Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Etikett-fri Imaging av enkelt proteiner skilles ut fra levende celler via iSCAT mikroskopi

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58486
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4, 4, 1,3
1Max Planck Institute for the Science of Light (MPL), 2Area of Scientific Learning, Milligan College, 3Department of Physics, Friedrich Alexander University Erlangen-Nuremberg, 4Department of Internal Medicine 5, Hematology and Oncology, Friedrich Alexander University Erlangen-Nuremberg (FAU), University Hospital Erlangen

Summary

Vi presenterer en protokoll for sanntids optisk påvisning av ett umerket proteiner som de utskilles fra levende celler. Dette er basert på interferometric spredning (iSCAT) mikroskopi, som kan brukes til en rekke ulike biologiske systemer og konfigurasjoner.

Abstract

Viser vi interferometric spredning (iSCAT) mikroskopi, en metode stand til å oppdage enkelt umerkede proteiner skilles ut fra individuelle levende celler i sanntid. I denne protokollen dekker vi de grunnleggende trinnene for å realisere en iSCAT mikroskop og komplettere den med flere tenkelig kanaler å overvåke levedyktigheten til en celle under studien. Etter bruker vi metoden for sanntids deteksjon av enkelt proteiner som de utskilles fra en levende celle som vi viser med en udødeliggjort B-celle linje (Laz388). Nødvendige skritt om utarbeidelse av mikroskopet og prøve og analyse av de innspilte dataene diskuteres. Video protokollen viser at iSCAT mikroskopi tilbyr en enkel metode for å studere sekresjon på enkelt-molekylet nivå.

Introduction

Utskilles proteiner spiller en betydelig rolle i ulike fysiologiske prosesser1. Derfor er de rutinemessig studerte som en kollektiv ensemble (Proteomikk) eller enkeltenheter2,3. Proteomikk undersøker tradisjonelt hele settet med proteiner i et bestemt biologisk system som f.eks enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA), flowcytometri eller massespektrometri4,5, 6. Enkelt proteiner, derimot, oppdages vanligvis bruker en rekke teknikker som er basert på fluorescens7,8, plasmonics9,10eller kryogene elektron11 microscopies. Alle disse teknikkene bruker komplekse instrumenter, merking eller begge og ofte mangler dynamics informasjon som de bare leverer langsiktig informasjon om systemet under studien.

Her bruker vi iSCAT12,13 mikroskopi følelse personlige sekretoriske proteiner med sub-sekunders midlertidig løsning14. Viktigere, oppdager teknikken svake spredte signalet iboende hver protein12,14. Mengden lys som en liten bioparticle sprer skalerer med sin polarizability. Forutsatt at formen på et protein kan tilnærmes ved en effektiv spredning sfære14,15,16, og at ulike proteiner har ligner refractive indekser, målt signalet kan være direkte koblet til molekylvekt (MW) av protein. Empirisk kalibrering av iSCAT kontrast mot molekylær vekt av referanse målinger gjør det mulig å skille proteiner av forskjellige størrelser. iSCAT eksperimenter kan lett bli supplert med fluorescens mikroskopi17,18, immunosorbent reagenser, så vel som fluorescerende eller spredning etiketter å tillate en bestemt oppdagelsen av noe protein rundt14 , 17 , 19.

I prinsippet iSCAT fungerer ved å forsterke et protein, svak lys spredt via interferometric blander med en sekundær referanse bølge. Oppdaget intensiteten (Equation 1) i en iSCAT mikroskopet er beskrevet av

Equation 2

hvor Equation 3 er hendelsen intensiteten, Equation 4 er en koeffisient for bidraget av referanse wave, Equation 5 betyr spredning styrke nano-objektet under studien, og Equation 6 er faseskift mellom den spredte og referanse bølger14. Enten overført eller tilbake-reflekterte hendelsen lyset er vanligvis brukt som en referanse bølge, hvor i hvert tilfelle Equation 7 står for transmissivity eller Reflektivitet for eksempel kammeret, henholdsvis. Begrepet Equation 8 er proporsjonal med protein's spredning tvers delen og kan bli neglisjert forhold til korset begrepet. Dermed, sette Equation 9 for komplett destruktiv interferens, oppdaget lyset er gitt av Equation 10 der Equation 11 er referanse intensiteten og Equation 12 er forstyrrelser intensiteten.

iSCAT mikroskopi tilbyr en utmerket metode for å studere biologiske prosesser på enkelt-molekylet nivå. Som et eksempel, undersøker vi Laz388 celler – en Epstein - Barr virus (EBV) forvandlet B-lymfocytt cellen linje20,21 , som de skiller proteiner som IgG-antistoffer16. Men metoden er generelt og kan brukes til en rekke andre biologiske systemer. iSCAT er iboende uspesifikke og kan oppdage noen protein eller hydrogenion eller det kan utvides med vanlige overflate functionalization metoder for spesifikke eller multiplex gjenkjenning. Dens enkelhet og muligheten til å kombineres med andre optisk teknikker, for eksempel fluorescens mikroskopi, gjør iSCAT til et verdifullt supplerende verktøy i cell biology.

Protocol

FORSIKTIG: Les alle relevante sikkerhetsdatablader (MSDS) før du bruker noen kjemikalier, observere alle nødvendige sikkerhets praksis og bruk personlig verneutstyr (laser vernebriller, vernebriller, hansker, laboratoriet strøk) etter behov.

1. bygge iSCAT mikroskop16,18

Merk: ISCAT mikroskopet består vanligvis av en modifisert invertert mikroskop oppsett. I korte trekk en laser er fokusert på tilbake fokalplanet av en høy numeriske blenderåpning (NA) mål og en tenkelig linse til å fokusere partikkels back-spredt lys på en kameraet chip. Generelt kan denne wide-field-mikroskopet bygget fra bunnen eller basert på en eksisterende invertert mikroskop. Denne protokollen dekker den viktige ting å realisere stilling, mens i brukte maskinvaren er mulig. En mer detaljert beskrivelse av en iSCAT-mikroskopet kan finnes i arbeidet med Arroyo et al. 18.

FORSIKTIG: En iSCAT mikroskop innebærer en intern til klasse IV laser lyskilde. Passende vernebriller er nødvendig når samle og sette mikroskop optikk. Da mikroskop, kontroller at laser strålen banen fortsatt rett og ikke forandret retning som nye optiske komponenter er lagt.

  1. Definere belysning banen til mikroskopet.
    1. Bruke en dempet optisk tabell og en rigid metall blokk, bygge et mikroskop utvalg scenen18 som inkorporerer en høy numeriske blenderåpning (NA) mål (100 X / 1.46 NA) og en oversettelse enhet som tillater lateral eksempel oversettelse samt endring i fokus posisjon for målsettingen.
      Merk: Bruk av en iSCAT mikroskopet på grensen til å oppdage enkelt proteiner er svært utsatt for ytre vibrasjoner. En centrosymmetric piezo scene som støtter prøven fra alle sider anbefales å begrense akustisk excitations av prøven som ellers ville kompromiss fokal og lateral stabilitet. Figur 1 viser et egnet eksempel Stadium, inkludert piezo oversettelse enheten og målet. I tillegg anbefaler at massiv og stabil monterer brukes for alle optisk komponentene som ble omtalt i fremgangsmåten. Slike komponenter er lett tilgjengelig fra kommersielle optikk leverandører.
    2. Bruk en 50 cm brennvidde singlet linse (wide-field objektiv) og en 45° (vertikalt) kopling speil å fokusere lys en diode laser på bølgelengde 445 nm på tilbake fokalplanet for målsettingen. Dette skaper en collimated stråle på målsettingens frem fokus og vil bli iSCAT belysning kilde. Eventuelt filtrere laser romlig før 50 cm linsen via en 30 µm pinhole eller single-modus fiber.
    3. Bruke et slippverktøy neddyppingsolje på målet og Plasser et glass dekkglassvæske i prøven flyet av mikroskopet scenen. Dette vil resultere i en strålen som gjenspeiler ned gjennom tenkelig målet.
      Merk: Refleksjon oppstår fra luften-glass grensesnittet på den øvre overflaten av prøve-dekkglassvæske og vil tjene som grunnlag for iSCAT referanse strålen. Gjenværende skitt eller støv på overflaten av dekkglassvæske vil gi opphav til spredning punktkilder, som hjelpemiddel i riktig fokusere på tenkelig målet i neste trinn.
      FORSIKTIG: Flertallet av laserlys overfører gjennom dekkglassvæske og reiser rett opp fra målet. Plasser en ugjennomsiktig speilende diffuser (f.eks., et papir kort) over dekkglassvæske å minimere risikoen for skade fra laserlys.

Figure 1
Figur 1: iSCAT utvalg scenen. Bildet viser massiv aluminium blokken som piezo oversettelse enheten (svart) er montert og midtstilt 100 x mål. 3-akse piezo scenen gir presis plassering av eksemplet i fokalplanet for målsettingen. Grove fokusere utføres ved å rotere en gjenget rør som målet er montert (ikke avbildet). Blokken er plassert på det optiske bordet med fire stål sokler over 45° kopling speilet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Definere tenkelig banen til mikroskopet.
    1. Innføre en antireflection (AR)-belagt strålen splitter (70% refleksjon, 30% overføring) i 45° vinkel i forhold til den hendelsen strålen, og ca 10 cm etter wide-field linsen. Velg AR belegget mot laser kilden. Dette overfører hendelsen strålen, og gjenspeiler referansen og spredt bjelker i 90° vinkel av hendelsen strålen.
      Merk: AR-belagt og/eller klemt fast beam splittere anbefales som betydelige ghosting og frynser effekter kan oppstå ved strålen deling kuber eller ubestrøket planar strålen splitters. Se diskusjon for mer informasjon. Eventuelt noen uønskede reflektert strålen som oppstår fra baksiden av bjelke splitteren kan være blokkert ved bruk av en iris-membran.
    2. En tykk strålen splitter vil innføre en betydelig strålen forskyvning slik at laseren ikke kan angi målet rett lenger. Eventuelt justere laser strålen banen før strålen splitter å sikre korrekt overføring gjennom målet.
      Merk: Bjelke splitteren kan også legges før bredt feltet linsen og mikroskopet scenen er plassert (i trinn 1.1.2.), slik at strålen ikke skal fortrenges senere.
    3. På dette punktet, fokuserer tenkelig arm av interferometer og sikre at prøven flyet og kamera parfocal. Plasser en konkav f =-45 cm linsen på en posisjon 5 cm etter wide-field linsen i hendelsen strålen banen. Dette vil resultere i en collimated stråle inn tilbake blenderåpning for målsettingen.
    4. Med skjerm i den reflekterte arm av interferometer, Flytt målet i vertikal retning å finne grov fokal plasseringen. Målet er i fokus når strålen treffer skjermen er collimated.
      Merk: Figur 2 viser en skjematisk av denne prosessen.
    5. Fjerne begge f =-45 cm linsen og skjermen når grov fokus er fullført.
      Merk: I stedet for en negativ brennvidde objektivet, wide-field linsen selv kan plasseres på en bevegelig montere og flyttet ut av banen bjelke for dette trinnet. Men for å oppnå mest stabile mikroskop konfigurasjonen, anbefales det å holde linsen wide-feltet i en fast stilling.
    6. Legge til en andre f = 50 cm singlet linse å fokusere spredte lys og collimate det reflekterte lyset på sensoren i en CMOS-kamera. Kontroller at objektivet er plassert 50 cm fra tilbake fokalplanet av målet å re collimate referanse strålen og fokusere spredte lys.
    7. Sted CMOS chip 50 cm fra f = 50 cm linsen og plasser strålen direkte på midten av chip.
      Merk: Følgende parametere brukes vanligvis for bildebehandling. Utgangseffekten på laser (bølgelengde 445 nm) er satt til 100 mW. Pinhole og strålen splitter dempe lyset slik at den effektive power inn målet er ca 9 mW. Strålen diameteren på prøveposisjon utgjør 6 µm. Brukte tenkelig linsen er effektiv forstørrelsen av systemet ca 300 x. Størrelsen på bildet på CMOS chip er satt til 128 × 128 piksler i området opplyst, noe som resulterer i en synsfelt av ca 5 × 5 µm2. Figur 3 viser en skjematisk av fullt monterte iSCAT mikroskopet.

Figure 2
Figur 2: grov fokusering av iSCAT mikroskopet. Skjematisk viser ordningen av optikk å bringe systemet i fokus. Baksiden AR-belagt splitterens strålen (70/30 BS) er merket i rødt. Viktig avstander tilbys i grønt. Brennvidder (f) av linser brukes er merket. Komponenter i boksen med blå stiplet legges i trinn 1.2.6 - 1.2.7. Konkave linsen (brukes til nytt collimate konvergerende iSCAT strålen) og skjermen fjernes senere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: iSCAT mikroskop. Skjematisk viser absolutt samlet iSCAT mikroskop. Baksiden AR-belagt splitterens strålen (70/30 BS) er merket i rødt. Viktig avstander tilbys i grønt. Brennvidder (f) av linser brukes er merket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Angi flere tenkelig kanaler.
    Merk: Denne delen legger en annen tenkelig bane til mikroskopet som tillater observasjon av et stort område rundt iSCAT laser lys-feltet mikroskopi, og å overvåke celle levedyktighet via fluorescens mikroskopi.
    1. Par resultatet av en LED-lyskilde (ca 500 nm < λ < 580 nm) i en lang arbeider avstand 20 X / 0,4 NA mål, og installere mekaniske komponenter over eksempel kammeret som tillater fokus og lateral plassering av LED utdataene på den prøven.
      1. Kontroller at lampen utdata spectrum dekker eksitasjon rekke celle død markøren (propidium iodide (PI)) og ikke forstyrrer dens fluorescens (λ > 600 nm). Bruke optiske filtre hvis nødvendig.
    2. Flytte øvre målet siden slik at den øvre (wide-field) og lavere (iSCAT) mål er kollineare. Dette bestemmes ved å plassere en skjerm lavere mål og maksimere intensiteten av LED lyset på skjermen. Plasser en λ = 550 nm kort-pass dichroic speil (SPDM) å splitte overført LED lys fra iSCAT laser banen.
    3. Dele denne bjelken i to kanaler med en 8% reflective/92% overførbar strålen splitter (BS). 92% banen er fluorescens kanalen og 8% banen brukes for lyse-feltet bildebehandling.
    4. Bilde lyse-feltet kanalen på en CMOS-kamera med en f = 5 cm akromatisk doublet linsen.
    5. Bilde fluorescens kanalen på en egen CMOS-kamera med en f = 5 cm akromatisk doublet linsen og en λ = 600 nm lange pass-filteret for å blokkere eksitasjon lyset. Figur 4a viser en skjematisk av ferdigmonterte mikroskopet inkludert alle tenkelig kanaler.

Figure 4
Figur 4: iSCAT mikroskopi proteiner utskilles av enkeltceller. (a) skjematisk av mikroskopet beskrevet i protokollen. Se delen 1 for mer informasjon. Forkortelser: LED, samme; SPF, kort-pass filter; OBJ, objektive; SPDM, kort-pass dichroic speil. BS, strålen splitter; LPF, lang-pass filter; BF, lyse-feltet. fluor, fluorescens; C1-C3, kamera 1-3. (b) Bright-feltet bilde av en enkelt celle Laz388 ca 4 µm fra iSCAT synsfelt (avbildet av en hvit firkant). Bilde tatt av kameraet C3, skala bar: 10 µm. (c) fluorescens image av det samme området vises i (b) med plasseringen av cellen som er merket med en hvit sirkel. Fravær av fluorescens angir at cellen er levedyktig. Bilde tatt av kameraet C2, skala bar: 10 µm. (d) rå iSCAT kamera image bilde med 80 µs eksponeringstid. Bilde tatt av kameraet C1. (e) iSCAT bilde av samme region etter spatiotemporal bakgrunn subtraksjon som beskrevet under diskusjon. Bildet ble integrert over 1000 sekvensiell rå rammer (d) med en siste bildet av 400 ms og avslører overflateruhet av glass dekkglassvæske. (f) tilsvarende differensial iSCAT bilde som viser hendelsen bindende for 2 proteiner til dekkglassvæske. Bildet ble bygget ved å trekke to påfølgende filtrert bilder (e). Skalere barer i (d), (e), og (f): 1 µm. Dette tallet er tilpasset fra McDonald, sekten et al. 16. copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Definere maskin- og programvare.
    1. Koble alle kameraer til en datamaskin. Installer respektive driverpakker og få/skrive programvare for deres kontroll.
      Merk: Passende maskinvare er nødvendig for høyhastighets oppkjøp. Minst er en flerkjerneprosessor, 16 GB RAM, en ramme fanget kort og en SSD plate for datalagring anbefalt.
    2. Observere iSCAT bildet CMOS-kamera, og at den er i fokus ved å finne en gjenværende støv eller skitt partikkel på glass dekkglassvæske. Kontroller at partikkels bilde er et sirkulært symmetrisk punkt spredning funksjon (PSF).
      Merk: Hovedårsaken til en ikke-sirkulært symmetrisk PSF er at laserstrålen ikke inn målet rett, men på en liten vinkel med hensyn til den optiske aksen. Dette er korrigert ved å justere vinkelen og plasseringen av hendelsen strålen med 45° kopling speilet.
    3. Sammenligne kamerabildene lyse-feltet og fluorescens kanaler. Kontroller at begge er i fokus og vise det samme området. Kontroller at plasseringen av iSCAT laser er omtrent i midten av bildet og Legg merke til plasseringen for senere bruk. Se figur 4b-4f for typiske kamerabilder.
      Merk: Bruk en celle prøve eller fluorescerende perler for å finne fokus for de to kanalene. Midlertidig fjerne fluorescens lang-pass filter hvis du vil justere systemet. Fokus for konvensjonelle bildebehandling cellene må være litt høyere enn iSCAT fokalplanet. For å kompensere for dette uten å flytte målet, fortrenge kameraer fra sine posisjoner i fokus for to respektive f = 5 cm linser.
    4. Angi nødvendig kameraet parametere. Bruk en fast bildefrekvens og Deaktiver gevinst og korrigering verktøy.
      Merk: Følgende parametere brukes: iSCAT kameraet er satt til å 5000 bilder per sekund (fps) med en eksponeringstid på 80 µs. Som nevnt ovenfor, er bildestørrelsen 128 × 128 piksler. Både lyse-feltet og fluorescens kameraer opererer på fullformat størrelse (1280 × 1024 piksler). Bright-feltet imaging utføres med en 20 ms eksponeringstid. Fluorescens kameraet er satt til 750 ms eksponeringstid og 5 påfølgende rammer er akkumuleres for å danne en endelige bildet. Bright-feltet og fluorescens bilder er ervervet ved fast 20 s tidsintervaller.

2. forberedelse av eksperimentet

  1. Klargjør lager mikroskopi medium.
    1. Legge til 25 mL av HEPES Buffer løsning (1 mol/L) til 975 mL av RPMI 1640 medium å få en siste 1 L 25 mmol/L HEPES løsning. Alternativt bruke en buffer medium med HEPES inkludert.
      Merk: HEPES brukes til å opprettholde pH verdien av mediet under en måling i omgivelsesforhold (f.eks utenfor en inkubator og uten konstant CO2 tilførsel).
    2. Ta en aliquot løsning nødvendig for et eksperiment og la den varmes opp til romtemperatur. 2 mL medium er tilstrekkelig. Holde de gjenværende lagerløsning på 4 ° C.
  2. Forberede mikroskop cuvette.
    Merk: Følgende beskriver fremgangsmåten for en spesialbygd eksempel holder en base aluminiumsplate og en akryl cuvette rett som både retter på dekkglassvæske og par det til piezoelectric 3D positioner. Kommersielt tilgjengelige steril kultur retter med glass bunn kan også brukes.
    Merk: Figur 5 viser bilder av spesialbygde eksempel holderen.
    1. Ta en ny mikroskopi dekkglassvæske og skylle den med deionisert vann (DI-vann) og etanol. Luften tørr lysbildet med nitrogen eller trykkluft.
    2. Rengjør dekkglassvæske i en oksygen plasma atmosfære (0,3 mbar gasstrykket) i 10 min på 500 W RF power. Dette fjerner alle organiske urenheter fra overflaten.
    3. Rengjør akryl cuvette rett ved å leve det i 0,2 mol/L NaOH løsning for ca 10 min. skyll med DI vann.
    4. Samle prøven holderen og dekke det med en plast Petriskål inntil i eksperimentet.

Figure 5
Figur 5: spesialbygde eksempel holderen. (a) prøve holderen komponenter: (1) akryl cuvette rett; (2) aluminium bunnplate; (3) holde skruer; (4) silikon o-ringen; (5) dekkglassvæske. (b) ferdig montert prøven holderen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Forberede mikroskopet.
    1. Slå på iSCAT belysning laser, lyse-feltet/fluorescens belysning LED, kameraer og anskaffelse/dataprogrammer. Blokkere laserstrålen på en posisjon før målet.
    2. Sikre at 100 X / 1.46 NA målet er ren. Hvis ikke, bruk linsen kluter og etanol for å rengjøre målet produsenten retningslinjer.
    3. Påfør en dråpe neddyppingsolje på mikroskopet målet.
    4. Ta prøven holderen (samlet i delen 2.2) og nøye montere den på piezo scenen av iSCAT mikroskopet slik at prøven dekkglassvæske er sentrert på mikroskopet målet. Være oppmerksomme og forsiktig for ikke å skade linsen. Fest enheten piezoelectric positioner med tommeskruer samtidig som produsenten angitt maksimalt dreiemoment ikke er overskredet.
    5. Legge til 1 mL av lager mikroskopi medium (forberedt i Seksjon 2.1.) i cuvette.
    6. Legge til 2 dråper propidium iodide flekken til medium som en celle død markør16,22.
    7. Oppheve laser og bringe systemet i fokus. Først kontrollere at målet er plassert på riktig avstand fra dekkglassvæske ved å gjenta trinn 1.2.3. -1.2.5. (Figur 2). Deretter finjustere fokus med z-aksen av piezo scenen.
    8. Bekreft at alle innstillinger for lyskilder, kamera, og programvaren er riktig angitt. Dette omfatter parametere som laser makt, LED intensitet, kameraet bildefrekvens, kameraet eksponeringstider eller programvare lagre banene.
      Merk: Lagre videoer på høy bildefrekvens kan produsere store filstørrelser. Sikre nok ledig diskplass på datamaskinen.
    9. Blokkere laserstrålen igjen. Mikroskopet er nå klar for et eksperiment.
  2. Forberede cellene.
    Merk: Laz388 celler20 er kultivert i RPMI 1640 medium med 10% fosterets kalv serum (FCS), aminosyrer, pyruvate og antibiotika. Cellene er er ruges på 37 ° C og 5% CO2 delt og utstyrt med fersk medium hver 2-3 dager23.
    1. Ta celle kultur kolbe settefiskanlegg og Sug opp mediet som inneholder ca 1 x 106 celler. For å fastslå riktig volum, kvantifisere konsentrasjonen av cellekultur ved bruk av en hemocytometer.
    2. Bland celle-løsning med 10 mL RPMI 1640 medium ved romtemperatur og sentrifuge prøven på 300 x g i 7 min.
    3. Nøye ekstra og forkaste nedbryting samtidig at pellet konsentrert celler forblir uforstyrret.
    4. Gjenta 2.4.2. -2.4.3. med konsentrert pellet celler.
    5. Nytt suspendere cellene i 0,5 mL lager mikroskopi medium (forberedt i Seksjon 2.1.) og umiddelbart bruke dem i et eksperiment.

3. iSCAT mikroskopi sekresjon celler

  1. Kontroller at laserstrålen blokkeres for å hindre at cellene blir direkte utsatt for laserlys iSCAT.
  2. Injisere cellene til eksempel cuvette.
    1. Injisere ca 3 µL av cellen utvalget (forberedt i inndelingen 2.4.) litt forskjøvet i prøven cuvette. Forsiktig touch pipette spissen å dekkglassvæske og sakte injisere celle løsningen. At cellene å bosette seg på dekkglassvæske.
      Merk: Bruke små pipette-spisser (10 µL) eller lange, fleksible gel-lasting tips.
    2. Kontroller at tettheten av celler er under ca 1 cellen per 500 µm² slik at encellede målinger ikke er påvirket av cellene i området rundt iSCAT laser.
    3. Hvis antall celler er for lav, Gjenta trinn 3.2.1. før et tilstrekkelig antall er tilgjengelig.
    4. Hvis celler er for tette, bruke en injeksjon av ca 20 µL av ekstra mikroskopi medium for å spre cellene over dekkglassvæske.
  3. Bruker piezo positioner, bevege prøven sidelengs å plassere en celle nær (ca. 10 µm) til iSCAT synsfelt. Kontroller at cellen ikke inn iSCAT synsfelt som direkte eksponering mot 445 nm laserlys kan være skadelig for cellen.
  4. Bruk lyse-feltet og fluorescens bilder til å finne og kontrollere cellens levedyktighet25.
    Merk: En levedyktig celle har en rund form i lyse-feltet bildet og er ikke fluorescerende, mens celledød angis av sterk fluorescens signaler som oppstår fra tilstedeværelsen av propidium iodide inni cellen22.
  5. Oppheve iSCAT laserstrålen og sikre dekkglassvæske overflaten er fortsatt i fokus. Angi tabellen isolasjon for å minimere drift og akustisk kobling av ambient omgivelsene.
    Merk: Sistnevnte oppnås med tunge optisk gardiner eller akryl paneler rundt tabellen optisk.
  6. Start målingen ved henting av bilder fra iSCAT, lyse-feltet og fluorescens kameraer. Automatisere og kontrollere prosessen gjennom programvare å maksimere eksperimentelle effektivitet. Periodisk sjekk levedyktigheten til cellen og fokus på systemet.
    Merk: Avhengig av laser intensitet, optisk komponenter, og eksponering tid for kameraet, iSCAT laser kan forstyrre fluorescens kameraet. Hvis dette problemet er observert, kan du vurdere å forskalinger iSCAT laser midlertidig under fluorescens bilde oppkjøp.

4. dataanalyse

Merk: Eksperimentelle data er iboende bråkete og iSCAT bilder er ikke annerledes. Det er flere kilder til støy i et typisk iSCAT mål, herunder wavefront skjevheter i hendelsen lyskilden, overflateruhet dekkglassvæske og kameraet Støy. Nedenfor presenterer noen måter som disse støykilder er avhjelpes via etterbehandling. Dessuten lateral mekanisk ustabilitet av føre til støyende data og må tas opp tilsvarende, som beskrevet under diskusjon nedenfor. Beskrevet analysene utføres med egendefinerte MATLAB skript.

  1. Minimere kameraet Støy ved filtrering rådata med en todimensjonal Fourier-filter som utelukker høy romlig frekvenser. Størrelsen på filteret må justeres for å passe bestemte eksperimentelle konfigurasjonen (avhengig av systemets numeriske blenderåpning).
    Merk: Funksjonene i bildet med høyere romlige frekvenser enn optisk system kommer fra eksterne kilder (for eksempel kamera skrivebeskyttet ut støy) og kan bli neglisjert.
  2. Konvertere bilder fra raw kameraet teller til iSCAT kontrast.
    Merk: Signalet oppdaget av kameraet er Equation 13 . iSCAT kontrast er definert som Equation 14 der Equation 15 er lysintensiteten referanse, i dette tilfellet delen reflektert av dekkglassvæske, og Equation 16 er forstyrrelser mellom Equation 15 og spredte intensiteten (Equation 17).
    1. Skille signalet til Equation 16 og Equation 15 av databehandling timelige gjennomsnittet av bestemte rammer som partikler av interesse ikke, finnes. Det resulterende bildet gir referanse signal Equation 15 .
      Merk: Alternativt en aktiv bakgrunn subtraksjon trinnet kan utføres som beskrevet nedenfor.
    2. Beregne kontrast i henhold til Equation 18 12,14,16.
  3. Opprette en rullende differensial avbildning ved å trekke fra hver etterfølgende ramme fra dens etterfølger.
    Merk: Gjenværende signaler fra overflateruhet av dekkglassvæske og wavefront skjevheter fjernes effektivt i dette trinnet som de er konstant i påfølgende rammer. Rullende differensial fjerner disse gjenværende signaler, forlater bare protein bindingene som oppstår fra ett bilde til neste. Denne dynamiske bakgrunn subtraksjon er gunstig som det ikke er følsom for langsiktig eksempel driver.
  4. Bruke en topp-søker algoritme for å finne og indeksere enkelt partikler for hver ramme og bestemme deres spesifikke kontrast og posisjon.
  5. Bruk informasjonen samlet i trinn 4.4 du oppretter histogrammer protein bindende hendelser og deres utdraget kontraster gjelder protein masse gjennom en kalibreringskurven samlet fra kjente protein prøver14,24.

Representative Results

En skjematisk av en iSCAT-mikroskopet er vist i figur 4a. Representant lyse-feltet, fluorescens og rå iSCAT bilder vises i figur 4bog 4 c 4 d, henholdsvis16. Figur 4e og 4f vise resultatene av fjerning av bakgrunnen og differensial etterbehandling; to adsorbert proteiner er synlig som Diffraksjon-begrenset flekker i figur 4f. Figur 6 viser et histogram for oppdaget proteiner i løpet av 125 s. Disse dataene ble oppnådd ved å bruke en topp-søker algoritme fanget bildene for å telle bindende hendelsene og katalogisere deres kontrast16. Totalt 503 proteiner ble oppdaget.

Neste, utskilles Art identifiseres sammenligning referanse målinger utført på renset protein løsninger, eller gjennom flere målinger med functionalized glass overflater14,16. ISCAT data, dermed visualisere direkte mobilnettet sekresjon dynamikken på en subsecond skala16. Som et eksempel, har vi tidligere funnet at IgG-antistoffer er en stor del av Laz388 secretome og frigis fra cellen med en hastighet på ca. 100 molekyler per andre16. I tillegg utskilles andre partikler som spenner over en rekke 100 kDa - 1000 kDa av celler16. Metoden beskrevet kan bli ytterligere næringsdrivende f.eks undersøke romlige konsentrasjon gradient av sekreter rundt en celle16, eller fastslå timelige dynamikken i mobilnettet lysis16.

Figure 6
Figur 6: kvantifisering av utskilles proteiner av en enkeltcelle Laz388. Histogrammet viser oppdagede proteiner i en tidsperiode på 125 s. kontrast verdiene akkumuleres i 1 x 10-4 kontrast hyller (blå stolper). Totalt 503 personlige proteiner ble regnet under målingen. Forsøket ble gjentatt 10 ganger med samme resultat. Dette tallet er tilpasset fra McDonald, sekten et al. 16. copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

En av de viktigste aspektene å skaffe nyttig iSCAT data er muligheten til å finne riktig fokus posisjon på dekkglassvæske overflaten, og videre til hold denne posisjonen i lange perioder. Unnlater å gjøre det vil resultere i utvidet PSFs, svak iSCAT signaler og drift-assosiert gjenstander i dynamics analyser. Det viser seg at finne fokalplanet på en ren, nakne dekkglassvæske overflate ikke er en lett oppgave som overflaten ikke er synlige på store referanse strålen bakgrunn (se Figur 4 d).

Rå iSCAT bilder er ofte skjult av bakgrunnen signaler som oppstår fra wavefront urenheter i excitation kilde, og kan hindre ens evne til å finne riktig tenkelig flyet. Aktive wavefront subtraksjon er en nyttig måte å omgå dette problemet og senere overvåke iSCAT fokus under en måling16. Én måte å oppnå dette er gjennom romlige eksempel modulering. I korte trekk gjelder en funksjonsgenerator en 50 Hz firkantbølge ekstern kontroll porten piezo scenen, noe som resulterer i en romlig eksempel moduleringshjul på anvendt frekvens (290 nm amplituden). Synkron kameraet oppkjøp utløses fra samme kilde, og når kombinert gjennom låsbare prinsipper, resulterer i en wavefront-kompensert bilde14,16. Det resulterende bildet viser vanligvis overflateruhet av dekkglassvæske (figur 4e). Små funksjoner igjen på glasset etter rengjøring kan brukes til å bringe mikroskopet i fokus. Parametere som brukes for dette aktive bakgrunn subtraksjon trinnet kan endres etter bildefrekvens, eksponeringstid eller maskinvare.

Som nevnt ovenfor, bruk av en høy kvalitet strålen splitter i iSCAT stilling (trinn 1.2.1.) anbefales som imaging gjenstander som skygger eller forstyrrelser som oppstår tynn planar strålen splittere vil påvirke bildet og forstyrre målingen. Figur 7 viser en sammenligning mellom en høy kvalitet og lav kvalitet strålen splitter. Både rå iSCAT bilder viser samme område på dekkglassvæske som inneholder noen gjenværende partikler. Samme iSCAT oppsett ble brukt til å fange både bilder, bare bjelke oppdelingen ble utvekslet. Figur 7a viser bildet dannet på kameraet ved bruk av en tykkere (5 mm), AR-belagt, og klemt fast bredde splitter. På grunn av klemt fast design, reflektert strålen fra tilbake overflaten av bjelke splitter anti-parallell til refleksjon som oppstår fra overflaten og inn ikke målet. Ingen forstyrrelser gjenstander oppstå. Figur 7b viser samme synsfelt på prøven, men denne gangen en tynnere (1 mm) planar strålen splitter ble brukt. To refleksjoner fra og baksiden splitterens strålen er parallell og overføres til kameraet. Forstyrrelser gjenstander er klart synlig.

Figure 7
Figur 7: sammenligning av iSCAT bilder produsert med høy og lav-kvalitet strålen splitters. (a) noe som resulterte rå iSCAT bilde ved bruk av en 5 mm tykk, AR-belagt og klemt fast bredde splitter. (b) noe som resulterte rå iSCAT bilde av samme område ved hjelp av en 1 mm tykk planar strålen splitter. Begge strålen splittere har samme splitting forhold (50% refleksjon, 50% overføring). Forstyrrelser gjenstander som oppstår fra Fresnel refleksjoner er tydelig observert i bildet med 1 mm tykke planar strålen splitter. Skalere barer: 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I denne protokollen beskriver vi et bredt felt belysning oppsett for iSCAT som det er rask og enkel å forstå og gir mulighet for parallell sensing over et stort område14. En annen felles tilnærming er å bruke acousto-optisk deflektorer (AODs) og skanning en AC confocal stråle eksempel12,17. Dette unngår behovet for høy kvalitet wavefronts men er mer eksperimentelt kompleks enn konvensjonelle wide-field bildebehandling. Videre er hastigheten på AC confocal belysning begrenset av for AODs. Avhengig av ønsket eksperimentelle parametrene kan enten AC confocal eller wide-field belysning ordninger i prinsippet benyttes for å oppdage enkelt proteiner skilles ut fra levende celler.

Som omtalt i protokollen, er det viktig å minimere lateral mekanisk svingninger i utvalg scenen av mikroskopet. Selv nanometer avvik i posisjonen til prøven kan føre til variasjoner i påfølgende kameraet rammer og indusere betydelig ytre støy i differensial bildet. Det anbefales derfor å bruke en mekanisk stabil mikroskop scene og en dempet optisk tabell (trinn 1.1.1.) og dekker installasjonen med optisk gardiner eller panel under et eksperiment (trinn 3.5.).

Et fokus stabilisering ordningen kan også bli vurdert for langsiktige mål. I denne tilnærmingen, er en andre laser innlemmet i mikroskopet totale interne refleksjon (TIR) arrangement, og senere fotografert på en kvadrant photodiode. Endringer i systemets fokus oversette til laterale forskyvninger av TIR laser spot på kvadrant diode, som deretter kan brukes i et aktivt feedback loop for å kontrollere z-aksen piezo scenen26. Vertikal drift langtidseffekter er dermed eliminert.

Flere endringer og utvidelser kan brukes med presentert teknikken adresse eksperimentelle behov. For eksempel kommersielle mikroskop scenen inkubatorer er tilgjengelig som kan lett bli innarbeidet i iSCAT mikroskop for langsiktig avbildning av celler. Andre teknikker kan også implementeres for å komplettere iSCAT imaging som AC confocal eller TIR fluorescens microscopies17. For å tilpasse på systemet under studien, iSCAT sekresjon målinger kan utføres andre cellen medier som DMEM eller DPBS, men bør den pH indikator fenol røde unngås så det kan forstyrre forsøket på grunn av absorpsjon av laserlys. I tillegg inneholder som fosterets kalv serum (FCS) eller menneskelig Platederivert lysate (hPL) proteiner som kan forstyrre iSCAT gjenkjenning. Avhengig av ønsket følsomheten av eksperimentet, bør disse kosttilskudd ekskluderes fra mikroskopi medium.

iSCAT er avhengig av en analytt muligheten til å spre lys – en egenskap som er iboende alle proteiner, og er dermed iboende uspesifikke. Likevel er noen grad av spesifisitet mulig som iSCAT signaler skala lineært med protein masse14,27,28. Dette gir kalibrering av en iSCAT system som bruker standard protein utvalgene, for eksempel bovin serum albumin (BSA) og fibrinogen14,27,28. I faktisk ganske nylig, unge et al. 28 har utvidet på arbeidet til Piliarik & Sandoghdar14 og har vist at iSCAT kan brukes til å bestemme molekylvekt av proteiner så liten som streptavidin (53 kDa) med en masse oppløsning på 19 kDa og en nøyaktighet på ca 5 kDa. Flere konvensjonelle tilnærminger kan videre utfyller iSCAT ved å gi et ekstra nivå av spesifisitet. Som et eksempel, enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA) eller andre overflaten modifikasjoner, begrense oppdaget protein bindende hendelser slik at bare målet protein er16.

I denne protokollen beskrev vi hvordan iSCAT mikroskopi kan brukes å undersøke mobilnettet sekreter på enkelt protein nivå med subsecond midlertidig løsning16. Teknikken er generelt og kan implementeres på noen kommersielle eller hjemme-bygget mikroskop. I motsetning til én-molekylet fluorescens tilnærminger, metoden lider ikke av photobleaching eller blinker effekter, men det fremdeles oppnår single-protein følsomhet. Disse funksjonene gjør iSCAT et kraftig verktøy i biosensing og mikroskopi. Framtidige applikasjoner vil fokusere på Klargjørende komplekse mobilnettet interaksjoner som immunologiske respons til stimulans eller mobil kommunikasjon.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Max Planck samfunnet, et Alexander von Humboldt professorat og Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Vi takker Stefanie Schaffer på Universitätsklinikum Erlangen gir Laz388 celler og nyttig diskusjoner. Vi takker Simone Ihloff og Maksim Schwab på MPL for kundestøtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Item/Device
100x / 1.46 NA objective Zeiss 420792-9800-000 alpha Plan Apochromat oil immersion
20x / 0.4 NA objective Leica 566049 N Plan
Piezo Stage PI P-517k020 3-axis stage with 100x100x10µm range
Diode laser (445 nm) Lasertack PD-01236
Optics/Optomechanics Thorlabs/Newport - lenses, mirrors, posts, mounts
Pinhole Thorlabs P30H
LED light source Thorlabs MCWHL5
Shortpass filter (580 nm) Omega Optical 580SP to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
Longpass filter (500 nm) Thorlabs FEL0500 to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
70R/30T beam splitter Newport 20Q20BS.1
Economy beam splitter Thorlabs EBS1 used for the comparison of fringe effects
Wedged plate beam splitter Thorlabs BSW26 used for the comparison of fringe effects
Shortpass dichroic mirror (550 nm) Edmund Optics 66249
8R/92T beam splitter Thorlabs BP108
CMOS camera Photonfocus MV1-D1024E-160-CL for iSCAT aquisition
CMOS cameras Mightex SCE-B013-U for bright field / fluorescence aquisition
Longpass filter (600 nm) Thorlabs FELH0600
Computer Fujitsu Siemens  - Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD
Acquisition Software LabVIEW - LabVIEW 2016 Suite
Analysis Software Matlab - Matlab 2014 Suite
Plasma Cleaner Diener Diener pico
Incubator Binder Model CB
Centrifuge Eppendorf 5810R
Reagent/Material
RPMI 1640 medium Gibco 11835063 without phenol red
HEPES Buffer Solution (1M) Sigma Aldrich 59205C
Cover slides Marienfeld 107052
Glass bottom culture dishes ibidi 81158
Fluorescent Microspheres Invitrogen F8821 used for calibration
Immersol immersion oil Zeiss 444960
Propidium iodide stain Invitrogen R37108
Small pipette tips Eppendorf 30075005
Flexible pipette tips Eppendorf 5242956003
Ethanol, 99.8% Fisher Scientific E/0650DF/15
Sodium hydroxide, pellets Sigma Aldrich 221465 for preparing 0.2M NaOH solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hathout, Y. Approaches to the study of the cell secretome. Expert Review of Proteomics. 4 (2), 239-248 (2007).
  2. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405 (6788), 837-846 (2000).
  3. Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. Journal of Proteomics. 73 (12), 2291-2305 (2010).
  4. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).
  5. MacBeath, G. Protein microarrays and proteomics. Nature Genetics. 32, 526-532 (2002).
  6. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8 (4), 247-258 (2008).
  7. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  8. Borisov, S. M., Wolfbeis, O. S. Optical biosensors. Chemical Reviews. 108 (2), 423-461 (2008).
  9. Dantham, V. R., Holler, S., Barbre, C., Keng, D., Kolchenko, V., Arnold, S. Label-Free Detection of Single Protein Using a Nanoplasmonic-Photonic Hybrid Microcavity. Nano Letters. 13 (7), 3347-3351 (2013).
  10. Zijlstra, P., Paulo, P. M. R., Orrit, M. Optical detection of single non-absorbing molecules using the surface plasmon resonance of a gold nanorod. Nature Nanotechnology. 7 (6), 379-382 (2012).
  11. Rickgauer, J. P., Grigorieff, N., Denk, W. Single-protein detection in crowded molecular environments in cryo-EM images. eLife. 6, e25648 (2017).
  12. Lindfors, K., Kalkbrenner, T., Stoller, P., Sandoghdar, V. Detection and Spectroscopy of Gold Nanoparticles Using Supercontinuum White Light Confocal Microscopy. Physical Review Letters. 93 (3), 037401 (2004).
  13. Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface. Optics Express. 14 (1), 405 (2006).
  14. Piliarik, M., Sandoghdar, V. Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites. Nature Communications. 5, 4495 (2014).
  15. Roux, K. H. Immunoglobulin Structure and Function as Revealed by Electron Microscopy. International Archives of Allergy and Immunology. 120 (2), 85-99 (1999).
  16. McDonald, M. P., et al. Visualizing Single-Cell Secretion Dynamics with Single-Protein Sensitivity. Nano Letters. 18 (1), 513-519 (2018).
  17. Kukura, P., Ewers, H., Müller, C., Renn, A., Helenius, A., Sandoghdar, V. High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus. Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).
  18. Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
  19. Spindler, S., et al. Visualization of lipids and proteins at high spatial and temporal resolution via interferometric scattering (iSCAT) microscopy. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (27), 274002 (2016).
  20. Lazarus, H., et al. Characterization of a unique cell line (LAZ 221) from human acute lymphocytic ("null" cell) leukemia. Cancer Research. 38 (5), 1362-1367 (1978).
  21. Mackensen, A., et al. Evidence for in situ amplification of cytotoxic T-lymphocytes with antitumor activity in a human regressive melanoma. Cancer Research. 53 (15), 3569-3573 (1993).
  22. Crowley, L. C., Scott, A. P., Marfell, B. J., Boughaba, J. A., Chojnowski, G., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), 647-651 (2016).
  23. Freshney, R. I. Primary Culture. Culture of Animal Cells. , (2005).
  24. Dahmardeh, M., et al. Unpublished data. , (2018).
  25. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. American Journal of Pathology. 146 (1), 3-15 (1995).
  26. Bellve, K., Standley, C., Lifshitz, L., Fogarty, K. Design and Implementation of 3D Focus Stabilization for Fluorescence Microscopy. Biophysical Journal. 106 (2), 606a (2014).
  27. Liebel, M., Hugall, J. T., Van Hulst, N. F. Ultrasensitive Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins. Nano Letters. 17 (2), 1277-1281 (2017).
  28. Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).

Tags

Engineering problemet 141 iSCAT label-fri enkelt-protein mobilnettet sekresjon bildebehandling spredning dynamikk sanntid
Etikett-fri Imaging av enkelt proteiner skilles ut fra levende celler via iSCAT mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gemeinhardt, A., McDonald, M. P.,… More

Gemeinhardt, A., McDonald, M. P., König, K., Aigner, M., Mackensen, A., Sandoghdar, V. Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy. J. Vis. Exp. (141), e58486, doi:10.3791/58486 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter