Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Etikett-fri Imaging av enstaka proteiner utsöndras från levande celler via iSCAT mikroskopi

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58486
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4, 4, 1,3
1Max Planck Institute for the Science of Light (MPL), 2Area of Scientific Learning, Milligan College, 3Department of Physics, Friedrich Alexander University Erlangen-Nuremberg, 4Department of Internal Medicine 5, Hematology and Oncology, Friedrich Alexander University Erlangen-Nuremberg (FAU), University Hospital Erlangen

Summary

Vi presenterar ett protokoll för realtid optisk detektion av enstaka omärkt proteiner när de utsöndras från levande celler. Detta är baserat på interferometrisk spridning (iSCAT) mikroskopi, som kan tillämpas på en mängd olika biologiska system och konfigurationer.

Abstract

Vi visar interferometrisk spridning (iSCAT) mikroskopi, en metod som kan upptäcka enstaka omärkt proteiner utsöndras från enskilda levande celler i realtid. I detta protokoll täcker vi de grundläggande stegen för att förverkliga ett iSCAT Mikroskop och komplettera med ytterligare tänkbar kanaler att övervaka livskraften i en cell under studien. Efter detta använder vi metoden för realtid upptäcka enstaka proteiner som de utsöndras från en levande cell som vi demonstrera med en förevigade B-cell linje (Laz388). Nödvändiga åtgärder om utarbetandet av Mikroskop och prov samt analys av de registrerade uppgifterna diskuteras. Video protokollet visar att iSCAT mikroskopi erbjuder en enkel metod för att studera sekretion på singel-molekyl nivå.

Introduction

Utsöndrade proteiner spelar en betydande roll i olika fysiologiska processer1. På grund av detta studeras de rutinmässigt som en kollektiv ensemble (proteomik) eller som enskilda enheter2,3. Proteomik undersöker traditionellt hela den uppsättning av proteiner förekommer i ett visst biologiska system genom t.ex. enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), flödescytometri eller masspektrometri4,5, 6. Enstaka proteiner, däremot, upptäcks vanligen med hjälp av olika tekniker som baseras på fluorescens7,8, plasmonik9,10eller kryogen elektron11 microscopies. Alla dessa tekniker använder komplexa instrument, märkning eller båda och saknar ofta dynamics information som de levererar endast långsiktig information om systemet under studien.

Här använder vi iSCAT12,13 mikroskopi till sense enskilda sekretoriska proteiner med sub sekund temporal upplösning14. Ännu viktigare, identifierar tekniken svaga spridda signalen inneboende till varje protein12,14. Mängden ljus som en liten bioparticle skingrar skalor med dess polariserbarheten. Antar att formen av ett protein kan approximeras med en effektiv spridning sfär14,15,16, samt olika proteiner har mycket liknande refractive index, uppmätta signalen kan vara direkt ansluten till molekylvikt (MW) av proteinet. Empiriska kalibrering av iSCAT kontrast jämfört med molekylvikt av referensmätningar gör att man kan särskilja proteiner av olika storlekar. iSCAT experiment kan lätt kompletteras med fluorescence mikroskopi17,18, immunosorbent reagenser, samt fluorescerande eller ytspridning etiketter för en specifik detektion av något protein intresse14 , 17 , 19.

I princip fungerar iSCAT genom att förstärka en proteinets svag spritt ljus via interferometrisk blandning med en sekundär referens våg. Upptäckta intensiteten (Equation 1) i en iSCAT Mikroskop beskrivs av

Equation 2

där Equation 3 är incident intensiteten, Equation 4 är en koefficient för bidrag av referens wave, Equation 5 betecknar scattering styrkan i nano-objektet under studien, och Equation 6 är fasförskjutning mellan utspridda och referens Waves14. Antingen den överförda eller back-reflekteras infallande som ljus vanligtvis används som en referens våg, där i varje fall Equation 7 står för den transmissivitet eller reflektivitet på prov avdelningen, respektive. Termen Equation 8 är proportionell mot proteinets spridning cross avsnitt och kan försummas jämfört med cross termen. Därigenom, Equation 9 för fullständig destruktiv interferens, upptäckta ljuset ges av Equation 10 där Equation 11 är referens intensiteten och Equation 12 är störningar intensiteten.

iSCAT mikroskopi erbjuder en utmärkt metod för att studera biologiska processer på singel-molekyl nivå. Som ett exempel, vi undersöker Laz388 celler — en Epstein - Barr virus (EBV) omvandlas B-lymfocyter cell linje20,21 — som de utsöndrar proteiner som IgG antikroppar16. Men metoden är generell och kan användas på en mängd andra biologiska system. iSCAT är till sin natur ospecifika och kan upptäcka något protein eller nanopartiklar eller det kan utökas med gemensamma ytan funktionalisering metoder för specifika eller multiplexade detektion. Dess enkelhet och förmågan att kombineras med andra optiska tekniker, såsom fluorescensmikroskopi, gör iSCAT ett värdefullt kompletterande verktyg i cellbiologi.

Protocol

Varning: Läs alla relevanta säkerhetsdatablad (MSDS) innan du använder inga kemikalier, iaktta alla lämpliga säkerhetsrutiner och personliga skyddsutrustning (laser skyddsglasögon, ögonskydd, handskar, laboratorium rockar) som behövs.

1. bygga iSCAT Mikroskop16,18

Obs: Mikroskopet iSCAT består vanligtvis av en modifierad inverterade mikroskopet setup. I korthet, en laser är inriktad på tillbaka fokalplanet höga numeriska bländaröppningen (NA) mål och en tänkbar objektiv används för att fokusera den partikelns bakåtspritt ljus på en kamera-chip. I allmänhet kan detta wide-fält Mikroskop byggt från grunden eller baserat på en befintlig inverterade mikroskopet. Detta protokoll täcker de väsentliga steg för att förverkliga setup, medan förändringar i används maskinvaran är möjliga. En mer detaljerad beskrivning av montering av ett iSCAT Mikroskop kan hittas i arbetet i Arroyo o.a. 18.

Varning: Ett iSCAT Mikroskop innebär en klass IIIB till klass IV laser ljuskälla. Lämpliga ögonskydd är nödvändigt när montering och uppriktning Mikroskop optiken. Under mikroskopet församling, kontrollera att sökvägen laser beam förblir rak och är inte avlänkas när nya optiska komponenter läggs till.

  1. Ställa in sökvägen belysning av mikroskopet.
    1. Med hjälp av en fuktad optiska tabell och en styv metall block, bygga en Mikroskop prov etapp18 som innefattar en hög numeriska bländaröppningen (NA) mål (100 X / 1,46 NA) och en översättningsenheten som möjliggör laterala prov översättning samt byter fokus positionen för målet.
      Obs: Drift av ett iSCAT Mikroskop på gränsen för att upptäcka enstaka proteiner är mycket mottagliga för externa vibrationer. En centrosymmetric piezo scenen som stöder provet från alla sidor rekommenderas att begränsa akustiska excitationer av provet som annars skulle äventyra fokal och lateral stabilitet. Figur 1 visar ett lämpligt urval skede, inklusive piezo översättningsenheten och målet. Det rekommenderas dessutom att massiva och stabila fästen som används för alla optiska komponenter som beskrivs i följande steg. Sådana komponenter är lätt tillgängliga från kommersiella optik leverantörer.
    2. Använd en 50 cm linne brännvidd (wide-fältet lins) och en 45° (vertikal) koppling spegeln för att fokusera ljuset av en diodlaser på våglängd 445 nm på tillbaka fokalplanet målet. Detta skapar en kollimerad stråle på målets framåt fokus och blir iSCAT belysning källa. Om nödvändigt, filtrera lasern rumsligt före 50 cm objektivet via en 30 µm pinhole eller single-mode fiber.
    3. Applicera en droppe av nedsänkning olja till målet och placera ett täckglas i provet symmetriplan Mikroskop scenen. Detta kommer att resultera i en stråle som reflekterar tillbaka ner genom syftet imaging.
      Obs: Reflektion uppstår från luft-glas-gränssnittet på den övre ytan av det prov täckglaset och kommer att ligga till grund för den iSCAT referensstråle. Kvarvarande smuts eller damm på ytan av täckglaset kommer att ge upphov till spridning källor, som stöd i den rätt fokusering av imaging målet i nästa steg.
      FÖRSIKTIGHET: Majoriteten av laserljuset sänder genom täckglaset och färdas rakt upp från målet. Placera en ogenomskinlig speglande diffusor (t.ex., en papperskort) ovanför täckglaset för att minimera risken för skador från laserljuset.

Figure 1
Figur 1: iSCAT prov scenen. Fotografiet visar den massiva aluminiumblock som monteras piezo översättningsenheten (svart) samt den centrera 100 x mål. 3-axlig piezo scenen möjliggör exakt positionering av provet i fokalplanet målet. Grov fokusering utförs genom att vrida ett gängade rör som målet är monterade (inte avbildas). Blocket är placerad på optiska tabellen med fyra stål piedestaler ovanför 45° koppling spegeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Ställa in mikroskopet tänkbar väg.
    1. Införa en antireflection (AR)-belagda stråldelare (70% reflektion, 30% transmission) i 45° vinkel i förhållande till den infallande stråle, och cirka 10 cm efter objektivets wide-fältet. Peka AR beläggning mot laserkällan. Detta överför den infallande strålen, och återspeglar hänvisningen och spridda balkar i 90° vinkel mot infallande strålen.
      Obs: AR-belagd eller inklämd beam splitters rekommenderas som betydande eftersläpningar och marginella effekter kan uppstå när du använder beam dela kuber eller obestruket planar beam splitters. Se diskussion för mer detaljer. Om så önskas, kan eventuella oönskade reflekterade strålen som härrör från baksidan av stråldelare blockeras genom användning av en irisbländare.
    2. En tjock stråldelare kommer att införa en betydande beam förskjutning så att lasern inte kan ange målet rakt längre. Om nödvändigt, justera laser beam sökvägen innan stråldelare att säkerställa rätt förökningen genom målet.
      Obs: Stråldelare kan också läggas innan brett fält linsen och Mikroskop scenen är placerad (i steg 1.1.2.), så att strålen inte kommer att förskjutas på senare.
    3. Vid denna punkt, fokusera interferometern imaging arm och se till att provet planet och kameran är parfocal. Placera en konkav f =-45 cm objektiv vid en position 5 cm efter objektivets wide-fältet i den infallande strålgång. Detta kommer att resultera i en kollimerad stråle in öppningens tillbaka målet.
    4. Med en skärm placeras i den reflekterade arm interferometern, flytta målet i vertikal riktning för att hitta den grova fokala positionen. Syftet är i fokus när strålen träffa skärmen är parallell.
      Obs: Figur 2 visar en schematisk bild av denna process.
    5. Ta bort båda f =-45 cm lins och skärmen när grov fokusering är klar.
      Obs: Istället för att använda en negativ brännvidd, wide-fältet linsen själv kan placeras på en lös fäste och skiftade ur beam sökvägen för det här steget. Men för att uppnå den mest stabila Mikroskop-konfigurationen, rekommenderas det att hålla wide-fältet linsen i en fast position.
    6. Lägga till en andra f = 50 cm linne linsen att fokusera det spridda ljuset och att collimate det reflekterade ljuset på sensorn av en CMOS kamera. Se till att linsen är placerat 50 cm från tillbaka fokalplanet målet så att åter collimate referensstråle och fokusera det spridda ljuset.
    7. Plats CMOS chip 50 cm från f = 50 cm lins och placera strålen direkt på mitten av chipet.
      Obs: Följande parametrar används vanligtvis för avbildning. Uteffekten från lasern (våglängd 445 nm) är satt till 100 mW. Pinhole och beam splitter dämpa genomlysning så att effektiva strömmen in målet är ca 9 mW. Beam diameter vid provposition uppgår till 6 µm. Med det imaging objektivet som används är effektiv förstoringen av systemet ca 300 x. Storleken på bilden på CMOS-chip är inställd på 128 × 128 pixlar inom det belysta området, vilket resulterar i ett synfält på ca 5 × 5 µm2. Figur 3 visar en schematisk bild av mikroskopet färdigmonterad iSCAT.

Figure 2
Figur 2: grov fokusering av mikroskopet iSCAT. Schematiskt visar ordningen av optiken för att sätta systemet i fokus. AR-belagda baksidan av stråldelare (70/30 BS) markeras i rött. Viktigt avstånd finns i grönt. Brännvidderna (f) av de linser som används betecknas. Komponenter i den blå streckad rutan läggs till i steg 1.2.6 - 1.2.7. Konkav lins (används för att åter collimate konvergerande iSCAT balken) och skärmen tas bort senare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: iSCAT Mikroskop. Schematiskt visar mikroskopet helt monterade iSCAT. AR-belagda baksidan av stråldelare (70/30 BS) markeras i rött. Viktigt avstånd finns i grönt. Brännvidderna (f) av de linser som används betecknas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Ställa in ytterligare tänkbar kanaler.
    Obs: Detta avsnitt lägger till en annan tänkbar väg mikroskopet som möjliggör observation av ett stort område kring iSCAT laser via ljusa fält mikroskopi och övervaka cellviabilitet via fluorescensmikroskopi.
    1. Par utdata från en LED-ljuskälla (cirka 500 nm < λ < 580 nm) in i en lång arbeta avstånd 20 X / 0.4 NA mål och installera mekaniska komponenter ovan provkammaren som möjliggör fokusering och laterala positionering av LED utdata på den prov.
      1. Se till att lysdioden produktion spektrum täcker excitation av cell death marker (propidium jodid (PI)) och stör inte dess fluorescens (λ > 600 nm). Använda optiska filter vid behov.
    2. Flytta övre målet sidled så att den övre (wide-field) och lägre (iSCAT) mål är collinear. Detta avgörs genom att placera en skärm under den lägre mål och maximera intensiteten av överförda LED-lampan på skärmen. Placera en λ = 550 nm kort-pass dichroic spegel (SPDM) att dela den överförda LED ljus från iSCAT laser sökvägen.
    3. Dela denna balk i två kanaler med en 8% reflective/92% transmissiv stråldelare (BS). 92% sökvägen är kanalen fluorescens och 8% sökvägen används för ljusa-området imaging.
    4. Bild ljusa fält kanalen på en CMOS kamera använder ett f = 5 cm akromatisk doublet objektiv.
    5. Bild fluorescens kanal på en separat CMOS-kamera med ett f = 5 cm akromatisk doublet lins och en λ = 600 nm lång-pass filter för att blockera excitation ljuset. Figur 4a visar en schematisk bild av mikroskopet färdigmonterad inklusive alla tänkbar kanaler.

Figure 4
Figur 4: iSCAT mikroskopi av proteiner som utsöndras av enstaka celler. (a) Schematisk av mikroskopet beskrivs i protokollet. Se avsnitt 1 för mer information. Förkortningar: LED, lysdioder; SPF, kort-pass filter. OBJ, mål; SPDM, kort-pass dichroic spegel; BS, stråldelare; LPF, lång-passera filter; BF, ljusa-fält; fluor, fluorescens; C1-C3, kamera 1-3. (b) ljus-fältet bild av en enda Laz388 cell ca 4 µm från iSCAT synfältet (skildras av en vit kvadrat). Bild tagen av kamera C3, skalstapeln: 10 µm. (c) fluorescens bild i samma region visas i (b) med positionen för cellen markeras av en vit cirkel. Avsaknad av fluorescens indikerar att cellen är livskraftig. Bild tagen av kamera C2, skalstapeln: 10 µm. (d) Raw iSCAT kamera bild korten med 80 µs exponeringstid. Bild tagen av kamera C1. (e) iSCAT bild i samma region efter spatiotemporal bakgrund subtraktion som beskrivs i diskussionsavsnittet. Bilden var integrerad över 1000 sekventiell raw ramar (d) med en sista bildruta tid av 400 ms och avslöjar ytfinheten av täckglaset. (f) motsvarande differential iSCAT bild som visar händelsen bindande för 2 proteiner på täckglaset. Bilden byggdes genom att subtrahera två på varandra följande filtrerade bilder (e). Skala barer i d, e, och f: 1 µm. Denna siffra har anpassats från McDonald, M.P. o.a. 16. copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Ställa in dator och programvara.
    1. Alla kameror genom att ansluta till en dator. Installera respektive drivrutinspaket och få skrivbehörighet programvara för deras kontroll.
      Observera: Lämplig maskinvara krävs för höghastighetståg förvärv. På ett minimum rekommenderas en multi-core processor, 16 GB RAM, en ram gripet kort och en solid-state skiva för lagring av data.
    2. Observera iSCAT bilden på CMOS kameran och se till att det är i fokus genom att hitta en kvarvarande damm eller smuts partikel på täckglaset. Kontrollera att partikelns bild är ett cirkulärt symmetrisk punkt sprida funktion (PSF).
      Obs: Den främsta orsaken till en icke-cirkulärt symmetriska polyesterstapelfibrer är att laserstrålen inte kommer in målet rakt men i en liten vinkel med avseende på den optiska axeln. Detta korrigeras genom att justera vinkel och position för den infallande strålen med 45° koppling spegeln.
    3. Jämföra kamerabilder av ljusa-fältet och fluorescens kanalerna. Se till att båda är i fokus och visa samma område. Kontrollera att placera av iSCAT laser är ungefär i mitten av bilden och ta del av dess placerar för senare referens. Se figur 4b – 4f för typiska Kamerabilder.
      Obs: Använd en cell provet eller fluorescerande pärlor för att hitta fokus för de två kanalerna. Ta tillfälligt bort den fluorescens lång-pass-filtret för att justera systemet. Fokus för konventionella avbildning av cellerna måste vara något högre än iSCAT fokalplanet. För att kompensera för detta utan att flytta målet, tränga undan kamerorna från sina positioner i fokus för de två respektive f = 5 cm objektiv.
    4. Ange parametrar för nödvändiga kamera. Använd en fast bildfrekvens och inaktivera programvara vinst och korrigering verktyg.
      Obs: Följande parametrar används: iSCAT kameran är inställd på 5000 bilder per sekund (fps) med en exponeringstid på 80 µs. Som nämnts ovan, är bildstorleken 128 × 128 pixlar. Både ljusa fält och fluorescens kameror fungerar på fullformat storlek (1280 × 1024 pixlar). Bright-området imaging utförs med en 20 ms exponeringstid. Fluorescens kameran är inställd på 750 ms exponeringstid och 5 bildrutor är samlat för att bilda en sista bild. Bright-området och fluorescens bilder förvärvas vid fasta 20 s tidsintervall.

2. beredning av experimentet

  1. Förbered det Lagerföra mikroskopi mediet.
    1. Tillsätt 25 mL HEPES buffertlösning (1 mol/L) till 975 mL RPMI 1640 medium att få en slutlig 1 L 25 mmol/L HEPES lösning. Alternativt använda en buffert medium med HEPES som redan ingår.
      Obs: HEPES används för att upprätthålla pH av mediet under en mätning i den omgivande miljön (t.ex. utanför en inkubator och utan konstant CO2 tillförsel).
    2. Tag en alikvot av den lösning som krävs för ett experiment och låt det varma upp till rumstemperatur. 2 mL medium är tillräckligt. Håll återstående stamlösning vid 4 ° C.
  2. Förbereda den Mikroskop kyvetten.
    Obs: Följande steg beskriver förfarandet för en specialbyggd provhållare, bestående av en aluminium bottenplatta och en akryl kyvetten maträtt som både fixar täckglaset och par det att piezoelektriska 3D lägesställaren. Kommersiellt tillgängliga sterila kultur rätter med glas botten kan också användas.
    Obs: Figur 5 visar fotografier av specialbyggda provhållaren.
    1. Ta ett nytt mikroskopi täckglas och skölj det med avjoniserat vatten (DI-vatten) och etanol. Med luftbläster i bilden med kväve eller tryckluft.
    2. Ren täckglaset i en syre plasma atmosfär (0.3 mbar gastryck) i 10 min på 500 W RF power. Detta tar bort alla organiska föroreningar från ytan.
    3. Ren akryl kyvetten skålen genom nedsänkning i 0,2 mol/L NaOH lösning för ca 10 min. Skölj med DI-vatten.
    4. Montera provhållaren och täck den med en plast petriskål tills det behövs i experimentet.

Figure 5
Figur 5: specialbyggda provhållaren. (a) prova innehavaren komponenter: (1) akryl kyvetten maträtt; (2) aluminium bottenplatta; (3) håller skruvar; (4) silikon O-ring; (5) täckglas. (b) färdigmonterade provhållaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Förbereda mikroskopet.
    1. Aktivera iSCAT belysning laser, ljusa-fältet/fluorescens belysning LED, kameror och förvärv/datorprogram. Blockera laserstrålen en ståndpunkt innan målet.
    2. Se till att 100 X / 1,46 NA mål är rena. Om inte, Använd lins rengöring våtservetter och etanol för att rengöra syftet enligt tillverkarens riktlinjer.
    3. Applicera en droppe nedsänkning olja på mikroskopet målet.
    4. Ta provhållaren (monteras i avsnitt 2.2) och noggrant montera den på piezo scenen av mikroskopet iSCAT så att det provet täckglaset är centrerad på mikroskopet målet. Vara uppmärksam och försiktig så att inte skada objektivet. Fäst enheten för piezoelektriska lägesställaren med tumskruvar samtidigt som tillverkaren angett maximalt vridmoment inte överskrids.
    5. Tillsätt 1 mL lager mikroskopi medium (förberedd i avsnitt 2.1.) i kyvetten.
    6. Lägg till 2 droppar av propidium jodid fläcken till medium som en cell death markör16,22.
    7. Avblockera laser och sätta systemet i fokus. Kontrollera först att målet är placerad på rätt avstånd från täckglaset genom att upprepa steg 1.2.3. – 1.2.5. (Figur 2). Sedan finjustera fokus med z-axeln av piezo scenen.
    8. Bekräfta att alla inställningar för ljuskällorna, kameror och programvaran är korrekt. Detta inkluderar parametrar såsom lasereffekt, LED intensitet, kamera bildhastigheter, kameran exponeringstider eller programvara spara sökvägar.
      Obs: Spara videoklipp med hög bildfrekvens kan producera stora filstorlekar. Säkerställa tillräckligt ledigt utrymme på datorn.
    9. Blockera laserstrålen igen. Mikroskopet är nu redo för ett experiment.
  2. Förbereda cellerna.
    Obs: Laz388 celler20 odlas i RPMI 1640 medium kompletteras med 10% fetalt kalvserum (FCS), aminosyror, pyruvat och antibiotika. Cellerna inkuberas vid 37 ° C och 5% CO2 och split och försedda med färska medium varje 2-3 dagar23.
    1. Ta cell kultur kolven ur ruvmaskinen och aspirera medium innehållande cirka 1 x 106 celler. För att bestämma den korrekta volymen, kvantifiera koncentration av cellkulturen genom användning av en hemocytometer.
    2. Blanda den cell lösningen med 10 mL RPMI 1640 medium vid rumstemperatur och centrifugera provet vid 300 x g i 7 min.
    3. Försiktigt extrahera och kasta bort supernatanten samtidigt att pelleten koncentrerad celler förblir opåverkade.
    4. Upprepa steg 2.4.2. – 2.4.3. med koncentrerad pelleten av celler.
    5. Slamma upp cellerna i 0,5 mL lager mikroskopi medium (förberedd i avsnitt 2.1.) och direkt använda dem i ett experiment.

3. iSCAT mikroskopi av utsöndrar celler

  1. Kontrollera att laserstrålen är blockerade för att förhindra att celler utsätts direkt till iSCAT laserljuset.
  2. Injicera det provet kyvetten cellerna.
    1. Injicera det provet kyvetten ca 3 µL av cell provet (beredd i avsnitt 2.4) tyngdpunkt. Försiktigt tryck pipettspetsen till täckglaset och injicera långsamt cell lösningen. Att cellerna att bosätta sig på täckglaset.
      Obs: Använd liten volym pipettspetsar (10 µL) eller långa, flexibla gel-lastning tips.
    2. Säkerställa att tätheten av celler understiger cirka 1 cell per 500 µm² så att enskild cell mätningar inte påverkas av flera celler i området kring iSCAT laser.
    3. Om antalet celler är för låg, upprepa steg 3.2.1. tills det finns tillräckligt många.
    4. Om täckningen av celler är alltför tät, använda en injektion av ungefärligt 20 µL av ytterligare mikroskopi medium för att skingra cellerna över täckglaset.
  3. Använda piezo lägesställaren, flytta provet sidled för att placera en cell nära (ca 10 µm) till iSCAT synfältet. Se till att cellen inte går iSCAT synfältet som direkt exponering för 445 nm laserljuset kan vara skadligt för cellen.
  4. Använd ljusa-området och fluorescens bilder att lokalisera och kontrollera cellernas livskraft25.
    Obs: En livskraftig cell har en rund form i bildens ljusa fält och är inte fluorescerande, medan celldöd indikeras av stark fluorescens signaler som härrör från förekomsten av propidium jodid inuti cellen22.
  5. Avblockera iSCAT laserstrålen och säkerställa att täckglas yta är fortfarande i fokus. Omslut tabellen isolering för att minimera drift och akustisk koppling från den omgivande miljön.
    Obs: Den senare är fulländad med tunga optiska gardiner eller akryl paneler kring optiska tabellen.
  6. Starta mätningen genom att förvärva iSCAT, ljusa-fältet och fluorescens rörliga bilder. Automatisera och styra processen genom programvara för att maximera experimentella effektivitet. Regelbundet kontrollera cellen livskraft och fokus i systemet.
    Obs: Beroende på laser intensitet, optiska komponenter, och exponeringen tidsinställningar av kameran, iSCAT laser kan störa kamerans fluorescens. Om detta beteende observeras, överväga kvarsittande iSCAT laser tillfälligt under fluorescens bild förvärv.

4. dataanalys

Obs: Experimentella data är till sin natur bullriga och iSCAT bilder är inte annorlunda. I området i närheten finns det flera bullerkällor i en typisk iSCAT mätning, inklusive wavefront snedvridningar i infallande ljus källa, ytjämnhet av täckglas och kameran buller. Avsnittet nedan presenterar några sätt som dessa bullerkällor avhjälps via efterbearbetning. Dessutom laterala mekanisk instabilitet av installationen leda till bullriga data och måste ta itu med detta, som beskrivs i diskussionsavsnittet nedan. De beskrivna analyserna utförs med anpassade MATLAB skript.

  1. Minimera kamera buller genom filtrering rådata med tvådimensionell Fourier filter som utesluter hög spatial frekvenser. Storleken på filtret behöver justeras för att passa den specifika experimentella konfigurationen (mestadels bestäms av systemets numerisk bländare).
    Obs: Funktioner i bilden med högre spatial frekvenser än det optiska systemet härstammar från yttre källor (såsom kamera avläsning buller) och kan försummas.
  2. Konvertera bilder från raw-kamera räknas till iSCAT kontrast.
    Obs: Signalen identifieras av kameran är Equation 13 . iSCAT kontrast definieras som Equation 14 där Equation 15 är intensiteten i referens ljuset, i detta fall delen reflekteras av täckglaset, och Equation 16 är inblandning mellan Equation 15 och spridda intensiteten (Equation 17).
    1. Separera signalen till Equation 16 och Equation 15 av computing temporal medelvärdet av särskilda ramar där partiklarna av intresse inte finns. Den resulterande bilden ger referenssignal Equation 15 .
      Obs: Alternativt en aktiv bakgrund subtraktion steg kan utföras som beskrivs i diskussionen nedan.
    2. Beräkna kontrast enligt Equation 18 12,14,16.
  3. Skapa en rullande differentiell avbildning genom att subtrahera varje sammanhängande ram från dess efterträdare.
    Obs: Resterande signaler från ytfinheten av täckglaset och wavefront snedvridningar avlägsnas effektivt i detta steg som de är konstant inom bildrutor. Rullande differential tar bort dessa kvarvarande signaler, lämnar bara protein bindningarna som uppstår från en ram till nästa. Denna dynamiska bakgrunden subtraktion är fördelaktigt eftersom det inte är känsliga för långsiktiga prov drivor.
  4. Applicera en peak-söker algoritm för att upptäcka och indexera enstaka partiklar för varje bildruta och fastställa deras särskilda kontrast och ställning.
  5. Använda informationen i steg 4.4 Skapa histogram av protein bindande händelser och relatera deras extraherade kontraster till protein massa genom en kalibreringskurva som sammanställts från kända protein prov14,24.

Representative Results

En schematisk bild av ett iSCAT Mikroskop visas i figur 4a. Representativa ljusa fält, fluorescens och rå iSCAT bilder visas i figur 4b, 4 coch 4 d, respektive16. Figur 4e och 4f visar resultaten av bakgrundsborttagning och differentiell efterbearbetning; två adsorberade proteiner är synlig som diffraktion begränsad ställen i figur 4f. Figur 6 visar ett histogram över de identifierade proteinerna under loppet av 125 s. Dessa data erhölls genom att tillämpa en peak-söker algoritm på de tagna bilderna att räkna de bindande händelserna och katalogisera deras kontrast16. Totalt 503 proteiner upptäcktes.

Nästa, utsöndras arter identifieras genom jämförelse med referensmätningar som utförs på renat protein lösningar eller via ytterligare mätningar med functionalized glas ytor14,16. ISCAT data, således visualisera direkt cellulära sekretion dynamics på en subsecond skala16. Som ett exempel, har vi tidigare funnit att IgG-antikroppar är en stor del av den Laz388 secretome och släpps ut från cellen med en hastighet av ca. 100 molekyler per andra16. Dessutom utsöndras andra partiklar som spänner över en rad 100 kDa - 1000 kDa i celler16. Den beskrivna metoden kan finnas ytterligare anställd exempelvis att undersöka sekret kring en cell16rumslig koncentration gradient eller att fastställa tidsmässiga dynamiken i Lys16.

Figure 6
Figur 6: kvantifiering av utsöndrade proteiner av en enda cell Laz388. Histogrammet visar identifierade proteiner under en tidsperiod av 125 s. kontrast värden ackumuleras i 1 x 10-4 kontrast lagerplatser (blå staplar). Totalt 503 enskilda proteiner räknades under denna mätning. Experimentet upprepades 10 gånger med liknande resultat. Denna siffra har anpassats från McDonald, M.P. o.a. 16. copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

En av de viktigaste aspekterna att erhålla användbara iSCAT data är förmågan att hitta rätt fokus position på täckglas ytan, och dessutom att hålla denna position för långa tidsperioder. Underlåta att göra detta kommer att resultera i breddad vävda, svag iSCAT signaler och drift-associerade artefakter i dynamics analyser. Det visar sig att hitta fokalplanet på en ren, bare täckglas yta inte är en lätt uppgift som surface-funktioner inte visas mot stora referens beam bakgrund (se figur 4 d).

RAW iSCAT bilder är ofta skyms av bakgrunden signaler som uppstår från wavefront föroreningar i exciteringskälla och kan hindra en förmåga att hitta den rätta bildplanen. Aktiva wavefront subtraktion är ett användbart sätt att kringgå problemet och därefter övervaka iSCAT fokus under en mätning16. Ett sätt att åstadkomma detta är genom rumsliga prov modulering. I korthet gäller en funktionsgenerator en 50 Hz fyrkantsvåg hamnen extern kontroll av piezo scenen, vilket resulterar i en rumslig prov modulering i tillämpad frekvens (290 nm amplitud). Synkron kamera förvärv utlöses från samma källa, och, när de kombineras genom inlåsning principer, resultera i en wavefront-kompenseras bild14,16. Den resulterande bilden visar vanligtvis ytfinheten av täckglaset (figur 4e). Små funktioner kvar på glaset efter rengöring kan användas för att föra mikroskopet i fokus. Parametrar som används för detta aktiva bakgrund subtraktion steg kan ändras enligt den bildhastighet, exponeringstid eller hårdvara.

Som nämnts ovan, rekommenderas användning av en hög kvalitet stråldelare i iSCAT inställningar (steg 1.2.1.), som imaging artefakter som spökbilder eller störningar som följd av tunna plana beam splitters kommer att påverka bilden och stör mätningen. Figur 7 visar en jämförelse mellan en hög kvalitet och låg kvalitet stråldelare. Både rå iSCAT bilder visar samma område på den täckglas som innehåller vissa kvarvarande partiklar. Samma iSCAT setup användes för att fånga båda bilderna, bara stråldelare utbyttes. Figur 7a visar bilden bildas på kameran med hjälp av en tjockare (5 mm), AR-belagda och inklämd stråldelare. Tack vare den inklämd designen, den reflekterade strålen från bakre ytan av stråldelare är anti parallell till reflektion som härrör från den främre ytan och går inte in i målet. Inga störningar artefakter uppstår. Figur 7b visar samma synfält på prov men denna gång en tunnare (1 mm) planar stråldelare används. Två reflektioner från främre och bakre ytor av stråldelare är parallella och sprids till kameran. Störningar artefakter syns tydligt.

Figure 7
Figur 7: jämförelse av iSCAT bilder produceras med hög - och låg-kvalitet beam splitters. (a) resulterande raw iSCAT bild av användning av en 5 mm tjock, AR-belagda och inklämd stråldelare. (b) resulterande raw iSCAT bild av samma område av användning av en 1 mm tjock planar stråldelare. Båda beam splitters har samma uppdelning förhållande (50% reflektion, 50% transmission). Störningar artefakter som härrör från Fresnel reflektioner observeras tydligt i den bild som produceras med 1 mm tjock planar stråldelare. Skala barer: 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

I detta protokoll beskriver vi ett wide-fältet belysning system för iSCAT eftersom det är snabbt, lätt att inse och möjliggör parallella avkänning över ett stort område14. En annan vanlig metod är att använda acousto-optic avvisare (utanordnarnas) och skanna en confocal balk över de prov12,17. Detta tillvägagångssätt undviker behovet av högkvalitativ wavefronts men är mer experimentellt komplex än konventionella wide-området imaging. Dessutom begränsas hastigheten på confocal belysning av utanordnarnas. Beroende på de önskade experimentella parametrarna, kan, antingen confocal eller wide-fältet belysning system i princip utnyttjas för att upptäcka enstaka proteiner utsöndras från levande celler.

Som diskuterades i hela protokollet, är det absolut nödvändigt att minimera laterala mekaniska svängningar i provet scenen av mikroskopet. Även nanometer avvikelser i position av provet kan leda till variationer i på varandra följande kamera ramar och framkalla betydande ovidkommande brus i bilden differential. Det rekommenderas därför att använda en mekaniskt stabil Mikroskop scenen och en dämpad optiska tabell (steg 1.1.1.) och att täcka setup med optisk gardiner eller paneler under ett experiment (steg 3.5.).

Ett system för stabilisering av fokus kan också övervägas för långtidsmätningar. I detta synsätt, är en andra laser införlivas i mikroskopet i en Totalreflexion (TIR) arrangemang och därefter avbildas på en kvadrant fotodiod. Förändringar i systemets fokus översätta till laterala förskjutningar av TIR-laser plats på quadrant dioden, som sedan kan användas i en aktiv feedbackloop för att styra z-axeln av piezo etapp26. Vertikala avdrift långtidseffekter elimineras därmed.

Flera ändringar och tillägg kan tillämpas på presenterade tekniken adress experimentella behov. Till exempel kommersiella Mikroskop scenen inkubatorer är tillgängliga som lätt skulle kunna införlivas i mikroskopet iSCAT för långsiktig avbildning av celler. Andra tekniker kan också genomföras för att komplettera iSCAT imaging, såsom confocal eller TIR fluorescens microscopies17. För att anpassa i systemet under studien, iSCAT sekretion mätningar kan utföras i andra cell medier såsom DMEM eller DPBS, dock bör den pH indikatorn fenolrött undvikas eftersom det kan störa experimentet på grund av absorptionen av laserljuset. Dessutom innehåller kompletterar som fetalt kalvserum (FCS) eller mänskliga blodplättar lysate (hPL) proteiner som kan interferera med iSCAT upptäckt. Beroende på önskad känslighet av experimentet, bör dessa tillskott uteslutas från mikroskopi medlet.

iSCAT är beroende av en analyts förmåga att scatter ljus – en egenskap som är inneboende till alla proteiner — och är därför till sin natur ospecifik. Viss grad av specificitet är dock möjligt som iSCAT signaler skala linjärt med protein massa14,27,28. Detta möjliggör kalibrering av ett iSCAT system med standard protein prover, såsom bovint serumalbumin (BSA) och fibrinogen14,27,28. I själva verket mycket nyligen, unga o.a. 28 har utökat för Piliarik & Sandoghdar14 arbete och har visat att iSCAT kan användas för att bestämma molekylvikten för proteiner så liten som streptividin (53 kDa) med en massa upplösning på 19 kDa och en noggrannhet på cirka 5 kDa. Flera konventionella metoder kan ytterligare komplettera iSCAT genom att ge en extra nivå av specificitet. Som ett exempel, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) eller andra ytmodifieringar, begränsa protein bindande händelser så att endast målproteinet är upptäckta16.

I detta protokoll beskrev vi hur iSCAT mikroskopi kan användas för att undersöka cellulära sekret på den enda proteinnivå med subsecond temporal upplösning16. Tekniken är generell och kan genomföras på någon kommersiell eller hembyggda Mikroskop. I motsats till singel-molekyl fluorescens metoder, metoden lider inte av fotoblekning eller blinkande effekter men det fortfarande uppnår single-protein känslighet. Dessa funktioner gör iSCAT ett kraftfullt verktyg i fältet biosensing och mikroskopi. Framtida tillämpningar kommer att fokusera på att belysa komplexa cellulära interaktioner såsom immunologiska reaktionen på ett stimulus eller cellulär kommunikation.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av den Max Planck-sällskapet, en Alexander-von-Humboldt-professuren och den Deutsche Forschungsgemeinschafts (CRC 1181). Vi tackar Stefanie Schaffer på Universitätsklinikum Erlangen för att tillhandahålla Laz388 celler och användbar diskussioner. Vi tackar Simone Ihloff och Maksim Schwab på MPL för teknisk support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Item/Device
100x / 1.46 NA objective Zeiss 420792-9800-000 alpha Plan Apochromat oil immersion
20x / 0.4 NA objective Leica 566049 N Plan
Piezo Stage PI P-517k020 3-axis stage with 100x100x10µm range
Diode laser (445 nm) Lasertack PD-01236
Optics/Optomechanics Thorlabs/Newport - lenses, mirrors, posts, mounts
Pinhole Thorlabs P30H
LED light source Thorlabs MCWHL5
Shortpass filter (580 nm) Omega Optical 580SP to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
Longpass filter (500 nm) Thorlabs FEL0500 to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
70R/30T beam splitter Newport 20Q20BS.1
Economy beam splitter Thorlabs EBS1 used for the comparison of fringe effects
Wedged plate beam splitter Thorlabs BSW26 used for the comparison of fringe effects
Shortpass dichroic mirror (550 nm) Edmund Optics 66249
8R/92T beam splitter Thorlabs BP108
CMOS camera Photonfocus MV1-D1024E-160-CL for iSCAT aquisition
CMOS cameras Mightex SCE-B013-U for bright field / fluorescence aquisition
Longpass filter (600 nm) Thorlabs FELH0600
Computer Fujitsu Siemens  - Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD
Acquisition Software LabVIEW - LabVIEW 2016 Suite
Analysis Software Matlab - Matlab 2014 Suite
Plasma Cleaner Diener Diener pico
Incubator Binder Model CB
Centrifuge Eppendorf 5810R
Reagent/Material
RPMI 1640 medium Gibco 11835063 without phenol red
HEPES Buffer Solution (1M) Sigma Aldrich 59205C
Cover slides Marienfeld 107052
Glass bottom culture dishes ibidi 81158
Fluorescent Microspheres Invitrogen F8821 used for calibration
Immersol immersion oil Zeiss 444960
Propidium iodide stain Invitrogen R37108
Small pipette tips Eppendorf 30075005
Flexible pipette tips Eppendorf 5242956003
Ethanol, 99.8% Fisher Scientific E/0650DF/15
Sodium hydroxide, pellets Sigma Aldrich 221465 for preparing 0.2M NaOH solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hathout, Y. Approaches to the study of the cell secretome. Expert Review of Proteomics. 4 (2), 239-248 (2007).
  2. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405 (6788), 837-846 (2000).
  3. Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. Journal of Proteomics. 73 (12), 2291-2305 (2010).
  4. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).
  5. MacBeath, G. Protein microarrays and proteomics. Nature Genetics. 32, 526-532 (2002).
  6. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8 (4), 247-258 (2008).
  7. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  8. Borisov, S. M., Wolfbeis, O. S. Optical biosensors. Chemical Reviews. 108 (2), 423-461 (2008).
  9. Dantham, V. R., Holler, S., Barbre, C., Keng, D., Kolchenko, V., Arnold, S. Label-Free Detection of Single Protein Using a Nanoplasmonic-Photonic Hybrid Microcavity. Nano Letters. 13 (7), 3347-3351 (2013).
  10. Zijlstra, P., Paulo, P. M. R., Orrit, M. Optical detection of single non-absorbing molecules using the surface plasmon resonance of a gold nanorod. Nature Nanotechnology. 7 (6), 379-382 (2012).
  11. Rickgauer, J. P., Grigorieff, N., Denk, W. Single-protein detection in crowded molecular environments in cryo-EM images. eLife. 6, e25648 (2017).
  12. Lindfors, K., Kalkbrenner, T., Stoller, P., Sandoghdar, V. Detection and Spectroscopy of Gold Nanoparticles Using Supercontinuum White Light Confocal Microscopy. Physical Review Letters. 93 (3), 037401 (2004).
  13. Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface. Optics Express. 14 (1), 405 (2006).
  14. Piliarik, M., Sandoghdar, V. Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites. Nature Communications. 5, 4495 (2014).
  15. Roux, K. H. Immunoglobulin Structure and Function as Revealed by Electron Microscopy. International Archives of Allergy and Immunology. 120 (2), 85-99 (1999).
  16. McDonald, M. P., et al. Visualizing Single-Cell Secretion Dynamics with Single-Protein Sensitivity. Nano Letters. 18 (1), 513-519 (2018).
  17. Kukura, P., Ewers, H., Müller, C., Renn, A., Helenius, A., Sandoghdar, V. High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus. Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).
  18. Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
  19. Spindler, S., et al. Visualization of lipids and proteins at high spatial and temporal resolution via interferometric scattering (iSCAT) microscopy. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (27), 274002 (2016).
  20. Lazarus, H., et al. Characterization of a unique cell line (LAZ 221) from human acute lymphocytic ("null" cell) leukemia. Cancer Research. 38 (5), 1362-1367 (1978).
  21. Mackensen, A., et al. Evidence for in situ amplification of cytotoxic T-lymphocytes with antitumor activity in a human regressive melanoma. Cancer Research. 53 (15), 3569-3573 (1993).
  22. Crowley, L. C., Scott, A. P., Marfell, B. J., Boughaba, J. A., Chojnowski, G., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), 647-651 (2016).
  23. Freshney, R. I. Primary Culture. Culture of Animal Cells. , (2005).
  24. Dahmardeh, M., et al. Unpublished data. , (2018).
  25. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. American Journal of Pathology. 146 (1), 3-15 (1995).
  26. Bellve, K., Standley, C., Lifshitz, L., Fogarty, K. Design and Implementation of 3D Focus Stabilization for Fluorescence Microscopy. Biophysical Journal. 106 (2), 606a (2014).
  27. Liebel, M., Hugall, J. T., Van Hulst, N. F. Ultrasensitive Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins. Nano Letters. 17 (2), 1277-1281 (2017).
  28. Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).

Tags

Engineering fråga 141 iSCAT etikett-fri single-protein cellulära sekretion imaging spridning dynamik realtid
Etikett-fri Imaging av enstaka proteiner utsöndras från levande celler via iSCAT mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gemeinhardt, A., McDonald, M. P.,… More

Gemeinhardt, A., McDonald, M. P., König, K., Aigner, M., Mackensen, A., Sandoghdar, V. Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy. J. Vis. Exp. (141), e58486, doi:10.3791/58486 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter