppnå mindre än 20 nm tjocklek, den sputtring gjordes för 45 s med en beläggning på 4 Å / s. Denna tunn beläggning (18 nm) verkar inte maskera ytstrukturen fibrin församling. Dock om berörda om maskering ultra-strukturen av koagel, kan kol beläggning användas som ett alternativ till guld/palladium, eftersom det kommer att lämna mindre ”holmar” beläggning molekyler på materialet.
Fokus har varit på Aβ-fibrinogen samverkan, kan detta protokoll ändras lätt för att analysera samspelet mellan andra proteiner eller föreningar med fibrin koagel. Efter dessa instruktioner, bör utredare kunna reproducera i vitro fibrin koagelbildning och utföra analyser med dessa strömlinjeformad clot-grumlighet assay och SEM protokoll. Som visas här med tidigare publicerade hämmaren sammansatta TDI-2760, dessa metoder ger värdefull information om fibrin koagelbildning som kan användas för att ytterligare studier både in vitro och in-vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso och Michael Foley från Tri-institutionella Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York för syntes av Aβ-fibrinogen interaktion hämmare och deras värdefulla förslag. Författarna vill även tacka medlemmar Strickland labbet för bra diskussion. Detta arbete fick stöd av NIH grant NS104386, Alzheimer's Drug Discovery Foundation och Robertson terapeutiska utvecklingsfonden för H.A., NIH bevilja NS50537, den Tri-institutionella Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer's Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation, och John A. Herrmann för S.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
